EKSTRAK DAUN BENALU CENGKEH (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2015 Tiana Fitrilia NIM G851130341
RINGKASAN TIANA FITRILIA. Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI. Benalu merupakan tumbuhan semi parasit yang memiliki banyak aktivitas biologis seperti antioksidan, antikanker, antidiabetes dan hipertensi. Dendrophthoe pentandra (L.) Miq merupakan salah satu spesies benalu di Indonesia yang dapat tumbuh diberbagai tanaman inang. Penelitian ini bertujuan mengetahui ekstrak paling aktif dari daun benalu cengkeh sebagai agen antioksidan dan antidiabetes secara in vitro serta untuk mengidentifikasi senyawa aktif menggunakan LC-MS/MS. Aktivitas antioksidan diukur menggunakan uji penangkapan radikal bebas DPPH dan aktivitas antidiabetes diukur menggunakan uji penghambatan enzim α-glukosidase. Sampel yang diuji meliputi ekstrak air, ekstrak etanol 70 %, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Kadar air yang diperoleh dari serbuk daun benalu cengkeh adalah 8 %. Hal ini menunjukkan bahwa serbuk daun benalu cengkeh dapat disimpan dalam jangka waktu lama. Serbuk daun kemudian diekstraksi dengan pelarut air dan etanol 70 % menghasilkan rendemen sebesar 26.3 % dan 23.5 %. Ekstrak etanol 70 % yang diperoleh difraksinasi dengan pelarut yang berbeda kepolaran yaitu nheksana dan etil asetat. Rendemen hasil fraksinasi yang diperoleh untuk fraksi nheksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol secara berturut-turut adalah 0.9 %, 7.1 % dan 6.8 %. Uji fitokimia menunjukkan bahwa semua sampel positif mengandung senyawa tanin dan flavonoid tetapi tidak mengandung alkaloid. Kandungan total fenol paling tinggi terdapat pada fraksi etil asetat yaitu 358.4 mg GAE/ g sampel. Semua sampel yang diuji memiliki aktivitas antioksidan dan antidiabetes. Aktivitas antioksidan yang tinggi ditunjukkan oleh ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi etil asetat sedangkan aktivitas antidiabetes paling tinggi ditunjukkan oleh ekstrak etanol 70 % dengan IC50 129.7 µg/mL dan memiliki jenis penghambatan nonkompetitif campuran. Analisis senyawa aktif menggunakan LC-MS/MS menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70 % daun benalu cengkeh mengandung tiga senyawa berdasarkan kelimpahan paling tinggi yaitu dengan bobot molekul 700.73 (m/z), 678.59 (m/z) dan 58.08 (m/z). Kata kunci: antidiabetes, antioksidan, daun benalu cengkeh, DPPH, LC-MS/MS α-glukosidase
SUMMARY TIANA FITRILIA. Clove Mistletoe Leaf Extracts (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) as an Antioxidant and Antidiabetes Agent In Vitro. Supervised by MARIA BINTANG and MEGA SAFITHRI. Mistletoe is a semi-parasitic plant that has many biological activities such as antioxidant, anticancer, antidiabetes and hypertension. Dendrophthoe pentandra (L.) Miq is one of the mistletoe species in Indonesia that can grew in various host plants. This study was conducted the most active extracts of clove mistletoe leaf as an antioxidant and antidiabetes in vitro as well as to identified of active compounds using LC-MS/MS. Antioxidant activity was measured using DPPH free radical scavenging assay and antidiabetes activity was measured using inhibition of α-glucosidase assay. Samples were tested include water and ethanol 70 % extracts as well as n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions. The moisture content of clove mistletoe leaf powder in the test was 8 %. This suggest that the clove mistletoe leaf powder can be stored for long periods. Than, the leaf powder was extracted with solvent of water and ethanol 70 % has a yield of 26.3 % and 23.5 %. The ethanol extract further fractionated with a solvent which has a different polarity, i.e. n-hexane and ethyl acetate. The yield of fractionation results for n-hexane, ethyl acetate and ethanol fractions were 0.9 %, 7.1 % and 6.8 %, respectively. Phytochemical test showed that all of the samples containing tannins and flavonoids but not for alkaloids. The highest total phenolic content was in ethyl acetate is 358.4 mg GAE/g sample. All samples tested had an antioxidant and antidiabetes activities. The best antioxidant activity was in water and ethanol extracts as well as ethyl acetate fraction while the highest antidiabetes activity was shown by ethanol 70 % extract with IC50 129.7 µg/mL and exhibited mixed-noncompetitive inhibition. Analysis of active compound using LC-MS/MS showed that ethanol 70 % extract of clove mistletoe leaf was containing three compounds based on the highest abundance with molecular weight 700.73 (m/z), 678.59 (m/z) and 58.08 (m/z). Keywords: antidiabetes, antioxidant, clove mistletoe leaf, DPPH, LC-MS/MS, α-glucosidase
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EKSTRAK DAUN BENALU CENGKEH (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) SEBAGAI AGEN ANTIOKSIDAN DAN ANTIDIABETES SECARA IN VITRO
TIANA FITRILIA
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Judul Tesis : Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro Nama : Tiana Fitrilia NIM : G851130341
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Maria Bintang, MS Ketua
Dr Mega Safithri, SSi MSi Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 11 Agustus 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul karya ilmiah dalam penelitian yang dilaksanakan sejak Januari sampai dengan Mei 2015 ini ialah Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) sebagai Agen Antioksidan dan Antidiabetes secara In Vitro. Ucapan terima kasih kepada Prof Dr drh Maria Bintang, MS dan Dr Mega Safithri, S.Si M.Si selaku pembimbing atas ilmu, saran dan kesabaran yang telah diberikan. Terima kasih juga kepada keluarga besar Biokimia (Dosen, Staff TU, Laboran dan teman-teman Biokimia 2013) yang telah memberikan motivasi dan membantu penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) sebagai sponsor Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri 2013. Ucapan spesial kepada kedua orang tua, adinda Bio, Gema dan Tirta yang selalu memberikan do’a dan dukungannya serta kepada anggota BSL IPB 2013 terima kasih atas persaudaraan yang telah diberikan kepada penulis. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015 Tiana Fitrilia
DAFTAR ISI 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian
1 1 2 2 2 2
2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Alat Prosedur Penelitian Analisis Data
3 3 3 3 3 6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan
7 7 11
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
19 19 19
DAFTAR PUSTAKA
20
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
32
DAFTAR TABEL 1. 2. 3. 4.
Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh Aktivitas antioksidan sampel daun benalu cengkeh Inhibisi enzim α-glukosidase
6 7 9 9
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7
Perbandingan kandungan total fenol sampel Plot Lineweaver-Burk pada uji kinetika enzim Mekanisme efek biologis senyawa polifenol Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antioksidan Struktur dasar flavonoid Mekanisme antioksidan dalam meredam radikal bebas Reaksi hidrolisis substrat oleh α-glukosidase
8 10 13 14 15 15 16
DAFTAR LAMPIRAN 1. Diagram alir penelitian 2. Kurva standar asam galat 3. Kurva Michaelis-Menten 4. Spektrum LC-MS/MS ekstrak etanol 70 % 5. Hasil uji analisis statistik total fenol sampel 6. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 antioksidan sampel 7. Hasil uji analisis statistik nilai IC50 inhibisi α-glukosidase
25 26 27 28 29 30 31
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Diabetes melitus (DM) adalah sindrom metabolik yang ditandai dengan tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia) karena gangguan produksi, sekresi atau resistensi insulin. Badan Kesehatan Dunia, World Health Organization (WHO) memperkirakan 150 juta penduduk dunia menderita diabetes dan akan mengalami kenaikan dua kali lipat pada tahun 2025 (WHO 2014). Jumlah penderita diabetes didominasi oleh pasien penderita DM tipe II dan prevalensinya tumbuh pada tingkat yang mengkhawatirkan (Perla dan Jayanty 2013). Data dari International Diabetes Federation (IDF), Indonesia diketahui sebagai salah satu negara dengan prevalensi DM tinggi menempati urutan ketujuh sebagai negara penderita DM terbesar setelah Cina, India, USA, Brazil, Rusia dan Meksiko (IDF 2013). Prevalensi diabetes di Indonesia tahun 2013 yang terdiagnosis diabetes sebesar 1.5 %. Prevalensinya meningkat sesuai dengan bertambahnya umur, namun cenderung menurun pada usia ≥ 65 (Kemenkes RI 2013). Hiperglikemia terlibat dalam pembentukan radikal bebas dengan mempercepat pembentukan senyawa oksigen reaktif (Patel et al. 2011). Senyawa oksigen reaktif dapat merusak sel β-pankreas dan dapat meningkatkan modifikasi lipid, DNA serta protein pada berbagai jaringan (Ueno et al. 2002; Patel et al. 2011). Adanya modifikasi molekuler menginisiasi terjadinya kerusakan oksidatif yang dikenal sebagai stres oksidatif (Setiawan dan Suhartono 2005). Stres oksidatif dapat menurunkan sekresi insulin oleh sel β-pankreas dan berperan dalam perkembangan komplikasi seperti ginjal, mata, pembuluh darah dan kerusakan saraf (Patel et al. 2011). Memperbaiki stres oksidatif adalah strategi yang efektif untuk menurunkan kadar glukosa darah dan komplikasinya. Kerusakan oksidatif tersebut dapat diredam dengan pemberian senyawa antioksidan (Setiawan dan Suhartono 2005). Pemberian antioksidan pada hewan uji dapat menghambat tahap awal nefropati dan neuropati (Ueno et al. 2002) sedangkan pada manusia dapat menghambat komplikasi mikrovaskuler, perbaikan sistem saraf otonom jantung dan perbaikan vasodilatasi (Beckman et al. 2001). Berbagai pengobatan diabetes telah banyak dilakukan. Salah satunya dengan pemberian obat sintetis, namun pengobatan ini dapat menimbulkan efek samping seperti kembung, diare dan kejang perut (Lee et al. 2007). Oleh karena itu, penggunaan tanaman herbal sebagai obat tradisional menjadi penting dalam pengobatan penyakit diabetes. Menurut Wu et al. (2014), terapi diabetes dapat dilakukan dengan pemberian senyawa antioksidan dan melalui mekanisme inhibisi enzim penghidrolisis karbohidrat seperti α-glukosidase pada organ pencernaan. Inhibisi α-glukosidase dapat menunda penyerapan glukosa sehingga dapat menekan kadar glukosa postprandial (Ping et al. 2010; Lee et al. 2014). Penggunaan tanaman herbal telah banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan sandang, pangan, kosmetik maupun obat. Tanaman benalu merupakan salah satu tanaman herbal yang manfaatnya belum diketahui secara luas. Menurut Artanti et al. (2003), benalu merupakan tumbuhan semi parasit yang memiliki banyak spesies bergantung pada tumbuhan inang tempat benalu itu tumbuh. Tumbuhan ini terdiri atas dua suku yaitu suku Loranthaceae
2 dan Viscaceae (Uji dan Samiran 2005). Benalu cengkeh adalah salah satu benalu yang masuk ke dalam suku Loranthaceae. Penelitian yang dilakukan oleh Suryanto dan Wehantouw (2008), ekstrak etanol benalu cengkeh pada bagian akar, batang, daun dan bunga mengandung komponen fenol, flavonoid dan tanin. Komponen tersebut merupakan metabolit sekunder yang keberadaannya melimpah di tumbuhan, memiliki banyak efek biologis termasuk aktivitas antioksidan dan dapat menghambat berbagai perkembangan penyakit kronis (Yao et al. 2013; Lee et al. 2014). Berdasarkan hal tersebut, adanya kandungan metabolit sekunder pada daun benalu cengkeh diduga berperan sebagai agen antioksidan dan antidiabetes melalui inhibisi enzim α-glukosidase. Sejauh ini belum dilaporkan adanya pengaruh jenis pelarut dalam mengekstrak metabolit sekunder serta pengujian terhadap senyawa aktif dari daun benalu cengkeh.
Perumusan Masalah Diabetes melitus membutuhkan penanganan secara tepat untuk menurunkan kadar glukosa darah dan mencegah terjadinya komplikasi. Hiperglikemia terlibat dalam pembentukan senyawa oksigen reaktif yang dapat merusak sel β pankreas dan mengganggu kesetimbangan antioksidan dalam tubuh. Selama ini, penggunaan obat sintetik sering menimbulkan efek samping seperti kembung, diare dan kejang perut. Oleh karena itu, pemanfaatan daun benalu cengkeh menjadi alternatif untuk pengobatan diabetes melalui inhibisi α-glukosidase.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menentukan ekstrak daun benalu cengkeh paling aktif sebagai agen antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak terpilih dari uji antidiabetes digunakan untuk menentukan kinetika inhibisi enzim dan identifikasi senyawa aktif menggunakan LC-MS/MS.
Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah tentang pemanfaatan daun benalu cengkeh sebagai agen antioksidan dan antidiabetes serta senyawa aktif yang terlibat didalamnya.
Ruang Lingkup Penelitian Lingkup kegiatan penelitian meliputi ekstraksi daun benalu cengkeh dengan pelarut air dan etanol 70 %. Ekstrak etanol 70 % difraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Sampel hasil ekstraksi dan fraksinasi dilakukan pengujian secara in vitro terhadap aktivitas antioksidan dan antidiabetes. Ekstrak paling aktif dalam menginhibisi α-glukosidase dijadikan dasar untuk pengkajian mekanisme inhibisi enzim dan identifikasi senyawa menggunakan LC-MS/MS.
3
2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2014 sampai Mei 2015. Penelitian dikerjakan di laboratorium Biokimia IPB dan Pusat Studi Biofarmaka.
Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu cengkeh (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) yang diperoleh dari daerah CurupBengkulu, etanol p.a, etanol 70 %, n-heksana, etil asetat, asam galat, metanol, reagen Folin-Ciocalteu, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), enzim α-glukosidase yang berasal dari rekombinan Bacillus stearothermophilus (Sigma G3651-250UN, Jerman), substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) (Sigma Aldrich, USA), dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), akarbose dan α-tokoferol.
Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven, corong pisah, evaporator, spektrofotometer (Hitachi tipe U-2800), pH meter (Eutech Instruments), vortex mixer (BI type 37600 mixer), microplate reader (Biotek Epoch) dan LC-MS/MS (QMicro QAA 842).
Prosedur Penelitian Preparasi Sampel Daun benalu cengkeh dideterminasi di Herbarium Bogoriense-LIPI, Bogor, Indonesia. Daun yang digunakan dimulai dari daun yang terletak pada lembar keempat dari pucuk ke arah daun yang lebih tua. Selanjutnya daun benalu cengkeh dikeringkan dan dihaluskan sampai berbentuk serbuk berukuran 40 mesh.
Penentuan Kadar Air Daun Benalu Cengkeh (SNI 01-3182-1992) Kadar air serbuk daun benalu cengkeh ditentukan dengan cara pengeringan di dalam oven. Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang dengan neraca analitik. Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 °C selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit kemudian ditimbang. Pemanasan diulang sampai diperoleh bobot konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan : Kadar air (%) =
4 Dengan : a = bobot contoh sebelum pemanasan (g) b = bobot contoh setelah pemanasan (g) Ekstraksi Daun Benalu Cengkeh (Harjadi 1993; Puro 2012) Ekstraksi daun benalu cengkeh dilakukan dengan metode perebusan dan maserasi. Perbandingan serbuk daun benalu cengkeh dengan pelarut adalah 1:10. Ekstraksi melalui perebusan dilakukan dengan cara merebus simplisia ke dalam pelarut air selama 2 jam sedangkan maserasi dilakukan dengan cara merendam simplisia ke dalam pelarut etanol 70 %. Maserasi dilakukan selama 24 jam dengan shaker pada kecepatan 150 rpm di suhu ruang. Campuran dipisahkan dan filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator sehingga diperoleh ekstrak air dan ekstrak etanol 70 %. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : Rendemen ekstrak (%) = Fraksinasi Ekstrak secara Ekstraksi Cair-cair (Kim et al. 2008) Ekstrak etanol 70 % selajutnya difraksinasi secara ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut dengan kepolaran yang semakin meningkat, yaitu pelarut nheksana (non polar) dan etil asetat (semi polar). Sebanyak 20 gram ekstrak etanol 70 % daun benalu cengkeh dilarutkan dalam air hangat 100 mL, dilakukan pengadukan sampai encer dan homogen kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah. Mula-mula difraksinasi dengan pelarut n-heksana sebanyak 100 mL. Campuran dikocok setiap 10 menit sekali sebanyak 3 kali, lalu didiamkan lebih kurang 30 menit untuk mencapai kondisi jenuh, sehingga diperoleh lapisan nheksana dan air. Lapisan n-heksana dipisahkan, kemudian lapisan air difraksinasi dengan etil asetat sebanyak 100 mL, diperoleh lapisan etil asetat dan air. Setelah lapisan etil asetat dipisahkan, lapisan air diuapkan dan ditambahkan pelarut etanol sebanyak 100 mL. Lapisan yang terbentuk dari hasil fraksinasi dipekatkan dengan evaporator. Uji Fitokimia (Farnsworth 1966; Chugh et al. 2012) Uji fitokimia dari ekstrak air, ekstrak etanol 70 % dan fraksi ekstrak etanol meliputi analisis kualitatif tanin, alkaloid, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Uji Tanin. Larutan uji dibuat dengan mereaksikan 10 mg sampel dengan 50 mL air panas, kemudian dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit dan filtrat disaring. Sebanyak 5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan beberapa tetes FeCL3. Terbentuknya warna hijau violet menunjukkan adanya tanin. Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mg ekstrak ditambahkan dengan 1 mL HCl 2N dan 9 mL aquades, kemudian dipanaskan selama 2 menit dan didinginkan. Filtrat disaring dan ditampung. Filtrat yang diperoleh merupakan larutan uji untuk pereaksi Meyer, Bouchardart dan Dragendorf. Keberadaan alkaloid dalam sampel ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih atau kuning pada pereaksi Meyer, endapan coklat sampai hitam pada pereaksi Bouchardart dan endapan jingga coklat pada pereaksi Dragendorf. Uji Flavonoid. Sebanyak 10 mg sampel direaksikan dengan 10 mL air kemudian dipanaskan. Campuran dipisahkan dan filtrat diberi serbuk Mg, 1 mL
5 HCl pekat dan 1 mL amil alkohol. Uji positif ditandai dengan munculnya warna pada lapisan amil alkohol. Uji Saponin. Sebanyak 10 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 mL air panas lalu didinginkan. Larutan uji dikocok vertikal selama 10 detik, kemudian diamati selama 10 menit. Terbentuknya buih setinggi 1 – 10 cm menunjukkan adanya saponin dalam sampel. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N buih tidak hilang. Uji Triterpenoid. Sebanyak 10 mg sampel ditambahkan dengan 5 mL larutan eter, kemudian diuapkan dalam cawan penguap. Larutan uji ditambahkan dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (2:1). Terbentuknya warna merah-hijau adanya triterpenoid. Penentuan Kandungan Total Fenol (Lim dan Murtijaya 2007) Sebanyak 300 μL sampel konsentrasi 200 µg/mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1.5 mL reagen Folin-Ciocalteau (1:10) dan 1.2 mL Na2CO3 7.5 %. Campuran diinkubasi di suhu kamar selama 30 menit kemudian absorban diukur menggunakan spektrofotometer pada 765 nm. Asam galat digunakan untuk pembuatan kurva standar. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Salazar et al. 2011) Larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 5, 10, 30, 50, 100 dan 200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate sebanyak 100 μL, ditambahkan dengan etanol p.a 100 μL dan larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) hingga volume 300 μL. Campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang kemudian absorban diukur dengan microplate reader pada 517 nm. αtokoferol digunakan sebagai pembanding dalam menangkap radikal bebas DPPH. Kapasitas penangkapan radikal bebas dihitung sebagai persentase inhibisi terhadap DPPH (persentase “scavenging effect”), yaitu : % inhibisi = *
(
)+
Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi sampel yang diperlukan untuk memberikan % inhibisi sebesar 50%. Uji Aktivitas α-Glukosidase (Sancheti et al. 2009; Sugiwati et al. 2009) Sebanyak 10 μl larutan standar, blanko dan sampel (konsentrasi 200, 500, 800 dan 1200 µg/mL) dimasukkan ke dalam sumur microplate reader dan ditambahkan dengan 50 μL larutan bufer fosfat pH 7. Selanjutnya, sebanyak 25 μl substrat berupa p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) 10 mM ditambahkan tiga menit sebelum uji dimulai. Reaksi diinisiasi dengan penambahan 25 μl enzim α-glukosidase dengan konsentrasi 0.04 U/mL dalam bufer fosfat (pH 7.0) kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μl Na2CO3 200 mM. Hasil reaksi diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 410 nm. Larutan akarbose digunakan sebagai kontrol positif dengan sistem reaksi sama seperti sampel. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Selanjutnya dilakukan perhitungan % inhibisi untuk menentukan nilai IC50. Sistem reaksi dapat diketahui pada Tabel 1.
6 Tabel 1 Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase Volume (μl) Reagen Blanko Kontrol blanko Sampel Kontrol sampel Pelarut 10 10 Sampel 10 10 Bufer 50 50 50 50 Substrat 25 25 25 25 Enzim 25 25 Buffer 25 25 Inkubasi 37°C 30 menit Na2CO3 100 100 100 100 Uji Kinetika Inhibisi α-Glukosidase (Alfarabi 2010) Uji kinetika inhibisi α-glukosidase diukur dengan meningkatkan konsentrasi p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida sebagai substrat yang diperoleh dari kurva Michaelis-Menten. Ekstrak daun benalu cengkeh yang digunakan sebagai penghambat aktivitas enzim merupakan ekstrak paling aktif pada uji inhibisi αglukosidase. Kinetika inhibisi α-glukosidase dipelajari dengan dua sistem reaksi, yaitu sistem reaksi dengan inhibitor dan tanpa inhibitor. Campuran sistem reaksi yang digunakan sama dengan campuran pada inhibisi α-glukosidase. Absorban diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 410 nm. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Analisis Senyawa Aktif Ekstrak Daun Benalu Cengkeh (Blazics et al. 2011) Sampel teraktif pada uji antioksidan dan inhibisi α-glukosidase dianalisis menggunakan Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) dengan tipe QMicro QAA 842. Sampel berupa cairan dimasukkan ke fase gerak yang ada pada kolom LC dengan laju alir 0.2 mL/menit. Temperatur kolom yang digunakan adalah 40 ⁰C dan waktu akhir 35 menit. Pemisahan senyawa kimia terjadi di dalam kolom dengan bantuan pompa. Hasil analisis dengan LC dilanjutkan ke MS untuk mengidentifikasi komponen kimia. Jenis analisis massa yang digunakan adalah quadrupole dengan modus scan selama 5 detik. Spektrum yang diperoleh menunjukkan rasio massa dengan muatan (m/z). Analisis Data (Mattjik 2002) Data dianalisis menggunakan Analyses of Variance (ANOVA) dan diuji lanjut dengan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS Statistics 16.0.
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Kadar Air Serbuk Daun Benalu Cengkeh dan Rendemen Ekstrak Daun benalu cengkeh yang telah dikeringkan dilakukan pengujian terhadap kadar air. Penentuan kadar air bertujuan mengetahui ketahanan simplisia dalam masa penyimpanan. Kadar air yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 8 %. Persentase tersebut menunjukkan bahwa setiap 100 gram bahan mengandung 8 gram air. Ekstrak daun benalu cengkeh diperoleh dengan cara perebusan menggunakan air dan maserasi menggunakan etanol 70 %. Proses ekstraksi diulangi sebanyak lima kali supaya senyawa yang terkandung dalam simplisia dapat tersari lebih optimal. Larutan hasil ekstraksi dievaporasi sampai menjadi ekstrak kering. Hasil ekstraksi berupa rendemen yang merupakan perbandingan antara bobot sampel yang diperoleh dengan bobot awal sampel dikali 100. Rendemen ekstrak yang dihasilkan adalah 26.3 % untuk ekstrak air dan 23.4 % untuk ekstrak etanol 70 %. Ekstrak etanol 70 % selanjutnya difraksinasi menggunakan pelarut dengan kepolaran yang berbeda yaitu pelarut n-heksana (non polar) dan etil asetat (semi polar). Dalam penelitian ini, fraksinasi dengan pelarut n-heksana memberikan warna kuning pada larutan dan rendemen yang diperoleh sebesar 0.9 %. Berbeda dengan pelarut n-heksana, hasil fraksinasi pelarut etil asetat menghasilkan warna hijau kehitaman dengan rendemen sebesar 7.1 % sedangkan rendemen fraksi etanol yang diperoleh sebesar 6.8 %. Senyawa Fitokimia Sampel uji yang merupakan hasil ekstraksi dan fraksinasi selanjutnya dilakukan pengujian terhadap senyawa fitokimia. Analisis yang dilakukan terdiri atas analisis alkaloid, tanin, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Hasil uji fitokimia sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Senyawa fitokimia sampel daun benalu cengkeh Kandungan Ekstrak Ekstrak Fraksi Fraksi Fraksi kimia air etanol n-heksana etil asetat etanol Alkaloid Mayer Dragendorf Bouchardat Tanin + + + + Flavonoid + + + + + Saponin + + + Triterpenoid + + + + + Keterangan : ( + ) = mengandung senyawa ( - ) = tidak mengandung senyawa
8 Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua sampel yang diuji positif mengandung flavonoid dan triterpenoid, namun semuanya negatif untuk alkaloid. Analisis tannin terdapat pada semua sampel kecuali fraksi n-heksana sedangkan analisis saponin tidak terdapat pada fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat. Kandungan Total Fenol Total fenol dievalusi menggunakan reagen Folin-Ciocalteau yang dapat bereaksi dengan gugus OH pada sampel. Adanya fenol dalam sampel ditunjukkan oleh terbentuknya kompleks berwarna biru yang dapat dibaca pada panjang gelombang 765 nm. Total fenol dinyatakan dengan ekuivalen asam galat atau Gallic Acid Equivalent (GAE). Persamaan regresi yang diperoleh dari pengukuran standar asam galat adalah y= 0.018x +0.113 dengan R2= 0.990 (Lampiran 2). Hasil uji statistika terhadap total fenol sampel diperoleh hasil jenis sampel menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0.05) (Lampiran 5). Hasil tersebut memperlihatkan bahwa setiap sampel uji yang terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol memiliki kandungan total fenol yang berbeda (Gambar 1).
Total fenol (mg GAE/g sampel)
400
358.4 a
350 300 250 200 150 100
85.6
c
109.8 b
37.4 d
26.4 e
50 0 Ekstrak air
Ekstrak etanol
Fraksi nheksana
Fraksi etil asetat
Fraksi etanol
Jenis sampel Gambar 1 Perbandingan kandungan total fenol sampel. Angka di atas tiap balok data menunjukkan kandungan total fenol sedangkan huruf superscrift (a,b,c,d,e) menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05)
Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan sampel daun benalu cengkeh dievalusi menggunakan radikal bebas DPPH. Produk yang terbentuk berupa 1.1-difenil-2pikrilhidrazin berwarna kuning yang dapat dibaca oleh microplate reader pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan sampel diketahui berdasarkan nilai inhibition concentration 50 % (IC50) (Tabel 3).
9 Tabel 3 Aktivitas antioksidan sampel daun benalu cengkeh Jenis sampel IC50 (μg/mL) Ekstrak air 11.4 a Ekstrak etanol 6.8 a Fraksi n-heksana 936.6 c Fraksi etil asetat 6.4 a Fraksi etanol 217.8 b α-tokoferol 6.1 a Keterangan: Huruf superscrift (a,b,c) pada tabel menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05)
Hasil uji statistika terhadap aktivitas antioksidan sampel diperoleh hasil yang tidak berbeda nyata antara ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi etil asetat serta α-tokoferol yang digunakan sebagai kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki aktivitas yang hampir sama dalam mereduksi radikal bebas DPPH. Sebaliknya, aktivitas antioksidan fraksi n-heksana dan fraksi etanol memiliki perbedaan yang nyata dengan sampel uji lainnya (Lampiran 6). Inhibisi Enzim α-Glukosidase Penentuan daya inhibisi sampel menggunakan enzim α-glukosidase yang berasal dari rekombinan Bacillus stearothermophilus dengan substrat berupa pnitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNPG) dan akarbose digunakan sebagai pembanding. Produk yang dihasilkan dari reaksi enzimatis berupa p-nitrofenol berwarna kuning. Aktivitas penghambatan enzim dari berbagai sampel diketahui berdasarkan nilai inhibition concentration 50 % (IC50) (Tabel 4). Tabel 4 Inhibisi enzim α-glukosidase Jenis sampel IC50 (μg/mL) Ekstrak air 437.8 d Ekstrak etanol 129.7 b Fraksi n-heksana 595.9 f Fraksi etil asetat 272.4 c Fraksi etanol 468.9 e Akarbose 0.1 a Keterangan : Huruf superscrift (a,b,c,d,e,f) pada tabel menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05)
Hasil uji memperlihatkan bahwa semua sampel termasuk akarbose sebagai kontrol positif memiliki daya inhibisi terhadap enzim α-glukosidase yang berbeda nyata (p<0.05) (Lampiran 7). Semakin kecil nilai IC50, aktivitas inhibisi αglukosidase semakin besar. Ekstrak etanol 70 % memiliki daya inhibisi paling besar dengan nilai IC50 sebesar 129.7 µg/mL sedangkan daya inhibisi paling kecil ditunjukkan oleh fraksi n-heksana dengan IC50 sebesar 595.9 µg/mL.
10 Kinetika Inhibisi Enzim Penentuan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase bertujuan mengkaji jenis inhibisi sampel terhadap enzim. Mekanisme inhibisi enzim ditentukan berdasarkan kurva Lineweaver-Burk dengan dua sistem reaksi, yaitu reaksi enzim-substrat tanpa inhibitor dan reaksi enzim-substrat dengan inhibitor. Inhibitor yang digunakan merupakan sampel teraktif dari pengujian inhibisi enzim α-glukosidase dengan nilai IC50 paling kecil yaitu ekstrak etanol 70 %. Analisis kinetika dipelajari melalui peningkatan konsentrasi substrat pNPG yang diperoleh dari kurva Michaelis-Menten yaitu 0.4-3.2 mM (Lampiran 3). Plot LineweaverBurk (Gambar 2) menunjukkan bahwa sistem tanpa inhibitor diperoleh persamaan y = 3.1827x + 0.5833 dengan nilai Vmaks 1.7 mM/mL menit dan Km 5.4 mM/mL sedangkan sistem dengan inhibitor diperoleh persamaan y = 4.8623x + 1.4584 dengan nilai Vmaks 0.7 mM/mL menit dan Km 3.3 mM/mL.
1/V (mM/menit)-1
y = 4.8623x + 1.4584 R2 = 0.9879 y = 3.1827x + 0.5833 R2 = 0.9995
Tanpa inhibitor Inhibitor 200 µg/mL 1/[S] (mM)-1 Gambar 2 Plot Lineweaver-Burk pada uji kinetika enzim
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa terjadi penurunan nilai Vm dan Km. Penurunan nilai Km dan Vm menunjukkan inhibitor bersifat unkompetitif. Namun, berdasarkan plot Lineweaver-Burk yang dihasilkan (Gambar 2), jenis inhibisi lebih cenderung bersifat campuran antara nonkompetitif dan unkompetitif. Identifikasi Senyawa Antidiabetes Analisis kandungan kimia dari sampel teraktif pada inhibisi α-glukosidase menggunakan LC-MS/MS. Sampel yang dianalisis adalah ekstrak etanol 70 %. Hasil analisis berupa spektrum yang menggambarkan rasio bobot molekul per muatan (m/z) (Lampiran 4). Hasil kromatogram terdapat tiga senyawa yang teridentifikasi berdasarkan kelimpahan paling tinggi, yaitu puncak dengan waktu retensi 1.45. Puncak tersebut diduga memiliki rumus molekul C29H55F3O15 dengan bobot molekul 700.73 (m/z). Puncak tertinggi kedua dari hasil kromatogram memiliki waktu retensi 16.61 dengan rumus molekul C28H38O19 dan berat molekul 678.59 (m/z) sedangkan puncak tertinggi ketiga memilki waktu retensi 17.63 dengan rumus molekul C4H10 dan bobot molekul 58.08 (m/z).
11 Pembahasan Kadar Air Serbuk Daun Benalu Cengkeh dan Rendemen Ekstrak Serbuk daun benalu cengkeh yang telah dikeringkan memiliki kadar air < 10 %. Hal ini menunjukkan bahwa serbuk daun tersebut dapat disimpan dalam jangka waktu lama. Rendahnya kadar air serbuk daun disebabkan oleh pengeringan di bawah sinar matahari selama tiga hari dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 45 ºC. Pengeringan dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme sehingga dapat menjaga kualitas serbuk daun benalu cengkeh. Masa simpan serbuk daun yang baik memiliki kadar air kurang dari 10 % (BPOM 2014). Kadar air yang tinggi (> 10 %) dapat menyebabkan terjadinya proses enzimatis dan kerusakan oleh mikroba. Enzim dapat mengubah kandungan kimia yang telah terbentuk menjadi produk lain yang mungkin tidak memiliki efek farmakologis seperti asalnya (Manoi 2006). Serbuk daun benalu cengkeh dengan kadar air < 10 % kemudian diekstraksi dengan cara perebusan dan maserasi menggunakan etanol 70 %. Proses ekstraksi dengan cara perebusan dipilh karena secara empirik banyak dilakukan oleh masyarakat dalam pengolahan tanaman obat sedangkan cara maserasi digunakan karena metodenya sederhana, relatif murah dan tidak membutuhkan pemanasan. Penggunaan dua metode ekstraksi yang berbeda bertujuan mengetahui kadar rendemen yang dihasilkan dan potensi senyawa aktif yang tersari dalam proses ekstraksi. Hasil esktraksi dengan perebusan menggunakan air memiliki rendemen yang lebih besar dibandingkan dengan rendemen hasil maserasi menggunakan etanol 70 %. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam daun benalu cengkeh lebih banyak bersifat polar. Perbedaan rendemen disebabkan oleh perbedaan sifat pelarut yang digunakan selama ekstraksi. Pelarut air memiliki kepolaran lebih tinggi dibandingkan dengan pelarut etanol (Markom et al. 2007). Kepolaran suatu pelarut dapat diketahui berdasarkan nilai momen dipolnya. Pelarut air memiliki momen dipol lebih besar dibandingan dengan pelarut etanol yaitu secara berurutan 1.87 dan 1.69 Debye (Markom et al. 2007). Ekstrak etanol 70 % yang diperoleh kemudian difraksinasi untuk memisahkan komponen kimia berdasarkan tingkat kepolarannya. Hasil fraksinasi menghasilkan rendemen fraksi etil asetat > fraksi etanol > fraksi n-heksana. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa kimia paling banyak dalam ekstrak etanol 70 % bersifat semi polar. Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Tursiman et al. (2012), besarnya rendemen fraksi etil asetat dibandingkan dengan fraksi n-heksana dapat dipengaruhi oleh keberadaan gugus etoksi pada struktur etil asetat yang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan sampel. Adanya senyawa non polar dalam ekstrak etanol 70 % yang merupakan hasil fraksinasi dengan n-heksana disebabkan oleh struktur etanol yang mengandung gugus fungsi OH yang bersifat polar dan rantai karbon yang bersifat non polar. Selanjutnya, sampel hasil ekstraksi dan fraksinasi yang terdiri atas ekstrak air, ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol dilakukan analisis fitokimia untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel.
12 Senyawa Fitokimia Penentuan senyawa fitokimia merupakan analisis awal untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang ada pada suatu bahan. Setiap sampel yang diuji memiliki kandungan senyawa yang berbeda. Secara kualitatif, semua sampel uji mengandung senyawa flavonoid dan triterpenoid. Senyawa flavonoid relatif polar sehingga dapat diekstrak dengan pelarut polar seperti air, metanol dan etanol (Phan et al. 2013). Keberadaan senyawa flavonoid pada sampel uji diketahui berdasarkan warna yang terbentuk pada lapisan alkohol (Farnsworth 1966). Jenis warna yang terbentuk bergantung oleh jenis senyawa flavonoid yang ada pada sampel (Farnsworth 1966). Kandungan senyawa fitokimia fraksi n-heksana lebih sedikit dibandingkan dengan sampel lainnya. Fraksi n-heksana tidak mengandung senyawa alkaloid, tanin dan saponin. Hal ini disebabkan oleh senyawa tanin yang memiliki kelarutan tinggi dalam pelarut polar sedangkan pelarut n-heksana bersifat non polar. Pelarut etanol adalah pelarut yang baik untuk mengekstrak tanin karena memiliki gugus OH yang dapat bereaksi dengan gugus tanin yang bersifat polar (Mailoa et al. 2013). Sementara senyawa saponin biasanya berada dalam bentuk glikosida yang terdiri atas steroidal atau aglikon terpenoid yang dihubungkan oleh satu atau lebih gugus gula (Chan et al. 2014) sehingga saponin cenderung bersifat polar. Senyawa metabolit sekunder diketahui memiliki banyak aktivitas biologis termasuk sebagai agen antioksidan dan antidiabetes (Bi et al. 2012; Tan et al. 2008). Senyawa metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan memiliki mekanisme kerja yang berbeda dengan inhibitor α-glukosidase. Senyawa antioksidan dapat mendonorkan elektron atau proton ke radikal bebas yang berada di seluruh jaringan sedangkan inhibitor α-glukosidase bekerja di usus halus untuk menunda pencernaan karbohidrat. Namun demikian, senyawa antioksidan dapat berkontribusi dalam menekan komplikasi penyakit diabetes (Setiawan dan Suhartono 2008). Flavonoid diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat melindungi tubuh dari kerusakan oksidatif (Marianne et al. 2012). Triterpenoid memiliki efek dalam penyerapan glukosa, sekresi insulin, retinopati dan nefropati (Rathore 2014). Antioksidan dibutuhkan untuk menekan kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh senyawa oksigen reaktif, reactive oxygen species (ROS). Stres oksidatif pada penderita diabetes dapat berasal dari tiga jalur, yaitu glikasi protein nonenzimatik, jalur poliol sorbitol dan autooksidasi glukosa (Setiawan dan Suhartono 2005). Senyawa ROS dapat menyebabkan kerusakan pada jalur diabetes yang selanjutnya dapat berkontribusi dalam pengembangan komplikasi baik secara mikro maupun makrovaskuler (Johansen et al. 2005). Adanya senyawa polifenol seperti flavonoid dan tanin dalam ekstrak daun benalu cengkeh dapat memberikan perlindungan secara tidak langsung dengan cara pengaktifan sistem pertahanan endogen dan memodulasi proses pensinyalan secara seluler seperti pengaktifan faktor transkripsi NF-κB, pengikatan DNA AP-1, biosintesis glutation, aktivasi protein kinase oleh mitogen (ERK, JNK dan p38) dan translokasi ke dalam nukleus oleh faktor transkripsi Nrf2 (Gambar 3). Aktivasi NF-κB dan p38 disebabkan oleh keberadaan senyawa oksigen reaktif seperti superoksida (•O2-) dan hidrogen peroksida (H2O2) (Johansen et al. 2005). Aktivasi NF-κB dapat menurunkan fungsi dari glutation (GSH) sebagai antioksidan nonenzimatik di dalam tubuh (Johansen et al. 2005; Retnaningsih et al. 2007).
13
Gambar 3 Mekanisme efek biologis senyawa polifenol. Nuclear factor-kappa B (NF-κB), activator protein-1 (AP-1), mitogen-activated protein kinase (MAPK), extracellular signal-regulated protein kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK), nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2) (Han et al. 2007)
Dalam penelitian ini, semua sampel uji tidak mengandung senyawa alkaloid. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dan antidiabetes tidak dipengaruhi oleh senyawa alkaloid. Berbeda dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Daniel et al. (2012) bahwa ekstrak etanol, fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat daun benalu sirsak positif mengandung alkaloid. Selain itu, ekstrak metanol benalu Viscum album mengandung tanin dan flavonoid namun tidak mengandung alkaloid dan saponin (Adaramoye et al. 2012). Perbedaan metabolit sekunder yang ada pada tanaman benalu dipengaruhi oleh jenis inang dan pelarut yang digunakan selama ekstraksi (Artanti et al. 2012; Teh et al. 2014). Kandungan Total Fenol Total fenol sampel diketahui berdasarkan kemampuan senyawa fenolik dalam mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat dalam reagen FolinCiocalteau yang dapat menghasilkan senyawa kompleks molibdenum-tungsten berwarna biru. Semakin pekat warna yang dihasilkan maka semakin banyak pula senyawa fenolik yang ada di dalam sampel. Asam galat digunakan sebagai standar dalam penentuan total fenol. Hal ini disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksi
14 dan ikatan rangkap yang terkonjugasi pada cincin benzena sehingga sangat efektif membentuk kompleks dengan reagen Folin-Ciocalteau (Rorong 2008). Selain itu, asam galat merupakan golongan fenol sederhana dengan ketersediaan substansi yang stabil dan murni. Secara kuantitatif, kandungan total fenol fraksi etil asetat lebih tinggi dibandingkan oleh sampel lainnya kemudian dikuti oleh ekstrak etanol, ekstrak air, fraksi etanol dan fraksi n-heksana. Hal ini dapat diartikan bahwa komponen fenol pada ekstrak etanol 70 % lebih banyak bersifat semi polar. Menurut Teh et al. (2014), kandungan total fenol bergantung pada jenis pelarut yang digunakan selama ekstraksi. Aktivitas Antioksidan Dalam penelitian ini, aktivitas antioksidan dievaluasi menggunakan metode DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar (Vicas 2012). Reaksi antara DPPH dan antioksidan yang berasal dari sampel diukur berdasarkan penurunan absorban produk yang terbentuk berupa 1.1-difenil-2pikrilhidrazin berwarna kuning dibandingkan dengan absorban kontrol berupa larutan DPPH yang berwarna ungu (Gambar 4).
Antioksidan
1.1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Ungu)
1.1-difenil-2-pikrilhidrazin (Kuning)
Gambar 4 Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antioksidan (Vicas 2012)
Berdasarkan nilai IC50 sampel, aktivitas antioksidan ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi etil asetat lebih tinggi dibandingkan dengan fraksi n-heksana dan fraksi etanol. Hal ini disebabkan oleh kemampuan pelarut dalam mengekstrak metabolit sekunder yang ada pada sampel (Teh et al. 2014). Secara kualitatif, semua sampel uji mengandung senyawa flavonoid dan triterpenoid. Adanya senyawa flavonoid dan triterpenoid memiliki kontribusi sebagai senyawa antioksidan (Badgujar et al. 2014; Topcu et al. 2007). Beberapa senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan telah diisolasi, antara lain rutin dan quersetin pada daun mulberry (Zhishen et al. 1999) serta flavonol glikosida pada ekstrak etanol benalu Dendrophthoe pentandra (L.) Miq (Artanti 2006). Berdasarkan struktur flavonoid (Gambar 5), aktivitas antioksidan ditunjukkan
15 oleh struktur dasar yang berupa inti flavan, terdiri atas 15 atom karbon yang disusun dalam 3 cincin (C6-C3-C8) , diberi tanda A, B dan C (Heim 2012).
Gambar 5 Struktur dasar flavonoid (Heim 2002)
Tingginya aktivitas antioksidan sampel dapat dipengaruhi oleh kandungan senyawa turunan fenol yang memiliki gugus hidroksi yang tersubstitusi pada cincin benzena dengan posisi orto dan para terhadap gugus OH dan OR (Tursiman et al. 2012). Kandungan total fenol yang tinggi berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan (Tursiman et al. 2012). Ekstrak yang banyak mengandung komponen fenol memiliki kemampuan mereduksi radikal bebas lebih baik daripada ekstrak lainnya (Wang 2012). Fraksi n-heksana memiliki aktivitas antiosidan kecil yang ditunjukkan dengan nilai IC50 paling besar. Berdasarkan analisis fitokimia, fraksi n-heksana tidak mengandung senyawa tanin dan saponin sedangkan kedua senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antioksidan (Bi et al. 2012; Ujwala et al. 2010). Selain itu, fraksi n-heksana mengandung komponen fenol yang sedikit karena pelarut n-heksana lemah dalam mengekstrak komponen fenol hidrofilik, tetapi kuat dalam mengekstrak fosfatida, lipid dan komponen lainnya yang larut dalam lemak (Teh et al. 2014). Setiap antioksidan memiliki mekanisme peredaman radikal bebas yang berbeda. Menurut Liang dan Kitts (2014), reaksi antara senyawa antioksidan dan DPPH dapat terjadi melalui dua mekanisme, yaitu transfer elektron atau atom hidrogen secara langsung dan transfer elektron dengan proton terkonsentrasi (Gambar 6)
Gambar 6 Mekanisme antioksidan dalam meredam radikal bebas. Antioksidan (Liang dan Kitts 2014)
→DPPH;
16
Kemampuan ekstrak dalam meredam radikal bebas DPPH melalui mekanisme transfer elektron atau atom hidrogen (Teh et al. 2014). Senyawa flavonoid dan tanin yang terdapat pada sampel merupakan senyawa fenolik yang sangat reaktif mendonorkan atom hidrogen ke radikal bebas sehingga senyawa tersebut digolongkan kedalam antioksidan primer. Antioksidan primer merupakan antioksidan pemutus rantai yang dapat bereaksi dengan radikal bebas membentuk radikal yang stabil (Rorong 2008). Aktivitas antioksidan α-tokoferol sebagai pembanding tidak berbeda nyata terhadap ekstrak air, ekstrak etanol dan fraksi etil asetat. Hal ini disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil pada cincin aromatik dari α-tokoferol dan senyawa fenol yang ada pada ekstrak daun benalu cengkeh (Engin 2009). Selain itu, αtokoferol dan senyawa fenol memiliki satu situs penangkapan elektron sehingga stoikiometrinya menjadi 1:1, artinya satu molekul DPPH dapat ditangkap atau direduksi oleh satu molekul α-tokoferol atau senyawa fenol. Inhibisi Enzim α-Glukosidase Selain sebagai agen antioksidan, senyawa metabolit sekunder yang ada dalam ekstrak daun benalu cengkeh juga berperan sebagai agen antidiabetes. Aktivitas antidiabetes dalam penelitian ini dievaluasi melalui inhibisi enzim αglukosidase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi akhir penyerapan karbohidrat di usus. Berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh, ekstrak etanol memiliki aktivitas antidiabetes lebih tinggi dibandingkan dengan sampel lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang memiliki kemampuan menginhibisi αglukosidase lebih banyak bersifat polar. Perbedaan daya inhibisi sampel disebabkan oleh perbedaan kandungan metabolit sekunder yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan pelarut yang berbeda. Ekstrak etanol 70 % mengandung senyawa tanin, flavonoid, saponin dan triterpenoid. Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Suryanto dan Wehantouw (2008), ekstrak etanol daun benalu cengkeh mengandung senyawa fenolik, tanin dan flavonoid. Senyawa tersebut diketahui dapat menghambat kerja enzim α-glukosidase (Nagmoti dan Juvekar 2013). Enzim α-glukosidase merupakan senyawa protein yang memiliki sisi katalitik untuk menghidrolisis ikatan glukosidik α-1.4 pada karbohidrat sehingga menghasilkan α-D-glukosa. Menurut Chiba (1997), residu katalitik yang dimiliki oleh enzim α-glukosidase adalah residu asam aspartat (Asp). Mekanisme hidrolisis substrat oleh αglukosidase dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 7 Reaksi hidrolisis substrat oleh α-glukosidase. R: Residu gula/ aglikon; H-OA: aseptor; ----: sisi pemisahan (Chiba 1997)
17
Gambar 7 menunjukkan bahwa reaksi hidrolisis substrat terjadi melalui pemisahan ikatan antara atom karbon anomerik pada residu glukosil dan oksigen glukosidik (C1-O). Selanjutnya, residu glukosil bereaksi dengan proton yang berasal dari H2O untuk menghasilkan produk berupa α-D-glukosa. Secara umum, hidrolisis ikatan glukosidik oleh α-glukosidase menghasilkan produk yang dapat mempertahankan ikatan (α→α atau β→β) atau mengubah ikatan (α→β atau β-α) pada substrat. Senyawa yang memiliki ikatan glikosida memiliki aktivitas inhibisi α-glukosidase yang lebih baik dibandingkan dengan senyawa dalam bentuk aglikon (Auliawan dan Cahyono 2014). Senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid dan saponin banyak ditemukan dalam bentuk glikosida (Ross et al. 2005; Chan et al. 2014) sehingga diduga memiliki aktivitas yang besar dalam menginhibisi α-glukosidase. Ekstrak air daun benalu Camelia sinensis yang dilaporkan oleh Artanti et al. (2012) memiliki aktivitas antidiabetes lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air dalam penelitian ini yaitu dengan IC50 11.8 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa jenis inang mempengaruhi kandungan metabolit sekunder yang ada pada tanaman benalu (Artanti et al. 2012). Kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding inhibisi α-glukosidase adalah akarbose. Secara statistik, nilai IC50 akarbose berbeda nyata dengan nilai IC50 sampel. Nilai IC50 kecil menandakan bahwa akarbose dengan konsentrasi 0.1 µg/mL dapat mengahambat enzim αglukosidase sebesar 50 %. Besarnya aktivitas akarbose dalam menghambat enzim α-glukosidase menyebabkan akarbose digunakan sebagai obat antidiabetes. Kinetika Inhibisi Enzim Ekstrak etanol yang memiliki aktivitas inhibisi α-glukosidase lebih tinggi dibandingkan dengan sampel lainnya digunakan sebagai inhibitor untuk mengetahui jenis penghambatan terhadap enzim. Kinetika α-glukosidase ditentukan melalui persamaan Michaelis-Menten untuk menentukan konsentrasi optimum dari substrat pNPG . Konsentrasi substrat yang digunakan untuk penentuan Km dan Vm melalui plot Lineweaver-Burk adalah 0.4-3.2. Penggunaan konsentrasi tersebut disebabkan oleh adanya peningkatan aktivitas enzim secara tajam di fase logaritmik Keberadaan inhibitor menyebabkan nilai Vm mengalami penurunan. Hal ini disebabkan oleh kemampuan inhibitor yang dapat menganggu konformasi enzim sehingga ikatan enzim dan substrat dalam membentuk produk menjadi tidak optimal. Selain itu, nilai Km yang menggambarkan afinitas pengikatan enzim-substrat juga mengalami penurunan. Penurunan nilai Km menunjukkan besarnya afinitas pengikatan enzim terhadap substrat sehingga untuk mencapai kecepatan reaksi maksimum dibutuhkan konsentrasi substrat yang kecil. Berdasarkan penurunan nilai Km dan Vm serta plot Lineweaver-Burk yang dihasilkan, mekanisme inhibisi belum dapat ditentukan secara mutlak, namun cenderung memiliki mekanisme penghambatan campuran antara nonkompetitif dan unkompetitif. Hal ini disebabkan oleh tingkat kemurnian ekstrak yang masih sangat rendah. Selain itu, variasi konsentrasi substrat yang digunakan juga bertanggungjawab mengubah sifat substrat atau kecepatan reaksi enzimatis (Babu et al. 2004). Pengujian lain yang memiliki tipe penghambatan nonkompetitif campuran terhadap enzim α-glukosidase adalah ekstrak Cymbopogon martini
18 (Roxb.) (Ghadyale et al. 2012) dan senyawa turunan flavonoid berupa kuersetin, isokuersetin dan rutin (Li et al. 2009). Adanya kemampuan ekstrak dalam mengahambat enzim penghidrolisis karbohidrat disebabkan oleh keberadaan senyawa fenolik yang dapat berikatan dengan protein enzim (Zhang et al. 2015). Identifikasi Senyawa Antidiabetes Penggunaan LC-MS/MS untuk menganalisis senyawa yang diduga memiliki potensi sebagai agen antidiabetes disebabkan oleh sensitivitas dan selektivitas yang tinggi (Zou dan Schreiber 2012). Preparasi sampel dapat dilakukan dengan mudah tanpa ada teknik derivatisasi dan dapat menganalisis senyawa yang bersifat sangat polar (Vogeser dan Seger 2008). Penelitian ini menggunakan analisis massa jenis quadrupole dengan teknik scan karena relatif sederhana dan murah. Berdasarkan analisis LC-MS/MS, ekstrak etanol 70 % memiliki puncak lebih dari satu. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol yang digunakan untuk analisis belum murni sehingga masih banyak senyawa lain yang teridentifikasi. Senyawa yang teridentifikasi oleh MS tidak dapat memprediksikan nama senyawa aktif secara tepat karena produk yang dihasilkan dari MS hanya berupa bobot dan rumus molekul. Analisis nama senyawa lebih lanjut dapat dilakukan dengan menggunakan instrument NMR (Blazics et al. 2011).
19
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Aktivitas antioksidan yang tinggi dari ekstrak daun benalu cengkeh ditunjukkan oleh ekstrak air, ekstrak etanol 70 % dan fraksi etil asetat dengan nilai IC50 berturut-turut 11.4 µg/mL, 6.8 µg/mL dan 6.4 µg/mL sedangkan aktivitas antidiabetes tertinggi ditunjukkan oleh ekstrak etanol 70 % dengan IC50 129.7 µg/mL. Ekstrak etanol 70 % yang merupakan ekstrak terpilih dari uji antidiabetes memiliki mekanisme penghambatan enzim α-glukosidase secara nonkompetitif campuran. Analisis LC-MS/MS ekstrak etanol 70 % daun benalu cengkeh mengandung tiga senyawa berdasarkan kelimpahan paling tinggi yaitu dengan bobot molekul 700.73 (m/z), 678.59 (m/z) dan 58.08 (m/z).
Saran Penggunaan metode uji antioksidan yang berbeda seperti Thiobarbituric Acid (TBA) perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat peroksidasi lipid. Perlu juga dilakukan isolasi senyawa pada sampel teraktif sehingga dapat dikembangkan sebagai alternatif pengobatan penyakit diabetes.
20
DAFTAR PUSTAKA Adaramoye O, Amanlou M, Habibi-Rezaei M, Pasalar P, Moosavi-Movahedi A. 2012. Methanolic extract of African mistletoe (Viscum album) improves carbohydrate metabolism and hyperlipidemia in streptozotocin-induced diabetic rats. Asian Pasific Journal of Tropical Medicine. 2012:427-433. Alfarabi M. 2010. Kajian antidiabetogenik ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) In Vitro [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Artanti N, Firmansyah T, Darmawan A. 2012. Bioactivities evaluation of Indonesia mistletoes (Dendrophthoe pentandra (L.) Mig.) leaves extracts. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2(1):24-27. Artanti N, Jamilah, Hanafi M, Lotulung P, Karbono LBS. 2003. Evaluasi aktivitas antioksidan daun benal (Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh) yang tumbuh pada inang duku (Lansium domesticum). Serpong (ID): Prosiding Semiloka Nasional. Artanti N, Ma’arifa Y, Hanafi M. 2006. Isolation and identification of active compound from star fruit (Averrhoa carambola) mistletoe (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) ethanol extract. J of Applied Sciences. 6(8):1659-1663. Auliawan R, Cahyono B. 2014. Efek hidrolisis ekstrak daun iler IColeus scutellarioides) terhadap aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase. JSM. 22(1): 15-19. Babu KS, Tiwari AK, Srinivas PV, Ali AZ, Raju C, Rao M. 2004. Yeast and mammalian α-glucosidase inhibitory constituent from Himalayan rhubarb Rheum emodi Wall.ex Meisson. Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters. 14:3841-3845. Badan Standarisasi Nasional. 1992. Standar Nasional Indonesia(SNI). SNI-013182-1992. Penentuan Kadar Air. Dewan Standarisasi Indonesia. Jakarta. Badgujar S, Patel VV, Bandivdekar AH. 2014. Foeniculum vulgare Mill: A review of its botany phytochemistry, pharmacology, contemporary application, and toxicology. Biomed Research International. doi:10.1155/2014/842674. Beckman JA. Goldfine AB, Gordon MB, Creager MA. 2001. Ascorbate restores endothelium-dependent vasolidation impaired by acute hyperglycemia in humans. Journal of the American Heart Association. 103(2001):16181623.doi:10.1161/01.CIR.103.12.1618. Bi L, Tian X, Dou F, Hong L, Tang H, Wang S. 2012. New antioxidant and antiglycation avtive triterpenoid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis. Filoterapia. 83. 234-240. Blazics B, Alberti A, Beni S, Kursinszki L, Tolgyesi L, Kery A. 2011. Identification and LC-MS/MS determination of Acetoside, the Main Antioxidant Compound of Euphrasia Rostkoviana, using the isolated target analyte as external standard. Journal of Chromatographic Science. 49. [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2014. Persyaratan mutu obat tradisional. Chan KW, Iqbal S, Khong NMH, Ooi DJ, Ismail M. 2014. Antioxidant activity of phenolics-saponins rich fraction prepared from defatted kenaf seed meal. Food Science and Technology. 56. 181-186.
21 Chiba S. 1997. Molecular mechanism in α-glucosidase and glucoamylase. Biosci. Biotech. Biochem. 61(8): 1233-1239. Chugh CA, Mehta S, Dua H. 2012. Phytochemical screening and evaluation of biological activities of some medicinal plants of phagwara, punjab. Asian Journal of Chemistry. 24(12):5903-5905. Daniel, Saleh C, Padin MSL. 2012. Uji bioaktivitas beberapa fraksi dari ekstrak daun benalu sirsak (Dendropthoe cf. Pentandra [L.] Miq.) yang berasal dari Kalimantan Timur. Mulawarman Scientific. 11(1). Engin KN. 2009. Alpha-tocopherol: looking beyond an antioxidant. Molecular Vision. 15:855-860. Farnsworth NR. 1966. Biological and phytochemical screening of plants. Journal of Pharmaceutical Sciences. 55(3). Ghadyale V, Takalikar S, Haldavnekar V, Arvindekar A. 2012. Effective control of postprandial glucose level through inhibition of intestinal alpha glucosidase by Cymbopogon martini (Roxb.). Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.doi:10.1155/2012/372909. Han X, Shen T, Lou H. 2007. Dietary polyphenols and their biological significance. Int. J. Mol. Sci. 8: 950-988. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia. Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. 2002. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships, Journal of Nutritional Biochemistry. 13. 572-584. [IDF] International Diabetes Federation. 2013. IDF Diabetes Atlas Sixth Edition. ISBN: 2-930229-85-3. Johansen JS, Harris AK, Rychly DJ, Ergul A. 2005. Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes: Linking basic science to clinical practice. Cardiovascular Diabetology. 4(5). [KEMENKES RI] Kementrian Kesehatan RI. 2013. Riset kesehatan dasar. Kim KY, Nam KA, Kurihara H, Kim SM. 2008. Potent α-Glucosidase inhibitors purified from the red alga Grateloupia elliptica. Phytochemistry. 69:28202825. Lee J, Sowndhararajan K, Kim M, Kim J, Kim D, Kim S, Kim GY, Kim S, Jhoo JW. 2014. Antioxidant, inhibition of α-glucosidase and suppession of nitric oxide production in LPS-Induced murine macrophages by different fractions of Actinidia arguta Stem. SaudiJournal of Biological Sciences. 2014.doi:10.1016/j.sjbs.2014.01.006. Lee SK, Hwang YJ, Song JH, Jo JR, Kim MJ, Kim ME, Kim JI. 2007. Inhibitory activity of Euonymus alatus agains α-glucosidase in vitro and in vivo. J nutr Re Pract. 1(3):184-188. Liang N, Kitts DD. 2014. Antioxidant property of coffee components: Assessment of method that define mechanisms of action. Molecules. 19.doi: 10.3390/molecules191119180. Lim YY, Murtijaya J. 2007. Antioxidant properties of Phyllanthus amarus extracts as affected by different drying methods. LWT. 40. 1664-1669. Li YQ, Zhou FC, Gao F, Bian JS, Shan F. 2009. Comparative evaluation of quercetin, isoquercetin and rutin as inhibitor of α-glucosidase. J. Agric. Food Chem. 57:11463-11468.doi:10.1021/jf903083h.
22 Mailoa MN, Mahendradatta M, Laga A, Djide N. 2013. Tannin extract of guava leaves (Psidium guajava L) variation with concentration organic solvents. International Journal of Scientific & Technology Research. 2(9). ISSN 2277-8616. Manoi F. 2006. Pengaruh cara pengeringan terhadap mutu simplisia sambiloto. Bul. Litro. XVII(6):1-5. Marianne, Rosnani, Yuandani. 2012. Antidiabetic activity from ethanol extract of kluwih’s leaf (Artocarpus camansi). Jurnal Natural. 11(2). Markom M, Hasan M, Daud WRW, Singh H, Jaim JM. 2007. Extraction of hydrolysable tannins from Phyllanthus niruri Linn:effects of solvent and extraction methods. Separation and Purification Technology. 52:487-496. Mattjik AA. 2002. Rancangan Percobaan. Bogor: IPB Pr. Nagmoti DM, Juvekar AR. 2013. In vitro inhibitory effects of Pithecellobium dulce (Roxb) Benth. Seeds on intestinal α-glucosidase and pancreatic αamylase. J Biochem Tech. 4(3)616-621. Patel DK, Kumar R, Prasad SK, Sairam K, Hemalatha S. 2011. Antidiabetic and in vitro antioxidant potential of Hybanthus enneaspermus (Linn) F. Muell in streptozotocin-induced diabetic rats. Asian Pasific Journal of Tropical Biomedicine. (2011): 316-322. Perla V, Jayanti SS. 2013. Biguanide related compounds in traditional antidiabetic functional foods. Food Chemistry. 138(2013):1574-1580. Phan MAT, Wang J, Tang J, Lee YZ, Ng K. 2013. Evaluation of α-glucosidase Inhibition Potential of some Flavonoids from Epimedium brevicornum. Food Science and Technology. 53(2013):492-498. Ping YX, Qing SC, Ping Y, Gang MR. 2010. Α-Glucosidase and α-Amylase Inhibitory Activity of Common Constituents from Traditional Chinese Medicine Used for Diabetes Melitus. Chinese Journal of Natural Medicines. 8(5):0349-0352. Puro I. 2012. Kajian aktivitas antibakteri daun gatel (Laportea decumana (Roxb.) Wedd.) dan daun benalu cengkeh. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian.IPB. Rathore K, Singh VK, Jain P, Rao SP, Ahmed Z, Singh VD. 2014. In-vitro and invivo antidiapogenic, hypolipidemic and antidiabetic activity of Diospyros melanoxylon (Roxb). Journal of Ethnopharmacology. 155: 1171-1176. Retnaningsih, Widowati W, Lindayani. 2007. Isolasi Senyawa Antioksidan dan Antidiabetes dari Biji Kacang Koro (Mucuna pruriens) [Laporan Hasil Penelitian]. Semarang: Universitas Katolik Soegijapranata. Rorong JA. 2008. Uji aktivitas antioksidan dari daun cengkeh (Eugenia carryophyllus) dengan metode DPPH. Chem. Prog. 1(2). Ross. SA, ElSohly MA, Sultana GNN, Mehmedic Z, Hossain CF, Chandra S. 2005. Flavonoid glycosides and cannabinoids from the pollen of Cannabis sativa L. Phytochem. Anal. 16: 45-48.doi: 10.1002.pca.809. Salazar R, Perez LA, Lopez J, Alanais BA, Torres NW. 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of plants from Northeast of Mexico. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011:16.doi:10.1093/ecam/nep127. Sancheti S, Sandesh S, Seo SY. 2009. Chaenomoles Sinensis : A Potent α-and βglucosidase inhibitor. American Journal of Pharmacology and Toxicology. 4(1):8-11.
23 Setiawan B, Suhartono E. 2005. Stres oksidatif dan peran antioksidan pada diabetes melitus. Maj Kedokt Indon. 55(2). Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009. Antihyperglycemic activity of the Mahkota Dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] leaf extracts as an alpha-Glucosidase inhibitor. Makara, Kesehatan. 13(2):74-78. Suryanto E, Wehantouw F. 2008. Aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak fenol dari benalu cengkeh. J Bahan Alam Indonesia. 6(5):1412-2855. Uji T, Samiran. 2005. Keanekaragaman jenis benalu dan tumbuhan inangnya di Kebun Raya Purwodadi, Jawa Timur. Laporan Teknik Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Tan MJ, Ye JM, Turner N, Behrens CH, Ke CQ, Tang CP, Chen T, Weiss HC, Gesing ER, Rowland A, James DE, Ye Y. 2008. Antidiabetic activities of triterpenoids isolated from bitter melon associated with activation of the AMPK pathway. Chemistry & Biology. 15. 263-273. Teh SS, Bekhit AED, Birch J. 2014. Antioxidative polyphenols from defatted oilseed cakes: effect of solvent. Antioxidants. 3(2014):6780.doi:10.3390/antiox3010067. Topcu G, Ertas A, Kolak U, Ozturk M, Ulubelen A. 2007. Antioxidant activity tests on novel triterpenoids from Salvia macrochlamys. ARKIVOC. 195-208. Tursiman, Ardiningsih P, Nofiani R. 2012. Total fenol fraksi etil asetat dari buah asam kandis (Garcinia dioica Blume). JKK. 1(1): 45-48. Ueno Y, Kizaki M, Nakagiri R, Kamiya T, Sumi H, Osawa T. 2002. Dietary glutathione protects rats from diabetic naphropathy and neuropathy. J Nutr. 132:897-900. Ujwala W, Vijender S, Mohammad A. 2012. In-vitro antioxidant activity of isolated tannisns of alcoholic extract of dried leaves of Phyllanthus Amarusschonn and Thonn. International Journal of Drug Development & Research. 4(1).ISSN 0975-9344. Vicas SI, Rugina D, Socaciu C. 2012. Phytochemicals as nutraceuticals-global approaches to their role in nutrition and health. China : Intech. Vogeser M, Seger C. 2008. A decade of HPLC-MS/MS innthe routine clinical laboratory-Goals for further developments. Clinical Biochemistry. 41: 649662. Wang Y, Huang S, Shao S, Qian L, Xu P. 2012. Studies on bioactivities of tea (Camellia sinensis L.) fruit peel extracts: antioxidant activity and inhibitory potential against α-glucosidase and α-amylase in vitro. Industrial Crops and Product. 37(2012):520-526. [WHO] World Heatlh Organization. 2014. Prevalence of diabetes worldwide. [Internet]. [diunduh 2011 Juli 21]. Tersedia pada www.who.int/diabetes/ facts/worldfigures/en. Wu Y, Ding Y, Tanaka Y, Zhang W. 2014. Risk factors contributing to type 2 diabetes and recent advances in the treatment and prevention. Int. J. Med. Sci. 11(11).doi: 10.7150/ijms.10001. Yao X, Zhu L, Chen Y, Tian J, Wang Y. 2013. In vivo and in vitro antioxidant activity and α-Glucosidase, α-Amylase inhibitory effects of flavonoids from Cichorium glandulosum seeds. Food Chemistry. 139(2013):59-66.
24 Zhang H, Wang G, Beta T, Dong J. 2015. Inhibitory properties of aqueous ethanol extracts of propolis on alpha-glucosidase. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. DOI:10.1144/2015/587383. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry. 64 555-559. Zou YY, Schreiber A. 2012. Quantitation and identification of organotin compounds in food, water, and textiles using LC-MS/MS. AB Sciex. 6690212-01.
25 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Preparasi simplisia
Ekstraksi simplisia dengan cara perebusan dan maserasi
Ekstrak etanol
Ekstrak air Fraksinasi dengan pelarut n-heksana dan etil asetat
Fraksi n-heksana
Fraksi Etanol Fraksi etil asetat
Pengujian
Fitokimia dan total fenol
Antioksidan (DPPH)
Antidiabetes (Inhibisi α-glukosidase)
Fraksi teraktif Uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase Identifikasi golongan senyawa kimia
26 Lampiran 2 Kurva standar asam galat
Konsentrasi (mg/L) Blanko 5 10 15 20 25 30 35 40
Absorban
Absorban sampel – Absorban blanko
0.042 0.245 0.351 0.426 0.501 0.664 0.738 0.807 0.886
0.203 0.309 0.384 0.459 0.622 0.696 0.765 0.844
27 Lampiran 3 Kurva Michaelis Menten
Konsentrasi (mM) Blanko 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10
Absorban
Absorban sampel – Absorban blanko
0.058 0.187 0.284 0.381 0.446 0.515 0.540 0.637 0.655 0.716 0.776 0.843 0.845 0.874 0.883 0.936 0.957 0.983 0.994 1.019 1.082
0.129 0.225 0.323 0.388 0.456 0.482 0.578 0.596 0.658 0.717 0.785 0.787 0.815 0.825 0.877 0.899 0.925 0.936 0.961 1.024
28 Lampiran 4 Spektrum LC-MS/MS ekstrak etanol 70 %
29 Lampiran 5 Hasil uji analisis statistik total fenol sampel ANOVA Total fenol Sumber keragaman Perlakuan Galat Total
Jumlah kuadrat 220971.160 164.264 221135.425
Derajat bebas 4 10 14
Kuadrat tengah 55242.790 16.426
F-hitung
Sig.
3363.047
.000
Uji lanjut Total Fenol Duncan Jenis sampel
N
Fraksi n-heksana Fraksi etanol Ekstrak air Ekstrak etanol Fraksi etil Sig.
3 3 3 3 3
1 26.4443
2
Alfa = 0.05 3
4
5
37.4167 85.5557 109.7777 1.000
1.000
1.000
1.000
358.4443 1.000
30 Lampiran 6 Hasil uji analisis statistik nilai IC50 antioksidan ANOVA Rataan IC50 Sumber Jumlah keragaman kuadrat Perlakuan 2072727.871 Galat 30788.560 Total 2103516.431
Derajat Kuadrat bebas tengah 5 414545.574 12 2565.713 17
F-hitung
Sig.
161.571
.000
Uji lanjut Rataan IC50 Duncan Jenis Sampel
N
Tokoferol Fraksi etil Ekstrak etanol Ekstrak air Fraksi etanol Fraksi n-heksana Sig.
3 3 3 3 3 3
1 6.0802 6.3706 6.8197 11.3852
Alfa = 0.05 2
3
217.7842 .907
1.000
936.6402 1.000
31 Lampiran 7 Hasil uji analisis statistik nilai IC50 inhibisi α-glukosidase ANOVA Rataan IC50 Sumber Jumlah keragaman kuadrat Perlakuan 759003.951 Galat 786.371 Total 759790.322
Derajat bebas 5 12 17
Kuadrat tengah 151800.790 65.531
F-hitung
Sig.
2316.477
.000
Uji Lanjut Rataan IC50 Duncan Jenis Sampel Akarbose Ekstrak etanol Fraksi etil Ekstrak air Fraksi etanol Fraksi n-heksana Sig.
N
Alfa = 0.05 3 4
1 2 5 6 3 .0804 3 129.677 3 272.413 3 437.8246 3 468.941 3 595.930 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
32
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kecamatan Curup Provinsi Bengkulu pada tanggal 15 April 1991, sebagai anak ke-1 dari 4 bersaudara dari pasangan Sumiadi dan Herna Siami. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Pendidikan Kimia, Fakultas KIP Universitas Bengkulu, lulus pada tahun 2013. Di tahun yang sama penulis diterima di Sekolah Pascasarjana IPB pada program studi Biokimia dengan sponsor beasiswa pascasarjana dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) melalui program Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN). Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam sebuah organisasi pascasarjana yaitu pengurus Himpunan Mahasiswa Muslim Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (HIMMPAS IPB) periode 2013-2015. Penulis telah mempublikasikan sebagian tesis ini pada jurnal IOSR Journal of Pharmacy (IOSRPHR), volum 5, nomor 8 dengan judul “Phytochemical screening and antioxidant activity of clove mistletoe leaf extracts (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq)”.
