Tempfli Károly1 – Kovács Bálint2 – Simon Zoltán3 – Bali Papp Ágnes4
Az adiponectin, a zsírsavkötő fehérje és a leptin gének expressziója sertés izom- és zsírszövetben Expression of adiponectin, adipocyte fatty acid-binding protein, and leptin genes in porcine muscle and fat tissues
[email protected] tanársegéd 2NymE-MÉK, hallgató, MSc 3Olmos és Tóth Kft, tenyésztésvezető 4NymE-MÉK, egyetemi tanár, intézetigazgató 1NymE-MÉK,
Összefoglalás. A húsminőséget és a testösszetételt befolyásoló gének működésének megismerése kiemelt jelentőségű kutatási terület, hiszen a minőségi termékek felé forduló fogyasztói hozzáállás miatt a húsminőség is szelekciós szempontként jelenik meg a sertéstenyésztésben. A húsminőséget befolyásoló fontos tényezők a test zsírtartalma és az intramuszkuláris zsír mennyisége. Jelen vizsgálatban a zsíranyagcserében jelentős szerepet játszó adiponektin (ADIPOQ), zsírsejt zsírsavkötő fehérje (A-FABP) és leptin (LEP) gének expressziója került felmérésre mangalica×duroc kocahízók hátszalonnájában és izomszövetében. A génműködés felméréséhez a reverz transzripciós, valós idejű polimeráz láncreakció (RT-qPCR) módszert használtuk β-actin referencia gén alkalmazásával. A vizsgált gének mindegyike detektálható a keresztezett egyedek zsír- és izomszövetében is. Az ADIPOQ kifejeződése szignifikáns (P<0,05) mértékben nagyobb a hátszalonnában, mint az izomszövetben. Az A-FABP és LEP gének esetében szintén intenzívebb működés figyelhető meg a zsírszövetben az izomhoz viszonyítva, bár a különbség nem szignifikáns mértékű. Az A-FABP és a LEP gének izomszövetben való jelentős kifejeződésük révén hozzájárulnak az intramuszkuláris zsírszövet kialakulásához.
Bevezetés A sertés zsírtermelését és húsminőségét befolyásoló gének működésének feltárása tenyésztési, takarmányozási, gazdasági, vagy akár humánbiológiai szempontból is számos előnyt jelenthet. Ismert sertésfajtáink rendkívüli sokszínűséget vonultatnak fel mind a zsírtermelés, mind a húsminőség tekintetében, így a szélsőségesen különböző megjelenésű és tulajdonságú fajták együttes vizsgálatával, összehasonlításával kiváló lehetőség nyílik a fenotípusos különbségekért felelős gének azonosítására. A sertés és az ember szervezete közötti nagymértékű hasonlóságnak köszönhetően a sertés különböző emberi betegségek (pl. cukorbetegség, elhízás) potenciális modellállatának is tekinthető. A zsírszövet elsődleges funkciója a többlet energia tárolása zsír formájában; emellett azonban a zsírszövet endokrin és parakrin szervként is működik, amely többek között leptin és adiponektin termelésével és véráramba juttatásával szabályozza az energia-háztartást, az inzulin működését és további fiziológiai folyamatokat (Havel, 2002; Ding és mtsai, 2004); ezért a zsírszövet hormontermelésének fontos szerepe van a takarmányfelvétel, továbbá a hízékonysági tulajdonságok alakításában is. A zsírsejtek által termelt fehérje hormonnak, az adiponektinnek szerepe van a glükoneogenezis gátlásában, valamint a zsírsavak oxidációjának serkentésében. Embernél az adiponektin különböző alléljait összefüggésbe
439
hozták az inzulinrezisztencia, a 2-es típusú cukorbetegség és a kóros elhízás kialakulásának kockázatával, továbbá fordított arányosságot figyeltek meg az adiponektin vérplazmában mért szintje és a testzsír aránya között (Wang és mtsai, 2006; Daniele és mtsai, 2008). A leptin gén (LEP) által kódolt hormon elsősorban a fehér zsírszövetben termelődik (Villalba és mtsai, 2009), kiemelkedő szerepe van a testtömeg szabályozásában, részt vesz a táplálékfelvétel és az energia-leadás közötti egyensúly fenntartásában, a szaporodásban és a csontfejlődésben is (Barb és mtsai, 2001). A fokozott zsírfelhalmozásra és elhízásra hajlamosabb sertésekben a génről íródott mRNS szintje jóval magasabb a többi egyedhez viszonyítva (Ramsay és mtsai, 1998). Az 1994-ben, egerek LEP génjében felfedezett mutáció egyértelműen elhízáshoz vezetett (Zhang és mtsai, 1994), ami óriási lendületet adott a gén további tanulmányozásához a humán gyógyászatban és a sertéstenyésztésben egyaránt. A zsírsavkötő fehérjék elsődleges szerepe a zsírsavfelvétel szabályozásában és a zsírsavak intracelluláris szállításában van. A zsírsejt zsírsavkötő fehérjék (A-FABP) szintje és a zsírsejtek száma, továbbá az intramuszkuláris zsírtartalom között összefüggés figyelhető meg (Damon és mtsai, 2006). A húsminőség és ízletesség szempontjából az intramuszkuláris zsírtartalomnak fokozott jelentősége van, hiszen az íz- és aromaanyagok zsírban oldódva találhatók meg a húsban (Fernandez és mtsai, 1999). Vizsgálataink célkitűzése volt, hogy az adiponektin (ADIPOQ), a zsírsejt zsírsavkötő fehérje (A-FABP) és a leptin (LEP) gének működését összehasonlítsuk szőke mangalica×duroc sertések hátszalonnájában és izomszövetében.
Anyagok és módszerek Az expressziós vizsgálatokhoz szükséges hátszalonna- és izommintákat (m. levator scapulae) a Pick Szeged Zrt. szegedi vágóhídján gyűjtöttük. A kísérletbe vont 5 szőke mangalica×duroc kocahízót az Olmos és Tóth Kft. biztosította. Az állatok élőtömege 137,3±8,5 kg volt. Az RNS-alapú vizsgálatok egyik kritikus pontja a mintavétel, hiszen a DNS-nél sokkal instabilabb és a környezetünkben általánosan elterjedt RNS-bontó enzimek (RNázok, ribonukleázok) által veszélyeztetett RNSállomány a vágást követően rövid időn belül degradálódhat; ennek elkerülése érdekében a mintavételt a vágást követő legfeljebb 45 percen belül végeztük. Az 1,5-2 g közötti mintákat műanyag fagyasztócsövekbe (VWR International) helyeztük és az adatok rögzítését (egyed fajtája, azonosító száma) követően azonnal folyékony nitrogénbe (–196°C) mártottuk. A szállítás és a feldolgozásig történő tárolás is a mintagyűjtő nitrogéntartályban történt. Az RNS izolálását a TRIzol módszer alapján végeztük (Chomczynski és Sacchi, 1987), TRIreagent (Life Technologies), kloroform és 1-bróm-3-klórpropán (VWR International) felhasználásával. Egy extrakció során hozzávetőleg 100-150 mg hátszalonna és izommintát dolgoztunk fel. A kinyert RNS mennyisége jellemzően nagyobb volt izom esetében: 500-1500 ng/µl, a zsírszövet 70-150 ng/µl-jéhez viszonyítva. A minták koncentrációját 50 ng/µl-re állítottuk be. Az izolált RNS mennyiségét Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) spektrofotométerrel állapítottuk meg (1. ábra). A spektrofotométer kis mennyiségű (1-2 µl) mintában méri a koncentrációt, továbbá 230, 260 és 280 nm-en elemzi a minták abszorbanciáját, az adatokból pedig arányszámokat képez. A 260/280 és a 260/230 nm-en mért abszorbancia-arányokból következtethetünk az izolátum tisztaságára is.
440
Megfelelő tisztaságúnak tekintettük a legalább 1,8 feletti 260/280 és 260/230 értékekkel jellemzett RNSizolátumokat.
1. ábra. Hátszalonna mintából izolált teljes RNS mennyiségi meghatározása Nanodrop 2000 spektrofotométer segítségével.
Az RNS-minták integritását agaróz gélelektroforézis alkalmazásával ellenőriztük (2. ábra). A gél festéséhez etídium-bromidot (Promega) használtunk. A vizsgálatok során kizárólag a tisztán látható, ép 18S és 28S rRNS-t mutató, nem degradálódott minták használhatók fel. A tisztított RNS-pelletet DEPC (dietilpirokarbonát)-kezelt, nukleázmentes vízben oldottuk vissza.
2. ábra. A zsír- és izomszövetből izolált teljes RNS integritásának vizsgálata 1%-os agaróz gélben.
441 441
A valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR) eredményét befolyásoló potenciális DNS-szennyezés elkerülése érdekében a tisztított RNS-izolátumokat DNáz kezelésnek vetettük alá, amely során az RQ1 RNasefree DNase kitet (Promega) alkalmaztuk. A reakcióelegyet legalább 30 percig 37°C-on tartottuk, majd a DNáz enzimet 65°C-on inaktiváltuk. Reverz transzkripció során az izolált teljes RNS-ről cDNS-t állítottunk elő iScript cDNA synthesis (Bio-Rad Laboratories) kit segítségével. A cDNS szintézishez 500 ng RNS-t használtunk fel. A cDNS előállítása oligo(dT) és random hexamer primerek keverékével történt. Az előállított cDNS-t 1:100 arányban hígítottuk a qPCR alkalmazását megelőzően. Az optimális hígítási mérték kiválasztásához standard hígítási sorokat készítettünk.
A β-actin, ADIPOQ, LEP és A-FABP génszakaszok amplifikálása az 1. táblázatban bemutatott primerek felhasználásával történt.
1. táblázat. Az expressziós vizsgálatok során alkalmazott primerek. Gén
Szekvencia (5’–3’)
Hossz
β-actin1
F: CCAGGTCATCACCATCGG; R: CCGTGTTGGCGTAGAGGT
158 bp
ADIPOQ2 F: CGAGAAGGGTGAGAAAGGAG; R: TAGGCGCTTTCTCCAGGTTC
123 bp
LEP2
102 bp
F: TGACACCAAAACCCTCATCA; R: ATGAAGTCCAAACCGGTGAC
A-FABP3 F: CAGGAAAGTCAAGAGCACCA; R: TCGGGACAATACATCCAACA 1 Luo és mtsai (2009) 2 Cirera és mtsai (2013) 3 Zhao és mtsai (2009)
227 bp
A vizsgálatok során a Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System-et használtuk átlátszó („clear”) plateekkel. A reakciók összeállítása a következő volt: 10 µl SsoFast EvaGreen supermix (Bio-Rad Laboratories), 1-1 µl forward és reverse primer, 1 µl cDNS és nukleázmentes víz 20 µl-ig.
442
A reakciók beállításai a következők voltak: •
ADIPOQ esetében: 95°C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95°C-on 5 s-ig és 60°C-on 5 s-ig
•
LEP esetében: 95°C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95°C-on 5 s-ig és 56°C-on 5 s-ig
•
A-FABP esetében: 95°C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95°C-on 5 s-ig és 58°C-on 5 s-ig
•
a referenciagénként alkalmazott β-actin kapcsolódási hőmérséklete az aktuális vizsgált gén hőmérsékletével egyezett meg. A különböző hőmérsékleteken végzett reakciók esetében a β-actin amplifikáció hatékonysága 93±8% volt.
Az optimális primer-kapcsolódási hőmérséklet és cDNS-hígítási arány megállapítása érdekében tízszeres hígítási sorokat készítettünk (3. ábra).
3. ábra. A reakciók hatékonyságának ellenőrzése ismert relatív koncentrációjú standard-ok segítségével.
A supermixben található EvaGreen egy fluoreszcens nukleinsav-festék, amely segítségével – a SYBR Green-alapú módszerhez hasonlóan – ciklusonként detektálható a keletkező PCR-termékek mennyisége. Mivel a módszer nem termék-specifikus, különösen fontos az olvadási (melting) teszt elvégzése (4. ábra) és negatív (cDNS nélküli) kontroll futtatása valamennyi reakció esetében.
4. ábra. Az egyes gének PCR-termékeinek specifikus olvadási görbéi.
443 443
A génexpresszió értékelése delta delta Ct (2-∆∆Ct) módszer alkalmazásával, β-actin referenciához normalizálva történt. A statisztikai értékeléshez az SPSS for Windows v16.0 program Tukey-tesztjét használtuk.
Eredmények és értékelés Az ADIPOQ, az A-FABP és a LEP génről íródott mRNS szintje is detektálható volt a keresztezett egyedek zsírés izomszövetében egyaránt (5. ábra). Az ADIPOQ expressziója a zsírszövetben szignifikáns (P<0,05) mértékben meghaladta az izomban megállapított értéket. Az izomszövetben való kifejeződés hátterében az intramuszkuláris zsírsejtek ADIPOQ-termelése áll. Az ADIPOQ hosszú hátizomban való kifejeződéséről számoltak be Ding és mtsai (2004) a Lee Sung taiwani fajta esetében, míg keresztezett lapály×yorkshire♀ × duroc♂ egyedeknél izomban nem fejeződött ki a gén. Összefüggést figyeltek meg továbbá az ADIPOQ izombeli expressziója és az intramuszkuláris zsírtartalom között is: 2,55% körüli izomközötti zsír esetén detektálható volt mRNS, míg 1,6% körül még nem. A mangalica duroc fajtával való keresztezéseiben is megjelenő fokozott zsírfelhalmozási hajlam megnyilvánul a modern fajták húsához viszonyított magasabb izomközötti zsírtartalomban, ami hozzájárul az ADIPOQ izomszövet-beli megjelenéséhez, kifejeződéséhez is.
5. ábra. Az adiponektin (ADIPOQ), a zsírsejt zsírsavszállító-fehérje (A-FABP) és a leptin (LEP) gének expressziója a keresztezett egyedek zsír- és izomszövetében a β-actin referenciagén segítségével normalizálva.
444
Normalizált expressziós ráta
4,5 4 3,5 3 2,5
Zsírszövet
2
Izomszövet
1,5 1 0,5 0 ADIPOQ
A-FABP
LEP
Az A-FABP és a LEP gének expressziós mintázata hasonlóan alakult: mindkét gén aktívabb a zsírszövetben, de jelentős a kifejeződésük izomszövetben is. A nagymértékű izomban való expresszió révén összefüggésben állnak az izomközötti zsírtartalom alakulásával. Az A-FABP szintje és az intramuszkuláris zsírmennyiség közötti összefüggést erősítették meg Luo és mtsai (2009) lapály és kínai taihu eredetű keresztezett ártányokban. A kísérleti állatokban a lenmag-etetés idejével arányosan növekedő izomközötti zsírtartalmat és A-FABP expressziót figyeltek meg a hosszú hátizomban. A LEP gén hasonló expressziójáról számoltak be Ramsay és Richards (2005) yorkshire×lapály keresztezett egyedek esetében, bár a hátszalonna és izomszövet közötti különbség esetükben szignifikáns (P<0,05) volt. További vizsgálatainkban a keresztezett egyedek eredményeit fajtatiszta mangalica és modern, „intenzív” fajták (pl. magyar nagy fehér) expressziós mintázatával vetjük össze annak érdekében, hogy azonosíthassuk a nagymértékben különböző zsírosodási hajlamot mutató fajták génműködése szintjén jelentkező különbségeket.
Köszönetnyilvánítás A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. A mintavételi lehetőségért és segítségükért köszönetet mondunk az Olmos és Tóth Kft. és a Pick Szeged Zrt. munkatársainak.
Irodalomjegyzék 1.
Barb, C.R.; Hausman, G.J.; Houseknecht, K.L. (2001): Biology of leptin in the pig. Domestic Animal Endocrinology, 21. 297–317.
445 445
2.
Chomczynski, P.; Sacchi, N. (1987): Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162. 156–159.
3.
Cirera, S.; Jensen, M.S.; Elbrond, V.S.; Moesgaard, S.G.; Christoffersen, B.O.; Kadarmideen, H.N.; Skovgaard, K.; Bruun, C.V.; Karlskov-Mortensen, P.; Jorgensen, C.B.; Fredholm, M. (2013): Expression studies of six human obesity-related genes in seven tissues from divergent pig breeds. Animal Genetics, 45. 59–66
4.
Damon, M.; Louveau, I.; Lefaucheur, L.; Lebret, B.; Vincent, A.; Leroy, P.; Sanchez, M.P.; Herpin, P.; Gondret, F. (2006): Number of intramuscular adipocytes and fatty acid binding protein-4 content are significant indicators of intramuscular fat level in crossbred Large White × Duroc pigs. J. Anim. Science, 84. 1083–1092.
5.
Daniele, A.; Cammarata, R.; Masullo, M.; Nerone, G.; Finamore, F.; D’Andrea, M.; Pilla, F.; Oriani, G. (2008): Analysis of adiponectin gene and comparison of its expression in two different pig breeds. Obesity, 16. 1869–1874.
6.
Ding, S.T.; Liu, B.H.; Ko, Y.H. (2004): Cloning and expression of porcine adiponectin and adiponectin receptor 1 and 2 genes in pigs. Journal of Animal Science, 82. 3162–3174.
7.
Fernandez, X.; Monin, G.; Talmant, A.; Mourot, J.; Lebret, B. (1999): Influence of intramuscular fat content on the quality of pig meat – 1. Composition of the lipid fraction and sensory characteristics of m. longissimus lumborum. Meat Science, 53. 59–65.
8.
Havel, P.J. (2002): Control of energy homeostasis and insulin action by adipocyte hormones: Leptin, acylation stimulating protein, and adiponectin. Current Opinion in Lipidology, 13. 51–59.
9.
Luo, H.F.; Wei, H.K.; Huang, F.R.; Zhou, Z.; Jiang, S.W.; Peng, J. (2009): The effect of linseed on intramuscular fat content and adipogenesis related genes in skeletal muscle of pigs. Lipids, 44. 999–1010.
10. Ramsay, T.G.; Richards, M.P. (2005): Leptin and leptin receptor expression in skeletal muscle and adipose tissue in response to in vivo porcine somatotropin treatment. Journal of Animal Science, 83. 2501–2508. 11. Ramsay, T.G.; Yan, X.; Morrison, C. (1998): The obesity gene in swine: sequence and expression of porcine leptin. Journal of Animal Science, 76. 484–490. 12. Villalba, D.; Tor, M.; Vidal, O.; Bosch, L.; Reixach, J.; Amills, M.; Sanchez, A.; Estany, J. (2009): An agedependent association between a leptin C3469T single nucleotide polymorphism and intramuscular fat content in pigs. Livestock Science, 121. 335–338. 13. Wang, Y.; Lam, K.S.L.; Xu, A. (2006): Adiponectin as a therapeutic target for obesity-related metabolic and cardiovascular disorders. Drug Development Research, 67. 677–686. 14. Zhang, Y.; Proenca, R.; Maffei, M.; Barone, M.; Leopold, L.; Friedman, J.M. (1994): Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 372. 425–432. 15. Zhao, S.M.; Ren, L.J.; Chen, L.; Zhang, X.; Cheng, M.L.; Li, W.Z.; Zhang, Y.Y.; Gao, S.Z. (2009): Differential expression of lipid metabolism related genes in porcine muscle tissue leading to different intramuscular fat deposition. Lipids, 44. 1029–1037.
446
