IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq

IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)

VIDA ELSYANA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Desember 2015 Vida Elsyana NIM G851130291

RINGKASAN VIDA ELSYANA. Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.). Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO. Benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) merupakan tanaman semiparasit yang termasuk dalam famili Loranthaceae. Benalu cengkih telah digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk pengobatan kanker. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi senyawa antikanker ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara in vitro pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCM-B2). Simplisia daun benalu cengkih diekstraksi dengan air menggunakan metode refluks dan etanol 70% dengan metode maserasi. Ekstrak etanol selanjutnya difraksinasi bertingkat menggunakan ekstraksi cair-cair dan diperoleh 3 fraksi, yaitu fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana. Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid. Sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih diuji menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi nheksana masing-masing memiliki nilai LC50 sebesar 649.12 μg/mL dan 55.32 μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi n-heksana sebelas kali lebih berpotensi memiliki aktivitas antikanker dibandingkan fraksi etil asetat. Pengujian lebih lanjut dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana benalu cengkih. Hasil analisis menggunakan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (Py-GC/MS) menunjukkan bahwa fraksi n-heksana daun benalu cengkih mengandung fitol dan metileugenol. Kedua senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antikanker. Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana daun benalu cengkih diuji menggunakan metode pewarnaan Trypan Blue dan sel dihitung menggunakan hemasitometer Improved Neubauer. Pengujian fraksi n-heksana daun benalu cengkih dilakukan pada konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. Fraksi nheksana daun benalu cengkih mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada konsentrasi 125 μg/mL dengan persentase penghambatan sebesar 38.69% pada sel lestari kanker K562 dan 41.5% pada MCM-B2. Benalu cengkih berpotensi menjadi antikanker alami.

Kata kunci: antiproliferasi, benalu cengkih, senyawa antikanker, sitotoksisitas

SUMMARY VIDA ELSYANA. Identification of anticancer compounds and antiproliferation activity assay of clove mistletoe leaves extracts (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.). Supervised by MARIA BINTANG and BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO. Clove mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) is semi-parasitic plant that belongs to Loranthaceae family. Clove mistletoe was used traditionally for cancer treatment in Indonesia. The purpose of this study was to identified anticancer compounds of clove mistletoe leaves extracts and to examine its antiproliferation activity on human myelogenous leukemia (K562) and canine benign mixed mamary (MCM-B2) cancer cell lines in vitro. The leaves powder of clove mistletoe were extracted by water using reflux method and by ethanol using maceration method. Ethanol extract of clove mistletoe was then fractionated using liquid-liquid extraction and resulted ethanol fraction, etyl acetate fraction, and n-hexane fraction. Phytochemical screening showed the leaves powder of clove mistletoe contained flavonoids, saponins, tannins, and triterpenoid. Cytotoxicity of clove mistletoe leaves extract was conducted using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Water extract, ethanol extract, and ethanol fraction had LC50 greater than 1000 μg/mL. Etyl acetate fraction and n-hexane fraction had LC50 649.12 μg/mL and 55.32 μg/mL, respectively. This results suggested that etyl acetate and n-hexane fractions had potent of anticancer activity in cancer cell lines. Nevertheless, n-hexane fraction eleven times more potent than etyl acetate fraction. Therefore, only n-hexane fractions was then considered for further examinations. Analysis of active compounds using Pyrolysis Gas Chromatography/Mass Spectrometry (Py-GC/MS) revealed that n-hexane fraction contained methyleugenol and phytol. These compounds was known acts as anticancer. Antiproliferation activity of n-hexane fraction of clove mistletoe was conducted using Trypan Blue Dye Exclusion Method and cells were counted using Improved Neubauer haemacytometer. The n-hexane fraction of clove mistletoe was tested at concentration 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. The results showed that n-hexane fraction could inhibited growth of K562 and MCM-B2 cancer cell line. The highest inhibition activity of K562 cell lines was 38.69%, while on MCM-B2 was 41.5%, this activity was achieved at concentration 125 μg/mL. Therefore, it was suggested that clove mistletoe had potential for natural anticancer. Keywords : anticancer compounds, antiproliferative, clove mistletoe, cytotoxicity

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIKANKER DAN UJI AKTIVITAS ANTIPROLIFERASI EKSTRAK DAUN BENALU CENGKIH (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)

VIDA ELSYANA

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Syamsul Falah, SHut MSi

Judul Tesis : Identifikasi Senyawa Antikanker dan Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Daun Benalu Cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) Nama : Vida Elsyana NIM : G851130291

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr drh Maria Bintang, MS Ketua

Prof drh Bambang Pontjo P, MS PhD APVet Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 17 Desember 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini ialah identifikasi senyawa antikanker dan uji aktivitas antiproliferasi ekstrak daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang, MS selaku ketua komisi pembimbing sekaligus ketua Program Studi Biokimia dan Bapak Prof drh Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, PhD.APVet selaku anggota komisi pembimbing atas saran dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi selaku penguji luar komisi dan Ibu Dr Suryani, SP, MSc selaku moderator pada ujian tesis atas saran untuk perbaikan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada seluruh staf Sekolah Pascasarjana (SPs) dan Fakultas MIPA IPB, khususnya Departemen Biokimia serta pranata laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB dan laboratorium kultur jaringan Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi FKH IPB. Penghargaan penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Dirjen Dikti) atas pemberian Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPP-DN) Tahun 2013. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua penulis, yaitu Bapak Maryoto dan Ibu Rukidah serta Kakak (Dedi Pramono dan Misgiyati) atas segala doa, motivasi, dan kasih sayangnya. Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua rekan pascasarjana Biokimia 50, khususnya Tiana Fitrilia dan Sri Asih serta rekan-rekan kerja di Laboratorium Bioanalisis dan Laboratorium Kultur Jaringan, khususnya Nita Shinta Sari, Fitri Hardiani Fathonah, dan Ansenora Bekris. Penghargaan penulis juga sampaikan kepada Saudari Lailan Sahrina Hasibuan, MKom atas saran dan bantuannya selama penelitian dan penulisan karya ilmiah. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2015 Vida Elsyana

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Hipotesis Ruang Lingkup Penelitian

1 1 2 2 2 3 3

2 METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan Alat Prosedur

3 3 3 4 4

3 HASIL Identitas Spesies Benalu Cengkih Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih

8 8 8 8 9 9 10

4 PEMBAHASAN Identitas Spesies Benalu Cengkih Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih

11 11 12 13 13 15 15

5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran

18 18 18

DAFTAR PUSTAKA

18

LAMPIRAN

22

RIWAYAT HIDUP

34

DAFTAR TABEL 1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut 2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih fraksi n-heksana daun benalu cengkih 4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih 5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih

8 8 9 10 11

DAFTAR GAMBAR 1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih 2 Penurunan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih 3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis

9 11 17

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4

Diagram alur penelitian Surat pernyataan hasil determinasi jenis benalu cengkih Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk menentukan nilai LC50 5 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0

22 23 24 26 33

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit paling mematikan di dunia. Tahun 2012, terdapat sekitar 14.1 juta kasus baru dan 8.2 juta kematian terkait kanker di seluruh dunia (WHO 2015). Kanker disebabkan oleh abnormalitas sel akibat adanya mutasi pada DNA (Garret 2001). Penyakit ini ditandai dengan perubahan sifat normal sel, yaitu sel menjadi lebih agresif, tumbuh, dan membelah tanpa terkendali karena mampu memenuhi sinyal pertumbuhannya sendiri. Sel tersebut selanjutnya memiliki kemampuan menyusup dan merusak jaringan di dekatnya lalu menyebar ke jaringan lainnya melalui sistem pembuluh darah dan limpa (metastasis) (Haryanti & Katno 2011). Pengobatan kanker secara konvensional dilakukan dengan pembedahan, radiasi, kemoterapi, dan terapi hormon (Dashora et al. 2011). Pengobatan kanker secara konvensional memiliki beberapa kelemahan. Pembedahan tidak dapat dilakukan untuk sel yang telah mengalami metastasis, radiasi seringkali berbahaya bagi sel-sel normal, dan kemoterapi belum memberi hasil optimal karena ketidakspesifikan kerja obat dan relatif mahal (Dashora et al. 2011; Fadhli et al. 2012; Gamal & Septananda 2013; Wicaksono dan Permana 2013). Hal ini mendorong peningkatan penggunaan herbal untuk pengobatan alternatif kanker, karena obat herbal memiliki efek samping kecil, aman, dan tidak menyebabkan ketergantungan (Olaku & White 2011). Herbal tidak hanya bermanfaat untuk pengobatan kanker pada manusia dan hewan, tetapi juga sebagai titik awal penemuan senyawa aktif untuk pengembangan obat baru (Wahyuni et al. 2009). Indonesia yang kaya akan keanekaragaman hayati memiliki berbagai jenis tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai sumber antikanker baru (Artanti et al. 2012). Salah satu tumbuhan yang telah digunakan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia sebagai antikanker adalah benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) (Artanti et al. 2012). D. pentandra termasuk famili Loranthaceae. Benalu umumnya dinamai berdasarkan tanaman inangnya, misalnya benalu teh, benalu mangga, dan benalu cengkih (Suryanto & Wehantouw 2008). Benalu bersifat merugikan bagi tumbuhan inangnya namun berpotensi sebagai tanaman obat (Fajriah et al. 2007; Artanti et al. 2012; Anita et al. 2014). Benalu termasuk tanaman semiparasit maka bioaktivitas benalu diduga bergantung pada tanaman inangnya (Xiou et al. 2008). Benalu yang hidup pada berbagai tanaman inang diketahui memiliki aktivitas sitotoksik dan antikanker. Benalu teh mampu menginduksi terjadinya apoptosis pada sel Jurkat T (Hashimoto et al. 2007). Daniel et al. (2012) melaporkan bahwa fraksi etil asetat benalu sirsak memiliki aktivitas sitotoksik terhadap larva udang. Ekstrak batang benalu kapuk mampu menekan ekspresi protein mutan p53 pada kultur sel HeLa (Gamal & Septananda 2013). Ekstrak etanol benalu jeruk bersifat toksik terhadap Artemia salina L. dengan nilai LC50 sebesar 648.15 μg/mL (Ramadhan 2013). Daun benalu langsat mengandung flavonoid dan pemberian ekstrak etanol terbukti memberikan efek hepatoprotektor pada tikus putih jantan yang diinduksi CCl4 (Tristanti et al. 2013). Ekstrak etanol

2 benalu mangga mampu memperbaiki struktur jaringan kanker kolon (Wicaksono dan Permana 2013). Salah satu benalu yang belum banyak diungkap potensinya adalah benalu cengkih. Terapi dengan meminum air rebusan daun benalu cengkih dilaporkan dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara (Puro 2012). Daun benalu cengkih juga memiliki aktivitas antiradikal bebas DPPH (Suryanto & Wehantouw 2008) dan mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus dan Escherichia coli (Puro 2012). Penapisan kandungan kimia pada daun benalu cengkih menunjukkan adanya komponen senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid (Fitrilia et al. 2015). Komponen flavonoid telah diketahui berperan penting dalam pencegahan kanker (Ren et al. 2003). Belum ada penelitian terkait identifikasi senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi secara in vitro pada benalu cengkih. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel lestari kanker payudara anjing (MCMB2) secara in vitro. Ekstrak benalu cengkih diharapkan mampu menghambat pertumbuhan sel kanker sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi bahan alam untuk pengobatan kanker.

Perumusan Masalah Potensi dari benalu cengkih belum banyak diungkap dibandingkan jenis benalu lainnya. Penapisan komponen fitokimia pada akar, batang, daun, dan bunga benalu cengkih menunjukkan adanya komponen fenolik, flavonoid, saponin, dan tanin (Suryanto & Wehantouw 2008). Kandungan senyawa antikanker dan aktivitas antiproliferasi dari ekstrak benalu cengkih secara in vitro belum diketahui.

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi kandungan senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih dan menguji aktivitas antiproliferasinya secara in vitro pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.

Manfaat Penelitian Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai kandungan senyawa antikanker dari ekstrak daun benalu cengkih serta aktivitas antiproliferasinya sehingga dapat bermanfaat dalam pengembangan potensi bahan alam untuk pengobatan kanker.

3 Hipotesis Ekstrak daun benalu cengkih mengandung senyawa antikanker. Ekstrak daun benalu cengkih juga menghambat pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2.

Ruang Lingkup Penelitian Lingkup kegiatan penelitian ini meliputi pengambilan sampel daun benalu cengkih (D. pentandra (L.) Miq.), pembuatan simplisia, penentuan kadar air, penapisan komponen fitokimia, dan ekstraksi dengan metode refluks dan maserasi. Tahap selanjutnya ialah uji sitotoksisitas ekstrak daun benalu cengkih dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Ekstrak yang paling aktif dianalisis senyawa aktifnya dengan kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (PyGC/MS). Ekstrak juga diuji aktivitas antiproliferasinya pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue.

2 METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioanalisis Departemen Biokimia FMIPA IPB, Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH Bogor, dan Laboratorium Kultur Jaringan Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) IPB. Penelitian dilaksanakan dari Desember 2014 hingga Agustus 2015.

Bahan Bahan yang diuji dalam penelitian ini adalah daun benalu cengkih yang diperoleh dari daerah Batanghari, Lampung Timur pada bulan Januari 2015. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian antara lain etanol 70%, etil asetat, n-heksana, akuades, amil alkohol, KOH, HCN 2N, pereaksi Wegner, Meyer, dan Dragendorff, FeCl3 10%, asam sulfat, asam asetat, Liebermann-Burchard, kista Artemia salina Leach, air laut, Tween80, akuabides steril, Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal Calf Serum (FCS) 10%, antibiotik PenisilinStreptomisin 1%, Fungizon, dan pewarna Trypan blue. Sel yang digunakan pada penelitian ini adalah sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel kanker payudara anjing (MCM-B2) koleksi Laboratorium Kultur Jaringan, Divisi Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patotogi FKH IPB.

4 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah grinder, desikator, cawan porselen, oven, evaporator vakum, corong pisah, vorteks, lampu TL 14 watt, plat BSLT, aerator, shaker orbital, inkubator CO2, autoklaf, mikroplat 24sumuran, mikroplat 96-sumuran, hemositometer Improved Neubauer, mikroskop cahaya, dan mesin GC/MS pirolisis (Shimadzu GCMS-QP2010).

Prosedur Determinasi Jenis Sampel Benalu Cengkih Sampel daun benalu cengkih dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi – LIPI, Cibinong Bogor untuk menentukan identitas spesies sampel.

Pembuatan Simplisia dan Penentuan Kadar Air Sampel Bagian benalu cengkih yang digunakan ialah daun. Daun benalu cengkih yang diambil mulai daun keempat dari pucuk ke arah yang lebih tua. Pembuatan Simplisia Daun benalu cengkih dicuci menggunakan air mengalir. Daun dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dan ditutup kain berwarna gelap. Pengeringan dilakukan selama 3x7 jam (hari ke 1,2,3) dengan cuaca normal. Pengeringan disempurnakan dengan oven pada suhu 40-45oC. Daun dibuat serbuk berukuran 40 mesh menggunakan grinder. Penentuan Kadar Air Sampel Kadar air ditentukan berdasarkan metode SNI 01-2891-1992. Cawan kosong dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105°C selama 1 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Cawan ditimbang dan dicatat massanya. Sebanyak 1 gram sampel ditimbang di dalam cawan tersebut. Sampel dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam atau sampai massanya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0.003 gram). Cawan berisi sampel kering lalu didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang massa akhirnya. Kadar air sampel dihitung berdasarkan persamaan (1) sebagai berikut. adar air % b

y a

Keterangan: x = massa cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = massa cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = massa cawan kosong (g)

Ekstraksi Sampel Simplisia benalu cengkih diekstraksi dengan pelarut air dengan cara direbus menggunakan refluks dan pelarut etanol 70% dengan metode maserasi.

5 Pembuatan Ekstrak Ekstrak air dibuat dengan cara merebus 40 g simplisia dengan 400 mL akuades selama 2 jam menggunakan refluks. Ekstrak etanol dibuat dengan cara merendam 40 g simplisia dengan 400 mL etanol 70% teknis dan diaduk menggunakan shaker orbital kecepatan 125 rpm selama 24 jam. Ekstraksi sampel dengan air dan etanol masing-masing dilakukan pengulangan tiga kali dengan pelarut baru. Ekstrak yang dihasilkan dipisahkan dari residunya menggunakan sentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Ekstrak diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC. Fraksinasi Ekstrak Etanol Ekstrak etanol difraksinasi dengan pelarut nheksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan etanol (polar) menggunakan corong pisah. Sebanyak 15 g ekstrak etanol dilarutkan dalam 100 mL air hangat lalu dimasukkan dalam corong pisah. Ekstrak etanol difraksinasi dengan 100 mL n-heksana. Campuran dikocok perlahan setiap 10 menit dan diulang tiga kali kemudian didiamkan selama 30 menit hingga terbentuk fraksi n-heksana (atas) dan air (bawah). Fraksi n-heksana dipisahkan dan fasa air difraksinasi lanjut dengan 100 mL etil asetat. Fraksi etil asetat yang dihasilkan kemudian dipisahkan dan fraksi air ditambah 100 mL etanol sehingga diperoleh fraksi etanol. Ekstraksi setiap fraksi menggunakan 100 mL pelarut baru dan diulang hingga pelarut hampir tak berwarna. Ketiga fraksi diuapkan pelarutnya menggunakan evaporator vakum pada suhu 60oC. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dan dihitung berdasarkan persamaan (2) sebagai berikut. endemen e stra

%

assa e stra yang dihasil an assa simplisia yang die stra si

100%

Uji Kualitatif Kandungan Fitokimia Sampel Penentuan kandungan fitokimia sampel dilakukan berdasarkan metode Windarini et al. (2013) yang dimodifikasi. Uji Alkaloid Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 mL HCl 2 N dan 9 mL akuades. Larutan dipanaskan selama 2 menit lalu didinginkan dan disaring. Filtrat diuji dengan tiga pereaksi alkaloid (Wagner, Meyer, dan Dragendorff). Adanya alkaloid ditandai dengan endapan coklat pada pereksi Wagner, endapan putih kekuningan pada pereaksi Meyer dan endapan merah hingga jingga pada pereaksi Dragendorff. Uji Flavonoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 0.05 g serbuk magnesium dan 0.2 mL asam alkohol (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volum sama). Campuran tersebut ditambahkan 2 mL amil alkohol kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau kuning pada lapisan amil alkohol. Uji Saponin Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 10 mL air panas dalam tabung reaksi lalu didinginkan. Larutan dikocok secara vertikal selama 10 detik. Adanya saponin ditandai dengan terbentuknya busa setinggi 1-10 cm yang stabil sekitar 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan setetes HCN 2N.

6 Uji Tanin Sebanyak 10 mg ekstrak dididihkan dalam 50 mL akuades selama 5 menit kemudian disaring. Larutan uji diambil 5 mL dan direaksikan dengan 3-5 tetes FeCl3 dalam tabung reaksi. Adanya tanin ditandai dengan warna biru tua atau hitam kehijauan. Uji Triterpenoid Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 5 mL larutan eter dalam cawan porselen kemudian diuapkan. Residu ditambahkan dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Adanya triterpenoid ditandai dengan warna merah hingga hijau.

Pengujian Sitotoksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Pengujian sitotoksisitas dilakukan berdasarkan metode McLaughlin et al. (1998) yang dimodifikasi. Penyiapan Larva Udang Penetasan larva dilakukan dengan cara merendam 10 mg kista udang dalam toples kaca berisi 1 L air laut yang telah disaring. Penetasan dilakukan pada suhu kamar dengan diterangi sinar lampu TL 14 watt dan diaerasi selama 24 jam. Larva udang digunakan untuk uji setelah 48 jam. Pembuatan Larutan Uji Larutan uji terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fra si etanol. Larutan sto 2000 μg/mL masingmasing e stra dibuat dengan menambah an 20 mg e stra dengan 50 μL Tween80 lalu ditambahkan air laut hingga volumnya 10 mL. Ekstrak disonikasi hingga larut. Pengujian dilakukan dengan konsentrasi 1000, 500, 100, dan 10 μg/mL. Pengujian Sitotoksisitas Sebanyak 1 mL air laut yang berisi 10 ekor larva udang dimasukkan ke dalam mikroplat 12 sumuran dan ditambahkan 1000, 500, 100, dan 10 μL larutan sto e stra 2000 μg/mL . Volume setiap sumuran dicukupkan hingga 2 mL dengan penambahan air laut. Setiap konsentrasi ekstrak diuji sebanyak tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar di bawah sinar lampu TL 14 watt selama 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang hidup. Kontrol dilakukan dengan prosedur yang sama tanpa penambahan ekstrak.

Analisis Senyawa Antikanker Senyawa aktif sampel dianalisis menggunakan GC/MS pirolisis (Shimadzu GCMS-QP2010). Helium digunakan sebagai carrier gas (0.85 mL/menit) dalam kolom kapiler Rtx-5 S 60 mm 0.25 mm 0.25 μm dan dioperasikan dengan mode electron impact (EI) pada 70 eV serta suhu sumber ion pada 200oC. Kondisi kromatografi diatur pada 50oC untuk suhu oven kolom dan 280oC untuk suhu injeksi. Injeksi dilakukan dengan mode split, yaitu isotermal pada 50oC selama 5 menit lalu ditingkatkan suhunya menjadi 280oC selama 30 menit kemudian dipertahankan pada suhu ini hingga menit ke-60. Komponen senyawa aktif diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan analisis MS.

7 Uji Aktivitas Antiproliferasi Uji aktivitas antikanker dilakukan berdasarkan metode Priosoeryanto et al. (1995a). Persiapan Media dan Ekstrak Sel lestari kanker dikultur menggunakan media pertumbuhan DMEM sebanyak 850 μL dalam mikroplat 24 sumuran. Media di setiap sumuran ditambahkan antibiotik (penisilin-streptomisin) 10 μL, fungizon 10 μL dan serum (FCS) 30 μL serta ekstrak sebanyak 50 μL. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak yang bersifat toksik berdasarkan uji toksisitas dengan BSLT. Variasi konsentrasi ekstrak ditentukan berdasarkan nilai LC50 dan diuji sebanyak tiga kali ulangan. Penanaman Sel Suspensi sel lestari kanker dalam ampul (cryovial) dicairkan (thawing) lalu dihomogenkan dengan vorteks. Sebanyak 50 μL sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 (kepadatan 7x106 sel/mL) ditanam ke dalam masing-masing sumuran yang telah berisi media bersuplemen dan ekstrak. Kontrol negatif dilakukan dengan medium DMEM dan kontrol positif menggunakan doksorubisin 100 μg/mL dengan prosedur yang sama. Volume total setiap sumuran adalah 1 mL. Semua perlakuan dilakukan dalam tiga kali ulangan. Sel lestari kanker diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Pemanenan dan Penghitungan Sel Sel dipanen setelah 3-4 hari yaitu ketika pertumbuhan sel dikontrol negatif telah menutupi sekitar 70% permukaan sumuran (konfluen). Sebanyak 100 μL sel lestari kanker dimasukkan ke dalam sumuran mikroplat ELISA yang telah berisi 5 μL pewarna trypan blue kemudian dihomogenkan. Sel sebanyak 5 μL ditetes an pada chamber hemasitometer lalu ditutup dengan cover slip. Sel dihitung menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x. Sel yang dihitung adalah sel yang berada pada kotak tengah kamar hitung baik sel yang mati (biru) maupun sel hidup (bening). Hasil penghitungan sel dikonversikan ke dalam jumlah sel per mL suspensi dengan persamaan (3) berikut. Jumlah sel/mL = Jumlah sel yang dihitung x Faktor volume x Faktor pengenceran Persentase aktivitas pertumbuhan dan penghambatan sel kanker dihitung dengan persamaan (4) dan (5) berikut. %

tivitas pertumbuhan

umlah rataan sel dengan perla uan umlah rataan sel di ontrol negatif

100%

% Aktivitas penghambatan = 100% - (% aktivitas pertumbuhan)

Analisis Statistika Data dianalisis menggunakan analisis varian NOV satu arah α 0.05 . Hasil uji berma na ji a diperoleh harga p≤0.05 dan ji a terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui signifikansi perbedaan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.

8

3 HASIL Identitas Spesies Benalu Cengkih Determinasi dilakukan oleh Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor berdasarkan sampel daun benalu cengkih. Hasil determinasi menunjukkan bahwa spesies benalu yang diteliti adalah Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. dan termasuk ke dalam famili Loranthaceae.

Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih Analisis gravimetri menunjukkan bahwa simplisia daun benalu cengkih memiliki kadar air sebesar 9.14%. Rendemen ekstrak daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut dapat dilihat pada Tabel 1. Ekstraksi sampel dengan pelarut air menghasilkan rendemen ekstrak yang lebih tinggi dibandingkan etanol 70%. Rendemen fraksinasi paling tinggi diperoleh melalui penggunaan pelarut etanol. Tabel 1 Rendemen ekstraksi daun benalu cengkih dengan beberapa pelarut Sampel

Rendemen (%)

Ekstrak air Ekstrak etanol Fraksi etanol Fraksi etil asetat Fraksi n-heksana

17.83 16.14 4.65 2.45 0.44

Penapisan Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih dapat dilihat pada Tabel 2. Semua sampel menunjukkan hasil uji negatif terhadap alkaloid dan positif terhadap flavonoid dan triterpenoid. Saponin tidak dijumpai dalam fraksi etil asetat dan n-heksana. Hanya fraksi n-heksana yang tidak mengandung tanin. Tabel 2 Hasil uji kualitatif kandungan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih Kandungan fitokimia

Ekstrak air

Ekstrak etanol

Fraksi etanol

Fraksi etil asetat

Fraksi n-heksana

Alkaloid Dragendrof Meyer Wagner Flavonoid Saponin Tanin Triterpenoid

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + +

+ +

9 Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang dapat dilihat pada Tabel 3. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana mampu mematikan 50% populasi larva udang pada konsentrasi lebih kecil dari 1000 μg/mL. Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak daun benalu cengkih Sampel Ekstrak air Ekstrak etanol Fraksi etanol Fraksi etil asetat Fraksi n-heksana

Nilai LC50 μg/mL 1572.43 1673.72 2157.16 649.13 55.32

Kandungan Senyawa Kimia Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih Kromatografi gas spektrometri massa pirolisis (GC/MS pirolisis) digunakan untuk menganalisis kandungan senyawa aktif dalam sampel fraksi nheksana benalu cengkih. Kromatogram dari hasil analisis GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncakpuncak spektrum yang menunjukkan kandungan senyawa dalam sampel fraksi nheksana (Tabel 4). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan terbesar dalam sampel fraksi n-heksana benalu cengkih diikuti dengan asam palmitat dan metil linolenat.

Gambar 1 Kromatogram GC/MS pirolisis fraksi n-heksana benalu cengkih

10 Tabel 4 Kandungan senyawa dalam fraksi n-heksana benalu cengkih Waktu Konsentrasi Puncak retensi Nama senyawa (%) (menit) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1.975 2.626 13.919 14.293 15.226 15.580 16.708 17.540 18.134 18.456 19.272 19.368 19.615 19.684 19.792 20.436 22.117 22.315

2.94 3.28 1.31 0.33 2.31 1.56 0.33 0.35 1.02 19.00 8.77 5.45 18.04 10.77 0.92 0.83 19.56 0.67

19 20

22.606 26.050

0.52 2.03

Etanol Kloroform 2,6-Dimetoksifenol Metileugenol 2,4-Di-tert-butilfenol Asam laurat Palmitat aldehida Neofitadiena Metil palmitat Asam palmitat Metil oleat Fitol Metil linolenat Asam stearat Etil n-heptadecanoat Methyl trans-9,10-e Dioktil ftalat 1H-Naftol[2,1-b]piran-8(4aH)one,3-etenildekahidro3,4a,7,7,10a-penta Albikanol Gliseril trioktanoat

Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih Pengaruh pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 disajikan pada Gambar 2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro. Jumlah sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tampak menurun seiring peningkatan konsentrasi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih yang diberikan. Aktivitas penghambatan ekstrak tampak berbeda pada kedua sel lestari kanker namun meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak yang digunakan (Tabel 5). Perlakuan dengan pemberian fraksi n-heksana secara nyata (p<0.05) mampu menghambat pertumbuhan kedua sel dibandingkan dengan kontrol negatif. Fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih konsentrasi 125 μg/mL mampu menghambat 2.9% lebih tinggi sel lestari kanker MCM-B2 dibandingkan dengan kontrol positif (doksorubisin). Terdapat lebih dari sepertiga sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 yang terhambat dengan pemberian fraksi nheksana pada konsentrasi 125 μg/mL.

11 100

Pertumbuhan sel (%)

90 80 70

60 50 40 30 20 10 0 25

50 75 100 125 Konsentrasi fraksi n-heksana (μg/mL)

Dox

Gambar 2 Penurunan sel lestari kanker K562 ( ) dan MCM-B2 ( ) setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih

Tabel 5 Aktivitas penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 setelah pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih Aktivitas penghambatan (%) Konsentrasi μg/mL K562 MCM-B2 0 25 50 75 100 125 Do 100 μg/mL

0a 15.52b 15.93b 20.76b 34.75c 38.69c 60.90d

0a 12.75b 23.99c 33.39d 34.85d 41.50e 38.59d

Keterangan : huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (p<0.05) pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).

4 PEMBAHASAN Identitas Benalu Cengkih Determinasi tumbuhan dilaksanakan untuk menetapkan identitas suatu tumbuhan. Determinasi dalam penelitian ini penting dilakukan untuk menentukan dan memastikan jenis (spesies) benalu cengkih. Hal ini dikarenakan suatu jenis benalu dapat tumbuh pada beberapa inang yang berbeda atau beberapa spesies benalu yang berbeda dapat tumbuh pada inang yang sama (Artanti et al. 2012).

12 Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menetapkan identitas tumbuhan ialah dengan mencocokkan sampel tumbuhan dengan spesies herbarium yang telah dideterminasi. Determinasi benalu cengkih pada penelitian ini dilakukan dengan mengirimkan sampel daun ke Herbarium Bogoriense, Puslit Biologi, LIPI Cibinong Bogor. Herbarium Bogoriense dipilih sebagai lembaga yang melakukan determinasi karena koleksinya yang lengkap dan lokasi yang relatif dekat dengan tempat pelaksanaan penelitian. Dendrophthoe pentandra (L.) Miq merupakan salah satu jenis benalu yang banyak dijumpai hidup pada berbagai tanaman di Indonesia (Marvibaigi et al. 2014). Dendrophthoe pentandra (L.) Miq selain dijumpai pada tanaman cengkih juga dilaporkan hidup pada tumbuhan inang lobi-lobi (Fajriah et al. 2007), teh, kepel, kedondong, srikaya (Artanti et al. 2012), sirsak (Daniel et al. 2012), kapuk (Gamal & Septananda 2013), langsat (Tristanti et al. 2013), dan mangga (Wicaksono & Permana 2013).

Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun Benalu Cengkih Penentuan kadar air simplisia daun benalu cengkih yang telah dikeringkan bertujuan mengoreksi rendemen ekstrak yang diperoleh. Hasil pengukuran dengan analisis gravimetri diketahui simplisia daun benalu cengkih mengandung kadar air 9.14%. Hasil tersebut menunjukkan simplisia telah memenuhi syarat kadar air simplisia kurang dari 10% (BPOM 2014) sehingga dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme dan dapat disimpan dalam jangka waktu lebih lama. Kadar air yang rendah juga dapat mencegah berubahnya kandungan fitokimia sampel menjadi produ lain yang berbeda efe fama ologinya a’mun et al. 2006). Rebusan daun benalu cengkih dilaporkan telah digunakan oleh masyarakat untuk terapi kanker (Puro 2012). Simplisia daun benalu cengkih pada penelitian ini diekstraksi dengan pelarut air menggunakan metode refluks untuk menguji bioaktivitas rebusan daun benalu cengkih. Simplisia juga diekstraksi dengan pelarut etanol 70% menggunakan metode maserasi. Etanol 70% dipilih sebagai pelarut untuk ekstraksi daun benalu cengkih karena sifatnya yang relatif aman, dan mampu menyari senyawa aktif dalam simplisia. Maserasi dipilih sebagai metode ekstraksi benalu cengkih karena tidak menggunakan suhu tinggi dalam proses ekstraksinya sehingga tidak akan merusak senyawa aktif yang terkandung dalam simplisia. Metode ini juga lebih sederhana, mudah dilakukan, dan murah dibandingkan dengan sokletasi dan perkolasi. Ekstraksi sampel dengan pelarut air dan etanol 70% masing-masing menghasilkan rendemen ekstrak 17.83% dan 16.14% (Tabel 1). Ekstraksi dengan pelarut air menghasilkan rendemen lebih tinggi daripada etanol 70%. Air diketahui bersifat lebih polar dibandingkan dengan etanol. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia daun benalu cengkih bersifat polar sehingga lebih banyak tersari dengan pelarut air. Ekstrak etanol yang diperoleh selanjutnya difraksinasi dengan pelarut polar (etanol), semipolar (etil asetat), dan nonpolar (n-heksana) untuk memisahkan kandungan fitokimia sesuai dengan kepolarannya. Fraksinasi ekstrak etanol dengan pelarut etanol, etil asetat, dan n-heksana masing-masing menghasilkan rendemen sebesar 4.65%, 2.45%, dan 0.44% (Tabel 1). Rendemen

13 fraksi etanol paling tinggi dibandingkan fraksi etil asetat dan n-heksana. Ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia dalam ekstrak etanol bersifat polar. Nilai rendemen ekstrak yang diperoleh selanjutnya dikoreksi dengan hasil analisis kadar air. Rendemen terkoreksi dari ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana daun benalu cengkih berturut-turut adalah 19.62%, 17.77%, 5.12%, 2.70%, dan 0.48%. Rendemen ekstrak yang diperoleh pada penelitian ini rendah diduga karena menggunakan metode maserasi dalam ekstraksinya. Ekstraksi menggunakan maserasi tidak memungkinkan terjadinya sirkulasi pelarut baru secara otomatis dalam penyariannya. Hal ini menyebabkan pelarut jenuh sehingga kemampuan penyarian berkurang dan tidak sempurna (Prasetyorini et al. 2011).

Komponen Fitokimia Ekstrak Daun Benalu Cengkih Uji kualitatif kandungan senyawa fitokimia menunjukkan bahwa daun benalu cengkih yang diambil dari daerah Batanghari-Lampung positif mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid, namun negatif terhadap alkaloid (Tabel 1). Fitrilia et al. (2015) meneliti ekstrak daun benalu cengkih dari Curup-Bengkulu juga melaporkan hasil yang sama. Benalu lobi-lobi juga positif mengandung triterpenoid dan negatif terhadap alkaloid (Fajriah et al. 2007). Hasil berbeda dilaporkan oleh Daniel et al. (2012) yaitu ekstrak benalu sirsak tidak mengandung triterpenoid, namun positif terhadap alkaloid. Hal ini memperkuat pernyataan a’at 2005) dan Marvibaigi et al. (2014) bahwa kandungan fitokimia benalu bervariasi bergantung pada jenis tanaman inang. Hasil penapisan ini menunjukkan bahwa kandungan fitokimia yang terdapat pada masing-masing ekstrak bergantung pada kepolaran ekstrak. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol (polar) mengandung flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid. Fraksi etil asetat (semipolar) mengandung flavonoid, tanin, dan triterpenoid. Fraksi n-heksana hanya mengandung flavonoid dan triterpenoid. Hal ini sesuai dengan pernyataan Artanti et al. (2012) bahwa pelarut yang digunakan untuk ekstraksi akan menentukan kandungan fitokimia ekstrak benalu.

Sitotoksisitas Ekstrak Daun Benalu Cengkih Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk menentukan sifat sitotoksik suatu senyawa atau ekstrak sebelum diuji menggunakan sel lestari kanker (Artanti et al. 2012; Sumakrianti et al. 2013). Sitotoksisitas senyawa atau ekstrak ditentukan berdasarkan respon kematian 50% populasi larva udang (LC50). Suatu ekstrak tumbuhan dianggap toksik terhadap larva udang apabila memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 1000 μg/mL (Meyer et al. 1982). Tingkat toksisitas tersebut menunjukkan potensi aktivitasnya sebagai antikanker. Metode BSLT telah teruji memiliki korelasi yang baik dengan aktivitas sitotoksik menggunakan sel lestari kanker (McLaughlin et al. 1998). Aktivitas sitotoksik ekstrak daun benalu cengkih terhadap larva udang dapat dilihat pada Tabel 2. Ekstrak air, ekstrak etanol, dan fraksi etanol tidak mengindikasikan adanya toksisitas terhadap larva udang karena memiliki nilai LC50 lebih besar dari 1000 μg/mL. Ketiga sampel tersebut diasumsikan tidak berpotensi memiliki aktivitas antikanker sehingga tidak diuji lebih lanjut. Hasil ini

14 sesuai dengan penelitian Artanti et al. (2012) yang menyebutkan bahwa ekstrak air D. pentandra dari inang kepel, kedondong, srikaya, dan teh juga tidak bersifat sitotoksik. Uji BSLT lazim digunakan dalam penapisan pendahuluan untuk deteksi komponen antikanker. Hasil penelitian ini membuktian bahwa air rebusan daun benalu cengkih tidak mengindikasikan adanya potensi antikanker sehingga diduga tidak efektif digunakan untuk pengobatan kanker. Kurang aktifnya air rebusan daun benalu cengkih diduga karena rusaknya kandungan fitokimia akibat penggunaan panas saat ekstraksi. Nilai LC50 ekstrak air dan ekstrak etanol yang lebih besar dari 1000 μg/mL menunjukkan bahwa kedua ekstrak ini relatif aman dikonsumsi untuk manfaat lain misalnya antioksidan. Fitrilia et al. (2015) melaporkan bahwa ekstrak air dan ekstrak etanol daun benalu cengkih memiliki nilai inhibition concentration 50% (IC50) masing-masing 11.39 μg/mL dan 6.82 μg/mL. Aktivitas antioksidan ekstrak air dan ekstrak etanol tersebut tidak berbeda nyata dengan α-tokoferol (IC50 6.08 μg/mL). Adanya aktivitas antioksidan diduga dapat berperan dalam mencegah terjadinya kanker. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana masing-masing pada konsentrasi 649.13 μg/mL dan 55.32 μg/mL mampu mematikan setengah populasi larva udang (Tabel 2). Hal ini mengindikasikan adanya toksisitas kedua fraksi pada larva udang sehingga diduga berpotensi memiliki aktivitas antikanker. Berdasarkan nilai LC50, fraksi n-heksana sebelas kali lebih berpotensi dibandingkan dengan fraksi etil asetat. Fraksi n-heksana diasumsikan memiliki bioaktivitas terbaik sehingga identifikasi kandungan senyawa antikanker dan pengujian aktivitas antiproliferasi pada sel lestari kanker selanjutnya dipertimbangkan hanya dilakukan pada fraksi n-heksana. Aktivitas sitotoksik fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana lebih aktif dibandingkan dengan ekstrak etanol (Tabel 2). Hasil ini sejalan dengan penelitian Pisutthanan et al. (2004) yang menunjukkan bahwa fraksinasi mampu membantu menghilangkan sebagian besar fraksi yang tidak aktif sehingga menghemat waktu dan biaya dalam menemukan senyawa aktif. Kematian larva udang karena pemberian ekstrak benalu cengkih diduga berkaitan dengan kandungan fitokimianya. Hal ini dipastikan dengan tidak adanya larva udang yang mati pada kelompok kontrol sehingga kematian larva udang bukan disebabkan kelaparan atau faktor lainnya. Flavonoid dan triterpenoid pada konsentrasi tertentu bersifat toksik sehingga diduga menjadi penyebab kematian larva udang. Berdasarkan hasil penapisan senyawa fitokimia pada Tabel 1, fraksi nheksana mengandung lebih sedikit senyawa fitokimia dibandingkan fraksi etil asetat namun fraksi n-heksana lebih bersifat sitotoksik daripada fraksi etil asetat. Aktivitas sitotoksik ini diduga karena adanya senyawa aktif lain yang lebih berpotensi sebagai antikanker pada fraksi n-heksana (McLaughlin et al. 1998). Analisis senyawa aktif dengan GC/MS pirolisis pada fraksi n-heksana selanjutnya dilakukan untuk mengungkap dugaan senyawa antikanker lain yang mungkin berperan dalam aktivitas sitotoksik.

15 Senyawa Antikanker Fraksi n-Heksana Daun Benalu Cengkih Senyawa yang berpotensi sebagai antikanker pada fraksi n-heksana diidentifikasi menggunakan GC/MS pirolisis. Hasil analisis GC/MS pirolisis dari fraksi n-heksana berupa kromatogram yang ditunjukkan pada Gambar 1. Terdapat 20 puncak spektrum yang muncul dan tampak saling tumpang tindih. Hal ini diduga karena kondisi ekstrak yang belum murni. Berdasarkan waktu retensinya, teridentifikasi sebanyak 20 senyawa dalam sampel fraksi n-heksana (Tabel 4). Senyawa-senyawa tersebut termasuk ke dalam golongan utama, yaitu fenolik, asam lemak, ester asam lemak, dan diterpen. Hasil analisis GC/MS pirolisis menunjukkan bahwa senyawa dengan kelimpahan terbanyak dalam fraksi n-heksana ialah dioktil ftalat (19.56%) diikuti dengan asam palmitat (19%) dan metil linolenat (18.04%). Dioktil ftalat memiliki kelimpahan tertinggi, namun studi literatur menunjukkan bahwa dioktil ftalat tidak memiliki bioaktivitas. Senyawa golongan asam lemak seperti asam laurat, asam stearat, dan asam palmitat diketahui memiliki sifat antikanker dan senyawa ester asam lemak berperan sebagai antioksidan (Sim et al. 2010). Fitol merupakan senyawa diterpen alkohol asiklik dan biasa dijumpai pada minyak essensial beberapa tanaman aromatik. Fitol diketahui memiliki beberapa bioaktivitas seperti antimikrob, antikanker, dan antiinflamasi (Sermakkani & Thangapandian 2012; Silva et al. 2013). Neofitadiena juga termasuk senyawa golongan diterpen. Penelitian Fajriah et al. (2007) juga melaporkan adanya kandungan neofitadiena pada ekstrak etil asetat benalu lobi-lobi (D. pentandra). Neofitadiena diketahui memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, dan antimikrob (Palic et al. 2002). Penelitian ini berhasil mengungkap adanya kandungan metileugenol pada fraksi n-heksana benalu cengkih (Tabel 4). Metileugenol termasuk komponen penyusun alami dari minyak essensial yang berasal dari tanaman aromatik seperti cengkih (Syzygium aromaticum) (Yi et al. 2015). Ini membuktikan bahwa kandungan benalu dipengaruhi oleh metabolit tanaman inangnya akibat dari sifat semiparasit benalu sehingga bioaktivitas benalu juga bergantung pada tanaman inangnya (Xiao et al. 2008). Senyawa 2,6-Dimetoksifenol dan 2,4-Di-tert-butilfenol termasuk golongan fenolik. 2,4-Di-tert-butilfenol secara struktural berkaitan dengan antioksidan BHA (butylated hydroxyanisole) (Sim et al. 2010) dan memiliki aktivitas antioksidan (Yoon et al. 2006).

Aktivitas Antiproliferasi Fraksi n-Heksana Benalu Cengkih Hasil BSLT dan analisis GC/MS menunjukkan bahwa fraksi n-heksana berpotensi memiliki aktivitas antikanker. Pengujian aktivitas antiproliferasi dilakukan untuk mengonfirmasi kemampuan fraksi n-heksana dalam menghambat pertumbuhan sel lestari kanker secara in vitro. Aktivitas antiproliferasi fraksi n-heksana diuji pada sel lestari kanker leukimia manusia (K562) dan sel kanker payudara anjing (MCM-B2). Nilai LC50 fraksi n-he sana dari BSLT di etahui sebesar 55.32 μg/mL. Nilai ini menjadi dasar dalam penentuan variasi konsentrasi ekstrak dalam pengujian aktivitas antiproliferasi pada sel lestari kanker. Nilai LC50 menjadi

16 konsentrasi tengah dalam seri variasi konsentrasi uji. Variasi konsentrasi sampel yang digunakan ialah 0, 25, 50, 75, 100, dan 125 μg/mL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian fraksi n-heksana daun benalu cengkih secara umum mampu menurunkan pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro (Gambar 2). Perlakuan dengan pemberian fraksi n-heksana secara nyata (p<0.05) mampu menghambat pertumbuhan kedua sel dibandingkan dengan kontrol negatif. Aktivitas penghambatan ekstrak meningkat seiring dengan peningkatan kosentrasi ekstrak yang digunakan namun tampak berbeda pada kedua sel lestari kanker. Hasil ini sesuai dengan penelitian Priosoeryanto et al. (2004) yang menyatakan bahwa aktivitas antikanker ekstrak bergantung pada jenis sel lestari kanker yang digunakan. Aktivitas penghambatan pada sel lestari kanker K562 dengan pemberian fraksi n-heksana konsentrasi 25, 50 dan 75 μg/mL tampa tida berbeda nyata (p>0.05). Aktivitas penghambatan yang tidak berbeda nyata juga tampak pada onsentrasi 100 dan 125 μg/mL. Hal ini diduga arena de atnya rentang konsentrasi uji yang digunakan sehingga antara konsentrasi yang satu dengan lainnya memberikan pengaruh tidak berbeda nyata. Sel lestari kanker K562 merupakan sel blast yang memiliki karakteristik diferensiasi sel sangat rendah (highly undifferentiated) pada seri granulositik dan sulit untuk matang menjadi sel fungsional (Lozzio & Lozzio 1979; Koeffler & Golde 1980). Selanjutnya penelitian Priosoeryanto (1995a) menyatakan bahwa sel lestari kanker MCM-B2 kemungkinan berasal dari sel induk (stem cell) atau sel atipikal sehingga sel-selnya belum terdiferensiasi. Hal ini ditunjukkan dari hasil observasi in vitro sel ini memiliki morfologi dan imunohistokimia yang homogen. Diferensiasi sel ini secara in vivo dapat terjadi dalam beberapa cara, namun diferensiasinya rendah pada kultur sel secara in vitro (Priosoeryanto 1995b). Karakteristik sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 tersebut diduga menjadi penyebab terhambatnya pertumbuhan sel-sel ini sehingga jumlah selnya menurun ketika diganggu pertumbuhannya secara in vitro dengan pemberian fraksi nheksana daun benalu cengkih. Perbedaan aktivitas penghambatan fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih juga diduga disebabkan oleh adanya perbedaan reseptor membran maupun inti sel pada sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Perbedaan reseptor berpengaruh pada jumlah senyawa aktif ekstrak daun benalu cengkih yang mampu terikat pada sel lestari kanker. Semakin banyak tersedia reseptor sel lestari kanker yang mampu mengikat senyawa aktif maka aktivitas penghambatan menjadi tinggi sehingga jumlah sel lestari kanker menurun. Perbedaan reseptor ini juga diduga menyebabkan perbedaan respon sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 terhadap fraksi n-heksana daun benalu cengkih dan doksorubisin. Sebagian besar kandungan fraksi n-heksana daun benalu cengkih adalah asam lemak dan ester asam lemak (Tabel 4). Asam lemak diketahui termasuk salah satu penyusun utama fosfolipid membran sel. Pemberian fraksi n-heksana memperkaya kandungan asam lemak tak jenuh dalam medium pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Hal ini diduga mampu mengubah komposisi membran sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 sehingga meningkatkan fluiditas membran sel. Peningkatan fluiditas diduga mempengaruhi fungsi membran dan reseptor menjadi lebih aktif mengikat senyawa yang berperan sebagai antikanker sehingga pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 menjadi terhambat.

17 Analisis GC/MS pirolisis pada fraksi n-heksana menunjukkan adanya senyawa fitol yang dilaporkan memiliki aktivitas antikanker (Tabel 4). Fitol diduga berperan dalam menghambat proliferasi sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Hal ini karena fitol dilaporkan mampu menginduksi terjadinya kematian sel terprogram (apoptosis) pada sel Huh7 dan HepG2 (Kim et al. 2015). Mekanisme apoptosis oleh fitol terjadi melalui aktivasi caspase-9/3 (Kim et al. 2015). Enzim caspase diketahui berperan penting sebagai perantara utama terjadinya apoptosis (Chang & Yang 2000). Jalur caspase diaktivasi oleh sitokrom c, yaitu protein proapoptosis dalam mitokondria yang pelepasannya diatur oleh famili protein Bcl2 (Bax dan Bad). Jalur caspase ini diawali dengan pengaktifan procaspase 9 menjadi caspase 9. Caspase 9 berperan sebagai inisiator apoptosis yang akan mengaktivasi caspase 3 sebagai efektor apoptosis. Caspase 3 selanjutnya bertugas memecah protein penting di dalam sel sehingga memicu terjadinya fragmentasi DNA dan menyebabkan kematian sel lestari kanker (Li et al. 2013). Mekanisme fitol dalam menginduksi terjadinya apoptosis ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3 Mekanisme fitol dalam induksi terjadinya apoptosis (Li et al. 2012)

Metileugenol juga diduga berperan dalam penghambatan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2. Hal ini dikarenakan metileugenol dilaporkan mampu menghambat pertumbuhan dan menginduksi terjadinya apoptosis pada sel HeLa (Yi et al. 2015).

18

5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Fraksi n-heksana ekstrak etanol daun benalu cengkih (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) memiliki aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 sebesar 55.32 μg/mL. Fraksi n-heksana juga menunjukkan aktivitas antiproliferasi terhadap pertumbuhan sel lestari kanker K562 dan MCM-B2 secara in vitro. Aktivitas penghambatan tertinggi dicapai pada pemberian fraksi n-heksana daun benalu ceng ih onsentrasi 125 μg/mL, yaitu sebesar 38.69% 562 dan 41.50% (MCM-B2). Analisis dengan GC-MS pirolisis mengungkap adanya metileugenol dan fitol dalam fraksi n-heksana benalu cengkih yang diketahui berperan sebagai antikanker sehingga benalu cengkih berpotensi dikembangkan sebagai antikanker alami.

Saran Pengujian aktivitas antiproliferasi pada sel normal dan sel lestari kanker lain akan memperkaya informasi bioaktivitas ekstrak benalu cengkih. Pemurnian ekstrak perlu dilakukan untuk memperoleh senyawa yang lebih murni dan berpotensi sebagai antikanker serta penelusuran mekanisme kerja senyawa antikankernya.

DAFTAR PUSTAKA Anita A, Khotimah S, Yanti AH. 2014. Aktivitas antibakteri ekstrak daun benalu jambu air (dendropthoe pentandra (L.) Miq) terhadap pertumbuhan Salmonella typhi. Jurnal Protobiont. 3(2) : 268-272. Artanti N, Firmansyah T, Darmawan A. 2012. Bioactivities evaluation of indonesian mistletoes (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) leaves extracts. JAPS. 2(1) : 24-27. [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2014. Persyaratan mutu obat tradisional. Chang HY, Yang X. 2000. Protease for cell suicide : functions and regulation of caspase. Microbiol Mol Biol Rev. 64:821-846. Daniel, Saleh C, Padin MSL. 2012. Uji bioaktivitas beberapa fraksi dari ekstrak daun benalu sirsak (Dendrophthoe cf. Pentandra [L.] Miq.) yang berasal dari Kalimantan Timur. Mulawarman Sci. 11(1) : 83-93. Dashora N, Sodde V, Bhagat J, Prabhu KS dan Lobo R. 2011. Antitumor activity of Dendrophthoe falcata against Ehrlich Ascites carcinoma In Swiss albino mice. Pharmaceut Crops. 2 : 1-7

19 Fadhli H, Teruna HY, Jose C. 2012. Uji toksisitas ekstrak kulit batang pulai basung (Alstonia spatulata BL) dengan metode brine shrimp lethality test. J Ind Che Acta. 3 (1) : 10-15. Fajriah S, Darmawan A, Sundowo A, Artanti N. 2007. Isolasi senyawa antioksidan dari ekstrak etil asetat daun benalu Dendrophthoe pentandra L. Miq yang tumbuh pada inang lobi-lobi. Jurnal Kimia Indonesia. 2(1):17-20 Fitrilia T, Bintang M, Safithri M. 2015. Phytochemical screening and antioxidant activity of clove mistletoe leaf extract (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) IOSR J Pharm. 5(8):13-18. Gamal, Septananda E. 2013. Potential analysis of cottonwood parasite (Dendropthoe pentandra) stem extract in decreasing of mutant P53 protein expression on cervical cancer cell (HeLa Cells) in vitro. JIMKI. 1(2): 11-15 Garret MD. 2001. Cell cycle control and cancer. Curr Sci. 81(5) : 515-522. Haryanti S, Katno. 2011. Aktivitas sitotoksik Ocimum sanctum L pada sel kanker kolon WiDr. Simposium Nasional XV PERHIPBA Hashimoto T, Vicas S, Suzuki T, Sambongi K, Kanazawa K. 2007. Benalu teh induces apoptosis in jurkat T cells. OCHA. HB-P-702. Kim CW, Lee HJ, Jung JH, Kim YH, Jung DB, Sohn EJ, Lee JH, Woo HJ, Baek NI, Kim YC et al. 2015. Activation of caspase-9/3 and inhibition of epithelial mesenchymal transition are critically involved in antitumor effecr of phytol in hepatocellular carcinoma cells. Phytother Res. 29(7):1026-31. Koeffler HP, Golde DW. 1980. Human myeloid leukemia cell linea : a review. Blood. 56(3) : 344-350. Li Y, Shuai Z, Jiang XG, Xiao YH. 2013. Curcumin inhibits human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation through regulations of Bcl-2/Bax and cytochrome c. Asian Pac J Cancer Prev. 14(8):4599-4, 602. Li Z, Xu X, Huang Y, Ding L, Wang Z, Yu G, Xu D, Li W, Tong D. 2012. Swainsonine Activates Mitochondria-mediated Apoptotic Pathway in Human Lung Cancer A549 Cells and Retards the Growth of Lung Cancer Xenografts. Int J Biol Sci. 8(3):394-405. doi: 10.7150/ijbs.3882 Lozzio BB, Lozzio CB. 1979. Properties adn usefulness of the original K-562 human myelogenous leukemia cell line. Leukemia Res. 3(6):363-370. a’at S. 2005. Tanaman obat untu pengobatan an er bagian 4, tera hir . Jurnal Bahan Alam Indonesia. 4(1) :244-252. a’mun, Suhirman S, Manoi F,. Sembiring BS, Tritianingsih, Sukmasari M, Gani A, Tjitjah, Kustiwa D. 2006. Teknik pembuatan simplisia dan ekstrak purwoceng. [Laporan Pelaksanaan Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik]. 314-324. Marvibaigi M, Supriyanto E, Amini N, Majid FZA, Jaganathan SK. 2014. Preclinical and clinical effect of mistletoe against breast cancer (review article). BioMed Res Int. doi :10.1155/2014/785479. McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Inform Jl. 32 : 513-524 Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. 1982. Brine shrimp : a convenient general bioassay for active plant constituens. J Med Plant Res. 45:31-34.

20 Olaku O, White JD. 2011. Herbal therapy use by cancer patient : a literature review on case report. Eur J Cancer. 47(4) : 508-514. doi:10.1016/j.ejca. 2010.11.018. Palic R, Stojanovic G, Alagic S, Nikolic, Lepojevic Z. 2002. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil and CO2 extracts of the oriental tobacco, Prilep. Flav Frag J. 17(5):323-326. DOI: 10.1002/ffj.1084. Pisutthanan S, Plianbangchang P, Pisutthanan N, Ruanruay S, Muanrit O. 2004. Brine shrimp lethality activity of Thai medicinal plants in the family Meliaceace. Naresuan Univ. J. 12(2):13-18. Prasetyorini, Wiendarlina IY, Peron AB. 2011. Toksisitas beberapa ekstrak rimpang cabang temulawak (Curcumaxanthorrhiza Roxb.) pada larva udang (Artemia salina Leach.). Fitofarmaka. 1(2):14-21. Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K. 1995a. Establishment of a cell line (MCM-B2) from a benign mixed tumour of canine mammary gland. Res Vet Sci. 58 : 272-276. Priosoeryanto BP, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K. 1995b. Transplantation of a cell line derived from a canine benign mixed mammary tumour into nude mice. J Comp Path. 113 : 383-388. Priosoeryanto BP, Gunanti, Huminto H, Sumarny R. 2004. Aktivitas antiproliferasi dan anti-invasi dari ekstrak kloroform dan metanol daun nusa indah putih (Mussaenda philippica) pada sel lestari tumor secara in vitro. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Puro I. 2012. Kajian aktivitas antibakteri daun gatel (Laportea Decumana (ROXB.) WEDD.) dan daun benalu cengkih [Skripsi]. Bogor (ID) : IPB. amadhan H. 2013. nalisis inhibisi enzim α-glukosidase dan sitotoksisitas ekstrak air-etanol benalu jeruk (Loranthus spp.) [Skripsi]. Bogor (ID) : IPB. Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoids : promising anticancer agent. Medicin Res Rev. 23(4) : 519-534. Sermakkani M, Thangapandian V. 2012. GC-MS analysis of Сassia italica leaf methanol extract. Asian J Pharm Clin Res.5(2):90-94. Silva RO, Sousa FBM, Damascenoa SRB, Carvalhoa NS, Silva VNG, Oliveira FRMA, Sousa DP, Araga KS, Barbosa ALR, Freita RM et al. 2013. Phytol, a diterpene alcohol, inhibits the inflammatory response by reducing cytokine production and oxidative stress. Fund Pharmacol. doi: 10.1111/fcp.12049 Sim KS, Sri Nurestri AM, Norhanom AW. 2010. Phenolic content and antioxidant activity of crude and fractionated extracts of Pereskia bleo (Kunth) DC. (Cactaceae). Afr J Pharm Phamacol. 4(5):193-201. Sukmarianti NW, Suaniti NM, Swantara IMD. 2013. Identifikasi dan uji aktivitas antikanker ekstrak spons Ianthella basta terhadap larva Artemia salina L. Cakra Kimia (Indones J App Chem). 1(1):14-19. Suryanto E, Wehantouw F. 2008. Aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak fenol dari benalu cengkih. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 6(5) : 185-188. Tristanti I, Fatimawali, Bodhi W. 2013. Uji efek hepatoprotektor ekstrak etanol daun benalu langsat (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) terhadap kadar malondialdehid (mda) pada hati tikus putih jantan galur wistar yang

21 diinduksi karbon tetraklorida (CCl4). Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT. 2 (3) : 75-78. [WHO] World Health Organization. 2015. Prevalence of cancer worldwide. [Internet]. [diunduh 27 September 2015].Tersedia pada http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/. Wahyuni FS, Lusianti M, Almahdy, Dachriyanus. 2009. Isolasi senyawa sitotoksik terhadap sel kanker payudara dari kulit batang Garcinia griffithii T. Daners. Jurnal Farmasi Indonesia. 4(4) : 177 -187. Wicaksono MH, Permana S. 2013. Potensi fraksi etanol benalu mangga (Dendrophthoe pentandra) sebagai agen anti kanker kolon pada mencit (Mus musculus Balb/c) setelah induksi Dextran Sulvat (DSS) dan Azoxymethane (AOM). Jurnal Biotropika. 1(2) : 75-79. Windarini LGE, Astuti KW, Warditiani NK. 2013. Skrining fitokimia ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.). Jurnal Farmasi Udayana. 1(2) : 1-8. Xiao YJ, Chen YZ, Chen BH, Chen JH, Lin ZX, Fan YL. 2008. Study on cytotoxic activities on human leukemia cell line HL-60 by flavonoids extracts of Scurrula parasitica from four different host trees . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 33(4):427-32. Yi JL, Shi S, Shen YL, Wang L, Chen HY, Zhu J, Ding Y. 2015. Myricetin and methyl eugenol combination enhances the anticancer activity, cell cycle arrest and apoptosis induction of cis-platin against HeLa cervical cancer cell lines. Int J Clin Exp Pathol. 8(2):1116-1127. Yoon MA, Jeong TS, Park DS, Xu MZ, Oh HW, Song KB, Lee WS, Park HY. 2006. Antioxidant effects of quinoline alkaloids and 2,4-di-tertbutylphenol isolated from Scolopendra subspinipes. Biol Pharm Bull. 29: 735-739.

22 Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Daun Benalu Cengkih

Ekstraksi

Refluks

Maserasi

Ekstrak Air

Ekstrak Etanol

Fraksinasi

Uji toksisitas terhadap larva udang (BSLT)

Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi etanol

Ekstrak/fraksi potensial

Identifikasi senyawa dengan GC/MS pirolisis

Uji antiproliferasi terhadap sel lestari kanker

Senyawa antikanker

23 Lampiran 2 Surat pernyataan hasil determinasi jenis benalu cengkih

24 Lampiran 3 Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih Pengujian Alkaloid

Ekstrak

Dragendrof

Meyer

Wagner

Flavonoid

Keterangan : Gambar dari kiri ke kanan = ekstrak etanol 70%, ekstrak air, fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana

25 Lampiran 3 Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun benalu cengkih (lanjutan) Pengujian Ekstrak

Saponin

Tanin

Triterpenoid

Keterangan : Gambar dari kiri ke kanan = ekstrak etanol 70%, ekstrak air, fraksi etanol, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana

26 Lampiran 4 Analisis probit menggunakan SPSS 16.0 untuk menentukan nilai LC50 1.

Ekstrak air Cell Counts and Residuals

PROBIT

Num ber 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Konsen trasi .000 .000 .000 10.000 10.000 10.000 100.000 100.000 100.000 500.000 500.000 500.000 1000.000 1000.000 1000.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 0 0 0 1 2 2 2 2 2 3 3 2 3 3 3

Expected Responses 1.220 1.220 1.220 1.235 1.235 1.235 1.377 1.377 1.377 2.135 2.135 2.135 3.358 3.358 3.358

Residual - 1.220 - 1.220 - 1.220 - .235 .765 .765 .623 .623 .623 .865 .865 - .135 - .358 - .358 - .358

Probability .122 .122 .122 .124 .124 .124 .138 .138 .138 .213 .213 .213 .336 .336 .336

Confidence Limits

PROBIT

Probability 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound -1567.861 -9170.081 -666.478 -1199.885 -7390.258 -453.899 -966.415 -6263.072 -316.969 -790.786 -5416.852 -212.245 -647.924 -4730.155 -125.422 -526.327 -4147.348 -49.842 -419.710 -3638.151 18.238 -324.247 -3184.249 81.219 -237.427 -2773.779 140.832 -157.509 -2398.709 198.475 173.371 -914.014 505.328 436.344 -26.683 1041.862 661.952 338.79 1897.933 864.555 527.506 2806.213 1052.297 666.282 3683.960 1230.445 784.890 4529.934 1402.806 893.484 5354.585 1572.434 996.909 6169.608 1742.062 1098.160 6986.804 1914.422 1199.543 7818.665 2092.571 1303.216 8679.574 2280.312 1411.590 9587.725 2482.915 1527.798 10568.506 2708.523 1656.531 11661.323 2971.496 1805.930 12935.788

27 Confidence Limits (lanjutan)

PROBIT

2.

Probability 0.9 0.91 0.92 0.93 0.94 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound 3302.377 1993.187 14540.079 3382.294 2038.322 14927.657 3469.114 2087.320 15348.743 3564.577 2141.158 15811.787 3671.194 2201.243 16328.979 3792.791 2269.721 16918.889 3935.653 2350.112 17612.018 4111.283 2448.862 18464.213 4344.752 2580.015 19597.175 3272.189 2194.766 8831.423

Ekstrak etanol Cell Counts and Residuals

PROBIT

Num ber 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Konsen trasi .000 .000 .000 10.000 10.000 10.000 100.000 100.000 100.000 500.000 500.000 500.000 1000.000 1000.000 1000.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 2 2

Expected Responses .074 .074 .074 .077 .077 .077 .110 .110 .110 .438 .438 .438 1.634 1.634 1.634

Residual -.074 -.074 -.074 -.077 -.077 -.077 -.110 .890 -.110 -.438 .562 -.438 -.634 .366 .366

Probability .007 .007 .007 .008 .008 .008 .011 .011 .011 .044 .044 .044 .163 .163 .163

Confidence Limits

PROBIT

Probability 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

0.07 0.08 0.09 0.1 0.15 0.2

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound 75.248 262.555 381.396 470.795 543.514 605.409 659.679 708.272 752.465 793.144 961.569 1095.427

-1246.843 -696.086 -361.988 -125.518 51.960 188.679 295.633 380.574 449.280 506.032 692.853 808.923

396.738 541.806 649.188 744.825 837.491 930.707 1025.361 1120.936 1216.402 1310.770 1749.628 2130.828

28 Confidence Limits (lanjutan)

PROBIT

3.

Probability 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.91 0.92 0.93 0.94 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound 1210.266 1313.395 1408.959 1499.640

897.303 971.56 1037.575 1098.470

2469.062 2777.914 3066.913 3342.888

1587.375 1673.719 1760.062 1847.797 1938.478 2034.042 2137.171 2252.010 2385.868 2554.293 2594.972 2639.165 2687.758 2742.028 2803.923 2876.642 2966.041 3084.882 3272.189

1156.198 1212.142 1267.413 1323.027 1380.041 1439.709 1503.711 1574.595 1656.808 1759.757 1784.554 1811.467 1841.028 1874.010 1911.586 1955.681 2009.823 2081.693 2194.766

3611.085 3875.900 4141.387 4411.699 4691.555 4986.898 5306.008 5661.737 6076.794 6599.524 6725.848 6863.107 7014.061 7182.687 7375.047 7601.095 7879.061 8248.670 8831.423

Fraksi etanol Cell Counts and Residuals

PROBIT

Num ber 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Konsen trasi .000 .000 .000 10.000 10.000 10.000 100.000 100.000 100.000 500.000 500.000 500.000 1000.000 1000.000 1000.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1

Expected Responses .090 .090 .090 .092 .092 .092 .120 .120 .120 .345 .345 .345 1.021 1.021 1.021

Residual -.090 -.090 -.090 -.092 -.092 -.092 -.120 -.120 .880 -.345 -.345 .655 -.021 -.021 -.021

Probability .009 .009 .009 .009 .009 .009 .012 .012 .012 .034 .034 .034 .102 .102 .102

29 Confidence Limits

PROBIT

4.

Probability 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.91 0.92 0.93 0.94 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound 37.177 -7242.812 443.766 285.594 -3942.089 670.906 443.206 -1964.133 931.266 561.772 -718.071 1369.001 658.216 -70.568 2091.139 740.305 225.479 2960.870 812.281 381.821 3826.687 876.727 481.208 4642.523 935.338 553.052 5403.036 989.290 553.052 6112.823 1212.663 793.063 9101.429 1390.194 912.736 11502.935 1542.499 1007.331 13571.286 1679.274 1088.602 15432.408 1806.016 1161.856 17159.070 1926.282 1230.059 18798.812 2042.641 1295.135 20386.191 2157.155 1358.501 21949.082 2271.669 1421.331 23512.510 2388.028 1484.729 25101.568 2508.294 1549.872 26744.369 2635.036 1618.175 28475.982 2771.811 1691.556 30344.994 2924.117 1772.937 32426.560 3101.647 1867.438 34853.237 3325.021 1985.904 37906.988 3378.973 2014.456 38644.623 3437.584 2045.450 39445.986 3502.030 2079.503 40327.155 3574.006 2117.504 41311.314 3656.095 2160.807 42433.790 3752.539 2211.635 43752.601 3871.105 2274.060 45373.974 4028.717 2356.947 47529.403 4277.134 2487.397 50926.815

Fraksi etil asetat Cell Counts and Residuals

PROBIT

Num ber 1 2 3 4 5 6 7 8

Konsen trasi .000 .000 .000 10.000 10.000 10.000 100.000 100.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 0 0 0 0 1 0 3 1

Expected Responses .865 .865 .865 .899 .899 .899 1.246 1.246

Residual -.865 -.865 -.865 -.899 .101 -.899 1.754 -.246

Probability .087 .087 .087 .090 .090 .090 .125 .125

30 Cell Counts and Residuals (lanjutan)

PROBIT

Num ber 9 10 11 12 13 14 15

Konsen trasi 100.000 500.000 500.000 500.000 1000.000 1000.000 1000.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 3 5 6 4 6 6 9

Expected Responses 1.246 3.771 3.771 3.771 7.693 7.693 7.693

Residual 1.754 1.229 2.229 .229 -1.693 -1.693 1.307

Probability .125 .377 .377 .377 .769 .769 .769

Confidence Limits

PROBIT

Probability 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.91 0.92 0.93 0.94 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound -459.285 -856.057 -233.400 -329.402 -674.901 -129.479 -246.996 -560.615 -62.891 -185.005 -475.092 -12.351 -134.580 -405.881 29.115 -91.661 -347.276 64.714 -54.029 -296.163 96.199 -20.334 -250.646 124.639 10.311 -209.485 150.738 38.519 -171.819 174.986 155.308 -18.770 278.276 248.128 98.298 364.938 327.759 194.243 443.776 399.271 276.080 518.899 465.537 347.940 592.486 528.417 412.654 665.786 589.254 472.354 739.617 649.127 528.726 814.660 708.999 583.165 891.634 769.836 636.903 971.427 832.716 691.136 1055.209 898.982 747.172 1144.619 970.494 806.657 1242.095 1050.125 871.981 1351.553 1142.946 947.217 1480.047 1259.735 1040.878 1642.726 1287.943 1063.370 1682.147 1318.587 1087.757 1725.021 1352.282 1114.519 1772.216 1389.914 1144.348 1824.985 1432.833 1178.300 1885.236 1483.258 1218.107 1956.108 1545.249 1266.935 2043.343 1627.656 1331.686 2159.465 1757.538 1433.444 2342.784

31 5.

Fraksi n-heksana Cell Counts and Residuals

PROBIT

Num ber 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Konsen trasi .000 .000 .000 10.000 10.000 10.000 100.000 100.000 100.000 500.000 500.000 500.000 1000.000 1000.000 1000.000

Number of Subjects 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Observed Responses 0 0 0 4 4 4 8 8 7 10 10 10 10 10 10

Expected Responses 1.636 1.636 1.636 2.111 2.111 2.111 7.856 7.856 7.856 10.000 10.000 10.000 10.000 10.000 10.000

Residual -1.636 -1.636 -1.636 1.889 1.889 1.889 .144 .144 -.856 .000 .000 .000 .000 .000 .000

Probability .164 .164 .164 .211 .211 .211 .786 .786 .786 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Confidence Limits

PROBIT

Probability 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.91 0.92 0.93 0.94

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound -76.033 -147.318 -41.666 -60.641 -123.271 -29.991 -50.875 -108.085 -22.513 -43.529 -96.709 -16.839 -37.553 -87.493 -12.187 -32.467 -79.680 -8.195 -28.007 -72.858 -4.667 -24.014 -66.776 -1.483 -20.382 -61.268 1.437 -17.039 -56.221 4.148 -3.199 -35.623 15.671 7.801 -19.735 25.311 17.238 -6.610 34.087 25.713 4.635 42.510 33.566 14.489 50.881 41.017 23.271 59.393 48.227 31.228 68.168 55.323 38.574 77.289 62.418 45.500 86.830 69.628 52.183 96.878 77.079 58.794 107.561 84.932 65.510 119.070 93.407 72.540 131.709 102.844 80.170 145.979 113.844 88.874 162.804 127.684 99.622 184.176 131.027 102.192 189.364 134.659 104.976 195.009 138.652 108.026 201.226 143.112 111.421 208.180

32 Confidence Limits (lanjutan)

PROBIT

Probability 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

95% Confidence Limits for Konsentrasi Estimates Lower Bound Upper Bound 148.198 115.281 216.125 154.174 119.799 225.474 161.520 125.335 236.988 171.286 132.665 252.323 186.678 144.164 276.545

33 Lampiran 5 Analisis statistika menggunakan SPSS 16.0 1. Sel lestari kanker K562 ANOVA

Jumlah_sel

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 40644.381 25084.889 65729.270

df 6 56 62

Mean Square 6774.063 447.944

F 15.123

Sig. .000

Jumlah_sel Duncan Kons Subset for alpha = 0.05 entra si N 1 2 3 4 150 9 54.0000 125 9 84.6667 100 9 90.1111 90.1111 75 9 1.0944E2 1.0944E2 50 9 1.1611E2 25 9 1.1667E2 0 9 Sig. 1.000 .587 .058 .500 Means for groups in homogeneous subsets are displayed

2.

5

1.3811E2 1.000

Sel lestari kanker MCM-B2 ANOVA

Jumlah_sel

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 49223.937 13387.778 62611.714

df 6 56 62

Mean Square 8203.989 239.067

F 34.317

Sig. .000

Jumlah_sel Duncan Kons Subset for alpha = 0.05 entra si N 1 2 3 4 125 9 1.1622E2 150 9 1.2200E2 1.2200E2 100 9 1.2944E2 1.2944E2 75 9 1.3233E2 50 9 1.5100E2 25 9 1.7333E2 0 9 Sig. .091 .187 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed

5

1.9867E2 1.000

34

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Desa Banarjoyo Kecamatan Batanghari, Lampung Timur, pada tanggal 10 Agustus 1989. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara, dari pasangan Maryoto dan Rukidah. Penulis menempuh pendidikan sarjana di Program Studi Pendidikan Kimia, Jurusan Pendidikan MIPA, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan (FKIP) Universitas Lampung dan lulus tahun 2011. Penulis sempat bekerja sebagai staf pengajar kimia di SMK Muhammadiyah Sekampung Lampung Timur dan IPA Terpadu di SMP Muhammadiyah Sekampung Lampung Timur. Tahun 2013, penulis diterima sebagai mahasiswa pascasarjana di Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut pertanian Bogor. Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN) diperoleh dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Dirjen Dikti). Artikel bagian dari arya ilmiah ini dengan judul “Cytotoxicity and antiproliferation activity assay of clove mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) leaves extracts” telah disubmit dan sedang dalam penelaahan (review) di Jurnal Advances in Pharmacological Sciences saat karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.