Ösztrogén-, D-vitamin- és kalcium-érzékelõ receptorok genotípusainak szerepe a colorectalis daganatok patogenezisében

KLINIKAI KUTATÁS

Ösztrogén-, D-vitamin- és kalcium-érzékelõ receptorok genotípusainak szerepe a colorectalis daganatok patogenezisében 1

2

Speer Gábor dr., Cseh Károly dr. , Fuszek Péter dr., Dworak Ottó dr. , Vargha Péter, Takács István dr., Nagy Zsolt dr. és Lakatos Péter dr. Semmelweis Egyetem, Budapest, Általános Orvostudományi Kar, I. Belklinika (igazgató: deChâtel Rudolf dr.) 1 Károlyi Kórház, Budapest, I. Belosztály (osztályvezető: Cseh Károly dr.) 2 Pathologisches Institut, Németország, Erlangen (osztályvezető: Dworak Ottó dr.) A szerzõk az ösztrogén-receptor gén Xbal, a D-vitaminreceptor gén BsmI és a kalcium-érzékelõ receptor gén A986S polimorfizmusait vizsgálták 56 colorectalis daganatban szenvedõ betegben. Meghatározták az erbB-2, az epidermalis növekedési faktor-receptor és a ras onkogének, illetve a p53 tumorszuppresszor gén expresszióját és kapcsolatát a vizsgált receptorok különbözõ genotípusaival. A betegeket öt évig követték. Az ösztrogénreceptor XX és a D-vitamin-receptor bb genotípusában szignifikánsan alacsonyabb erbB-2 expressziót találtak (6/56 és 11/56), szemben az xx, Xx, illetve BB, Bb genotípusokkal (31/56, illetve 26/56; p = 0,0043, ill. 0,041). Az XX genotípussal szignifikánsan alacsonyabb epidermalis növekedési faktor-receptor expresszió is járt, míg az xx és Xx genotípusban ez szintén gyakoribb volt (7/56 vs. 30/56; p = 0,049). A két receptor genotípusainak kombinálása során találtak olyan allélvariációt (XXbb), amelyhez szignifikánsan alacsonyabb erbB-2 expresszió tartozott, szemben más genotípus-kombinációkkal (Xxbb, XxBb, XXBb), ahol magasabb expressziót találtak (2/7 vs. 7/7, 4/5, 4/5; p = 0,0011). Azokban a betegekben, akikben a vizsgált onkogének együttes expressziója mellett a kalcium-érzékelõ receptor AA genotípusát találták, a daganat felfedezésekor magasabb UICC stádiumban voltak, szemben az AS genotípusú betegekkel. Ezen túl az AA genotípus elõfordulása a betegek között szignifikánsan gyakoribb volt a kontrollokhoz képest (36/56 vs. 36/112; p = 0,0004). Eredményeik alátámasztják az eltérõ onkogénexpressziókkal járó ösztrogén-, és D-vitamin-receptor gén-polimorfizmusainak szerepét a colorectalis daganatok kialakulásának patogenezisében. Felmerül továbbá az a lehetõség is, hogy a kalcium-érzékelõ receptor A986S polimorfizmusa hatással lehet a betegség kimenetelére, esetleges prognosztikai markere lehet.

The role of estrogen-, vitamin D- and calcium-sensing receptor genotypes in the pathogenesis of human colorectal cancer. In this study, the XbaI polymorphisms of the estrogen-, the BsmI polymorphism of the vitamin D- as well as the A986S polymorphism of the calciumsensing receptor genes were investigated in 56 patients with colorectal cancer. The expression of erbB-2, epidermal growth factor receptor, ras, p53 and their relationship to estrogen-, vitamin D- and calcium-sensing receptor genotypes were also studied. In subjects exhibiting XX genotype of the estrogen receptor gene or bb genotype of the vitamin D receptor gene, erbB-2 expression was significantly lower compared to those with xx, Xx or BB, Bb (6/56 and 11/56 vs. 31/56 and 26/56; p = 0.0043 and 0.041). The presence of the XX alleles of estrogen receptor gene significantly correlated with the overexpression of the epidermal growth factor receptor expression in tumors, whereas in xx and Xx genotypes, significantly higher expression was seen (7/56 vs. 30/56; p = 0.049). Analyzing the combinations of the two gene allelic variants, we have found XXbb genotype to be associated with a significantly lower erbB-2 expression, compared to other combinations (Xxbb, XxBb, XXBb) (2/7 vs. 7/7, 4/5, 4/5; p = 0.0011). Patients with AA calcium-sensing receptor genotype were in higher UICC stages at the time of discovery of their disease than those with AS genotype. The AA allelic variant of the calcium-sensing gene was more frequent among patients with colorectal cancer compared to controls (36/56 vs. 36/112; p = 0.0004). Our observations raise the possibility that estrogen-, and vitamin D receptor gene polymorphisms accompanied with variable oncogene expression might influence the pathogenic processes resulting in the development of colorectal cancer. The A986S polymorphism of calcium-sensing receptor might also be a prognostic marker of the disease.

Kulcsszavak: ösztrogén-receptor, D-vitamin-receptor, kalciumérzékelõ receptor, erbB-2, EGFR, colorectalis daganat

Key words: estrogen receptor, vitamin D receptor, calciumsensing receptor, erbB-2, EGFR, colorectal cancer

Rövidítések: BMD = csont-ásványianyag-sűrűség; CaSR = kalciumsensing (-érzékelő) receptor; EGFR = epidermalis növekedési faktorreceptor; ER = ösztrogén-receptor; ERE = ösztrogén response element (ER kötőhely); PCR = polimerase chain reaction (polimeráz láncreakció); UICC = Nemzetközi Rákellenes Unió (Union Internationale Contre le Cancer) stádiumbeosztási rendszere; VDR = D-vitamin-receptor; VDRE = vitamin D response element (VDR kötőhely)

A colorectalis daganat a nyugati világban a második helyen álló halálok. Az utóbbi években egyre több adat látott napvilágot, melyek szerint a colorectalis epithel sejtciklusának regulációjában a szteroidhormon receptorok is szerepelnek. Ezek közé tartozik az ösztrogén-receptor (ER) és a D-vitamin-receptor (VDR) is.

Orvosi Hetilap 2001, 142 (18), 947–951.

947

Posztmenopauzában az ösztrogénpótló-kezelés 30–50%-kal csökkenti a colorectalis daganatok incidenciáját (5, 11). A D-vitaminnak és receptorának – a kalcium-anyagcsere szabályozásán túl – sejtosztódást és proliferációt gátló, illetőleg sejtdifferenciációt serkentő hatása van. Az ER és a VDR a nukleáris szteroid/tiroid receptorcsalád tagja. Az ösztrogén fokozza a VDR expresszióját, így a D-vitamin/VDR rendszer hatásait is befolyásolja (24). ER és VDR jelenlétét írták le colontumor-sejtvonalakban és humán colorectalis daganatokban (19, 38). Az ER és a VDR polimorfizmusai számos betegségben jellemző megoszlást mutatnak, így az ER gén XbaI polimorfizmusának hatása van az osteoarthritis (36), a 2-es típusú diabetes mellitus (32) kialakulására és – a VDR gén BsmI polimorfizmusához hasonlóan – kapcsolatát mutatták ki a csont-ásványianyag sűrűségével (BMD) is (22). A VDR gén BsmI polimorfizmusa és az 1-es típusú diabetes mellitus (15), illetve az emlődaganat kialakulása (17) között találtak összefüggést. Klinikai adatok alapján is felmerül a lehetősége az ER és a VDR gének interakciójának (33), például az ER gén XbaI és a VDR gén BsmI bizonyos allélkombinációiban jobban csökken a BMD, mint amikor egyedül vizsgálják a két polimorfizmust (40).

A D-vitamin mellett, in vivo és in vitro vizsgálatok bizonyítják a kalciumnak a colorectalis daganatokkal szembeni (25, 28) védő hatását. A csökkent kalcium- és D-vitamin-bevitel fokozott rizikót jelent a colorectalis daganatok kialakulására. Kalciumion (Ca2+) szükséges a sejtosztódáshoz és sejtdifferenciációhoz, intercellularis kapcsolatok és szignáltranszdukciós kaszkádok résztvevője (3). Ikervizsgálatok szerint a szérumkalciumszint nagyrészt genetikai faktorok által meghatározott (39). Ennek kulcstényezője lehet az ún. kalcium-érzékelő receptor (CaSR), amely az extracelluláris ionos kalcium koncentrációját detektálva az adott célszervekben reagál a változásra, így szabályozva a szervezet kalcium-homeosztázisát (4). Egy munkacsoport összefüggést talált a CaSR gén 986 Ala/Ser polimorfizmusa (A986S) és az eltérő kalciumszintek között egészséges felnőttekben (6). Mindezek mellett ismert, hogy colorectalis daganatokban döntően az erbB-2 (más néven HER-2/neu), az epidermalis növekedési faktor-receptor (EGFR, más néven erbB-1) és a ras onkogének megnövekedett expressziójának, illetőleg a p53 tumorszuppresszor gén mutációjának van diagnosztikus és prognosztikus jelentősége (2, 12, 14, 20, 27). A nukleáris szteroid/tiroid receptorcsalád részben az EGFR és az erbB-2 receptor transzkripciójának szabályozása révén fejti ki a sejtproliferációt befolyásoló hatását (8). Az erbB-2 és az EGFR a tirozinkináz receptorok családjába tartozik (23), foszforilációs kaszkádrendszert elindítva a sejtosztódás és a sejtdifferenciálódás szabályozásáért felelős gének expresszióját szabályozzák. Mindkettő megnyilvánul a normális emberi colon-epitheliumban, túlzott jelenlétük azonban malignitást okozhat, sőt az erbB-2 fokozott expresszióját már a premalignus laesiókban is megfigyelték (7, 20). A p53 megnövekedett intracelluláris szintje összefügg mutációjának jelenlétével és korrelál a rossz prognózissal (41). A ras túlzott expressziója (azaz immunhisztokémiai detektálhatósága) folyamatos szignált jelent a sejtosztódásra, független prognosztikai faktor (2, 14). Ezen tanulmányban vizsgáltuk az ER gén XbaI, a VDR gén BsmI és a CaSR gén A986S polimorfizmusainak eloszlását colorectalis tumorban szenvedőkben és egészségesekben, ezek összefüggését az erbB-2, az EGFR, a ras és a p53 expressziójával, valamint a különböző genotípusok és kombinációik kapcsolatát az UICC stádiumokkal és a prognózissal. A betegeket 5 évig követtük. 948

Betegek és módszerek 56 sebészileg kezelt betegből, 1992–1994 között eltávolított colorectalis adenocarcinoma került feldolgozásra (átlagéletkor = 64 (23–84) év, nő/férfi = 29/27, UICC stádium: I: 12/56, II: 20/56, III: 19/56, IV: 5/56, malignitás foka: G2 = 56/56). A kontrollcsoportban is meghatároztuk az ER, a VDR és a CaSR genotípusokat. A kontrollcsoportba 112, korban illesztett egészséges személyt vontunk be (átlagéletkor = 63 (23–83) év, nő/férfi = 58/54), gastrointestinalis fájdalom hiánya, negatív családi anamnézis a colorectalis daganatokra és Weber-negativitás alapján. A szövettani mintákat az immunhisztokémiához 4%-os formaldehidben fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A proteinblottoláshoz natív szövettani mintákat használtunk. A polimorfizmusok meghatározásához genomikus DNS-t izoláltunk a sebészileg eltávolított daganatokból és az épben kimetszett normális mucosából a következő módszerrel: 100 mg mechanikusan homogenizált szövetdarabot 1,2 ml DNS lízis oldatban (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0 25 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, és 0,1 mg/ml proteináz K végkoncentráció) 50 °C-on, 18 órán keresztül emésztettünk. A DNS koncentrációját extrahálás és kicsapás után UV-spektrofotométerrel mértük. A kontrollcsoport DNS-mintáit perifériás vérből izoláltuk.

Genotipizálás Az ER gén XbaI, a VDR gén BsmI és a CaSR gén A986S polimorf régiót tartalmazó szekvenciáját PCR-technikával amplifikáltuk. Az ER gén PCR-hez felhasznált primerek: primer 1:5’ CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC 3’ 34-mer, primer 2:5’ TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA 3’ 33-mer (10 µM végső koncentráció). A VDR gén PCRhez felhasznált primerek: primer 1:5’ AAC CAG CGG GAA GAG GTC AAG GG 3’ 23-mer, primer 2:5’ CAA CCA AGA CTA CAA GTA CCG CGT CAG TGA 3’ 30-mer (2,5 µM végkoncentráció). A PCR reakció mindkét gén esetében 50 µL térfogatban zajlott, a következő összetételben: 5 µl 10 × PCR reakció puffer, 1 µl dNTP (10 mM végkoncentráció), 5 µl 25 mM MgCl2, 10 µl DNS (1 µg), 1–1 µl primer 1 és 2, 0,4 µl (2 U/µl) Taq (Promega, Madison, USA) és 26,6 µl desztillált víz. A PCR program a következő volt: 95 °C 2 min, 85 °C 3 min, 5 × (70 °C 210 sec, 95 °C 30 sec), 30 × (70 °C 105 sec, 90 °C 30 sec), 10 × (70 °C 210 sec, 95 °C 30 sec) és 70 °C 15 min. Az amplifikált PCR terméket az ER polimorfizmusnál XbaI enzimmel (Promega, Madison, USA) emésztettük 37 °C-on éjszakán át, míg a VDR polimorfizmusok meghatározásához BsmI restrikciós enzimet használtunk (BioLabs, Beverly, USA) (65 °C, 90 min). Emésztés után a reakcióelegyet 10 µg/ml etidium-bromidot tartalmazó 2%-os agarózgélen futtattuk. Értékelés: X, B jellel jelöljük az allélt, ha az nem tartalmazza a XbaI, BsmI restrikciós enzim helyet – x, b, ha tartalmazza azt, és az enzim emészt. Így (mivel minden génből apai és anyai is van) a genotípusok a következők: XX, Xx, xx, illetőleg BB, Bb, bb. A CaSR gén A986S polimorfizmus meghatározásához felhasznált primerek: primer 1:5’ ACG GTC ACC TTC TCA CTG ACG TTT GAT GAG CCT CAG AAG TAC T 3’ 43-mer, primer 2:5’ GCT TTG ATG AGC CTC AGA AGA TCG 3’ 24-mer, primer 3:5’ CTC TTC AGG GTC CTC CAC CTC T 3’ 22-mer (10 µM végső koncentráció). A PCR reakció 20 µl térfogatban, a következő kondiciók mellett zajlott: 2 µl 10 × PCR reakció puffer, 4 µl dNTP (1mM), 1,2 µl 25 mM MgCl2, 1 µl DNS (25 ng/ml), 3–2–1 µl (primer -3, -2, -1), 0,1 µl (0,5 U/µl) Taq (Promega, Madison, USA) és 5,7 µl desztillált víz. A PCR program a következő volt: 94 °C 12 min, 35 × (94 °C 20 sec, 55 °C 20 sec, 72 °C 30 sec) és 72 °C 5 min. A CaSR génnek a 986-os helyen való eltérése alapján (attól függően, hogy alanint vagy szerint tartalmaz) két típusa van: az A allél és az S allél, ezért a genotípusok a következők: AA, AS, SS. Az electroforetikus szeparáció 7%-os Spreadex/acrilamide-bis (29:1) gélen történt (Elchrom, Cham, Svájc). A PCR reakciókhoz Hybaid Express (Teddington, Middlesex, Anglia) készüléket használtunk.

Immunhisztokémia és proteinblotting Az erbB-2, EGFR, ras és p53 fehérjék expresszióját immunhisztokémiai és proteinblotting módszerekkel határoztuk meg, amelyek részletes leírását korábbi közleményünk tartalmazza

(31). A szövettani mintákat a proteinblottoláshoz mechanikusan szolubilizáltuk. A mintákat 7 mg/ml fehérjekoncentrációra állítottuk és 1%-os BSA-val való blokkolás után 200 µl mintát blottoltunk a nitrocellulóz membránra (0,45 µm pórusméret) Bio-Dot mikrofiltrációs apparátus (BioRad) használatával. A következő hígításokat alkalmaztuk a monoklonális antitesteknél: erbB-2 (BioGenex, Mainz, Németország) 1:40, EGFR külső domén (Boehringer, Mannheim, Németország) 1:20, ras (Boehringer) 1:20, p53 (DAKO DO-7, Hamburg, Németország) 1:40. Az inkubáció szobahőmérsékleten, éjszakán keresztül zajlott. Mosás után kecske anti-egér Ig-Fab peroxidázzal konjugált (Boehringer) második antitestet használtunk 1:1000 hígításban 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten. A peroxidáz aktivitását 4 kloro-naftolt, peroxidot, TBS-t és metanolt tartalmazó oldattal tettük láthatóvá. Mindkét esetben szemikvantitatív analízist végeztünk. Csak azokat a mintákat vontuk be a vizsgálatba, melyek mindkét módszerrel azonos eredményt adtak.

Statisztika A polimorfizmusok eloszlásának és a különböző genotípusok és onkoprotein-expressziók közti korrelációk meghatározásához c2 és Fisher-exact tesztet használtunk.

Eredmények Az ER gén xx és Xx, illetve a VDR gén BB és Bb genotípusaiban szignifikánsan gyakoribb erbB-2 expressziót mutattunk ki, szemben az XX és bb genotípussal (1. táblázat). Az ER gén XX genotípusában szignifikánsan ritkább EGFR külső domén-expressziót is találtunk (EGFR-expresszió nincs: xx = 6/19, Xx = 4/19, XX = 9/19; van EGFR-expresszió: xx = 12/37, Xx = 18/37, XX = 7/37; p = 0,049). Az ER és a VDR genotípusok a többi onkogén expressziójával nem korreláltak. Nem találtunk összefüggést a vizsgált ER és VDR-gén polimorfizmusok és az UICC stádiumok, illetve az ötéves túlélés között sem. Az ER gén XbaI és a VDR gén BsmI polimorfizmusának kombinációja esetén az XXbb genotípusú betegekben szignifikánsan kevésbé expresszálódott az erbB-2 (5/7 esetben nem volt, 2/7 esetben volt expresszió) szemben más genotípus-kombinációkkal (Xxbb = 0/7 vs. 7/7, XxBb = 1/5 vs. 4/5, XXBb = 1/5 vs. 4/5, xxBb = 1/5 vs. 4/5; p = 0,0011). Hasonlóan az Xxbb és XxBb genotípusok esetén szignifikánsan gyakoribb EGFR külső domén-expresszió volt látható (nincs EGFR-expresszió: Xxbb = 1/7, XxBb = 0/5, van EGFR-expresszió: Xxbb = 6/7, XxBb = 5/5) szemben más genotípusokkal (XXbb = 3/7 vs. 4/7, XXBb = 3/5 vs. 2/5, xxBb = 2/5 vs. 3/5; p = 0,026) (csak a leggyakoribb kombinációkat tüntettük fel, n = 29). Nem volt eltérés az ER/VDR/CaSR más allélkombinációi esetében az összes vizsgált paraméterben. 1. táblázat: A erbB-2 gén expressziója és az ösztrogén-recptor gén (ER) illetve a D-vitamin-receptor gén (VDR) polimorfizmusainak viszonya colorectalis adenocarcinomában

Genotípus ER gén

erbB-2 expresszió nincs (n = 19) van (n = 37) Összes (n = 56)

VDR gén

xx és Xx

XX

BB és Bb

bb

9/56 31/56* 40

10/56 6/56 16

8/56 26/56** 34

11/56 11/56 22

*c2= 8,157, p= 0,0043; **c2= 4,18, p= 0,041

Az ER gén XbaI és a VDR gén BsmI genotípus eloszlása nem különbözött a beteg- és kontrollcsoportban (VDR: betegek: BB = 13/56, Bb = 21/56, bb = 22/56, kontroll: BB = 21/112, Bb = 54/112, bb = 37/112; ER: betegek: XX = 16/56, Xx = 22/56, xx = 18/56, kontroll: XX = 16/112, Xx = 71/112, xx = 25/112). A normális mucosa és a daganatszövet genotípusa között sem volt eltérés. A CaSR gén A986S genotípus-eloszlása viszont szignifikánsan eltérő volt a két csoport között, azaz a CaSR gén AA genotípusa gyakrabban fordult elő a betegekben, szemben a kontrollcsoporttal (betegek: AA = 36/56, AS = 20/56, SS = 0/56, kontroll: AA = 36/112, AS = 74/112, SS = 2/112; p = 0,0004). Azon betegek esetében, akiknél a vizsgált 4 onkogén (illetőleg minimum 3) együttes jelenléte volt észlelhető és CaSR AA genotípusúak voltak, megállapítható volt, hogy szignifikánsan magasabb UICC stádiumban került daganatuk felismerésre, míg az AS genotípushoz alacsonyabb UICC stádiumok tartoztak (2. táblázat). Az ötéves követési periódus alatt (1992–1999) 17/56 beteg halt meg tumorrecidíva, illetve metasztázisok következtében, mindannyian a III., illetve IV. UICC stádiumokban. A meghalt betegek között az AA genotípus előfordulása szignifikánsan gyakoribb volt az öt év után még élő betegekéhez képest, azaz AA (n = 36): 13/36 vs. 23/36, AS (n = 20): 4/20 vs. 16/20 (p < 0,05). Nem volt korreláció azonban a CaSR gén A986S allélpolimorfizmusa és különkülön az erbB-2, az EGFR külső domén, a ras és a p53 expressziója között sem. Az immunhisztokémia és a proteinblotting eredménye azonos volt az onkoproteinek normális mucosában, illetve az adenocarcinomában való expressziójának kimutatásában. Az onkoproteinek expressziója szignifikánsan különbözött a normál és a tumoros szövetben (3. táblázat). Az erbB-2, az EGFR külső domén, a ras és a p53 proteinek együttes (ko)-expressziója a daganatszövetben szignifikánsan magasabb volt, mint a normális mucosában (16/56 vs. 1/56; p < 0,001). Az erbB-2 és az EGFR expressziója korrelált a rossz prognózissal (p < 0,05). 2. táblázat: A kalcium-érzékelõ receptor (CaSR) A986S polimorfizmusa és a vizsgált gének együttes expressziója (4 ill. minimum 3) a különbözõ UICC stádiumú colorectalis adenocarciomában szenvedõ betegekben (a vizsgált 56 betegbõl 32 esetében fordult elõ 3 illetve 4 onkogén együttes expressziója)

UICC

AA (n=20) AS(n=12)

1

2

3

4

4/20 4/12

3/20 6/12

9/20 2/12

4/20 0/12

p= 0,026, c2= 4,97

3. táblázat: Az erbB-2 az EGFR külsõ domén, a ras és a p53 megnövekedett jelenléte colorectalis adenocarcinomában és a colorectum normális mucosájában

Daganatszövet

Normális mucosa

37/56* 37/56* 43/56* 39/56*

3/56 6/56 9/56 6/56

erbB-2 EGFR kölső domén p53 ras *p< 0,0001 vs. normális mucosa

949

Megbeszélés Munkánkban kapcsolatot találtunk az ER gén XbaI polimorfizmusa és az erbB-2, valamint az EGFR onkogének expressziója között, emberi colorectalis daganatokban, azaz találtunk olyan genotípust (XX), melyben alacsonyabb volt e két fehérje expressziója. Hasonlóan, a VDR gén bb genotípusával is ritkábban járt együtt az erbB-2 fehérje expressziója (31). Az ER/VDR genotípusok kombinációja esetén találtunk olyat (XXbb), amelyben alacsony, míg más genotípus-kombinációkban magasabb volt a két onkogén mennyisége. Az erbB-2 gén expressziója prognosztikai faktor colorectalis daganatokban (17, 20), míg az EGFR a colonmucosa hiperproliferatív állapotáért felelős (27). Az erbB-2 és az EGFR gyakran együttesen van jelen a tumorokban, ezáltal fokozottabban rontják a prognózist, mint egymagukban, mivel heterodimerizációjukkal sokszorosára nő a sejtproliferációs hatásuk (7, 23). Az EGFR külső doménje tartalmazza az erbB-2-vel heterodimert alkotó részt (29). Eredményeink, arra utalnak tehát, hogy az ER és a VDR gének egyes genotípusaival együtt járó megnövekedett erbB-2 és EGFR expresszió nagyobb rizikót jelent a daganat kialakulására. Az ER és a VDR gének általunk vizsgált polimorfizmusainak jelentőségét számos betegségben leírták (15, 17, 22, 36, 37). Munkánk újabb adattal szolgál az intronikus polimorfizmusok szerepének és az ER/VDR-rendszer interakciójának megértéséhez, amelynek egyik lehetséges kulcspontja a periférián az androgéneket ösztrogénekké konvertáló aromatáz enzim. Az aromatáz enzim D-vitamin/VDR komplex kötőhelyet (ún. VDRE) tartalmaz (13), azaz a D-vitamin/VDR-rendszer szabályozza a működését. Indirekt bizonyítékok támasztják alá a nukleáris szteroid/tiroid és a tirozinkináz receptorcsalád tagjai közötti interakciót (18). Adataink alapján az ösztrogén/ER és a D-vitamin/VDR a sejtproliferációt részben az erbB-2 és az EGFR expressziójának szabályozásával befolyásolhatja. Számos, a sejtproliferációt szabályozó gén tartalmaz VDRE-t és ösztrogén/ER komplex kötőhelyet (ERE) a promóter régiójában, ahova a hormon-receptor komplex bekapcsolódik és szabályozza az illető gén átírását. Az erbB-2 ERE-t (16), míg az EGFR VDRE-t tartalmaz (10). Másokhoz hasonlóan, azt találtuk, hogy a colorectalis daganatokban prognosztikai és patogenetikai faktornak számító erbB-2, EGFR, ras nagy mennyiségben van jelen, illetve a mutáns p53 is kimutatható, szemben a normális mucosával. A p53 központi szerepet játszik a colorectalis daganatok progressziójában (12, 14), expressziójának immunhisztokémiai detektálhatósága összefügg mutációjának jelenlétével, ugyanis a mutáció miatt sokszorosára nő a féléletidő, így kimutathatóvá válik, szemben a rövid féléletidejű normális p53-mal (41). A normális p53 funkció elvesztése a sejt genetikai instabilitásához vezet. A GTP-kötő fehérjék csoportjába tartozó ras, különböző növekedési faktorok jelátviteli pályájában vesz részt (például erbB-2, EGFR), megnövekedett expressziója állandó késztetést jelent a sejtosztódásra, független prognosztikai faktor (2, 14).

Az ER, a VDR és a CaSR gének általunk vizsgált polimorfizmusai önmagukban nem befolyásolták az UICC stádiumokat, azonban abban az esetben, ha a vizsgált onkogének együttes expressziója volt jelen, a CaSR gén A986S exonikus polimorfizmusa kapcsolatban volt az UICC stádiumokkal. Az AA genotípusú betegek a daganat felfedezésének idejében szignifikánsan magasabb UICC stádiumokban (III., IV.), azaz rosszabb állapotban voltak, szemben a heterozigótákkal (AS), akiknek az UICC stádiumuk alacsonyabb (I., II.) volt. Cole és mtsai kimutatták, hogy a homozigóta AA genotípus alacsonyabb szérum950

kalcium-szinttel jár együtt az AS heterozigótákhoz és az SS homozigótákhoz képest (6). A colon-adenocarcinomás betegeink között az AA genotípus sokkal gyakoribb volt, mint a kontrollcsoportban. Ezenfelül a vizsgált periódus alatt elhunyt betegek között az AA genotípus előfordulása szintén gyakoribb volt az öt év után még élő betegekhez képest. Eredményünk felhívja a figyelmet, hogy az élethosszan tartó – normál határokon belüli, de – viszonylagosan alacsonyabb szérumkalcium-koncentráció rizikófaktor lehet a colorectalis daganatok kialakulásában. Az utóbbi elképzelést támasztják alá azok a vizsgálatok, amelyek a D-vitamin és a kalcium antiproliferációs hatását in vivo és in vitro is megerősítik (21, 25, 35). Kísérletekben a zsírok (és más karcinogének) epithelialis proliferációt okozó hatását a kalcium- és D-vitamin-pótlás gátolta (26, 30, 42). Epidemiológiai adatok bizonyítják, hogy az alacsony kalcium- és D-vitamin-bevitel és a colorectalis daganatok előfordulásának gyakorisága között fordított összefüggés van (28), illetve a magas fitoösztrogén-tartalmú szemivegetáriánus diéta véd a colorectalis daganatok kialakulása ellen (1, 34). A legutóbbi metaanalízis szerint az ösztrogénpótló-kezelés 30–50%-kal csökkentette a colorectalis daganatok incidenciáját (5, 11). Eredményeink összefoglalásaként felhívjuk a figyelmet az ösztrogén/ER, a D-vitamin/VDR és a Ca2+/CaSR rendszer potenciális szerepére a colorectalis daganatok kialakulásának patogenetikai folyamatában, ennek a végleges igazolása azonban még további vizsgálatokat igényel. IRODALOM: 1. Adlercreutz, H., Mazur, W.: Phyto-oestrogens and Western diseases. Ann. Med., 1997, 29, 95–120. – 2. Boss, J. L., Fearon, E. R., Hamilton, S. R. és mtsai: Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature, 1987, 327, 293–297. – 3. Bostik, R. M.: Human studies of calcium supplementation and colorectal epithelial cell proliferation. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1997, 6, 971–980. – 4. Brown, E. M., Polack, M.: The extracellular calcium-sensing receptor: its role in health and disease. Ann. Rev. Med., 1998, 49, 15–29. – 5. Chen, M. J., Longnecker, M. P., Morgenstern, H. és mtsai: Recent use of hormone replacement therapy and the prevalence of colorectal adenomas. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7, 227–230. – 6. Cole, D. E. C., Peltekova, V. D., Rubin, L. A. és mtsai: A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor and circulating calcium concentrations. Lancet, 1999, 353, 112–115. – 7. Dougall, W. C., Qian, X., Greene, M. I.: Interaction of the neu p185 and EGF receptor tyrosine kinases: implications for cellular transformation and tumor therapy. J. Cell Bioch., 1993, 53, 61–73. – 8. Fernandez-Pol, J. A.: Modulation of EGF receptor protoonkogene expression by growth factors and hormones in human breast carcinoma cells. Crit. Rev. Oncog., 1991, 2, 173–185. – 9. Gennari, L., Becherini, L., Masi, L. és mtsai: Vitamin D receptor genotypes and intestinal calcium absorption in postmenopausal women. Calcif. Tissue Int., 1997, 61, 460–463. – 10. Gonzalez, E. A., Martin, K. J.: The human epidermal growth factor receptor promoter contains a vitamin D response element (abstract). J. Bone Miner. Res., 1997, 12, S332. – 11. Grodstein, F., Newcomb, P. A., Stampfer, M. J.: Postmenopausal hormone therapy and the risk of colorectal cancer: a review and metaanalysis. Am. J. Med., 1999, 106, 574–582. – 12. Hamelin, R., Laurent-Puig, P., Olschwang, S. és mtsai: Association of p53 mutations with short survival in colorectal cancer. Gastroenterol., 1994, 106, 42–48. – 13. Harada, N., Utsumi, T., Takagi, Y.: Tissue-specific expression of the human aromatase cytochrome P450 gene by alternative use of multiple exons I and promoters, and switching of tissue-specific exons I in carcinogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 11312–11316. – 14. Hayashi, Y., Widjono, Y. N., Ohta, K. és mtsai: Expression of EGF, EGF receptor, p53, v-erbB and ras p21 in colorectal neoplasm by immunostaining paraffin-embedded tissues. Pathol. Int., 1994, 44, 124–130. – 15. Hitman, G. A., Mannan, N., McDermott, M. F.

és mtsai: Vitamin D receptor gene polymorphism influence insulin secretion in Bangladeshi Asians. Diab., 1998, 47, 688–690. – 16. Hua, W., Christianson, T., Rougeot, C. és mtsai: SKOV3 ovarian carcinoma cells have functional estrogen receptor but are growth-resistant to estrogen and antiestrogens. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1995, 55, 279–289. – 17. Ingles, S. A., Garcia, D. G., Wang, W. és mtsai: Vitamin D receptor genotype and breast cancer in Latinas (United States). Cancer Causes Control, 2000, 11, 25–30. – 18. Ignar-Trowbridge, D. M., Teng, C. T., Ross, K. A. és mtsai: Peptide growth factors elicit estrogen receptor-dependent transcriptional activation of an estrogenresponsive element. Mol. Endocrinol., 1993, 7, 992–998. – 19. Kaklamanos, I. G., Bathe, O. F., Franceschi, D. és mtsai: Expression of receptors for estrogen and progesterone in malignant colonic mucosa as a prognostic factor for patient survival. J. Surg. Oncol., 1999, 72, 225–229. – 20. Kapitanovic, S., Radosevic, S., Kapitanovic, M. és mtsai: The expression of p185 (HER-2/neu) correlates with stage of disease and survival in colorectal cancer. Gastroenterol., 1997, 112, 1103–1113. – 21. Kleibeuker, J. H., van der Meer, R., de Vries, E. G.: Calcium and vitamin D: possible protective agents against colorectal cancer? Eur. J. Cancer, 1995, 31A, 1081–1084. – 22. Kobayashi, S., Inoue, S., Hosoi, T. és mtsai: Association of bone mineral density with polymorphism of estrogen receptor gene. J. Bone. Miner. Res., 1996, 11, 306–311. – 23. Kolibaba, K. S., Druker, B. J.: Protein tyrosine kinases and cancer. Biochim. Biophis. Act., 1997, 1333, F217–F248. – 24. Liel, Y., Shany, S., Smirnoff, P. és mtsai: Estrogen increases 1,25-dihydroxyvitamin D receptors expression and bioresponse in the rat duodenal mucosa. Endocrinol., 1999, 140, 280–285. – 25. Lipkin, M., Newmark, H.: Calcium and the prevention of colon cancer. J. Cell Biochem., 1997, 22 (Suppl.), 65–73. – 26. Llor, X., Jacoby, R. F., Teng, B. B. és mtsai: K-ras mutations in 1,2-dimethylhydrazine-induced colonic tumors: effects of supplemental dietary calcium and vitamin D deficiency. Cancer Res., 1991, 51, 4305–4309. – 27. Malecka-Panas, E., Kordek, R., Biernat, W. és mtsai: Differential activation of total and EGF receptor (EGFR) tyrosine kinase (tyr-k) in the rectal mucosa in patients with adenomatosus polyps, ulcerative colitis and colon cancer. Hepatogastroenterol., 1997, 44, 435–440. – 28. Martinez, M. E., Giovannucci, E. L., Colditz, G. A. és mtsai: Calcium, vitamin D, and the occurrence of colorectal cancer among women. J. Natl. Cancer Inst., 1996, 88, 1375–1382. – 29. O’Rourke, D. M., Nute, E. J. L., Davis, J. G. és mtsai: Inhibition of a naturally occuring

EGFR oncoprotein by the p185neu ectodomain: implications for subdomain contributions ro receptor assembly. Onkogéne, 1998, 16, 1197–1207. – 30. Pence, B. C., Buddingh, F.: Inhibition of dietary fat-promoted colon carcinogenesis in rats by supplemental calcium or vitamin D (3). Carcinogenesis, 1988, 9, 187–190. – 31. Speer, G., Dworak, O., Cseh, K. és mtsai: Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism correlates with the erbB-2/HER-2 expression in human rectal cancer. Oncology, 2000, 58, 242–247. – 32. Speer, G., Cseh, K., Winkler, G. és mtsai: Vitamin D and estrogen receptor gene polymorphism in type 2 diabetes mellitus and in android type obesity. Eur. J. Endocrinol., 2001, 144, 1–6. – 33. Suarez, F., Rossignol, C., Garabédian, M.: Interactive effect of estradiol and vitamin D receptor gene polymorphism as a possible determinant of growth in male and female infants. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1998, 83, 3563–3568. – 34. Tham, D. M., Gardner, C. D., Haskell, W. L.: Potential health benefits of dietary phytoestrogens: a review of the clinical, epidemiological, and mechanistic evidence. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1998, 83, 2223–2235. – 35. Thomas, M. G., Tebbutt, S., Williamson, R. C.: Vitamin D and its metabolites inhibit cell proliferation in human rectal mucosa and a colon cancer cell line. Gut, 1992, 33, 1660–1663. – 36. Ushiyama, T., Ueyama, H., Inoue, K. és mtsai: Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis. J. Rheumatol., 1998, 25, 134–137. – 37. Vandevyer, C., Wylin, T., Cassiman, J. J. és mtsai: Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women. J. Bone Miner. Res., 1997, 12, 241–247. – 38. Vandewalle, B., Adenis, A., Hornez, L. és mtsai: 1,25-hidydroxyvitamin D3 receptors in normal and malignant human colorectal tissues. Cancer Lett., 1994, 86, 67–73. – 39. Whitfield, J. B., Martin, N. G.: The effects of inheritance on constituents of plasma: a twin study on some biochemical variables. Ann. Clin. Biochem., 1994, 21, 176–183. – 40. Willing, M., Sowers, M., Aron, D. és mtsai: Bone mineral density and its change in white women: estrogen and vitamin D receptor genotypes and their interaction. J. Bone Miner. Res., 1998, 13, 695–705. – 41. Wynford-Thomas, D.: p53 in tumor pathology: can we trust immuncythochemistry? J. Pathol., 1992, 166, 329–330. – 42. Xue, L., Lipkin, M., Newmark, H. és mtsai: Influence of dietary calcium and vitamin D on diet-induced epithelial cell hyperproliferation in mice. J. Natl. Cancer. Inst., 1999, 91, 176–181. (Speer Gábor dr., Budapest, Korányi S. u. 2/a. 1083)

Fontos értesítés olvasóink és szerzõink számára Az Orvosi Hetilap Szerkesztőségének címe 2001. május 1-jétől megváltozik. Az új cím: 1054 Budapest, Zoltán u. 8. V. em.

1245 Budapest 5., Pf.: 1012 · Tel.: 36 (1) 331-0781 · Fax.: 36 (1) 312-2450 · E-mail: [email protected]

Kérjük, hogy a jelzett időponttól kezdve a kéziratokat és valamennyi levelezésüket az új címre juttassák el. Szerkesztőség

A Pluss, HIV pozitívokat és AIDS betegeket segélyezõ alapítvány azonnali, HIV/AIDS betegségekkel, megelõzéssel kapcsolatos szakmai felvilágosítással és tanácsadással szolgál kórházak, klinikák, rendelõintézetek és orvosi rendelõk részére. Telefon: 06-20-9349-449

951