Farmakogenetikai markerek jelentősége a colorectalis daganatok fluoropirimidin alapú terápiájában

Doktori (Ph.D.) Értekezés

Farmakogenetikai markerek jelentősége a colorectalis daganatok fluoropirimidin alapú terápiájában

Dr. Hitre Erika Országos Onkológiai Intézet

Témavezető: Dr. Kralovánszky Judit Ph.D. tudományos osztályvezető Országos Onkológiai Intézet Klinikai tanácsadó: Dr. Láng István az MTA doktora, egyetemi magántanár Programvezető: Dr. Kopper László az MTA doktora, egyetemi tanár Szigorlati Bizottság Elnök: Dr. Papp János, egyetemi tanár, az MTA doktora Tagok: Dr. Buday László, egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Naszály Attila, főorvos, kandidátus Hivatalos Bírálók Dr. Buday László, egyetemi docens, az orvostudomány doktora Dr. Lakatos László, főorvos, Ph.D. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Onkológiai Program 8/1 2006

1

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A colorectalis daganatok hazai előfordulása, gyakoriság, rizikótényezők, molekuláris rizikó faktorok 1.2. A betegség patogenezise 1.3. A CRC kezelésének lehetőségei (sebészi kezelés, sugárterápia, belgyógyászationkológiai kezelés) 1.4. A kemoterápia formái, az alkalmazott gyógyszerek és legfontosabb metabolikus tulajdonságaik 1.4.1. A CRC adjuváns terápiája 1.4.2. A korai CRC belgyógyászati-onkológiai kezelése 1.4.3. A távoli áttétes CRC belgyógyászati-onkológiai kezelése 1.4.4. A kemoterápia során alkalmazott gyógyszerek és sajátosságaik 1.4.5. Molekuláris célpontra tervezett biológiai (immun-) terápiás szerek 1.5. Lehetőségek a kemoterápiás kezelés hatékonyságának fokozására 1.5.1 Farmakokinetikai módszerek az optimális dózis kiválasztására 1.5.2. A terápia optimalizálásának lehetőségei farmakogenetikai prognosztikai és prediktív markerek alapján 2. CÉLKITŰZÉSEK

4 7 11 15 16 19 21 24 26 29 32

3. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Betegek 3.1.1. Betegek és kontroll személyek a CRC rizikó vizsgálatában 3.1.2. Betegek az adjuváns kezelési formák összehasonlításának illetve a TS polimorfizmusok hatásának vizsgálatában 3.1.3. Betegek a farmakokinetikai követéses vizsgálatban 3.1.4. Betegek az MTHFR C677T polimorfizmusok vizsgálatában 3.2. Kezelés 3.2.1. Adjuváns kezelés 3.2.2. Palliatív kezelés 3.3. Módszerek 3.3.1. DNS izolálás 3.3.2. Az 5’-TSER locus genotipizálása 3.3.3. A 3’-TSUTR locus genotipizálása 3.3.4. Az MTHFR C677T genotípus meghatározása 3.3.5. A DPD enzim aktivitás meghatározása perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) 3.3.6. A szérum 5-FU koncentráció és a kreatinin szint meghatározása 3.3.7. Statisztikai módszerek

33 35 35 35 38 39 39 39 40 41 41 42 42

4. EREDMÉNYEK 4.1. A CRC rizikó vizsgálata 4.2. Az adjuváns bolus és folyamatos infúziós kezelés összehasonlítása 4.3. TS polimorfizmusok vizsgálata az adjuváns kezelés során 4.4. Az 5-FU kezelés farmakokinetikai követése metasztatikus CRC-s betegek esetén

2

43 45 50 56

4.5. Az MTHFR C677T génpolimorfizmus vizsgálata palliatív kezelés során

59

5. MEGBESZÉLÉS 5.1. A CRC rizikó vizsgálat 5.2. Az adjuváns bolus és folyamatos infúziós kezelés összehasonlítása 5.3. TS polimorfizmusok vizsgálata az adjuváns kezelés során 5.4. Az 5-FU kezelés farmakokinetikai követése metasztatikus CRC-s betegek esetén 5.5. Az MTHFR C677T génpolimorfizmus vizsgálata palliatív kezelés során

64 66 67 70 71

6. KÖVETKEZTETÉSEK

74

7. RÖVIDITÉSEK JEGYZÉKE

76

8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

78

9. IRODALOMJEGYZÉK

79

10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

97

11. ÖSSZEFOGLALÁS

105

3

1. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A colorectalis daganatok hazai előfordulása, gyakoriság, rizikótényezők, molekuláris rizikófaktorok A vastag- és végbélrák ma is az egészségügy egyik legsúlyosabb, megoldatlan problémája,

világszerte

a

negyedik

leggyakrabban

előforduló

rosszindulatú

megbetegedés és a negyedik leggyakoribb daganatos halálok. A WHO adatai szerint évente 1023 ezer új eset kerül felismerésre illetve 529 ezren halnak meg colorectalis carcinomában (CRC). (1) A nemzetközi szakirodalomban megjelent epidemiológiai adatok alapján Európában Magyarországon a legmagasabb a daganatos megbetegedések miatti halálozás. Hazánk a férfi összes daganatos halálozási sorrendben az első, míg a női összes daganatos halálozási sorrendben a második helyen áll. A CRC-t tekintve, a magyarországi daganatmortalitások alapján az európai országok között hazánk a nők esetében az első, a férfiaknál pedig a második helyet foglalja el. (2) 2004-ben összesen 8841 újonnan felfedezett CRC-t jelentettek be Magyarországon, ebből 4705 férfi és 4136 nő volt. 2003-ban 2787 férfi és 2311 nő halt meg vastagilletve végbéldaganat következtében. (3) Míg az utóbbi negyed században a CRC hazai gyakorisága és halálozása egyaránt jelentős mértékben nőtt, addig a világon több helyen (Kanada, Nagy-Britannia, Dánia) mind a gyakoriság, mind a halálozás csökkenő tendenciát mutat. A túlélés az összes európai országban javul, mind a férfiak, mind a nők esetében, függetlenül a lokalizációtól és az életkortól. (4) Felmerül a kérdés, hogy miért rosszabb a helyzet Magyarországon, mint más országokban? A CRC kialakulásában környezeti és genetikai faktorok egyaránt szerepet játszanak. A CRC-k 88-94%-a sporadikus és csak 5-10% az öröklődő forma. Amennyiben a családi anamnézisben CRC szerepel, az a sporadikus vastagbélrák kifejlődésének esélyét jelentősen növeli. (5) Legalább egy elsőfokú rokon betegsége esetén a CRC kifejlődésének kockázata megduplázódik. (6, 7) Számos tanulmányban vizsgálták a környezeti faktorok jelentőségét, hatását a CRC etiológiájában. (8) A táplálkozás során felmerült lehetséges befolyásoló tényezők: a

4

teljes kalóriabevitel, a táplálék hús, zsír, fehérje ill. rosttartalma és az elfogyasztott gyümölcs, zöldség mennyisége. A teljes kalóriabevitel és az elhízás a vizsgálatok szerint független prognosztikai markernek bizonyultak a CRC kialakulását illetően. A magasabb testtömegindex megduplázta a kockázatot. Az összefüggés kifejezettebb férfiak és colon carcinoma esetében. (9, 10) A vöröshúsféleségek nagymennyiségű fogyasztása szintén független prognosztikai tényezőnek számít a CRC etiológiájában. (11, 12) A táplálkozás során a szervezetbe került zsírok abnormalis bélhámsejt proliferációt indíthatnak be. Ellentmondásos adatok szólnak arról, hogy a zsírok mely fajtái jelentenek fokozott kockázatot. (13) Korábbi adatok szerint magasabb rosttartalmú diéta esetén a CRC incidenciája alacsonyabb. Ezt az összefüggést annak tulajdonítják, hogy a rostok a belekben képződő carcinogén

anyagokat

eliminálják,

és

gyorsítják

a

táplálék

áthaladását

az

emésztőrendszeren. Több nagy vizsgálat azonban nem tudta igazolni a rostok protektív hatását. (14, 15) A kalcium, az antioxidans vitaminok (E, C, A) ill. a fólsav esetleges kemopreventív hatásának eldöntése további vizsgálatok feladata lesz, mivel a jelenleg rendelkezésre álló adatok nem egyértelműek. A tartós, nagy mennyiségű cigaretta élvezete egyértelműen növeli mind az adenoma, mind a CRC előfordulási gyakoriságát. (16) A felsoroltakon kívül egyéb rizikófaktorok is szerepet játszhatnak, így az idősebb életkor, a férfi nem, a cholecystectomia a beteg anamnézisében, a különböző hormonalis faktorok, mint a korai menopausa, az első terhesség idősebb életkorban ill. a nulliparitás. Amennyiben a beteg anamnézisében colorectalis polyp, adenoma előfordult, akkor nagyobb a valószínűsége CRC kialakulásának. Egy esetleges CRC-t követően egy második béldaganat kifejlődésének a rizikója 1,5-3% a diagnózist követő első 5 évben. Egyéb

rosszindulatú

megbetegedés

(vékonybél,

endometrium,

emlő

vagy

ovariumdaganat) után szintén nagyobb esély van a CRC kialakulására. Fekélyes vastagbélgyulladásnál a diagnózistól eltelt idővel arányosan nő a carcinoma kialakulásának valószínűsége: 10 év után 2%, 20 év után 8% és 30 évet követően pedig 18 %. Ez a rizikónövekedés Crohn betegségben is megfigyelhető. (1)

5

A CRC-k genetikai hátterét tekintve kb. 10%-uk öröklődő, és csupán 2-6 %-ban szerepel nagy penetranciájú gén a daganat kialakulásában. Az alacsony penetranciájú génkombinációk és a „nyugati-életstílus”, táplálkozás együttesen játszhat szerepet a sporadikus CRC patogenezisében. (17) A timidilát szintáz (TS) a timidilát bioszintézis kulcsenzime, a folát metabolizmushoz kapcsolódóan fontos szabályzója a dNTP szinteknek. A TS enzim jellegzetessége mint kemoterápiás célpont elsősorban abból származik, hogy az enzimműködésen túl a sejtben szabályozó szerepe van. Már kis változás a dNTP szintetizáló enzimek expressziójában befolyásolja a rendelkezésre álló dNTP-okat, (18) és a dNTP pool torzulása érinti a replikációs hűséget. (19) Másrészről a folát/metil metabolizmus befolyásolja a DNS épségét mind a nukleotid szintézis, mind a DNS metilációs mechanizmus által. (20) Ezért az egyéni genetikai tényezők, melyek a folát/nukleotid metabolizmust érintik értelemszerűen legalább két különböző útvonalon keresztül befolyásolják a genetikai stabilitást, és módosítják molekuláris carcinogenezist. (21) Általában elfogadott, hogy a táplálkozási szokások befolyásolják a rákrizikót, (22) de néhány következetlenség előfordul az étrendi folát és a CRC összefüggését illetően. (20, 23

) A legutóbbi eredményekből és elméletekből a legvalószínűbb következtetés az, hogy

a genetikai sajátosságok, amely érintik a folát-metabolizáló géneket, meghatározók a carcinogenezist befolyásoló gén-tápanyag kölcsönhatás kialakításában. A TS gén ismert polimorfizmusairól leírták, hogy folát felvételtől függő módon módosítják az egyéni fogékonyságot a colorectalis adenomára. (24) Mitöbb, nemrégiben, úgy találták, hogy a TS genotípusok befolyásolják a plazma folát szinteket, (25) és ugyanakkor ezek a polimorfizmusok megváltoztatják a haematológiai malignitások rizikóját is. (26) Két funkcionálisan fontos TS gén polimorfizmus van jelen a TS mRNS-en: az egyik egy promoter-enhancer régió (5’-TSER) hosszpolimorfizmus az 5’-UTR-on, mely általában 2 vagy 3, 28 bp egységnyi, tandem ismétlődést (2R vagy 3R) tartalmaz, és ismereteink szerint a transzkripciós autoregulációs mechanizmusban van szerepe. (27) A másik, hasonlóan gyakori, 6 bp ins/del-típusú (TS1494del6), 3’-UTR lokalizált (3’-TSUTR) (28) feltehetően a TS transzkript stabilitását befolyásoló polimorfizmus. (29) Bár az 5’-TSER etnikailag eltérő gyakoriságú polimorfizmus, (30) és a CRC epidemiológiájából ismert az etnikumok közti különbözőség, (31) az eddigi populációs vizsgálatok a TS gént nem azonosították a CRC kialakulásának markereként. (32, 33, 34)

6

E gyakori polimorfizmus rasszbeli/etnikai megoszlásának nagy különbségei (35) és a feltételezhetően a carcinogenezisre kifejtett hatása körülményessé teszi a genetikai epidemiológiai kiértékelést azokban a populációkban, ahol nagy a migráció, és összetett hatások is érvényesülnek: környezet, étkezési szokások és ismeretlen rizikó faktorok. A magyar népesség, a relatív alacsony lélekszámmal, az alacsony (be)vándorlási aránnyal, közepes társadalmi, gazdasági és kulturális különbözőséggel, egészségtelen étkezési szokásokkal és az európai CRC morbiditásban egyik vezető hellyel (36) bizonyítottan egy olyan rendszer, ahol kevés a zavaró hatás és a mintavételi hibaforrás az alacsony genetikai penetranciájú TS-nek a CRC rizikóra kifejtett hatásának megállapítására, még kis esetszámú tanulmányok esetén is. 1.2. A betegség patogenezise A CRC genetikai hátterének kutatása az 1990-es években bebizonyította, hogy az ép vastagbélnyálkahártyának az ún. adenoma-carcinoma szekvencián keresztül vastagbélrákká történő átalakulásáért bizonyos genetikai történések felelősek. (37) A genetikai változások összessége, melyek a csírasejtekben, illetve a szomatikus sejtekben egyaránt létrejöhetnek, végeredményben klonalis sejtburjánzáshoz vezetnek. Az örökletes daganatok általában multiplexek, fiatalabb életkorban jelentkeznek, mint a sporadikus formák. A vastagbélrákoknál is több öröklődő kórkép ismert. A familiaris adenomatosus polyposis syndromaban (FAP), az 5-ös kromoszómán (5q21) elhelyezkedő adenomatosus polyposis coli (APC) gén mutációja okozza a betegség kialakulását. Az összes vastagbélrák 1%-a tartozik ebbe a csoportba. Ennél a syndrománál a CRC mellett egyéb daganatok is kialakulhatnak. Társulhatnak osteomák, epidermoid cysták (Gardner syndroma) és központi idegrendszeri primer tumorok (Turcot syndroma). A másik részletesen tanulmányozott öröklődő vastagbélrák syndroma a herediter nem polyposus vastagbélrák (HNPCC). Ez a típus a vastagbélrákok kb. 3%-át teszi ki. A fenotípusos jegyek nem olyan határozottak, mint a FAP esetében. Sok esetben nehéz elkülöníteni a sporadikus formától. A DNS mismatch repair géncsalád csírasejtes mutációja jellemző erre a formára. Az esetek 60 %-ában a károsodás a hMLH1 vagy a hMSH2 génben történik.

7

A HNPCC I típusban csak vastagbéldaganat, míg a HNPCC II-ben egyéb daganatok társulása a jellemző. Kialakulhat gyomor-, vékonybél-, epeúti-, endometrium-, húgyutiés petefészekrák egyaránt. Bőrtumorok együttes előfordulása esetén Muir-Torre syndromáról beszélünk. HNPCC családokban 80% annak a valószínűsége, hogy carcinoma alakul ki a bélben. Egyéb daganat megjelenésének pedig 40% az esélye a betegek élete során. (38) Az öröklődő formák genetikai hátterének tanulmányozása segített a sporadikus vastagbélrákok kialakulása során zajló genetikai változások alaposabb megismeréséhez. Ezek a változások proto-onkogéneket és tumor szuppresszor géneket egyaránt érintenek, amelyek involválódnak a daganatfejlődés összetett folyamatában. A géneken kívül egyéb molekuláris változások szerepét is igazolták a CRC-k kialakulása során. Az APC gén szomatikus mutációinak a megjelenése a kezdeti lépés a legtöbb CRC kifejlődésében. FAP-ban az APC gén autoszómális dominánsan öröklődő mutációja miatt alakulnak ki az adenomatosus polypok ezrei, majd évek múlva, általában a betegek 20-as ill. 30-as éveiben a CRC. Molekuláris genetikai vizsgálatok bizonyították be, hogy a sporadikus CRC esetében szintén az APC gén szomatikus mutációi indítják el a kóros, klonalis sejtburjánzást. Az elmúlt két évtizedben a CRC-ben történő genetikai változások azonosításában, pontosabb jellemzésében jelentős előrehaladás történt. A CRC kialakulásának modellezése kapcsán sikerült a különböző résztvevő gének mutációinak a kimutatása. Így derült fény az APC, K-ras, TP53 és a DCC gének szerepére. (39) A CRC-k kialakulásának egy másik útja az, amikor normal kariotípus mellett genetikai instabilitás van a mikroszatellita lokuszban, mivel a DNS mismatch repair gének nem működnek vagy csökkent aktivitásúak. A mikroszatelliták normal állapotban stabilan öröklődnek, azonban nagymértékben instabillá válhatnak a DNS mismatch repair gének hiánya esetében. HNPCC-kban ez a változás a csírasejteket érinti. Amennyiben szomatikus sejtekben alakul ki a DNS repair enzimek zavara, ez mikroszatellita instabilitást (MSI) okozhat. Ez a mutáció figyelhető meg a sporadikus colorectalis carcinomák közel 15%-ában. (40) Hat különböző gén tartozik az MMR géncsaládba: hMHL1, hMSH2, hMSH3, hMSH6, hPMS1, hPMS2. A HNPCC-ban történt vizsgálatok során derült fény az MMR gének oki szerepére a carcinoma kialakulásában. Az MMR inaktiválódását, expresszió

8

változását

nemcsak

a

gének

pontmutációi,

hanem

MSI

ill.

epigenetikus

mechanizmusok, pl. hipermetiláció is okozhatja. Az MSI során a DNS rövid repetitív szekvenciáinak

a

mutációja

figyelhető

meg.

Az

MSI

szempontjából

megkülönböztethetők: MSI-high (MSI-H, a mikroszatellita lokuszok több mint 30-40%a hibás), MSI-low (MSI-L, kevesebb mint 30% a hiba) és MSS (mikroszatellita stabil) azaz MSI-t nem mutató tumorok. DNS chip segítségével 81 gén szelektív expresszió csökkenését mutatták ki MSI high (MSI-H) tumorokban. (41) A gének vizsgálata során a RAB32 (ras családba tartozó gén) hipermetilációját az MSI-H tumorok 56%-ában mutatták ki, míg az MSI-low (MSI-L) tumorok estén egyetlen egyben sem. A MMR gének mutációja számos következményes genetikai változást indít el. Az előzőekben említett APC, b-katenin, hMSH3, hMSH6, TCF-4, c-myc kaszkádban résztvevő géneken, faktorokon kívül a TGFb és az apoptózis regulátor, BAX gének is károsodnak. Ezeken keresztül az apoptózis ill. a proliferáció szabályozásának zavara alakul ki. Íly módon (MSI-útvonal) keletkezik a sporadikus vastagbél daganatok 15%-a. Ezek a tumorok gyakrabban jelentkeznek idősebb korban, proximalis lokalizációjúak, diploidok, differenciálatlanabbak. A ras onkogének a legkorábban azonosított proto-onkogének közé tartoznak. A K-ras gén mutációja a kis adenomákban ritka, előfordulása a villosus polypokban egyre gyakoribb, és a rosszindulatú elváltozások kb. felében fordul elő. A ras mutációk az adenoma keletkezése után, de még a definitív carcinoma előtt észlelhetők. A mutáns ras onkogéneknek funkcionális jelentősége a CRC etiológiájában bizonyított. A daganat növekedése szignifikánsan csökkent inaktivált mutáns ras allélek esetében. Ras mutációk nagy gyakorisággal találhatók az emberi bélnyálkahártya aberráns cryptáiban. (42) Ezek az aberrans cripta fókuszok (ACF) feltételezett preneoplasztikus léziók, amelyek pathológiai szempontból a hiperplasztikus és a diszplasztikus állapot közötti átmenetet képviselik. Csak a diszplasztikus, aberráns proliferációt mutató cryptákban mutatható ki együttesen az APC és a ras mutáció. A mutáns ras, az APC által elindított tumorgenezist képes elősegíteni. A colorectális rákokban további klasszikus genetikai eltérések is ismertek, mint a p53 tumor szuppresszor gén mutációja és a 18q kromoszóma heterozigótaság elvesztése

9

(LOH). A genetikai eltérések csaknem mindegyike, bár kisebb arányban, kimutatható a rákmegelőző állapotokban is. A heterozigótaság elvesztése a 18-as kromoszóma hosszú karjának (18qLOH) az esetében nagy incidenciával fordul elő sporadikus vastagbélrákok esetében. A 18-as kromoszóma ezen lokuszában több potenciális tumorszuppresszor gént azonosítottak: DCC, SMAD4. Egyes vizsgálatok szerint a 18qLOH korai stádiumú CRC esetén korrelál az alacsonyabb túlélési aránnyal. (43) A vizsgálatok rávilágítottak a DCC és a SMAD4 jelentős szerepére a tumorgenezisben. A DCC fehérje főleg az idegrendszerben és a normal, differenciált bélnyálkahártya sejtjeiben található meg. Vastagbélrákokban a DCC csökkent expressziója és a rosszabb prognózis, a metasztázis képzés között korreláció van. (44) A SMAD4 locus által kódolt fehérje központi szerepet játszik a TGFb szignál transzdukciós útvonalban. A CRC-k 10-30%-ában szomatikus mutációja figyelhető meg. A mutáció gyakorisága az előrehaladott vastagbélrákokban nagyobb, mint korai stádiumú betegségben. A SMAD4 inaktiválódása hozzájárul a CRC progressziojához. Csírasejtes mutációja juvenilis polyposusos betegekben fordul elő. (45) A kromoszómainstabilitás (CIN) számeltéréseket, kariotípus heterogenitást jelent. A CIN oka az ellenőrzőpontokat szabályozó gének zavara. Fontos, hogy a heterozigotaság elvesztése müködési hibát csak abban az esetben jelent, ha a megmaradt, duplikálódó kromoszómarészlet hibás. Gyakran érintett szakaszok a 18qLOH (DCC, SMAD4) és a 17pLOH (p53). Az MSI-vel ellentétben a CIN dominans tulajdonsága a daganatnak. Ezek a kromoszómális eltérések már a praemalignus léziókban is kimutathatók. (46) A sporadikus rákok 80-85%-ában ez a jellemző pathogenetikai út. Szemben a herediter tumorokkal, a sporadikus rákok esetén mismatch repair gének inaktivációjában az epigenetikus eltéréseknek, a DNS metiláció megváltozásának van kiemelkedő szerepe. A DNS metiltranszferáz enzim minden egyes egyénben egy jellegzetes metiláltsági állapotot alakít ki. A DNS metiltranszferáz hipermetilációja a Kras onkogén mutációjával jár együtt. Sporadikus rákokban a hipermetiláció tehető felelőssé döntő többségben a MMR gének inaktivációjáért. Egyéb sejtciklus-szabályozó gének ill. az APC gén hipermetilációját is igazolták. Valamilyen gén hipermetilációja a sporadikus tumorok 10-30%-ában mutatható ki. (47)

10

Lényeges megfigyelés, hogy a sporadikus CRC-k az adenomákban jelen lévő rövid telomerrel rendelkező sejtekből alakulnak ki. (48) Ez megmagyarázza a kromoszóma instabilitás gyakoriságát. CRC-kban jelentősen emelkedett telomeráz aktivitás van a kontroll szövetéhez képest, amely a lokális invazitással mutat kapcsolatot. FAP esetében kimutatták, hogy a telomeráz aktivitás az adenoma-carcinoma átmenetet segíti elő. (49) Számos adat bizonyítja, hogy a cyclooxigenáz (COX) enzim szerepet játszhat a CRC patogenezisében. A carcinogenezis korai stádiumában fokozott COX-2 expressziót mutattak ki. A COX-2 mRNS expresszió elsősorban a distalis és nagyobb méretű adenomákban fokozott. A COX-2 tumorképződést indukáló hatásának a közvetítéséért részben a p53 a felelős. (47) Az előbbiekben említett lehetőségeken kivül egyéb változások is a carcinoma keletkezését indukálhatják. Colitis ulcerosa esetében a krónikusan fennálló gyulladás lehet a feltételezett mechanizmus. A hosszú évekig fennálló krónikus gyulladás a bélhám integritásának károsodását eredményezi. A fekélyes vastagbélgyulladásban a polyp, adenoma „állomás” hiányzik, az APC, K-ras mutációk ritkábban fordulnak elő. A sporadikus rákokhoz képest a p53 mutáció korábban észlelhető, már a morfológiailag épnek tűnő nyálkahártyában igazolható. A bélben jelen lévő carcinogénekkel együttesen p53 mutációt, aneuploidiát okoznak. Majd a carcinoma kialakulását ezekben az esetekben diszplázia előzi meg. (50) 1.3.

A

CRC

kezelésének

a

lehetőségei

(sebészi

kezelés,

sugárterápia,

belgyógyászati-onkológiai kezelés) A CRC szakszerű kezelése számos orvosi szakma szoros együttműködését igényli, tehát multidiszciplináris

feladat.

Leghatékonyabban

olyan

szakosodott

onkológiai

központokban történik, ahol valamennyi érintett társszakma magas szinten képviselve van, együttműködésük lehetősége adott, és nagyszámú beteg ellátása révén a kellő tapasztalat is rendelkezésre áll. Az egyes betegek kezelési tervére minden esetben a Multidiszciplináris Onkológiai Bizottságnak kell javaslatot tennie. Ebben diagnosztikus képalkotó szakember, pathológus, sebész, sugárterapeuta és belgyógyász-onkológus vesz részt. Konzultációjukra a pathológiai diagnózis és a stádium felmérő teljes

11

kivizsgálás birtokában kerüljön sor, mielőtt bármilyen kezelés elkezdődne. Különösen fontos ez a rectum carcinoma neoadjuváns kezelésének az indikációjakor. A CRC vonatkozásában is igaz, hogy a legjobb terápiánál is eredményesebb a megelőzés. A primer prevenció, azaz a betegség kialakulását elősegítő kockázati tényezők kiküszöbölése nemcsak szűkebb értelemben vett orvosi, hanem össztársadalmi feladat. A már kialakult CRC kezelése az utolsó másfél évtized alatt rohamosan fejlődött. Az adjuváns kemoterápia CRC-ban, a multidiszciplináris terápia részeként, mindössze 15 éve vált a bizonyítékokon alapuló orvoslás elvei szerint általánosan elfogadottá. (51) Az azóta tapasztalható gyorsütemű fejlődés eredményeként, a CRC a kevéssé kemoszenzitív daganatok közül a közepesen kemoszenzitív rákok közé került, és a kemoterápia – az új évezredben a biológiai célzott terápiával kiegészítve – a komplex kezelés egyre jelentősebb összetevőjévé vált. Mindazonáltal a CRC multidiszciplináris kezelésének a legfontosabb eleme ma is a daganat sebészi eltávolítása. Ez a végbél és a többi vastagbélszakasz területén különböző technikákkal történhet. A sebészi kezelés részleteinek ismertetése nem tárgya az értekezésnek. Annyit azonban itt is hangsúlyozni kell, hogy a sebész személye ma is az egyik legfontosabb prognosztikai tényező. Jó gyógyulási eredmények csak akkor érhetők el, ha a műtétet CRC-ra szakosodott, tapasztalt, onkológiai szemlélettel rendelkező sebész végzi, aki szorosan együttműködik a belgyógyász-onkológussal, és – végbélrák esetén – a sugárterapeuta szakemberrel is. A sugárterápia a rectum carcinoma komplex kezelésének a fontos része, és elsősorban a helyi kiújulás megelőzését szolgálja. Alkalmazható műtét előtt önmagában (preoperatív, neoadjuváns radioterápia), vagy kemoterápiával kombinálva (neoadjuváns kemoradioterápia), illetve műtét után kemoterápiával együtt (postoperatív adjuváns kemoradioterápia), amennyiben preoperativ sugárkezelésre nem kerül sor. A sugárterápia részletei nem képezik az értekezés tárgyát. A CRC belgyógyászati-onkológiai kezelése a kemoterápiát, a célzott biológiai (immun-) terápiát és a szupportiv kezelést foglalja magában. CRC-ban a kemoterápia (neo-) adjuváns és palliatív formában alkalmazható. Az adjuváns kemoterápia célja az elsődleges sebészi rezekciót követően a hagyományos diagnosztikai módszerekkel ki nem mutatható, un. ”alvó” daganatsejtek, esetleg mikrometasztázisok kiiktatása. Az adjuváns kemoterápia III. stádiumú betegségben

12

általánosan javallt, második stádiumban pedig akkor érdemes adni, ha a kiújulás kockázata nagy. Neoadjuváns kemoterápián a műtét előtt, elsődleges kezelésként adott citotoxikus terápiát értünk. Klasszikus értelemben ezt rectum carcinomában alkalmazzuk sugárterápiával kombinálva (kemo-radioterápia). Célja irresecabilis esetben a műthetőség lehetővé tétele, resecabilis esetben, pedig a primer tumor és a környéki nyirokcsomóáttétek visszafejlesztése, az un. „down-staging”. Ezzel olyankor is lehetővé tehető az analis sphincter megőrzése, amikor ez, előzetes gyógyszeres és sugárkezelés nélkül nem lenne lehetséges. Újabban a neoadjuváns kemoterápia fogalmát kiterjesztették azokra az esetekre is, amikor az eredetileg irresecabilis máj- (vagy tüdő-) áttéteket korszerű kemoterápiás kombinációk alkalmazásával műthetővé teszik. Ilyenkor a sikeres R0 metastasectomia után a betegek egy része hosszútávú túlélővé, gyakorlatilag gyógyulttá válhat. Palliatív kemoterápiáról akkor beszélünk, ha a citotoxicus gyógyszeres kezelést nem kuratív céllal adjuk, hanem előrehaladott, távoli áttétes esetekben a túlélés meghosszabbítása, a progresszió későbbre halasztása, a tünetek, panaszok csökkentése és az életminőség javítása/megőrzése a cél. Az utóbbi másfél évtized a palliatív kemoterápia terén is jelentős javulást hozott, a legjobb tüneti/támogató kezeléshez (best supportive care - BSC) képest a IV. stádiumú betegek átlagos túlélését (mOS) jelentősen megnövelte (6 hónapról 24 hónapra). Számos tényezőt azonosítottak, amelyek befolyásolhatják a daganatos betegség recidíváját, illetve a betegek túlélését. Azonban egyik jelentősége sem múlja felül a stádium meghatározás prognosztikai szerepét. A CRC stádium besorolása a TNM klasszifikáció, illetve a Dukes besorolás szerint történik.

(I.

táblázat)

A

TNM

klasszifikáció

folyamatos

finomításokon

és

módosításokon megy keresztül. Jelenleg az AJCC 6. formája van érvényben (www.cancerstaging.org - 2004. augusztus 6.): I stádiumú (T1-2, N0, M0) betegségnél a béldaganat a submucosára terjed. IIA (T3, N0,M0) stádiumnál a muscularis proprián át a daganat infiltrálja a subserosát. IIB (T4, N0, M0) stádiumban a daganat direkt terjedést mutat a környező struktúrákra, perforálja a zsigeri hashártyát. I, IIA, IIB stádiumban a környéki nyirokcsomókban daganatsejt nem észlelhető (N0).

13

IIIA (T1-2, N1, M0) stádiumban a daganat a muscularis propriáig terjedhet, az eltávolított nyirokcsomók közül 1-3-ban észlelhető metastasis. IIIB (T3-4, N1, M0) stádiumban a daganat a környezetét infiltrálhatja és 1-3 lokoregionalis nyirokcsomóba adhat áttétet. IIIC (bármilyen T, N2, M0) stádiumnál 4 vagy annál több metasztatikus nyirokcsomó van jelen, függetlenül a daganat méretétől. IV (bármilyen T, bármilyen N, M1) esetében távoli metasztázis észlelhető. I. táblázat. A CRC stádium beosztása és összefüggése a prognózissal. (52) Stádium

TNM

Ötéves túlélés %

I.

T1-2, N0, M0

> 90

IIA

T3, N0, M0,

IIB

T4, N0, M0

IIIA

T1-2, N1, M0

IIIB

T3-4, N1, M0

IIIC

T(bármilyen), N2, M0

IV

T(bármilyen), N(bármilyen), M1

60-85

25-65

5-7

II. táblázat. A kis és nagy rizikójú CRC meghatározása Kis rizikó

IIa

II és III stádium a TNM besorolás szerint Nagy rizikó Stádium esetszám T és N 5-éves túlélés (%) II 34261 T3-4, N0 82,5 IIa

28635

T3, N0

84,7

IIb

5826

T4, N0

72,2

+ IIIa

IIb +

III

26249

Tx N1,2

59,5

IIIa

1989

T1-2,N1

83,4

IIIb

15940

T3-4,N1

64,1

IIIc

8600

Tx, N2

44,3

14

IIIb IIIc

Az EORTC 2005 októberi gyűlésén 119363 beteg adatainak a feldolgozása alapján, a betegeket a stádium és a túlélés összefüggésében, alacsony és magas rizikójú csoportba osztották. Az alacsony kockázatú csoportba a IIA és a IIIA stádiumok tartoznak, míg a magas kockázatúba a IIB, IIIB és a IIIC. (II. táblázat) 1.4. A kemoterápia formái, az alkalmazott gyógyszerek és legfontosabb metabolikus tulajdonságai 1.4.1. A CRC adjuváns terápiája A potenciálisan kurativ béldaganatok esetében az elsődleges sebészeti ellátás döntő jelentőségű. A legtöbb esetben ez a primer daganat resectioját jelenti a környéki nyirokcsomókkal együtt. A megfelelő lokális kezelést követően azonban a betegek egy jelentős részében a daganat recidivál. A legfontosabb prognosztikai faktor, amely a progressziót előrevetítheti, a műtét során eltávolított nyirokcsomókban észlelt áttét. II stádium esetén a relapsus rizikója 25-30% között van, III stádiumban a rizikó magasabb, 40-60%. A túlélést nem csak a metasztatikus nyirokcsomók jelenléte, hanem az eltávolított nyirokcsomók száma is befolyásolja. Stádium II esetén, ha 10 vagy annál kevesebb nyirokcsomót távolítottak el, a betegek 5-éves túlélése 73%, 20 vagy annál több nyirokcsomó rezekálása esetén, pedig 87%. A nemzetközi ajánlások szerint minimum 14 nyirokcsomó vizsgálata szükséges. (53) A daganat nemcsak lokálisan, hanem távoli áttét formájában is progrediálhat. Az esetek 74%-ában az első 3 évben alakul ki a metasztázis. A leggyakoribb érintett szervek a máj, a peritoneum, a tüdő és a csont. Az adjuváns belgyógyászati terápia célja a reziduális daganatsejtek elpusztítása ill. a tünetmentes (DFS) és a teljes túlélés (OS) növelése. A diagnosztizált betegek kb. 40%ánál észlelhető nyirokcsomó metasztázis, és a betegek 15-20%-a T3-4, N0 stádiumba tartozik. A III-as stádiumú betegségnél a postoperatív adjuváns kezelés standard eljárásnak számít. II stádiumban az adjuváns kezelés javallata egyelőre nem egyértelmű. Kis kockázatú esetekben rutinszerűen nem ajánlott. Ebben a betegcsoportban is számos prognosztikai

15

faktort azonosítottak, amelyek nagyobb rizikót jelentenek a daganat recidivájának kialakulását illetően. Ezek a következők: kevesebb, mint 14 db eltávolított környéki nyirokcsomó, T4-es primer tumor, perforáció, obstructio, rosszul differenciált daganat, magas S-fázisú sejtarány, jelentősen emelkedett preoperatív CEA érték, fiatal életkor. (54) II stádiumban a felsorolt rizikófaktorok figyelembe vételével, a beteg részletes tájékoztatását követően kell dönteni az adjuváns kemoterápiáról.

1.4.2. A korai CRC belgyógyászati-onkológiai kezelése A primer ellátás a daganat sebészi eltávolítása. 1988-ban közölték az első olyan randomizált vizsgálat eredményeit, amelyben igazolódott, a csak sebészi kezeléssel szemben, az 5-FU alapú posztoperatív adjuváns terápia okozta túlélési előny. (51) Ezt követően a csak sebészi kezelés és az 5-FU+levamisol kombinációval történtek klinikai vizsgálatok. Szignifikánsan jobb betegségmentes illetve teljes túlélést értek el a kemoterápiás csoportban. Ezeket a vizsgálatokat követte az 5-FU leukovorinnal (LV) történő együttes adása. A postoperatív 5-FU+LV adjuváns kemoterápia, összehasonlítva a csak sebészi ellátással, a relapsus és a mortalitás rizikóját 30-40%-kal csökkenti. A LV dózisa (magas szemben az alacsonnyal) sem a DFS-re sem az OS-re nem volt hatással. Andre és munkatársai az 5-FU kétfajta alkalmazási módját hasonlították össze (de Gramont protokoll szemben bolus 5-FU+LV). Szignifikáns különbséget csak a mellékhatások tekintetében találtak. Folyamatos alkalmazási módnál kevesebb grade 34 neutropeniát, diarrheat és mucositist észleltek. Ez a vizsgálat mondta ki, hogy a folyamatos 5-FU infúzió kevesebb mellékhatást okoz, mint a bolus.(55) Összesített elemzések igazolták, hogy az 5-FU-alapú adjuváns kemoterápia III stádiumú CRC esetén az 5-éves daganatmentesség arányát 42%-ról 58%-ra, az 5-éves túlélést pedig 51-ről 64%-ra növeli. Ez a kedvező hatás mind a fiatalabb, mind az idősebb betegpopulációban egyaránt kimutatható. (56) Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy nagy, multicentrikus tanulmányok eredményei alapján az 5-FU alapú adjuváns kemoterápia csökkenti a relapsus rizikóját, illetve egyértelműen javítja a teljes túlélést III. stádiumú CRC-ban.(57, 58) Az 1990-es évek óta

16

a 6 hónapig tartó 5-FU-alapú adjuváns kezelés világszerte elfogadottá vált. (59) Ma már széles körben ismert, hogy az Európából kiindult tartós infúziós formák hatásosabbak és jobban tolerálhatók, mint a bolus adagolás. I stádiumban (T1N0M0 és T2N0M0), valamint IIA stádiumban (T3N0M0) gyógyszeres kezelés nem szükséges, mert a kiújulás kockázata csekély. Legújabban egyre általánosabban elfogadott az a nézet, hogy IIIA stádiumban (T1-2N1M0) sem érdemes adjuváns kemoterápiát adni, mert az ilyen betegek várható ötéves túlélése (83,4%) nem különbözik értékelhetően a IIA stádiumétól (T3N0M0: 84,7%). (60) A kiújulás tekintetében nagy és kis kockázatú korai CRC meghatározása a legújabb, 2004-es TNM beosztás szerint a TN státusz pontos figyelembevételén alapul, és a II („node negatív”) és III („node pozitív”) stádiumokon „átfedően” különbözetet meg kis kockázatú (IIA+IIIA) és nagy kockázatú (IIB+ IIIB+IIIC) korai CRC-t. (II. táblázat) Tehát a IIB stádiumban ugyanúgy indokolt az adjuváns kemoterápia, mint a IIIB és IIIC stádiumban. II és III stádiumú CRC-ban fokozott kiújulási kockázatra utal: grade III tumor, magas MAI, lymphovascularis és perineuralis tumorsejt invázió, obstrukció, perforáció, ulceráció, MSI hiánya (MSI stabil tumor), LOH (18q deletio), genetikai tényezők, erősen (>10x) emelkedett kiindulási CEA, fiatal (<40 év) életkor, N0 esetében <14 eltávolított/vizsgált nyirokcsomó, a locoregionalis nyirokcsomók nagy száma. II stádiumú CRC-ban tehát a kiújulási kockázat, a lehetséges mellékhatások és a beteg kívánságának a figyelembevételével az adjuváns kemoterápia javallatának egyénre szabott mérlegelése szükséges. Végbélrákban a (neo)adjuváns kemoterápiát radioterápiával kiegészítve adják. A radioterápiát lehetőleg a műtét előtt kell adni, vagy rövid kezelésként (5x5 Gy), vagy hosszú frakcionálással (45-50,4 Gy, 1,8 Gy frakciókkal). Utóbbit általában folyamatos infúziós 5-FU kemoterápiával célszerű kombinálni. Ha a rectumcarcinomas beteg preoperatív sugárkezelésben nem részesült, a műtét után adjuváns kemo-radioterápiát kell kapnia. Ennek során az 5-FU-t tartós infúziós formában ajánlatos adni. Biztató vizsgálatok folynak a CIFU(FA) oralis fluoropyrimidinekkel történő helyettesítéséről rectumcarcinoma adjuváns kezelése során is.

17

Az új kemoterápiás gyógyszerek megjelenésével tovább bővült a kombinációs lehetőségek tárháza. A készítményeket először általában metasztatikus betegcsoportban kezdték

használni.

Később

adjuvans

vizsgálatok

indultak.

Közülük

kiemelt

jelentőségűek az oxaliplatinnal és az irinotecannal végzett tanulmányok. Az oxaliplatinnal metasztatikus betegségben 50-53%-os válaszadási arányt és szignifikánsan jobb DFS-t lehet elérni. Adjuváns kezelésben a hatékonyságát a MOSAIC tanulmány során vizsgálták. (61) Az oxaliplatin kombináció (FOLFOX) a 3 éves DFS-t szignifikánsan javította. Az OS-ben nem találtak különbséget. Sargent és mtsai több mint 20000 beteg adatait elemezve szoros összefüggést tudtak igazolni a 3-éves DFS és az 5-éves OS között. (62) Az adott adjuváns terápiával elérhető 3 éves DFS jól jellemezheti a kezelés hatékonyságát. Napjainkban a nagy rizikójú (T4, N2) vastagbél daganatos betegek számára a FOLFOX4 az ajánlott adjuvans kemoterápia (végbélrákban a FOLFOX előnyét a CIFUFA-val szemben nem bizonyították). (63) Bár a PETACC-3 vizsgálatban az adjuváns FOLFIRI kezelés a betegek relapszusmentes túlélését (RFS) szignifikánsan fokozta a CIFUFA kezeléshez képest, azonban az elsődleges végpont (DFS) tekintetében a javulás nem érte el a szignifikancia határát. Ezért az irinotecan a CRC adjuváns kezelésében rutinszerűen jelenleg nem alkalmazható. Ugyanez vonatkozik a célzott biológiai szerekkel való kombinált biológiai-kemoterápiás protokollokra is. A kombinált kemo- és biológiai (cetuximab, bevacizumab) terápiák fokozott hatékonyságát IV-es stádiumban már bizonyították. Lehetséges szerepüket az adjuváns kezelésben folyamatban lévő nemzetközi vizsgálatok tanulmányozzák. Az oralis fluoropirimidinek (UFT, capecitabine) szerepét a CRC adjuváns terápiájában több randomizált vizsgálatban is tanulmányozták, azonban a kontroll csoportokban a betegek bolus 5-FU+LV (Mayo séma) kezelést kaptak. A Mayo protokoll jelenleg nem a legjobbnak elfogadott terápia a CRC adjuvans kezelésében. Japán szerzők három randomizált vizsgálat adatait elemezve arra a megállapításra jutottak, hogy az oralis fluoropirimidinek a mortalitást 11%-kal, a recidivát 15%-kal csökkentik az adjuváns terápia során. (64) Összefoglalva elmondható, hogy a CRC-k adjuvans kezelésében az 5FU/LV kombináció a „gold standard”. Az oxaliplatin hozzáadása a CIFUFA-hoz szignifikánsan

18

javítja a DFS-t és valószínűvé teszi, hogy az OS-t is meghosszabbítja. Az adjuváns kezelés időtartama 6 hónap. Az elmúlt 15 év alatt a kontroll csoporthoz (primer sebészi ellátás és observatio) képest a DFS-ben több mint 20%-os javulást értek el a kombinált adjuváns protokollok. (4) 1.4.3. A távoli áttétes CRC belgyógyászati-onkológiai kezelése Távoli áttétek előfordulása esetén az első kérdés az, hogy lehetséges-e azok R0 rezekciója. Amennyiben igen, a választandó kezelés a műtét. Jelenleg nem áll rendelkezésre elegendő tudományos bizonyíték annak az eldöntésére, hogy az R0 metastasectomiát követően szükséges-e „adjuváns” (postoperatív) gyógyszeres kezelést alkalmazni. Rezekálható távoli áttétes CRC esetén „neoadjuváns” kemoterápia (biológiai terápia?) akkor jön szóba, ha az áttétek együtt fordulnak elő a primer tumorral. Amennyiben az áttét(ek) R0 rezekciója nem lehetséges azt kell eldönteni, hogy van-e esély az áttét(ek) gyógyszeres kezeléssel történő műthetővé tételére. Ha igen, „neoadjuváns” kombinált kemo-(±biológiai) terápiát kell alkalmazni a korszerű kombinációk (FOLFIRI, FOLFOX, /FUFA-irinotecan-bevacizumab/) valamelyikével. Ha a „neoadjuváns” gyógyszeres kezeléssel a resecabilitas elérhető, a műtét célja az R0 metastasectomia. A máj vagy tüdő áttét akár primer, akár „neoadjuváns” FOLFOX vagy FOLFIRI

kezeléssel

lehetővé

tett

R0

resectioja

35-58%-os

ötéves

túlélést

eredményezhet (65). Fenti korszerű kemoterápiák valamelyikével az eredetileg irresecabilis májáttétek mintegy 15%-a műtéthetővé tehető, és az így R0 resection átesett betegek túlélési esélye azonos az elsődlegesen resecalható betegekével. A korszerű intervenciós radiológiai (preoperatív vena portae embolizáció), sebészi (kétlépcsős máj resectio) és ablatios (RFA) módszerek szakszerű kombinálásával egyre több májáttétes CRC-s beteg válhat hosszútávú túlélővé, azaz gyakorlatilag gyógyulttá. (66) Ha az áttétes daganat „neoadjuváns” gyógyszeres kezeléssel nem tehető műthetővé, a belgyógyászati-onkológiai terápia célja a túlélés meghosszabbítása, a daganatnövekedés lehetőség szerinti kontrollja, a daganattal összefüggő tünetek csökkentése, valamint elfogadható életminőség fenntartása. A gyógyszeres kezeléssel műthetővé nem tehető IV stádiumú CRC-s betegek általános állapotuk (performance státusz - PS), az áttétes szervek száma, a szérum alkalikus

19

foszfatáz (AP) és a fehérvérsejt szám (fvs) alapján jó, közepes és rossz prognózisú csoportba sorolhatók. Az ECOG 0 általános állapotú, csak egyetlen szervben távoli áttéttel rendelkező, normális AP és fvs számú betegek a jó prognózisú csoportba tartoznak. A jó- és közepes prognózisú betegek kezelési stratégiájának iránya mindhárom

nagyhatású

citotoxikus

gyógyszer

(5-FU,

irinotecan,

oxaliplatin)

alkalmazása a palliatív gyógyszeres terápia során. (67) Ez egyidejűleg vagy szekvenciálisan történhet (FOLFIRI vagy FOLFOX kezelések formájában). A rossz prognózisú csoportba tartozó betegek számára fluoropyrimidin monoterápia az észszerű kezelés, lehetőleg orális készítmény (capecitabin) formájában. A jó és közepes prognózisú csoportba tartozó betegek számára ajánlható lehetséges első vonalbeli kombinációk: FOLFIRI vagy FOLFOX vagy FUFA+Bevacizumab ± irinotecan. Amennyiben a beteg adjuváns kemoterápiaként FOLFOX kombinációt kapott, FOLFIRI±bevacizumab az ésszerű első vonalbeli kombináció.A legmegfelelőbb további (második-harmadik vonalbeli) kemo-biológiai terápiás gyógyszerkombinációkat az aktuális első vonalbeli kombinációk, és - ha volt -, az adjuváns kezelés ismeretében lehet kiválasztani. A következőkben a különböző első választású kombinációkat követően adható második-, harmadik- stb. vonalbeli lehetséges kombinációk kerülnek ismertetésre. I. Első vonalbeli CIFUFA (vagy oralis fluoropirimidin, pl. capecitabin) → FOLFIRI → IRI+cetuximab → FOLFOX → klin. vizsgálat vagy 5-FU mitomycin (MMC) VAGY FOLFOX → IRI+cetuximab → klin. vizsgálat vagy 5-FU MMC VAGY FOLFOX → FOLFIRI → IRI+cetuximab → klin. vizsgálat vagy 5-FU MMC II. Első vonalbeli FOLFIRI vagy FOLFIRI+bevacizumab → FOLFOX → IRI + cetuximab → klin. vizsgálat vagy 5-FU MMC VAGY IRI+cetuximab → FOLFOX → klin. vizsgálat vagy 5-FU MMC III. Első vonalbeli FOLFOX → FOLFIRI → IRI+cetuximab → klin. vizsgálat vagy 5FU MMC VAGY mono IRI → mono iri+cetuximab → klin. vizsgálat vagy 5-FU MMC Az első vonalbeli FOLFIRI után adott második vonalbeli FOLFOX-ra kapott tumorválasz jobb, mint az első vonalbeli FOLFOX-ot követően adott második vonalbeli

20

FOLFIRI-re kapott tumorválasz. (68) Ezért az első vonalbeli FOLFOX kezelés után a második vonalbeli irinotecan monoterápia az ésszerű választás. Amennyiben a beteg valamilyen okból sem irinotecant, sem oxaliplatint nem kaphat, 5-FU+bevacizumab terápia választható. Az 1990-es években bevezetett kemoterápiás szerek (irinotecan és oxaliplatin) és a 2000-es évek elején először alkalmazott célzott biológiai terápiás szerek (bevacizumab és cetuximab) alkalmazása szignifikánsan javította az előrehaladott CRC-s betegek életkilátásait. Az 5-FU kezelés előtt a távoli áttétes CRC-vel átlagosan mindössze fél évet lehetett élni. Ez az 5-FU- alapú kemoterápiával kb. 1 évre hosszabodott. A medián túlélés az irinotecan- vagy oxaliplatin-alapú kombinációkkal 14-16 hónapra és mindhárom szer egyidejű vagy egymást követő alkalmazásával, vagy biológiai kemoterápiás kombinációval 20 hónap fölé emelkedett. (69) Elmondható tehát, hogy a korszerű kemoterápiás és célzott biológiai terápiás szerek alkalmazásával a távoli áttétes CRC-s betegek ma átlagosan kétszer annyi ideig élnek, mint egy évtizeddel ezelőtt. A modern adjuváns kemoterápia 30%-kal megnöveli a gyógyulás esélyét a III-as és a nagy kiújulási kockázatú II-es stádiumú betegségben. Mindazonáltal az irresecabilis, előrehaladott CRC még ma is gyógyíthatatlan, végzetes kimenetelű betegség. A további haladás a molekuláris célpontokat tanulmányozó alapkutatások eredményeinek a klinikai gyakorlatba való gyors átültetésétől, a jól tervezett, randomizált klinikai vizsgálatok eredményeitől és a farmakogenetikai vizsgálatok eredményeinek nagyobb beteganyagon történő igazolásától és bevezetésétől várhatóak.

1.4.4. A kemoterápia során alkalmazott citotoxikus gyógyszerek és sajátosságaik 5-fluorouracil (5-FU) Évtizedek óta az 5-FU számít a CRC esetében a kezelés gerincének. Metasztatikus CRC-ban az 5-FU+LV kombinációval a betegek kb. 20%-ában érhető el objektív válasz (50 %-os vagy annál nagyobb regresszió). Az

5-FU,

az

5-fluoropirimidinek

legszélesebb

körben

alkalmazott

tagjának

kifejlesztéséhez több mint 40 évvel ezelőtt az a megfigyelés vezetett, hogy a

21

tumorsejtek (szemben a normál sejtekkel) az uracilt, a nukleinsavak szintézisének prekurzorát fokozottan használják fel. A DNS és RNS szintézishez nélkülözhetetlen természetes pirimidin molekula, az uracil kismértékű módosítása, közelebbről az 5-ös pozícióban lévő hidrogén fluorral való szubsztitúciója eredményezte az 5-FU-t, mely önmagában inaktív vegyület, metabolikus aktiválás szükséges ahhoz, hogy hatását kifejthesse. Az 5-FU metabolikus aktiválása során keletkező aktív nukleotidjai (FdUMP, FUTP, FdUTP) három főbb ponton fejtik ki hatásukat: (i) a timidin szintézis „de novo” útjáért felelős timidilát szintáz gátlása az FdUMP által, (ii) az 5-fluorouridin-5’-trifoszfát (FUTP) beépülése a RNS-be; (iii) az 5-fluoro-2’-dezoxiuridin-trifoszfát (FdUTP) beépülése a DNS-be. A domináns metabolikus utat a rendelkezésre álló anabolikus és katabolikus enzimek expressziója/aktivitása, valamint a normál szubsztrátok aránya határozza meg. Az antiproliferatív hatásért elsősorban a TS gátlását tartják felelősnek. A TS a dUMP reduktív metilezését katalizálja dTMP-tá redukált folát 5,10-metiléntetrahidrofolát (MTHF) metildonorkénti jelenlétében. Ez a reakció az egyedüli de novo út a timidilát (dTTP) képzéséhez, amely a DNS replikációhoz és javításhoz (repair) nélkülözhetetlen. A 36 kD molekulatömegű TS fehérje dimerként működik, amelynek mindkét alegysége tartalmaz egy kötőhelyet a nukleotid és redukált folát számára. Az 5FU metabolitja az FdUMP kötődik a TS fehérje nukleotid kötőhelyéhez, és a redukált foláttal együtt egy stabil ternier komplexet képez, ezáltal megakadályozva a dTMP szintézisét. A TS gátlást követő molekuláris események nem teljesen tisztázottak, valószínű azonban, hogy a dTTP hiánya a többi nukleotid (dATP, dGTP, dCTP) szintjét is befolyásolja és a nukleotidok között egyensúlyi zavar (imbalance) lép fel, amely a DNS szintézist és javítást befolyásolja, és letális DNS-károsodást eredményezhet. A TS gátláson felül, az át nem alakult dUMP akkumulálódik és átalakul dUTP-vé. A dUTP téves beépülése, (misincorporation) nukleotid exciziós repair útján történő kivágásának és kijavításának elmaradása DNS lánctörésekhez, sejthalálhoz (apoptózis) vezethet. A stabil ternier komplex kialakulásához kivülről adagolt redukált folát (leukovorin) biztosítása szükséges. A TS gátlása „timinhiányos” állapotot hoz létre, mely a legtöbb aktívan osztódó sejt számára letális. A timidilát szintézis-mentesítő (salvage) útját a timidinkináz (TK) biztosítja, mely a keringő timidint hasznosítja a dTTP előállítására, ezáltal csökkenti az 5-FU hatását,

22

ugyanakkor, mint a katabolikus enzim, a dihidropirimidin dehidrogenáz szubsztrátja, azt lekötve fokozza az aktiválódás számára felhasználható 5-FU koncentrációját. Az RNS irányú hatást az 5-FU citotoxicitásának kialakulásában az a felismerés támasztotta alá, miszerint a FUTP mindhárom típusú RNS-be (riboszomális, messenger, transzfer) is beépül. Az aktiválás mellett az 5-FU a szervezetbe kerülve igen gyors és jelentős lebontáson (katabolizmus) megy keresztül, több mint 80%-a lebomlik, így az aktiválás számára rendelkezésre álló 5-FU mennyiségét a lebontási folyamat szabályozza. A lebontás első, sebesség-meghatározó enzime a DPD, amely az 5-FU-t dihidrofluorouracillá (H2FU) alakítja át. Aktivitása legnagyobb a májban és a perifériás mononukleáris sejtekben, míg a tüdőben, vesében, lépben, csontvelőben és bélnyálkahártyában alacsony. A DPD hiánya vagy csökkent aktivitása súlyos, néhány esetben halálos kimenetelű toxicitást okozott 5-FU-val kezelt betegekben. A DPD teljes hiánya nagyon ritka, azonban részleges DPD hiányt írtak le nem szelektált, daganatos betegpopuláció 3%-ában, amely a magyar daganatos populációban kissé magasabb (5,5%). (70) Irinotecan (CPT, Campto) Az irinotecan a camptotecin félszintetikus származéka. Az irinotecan ”prodrug”-nak tekinthető, mert az SN-38 jelzésű metabolitjának fokozottabb a citotoxicitása. Az irinotecan megoszlása a szervezetben meglehetősen gyors, majd két szakaszban a vesén és a bélrendszeren keresztül kiürül. Az irinotecan karboxileszterázok hatására átalakul 7-etil-10-hidroxicamptothecinné (SN-38), amelynek citotoxicitása in vitro kísérletben 100x nagyobb az irinotecannál. Az SN-38 a tulajdonképpeni aktív metabolit, mely glükoronsavhoz kötődik a májban, és az epével együtt a bélrendszeren át távozik a szervezetből, ezért tehető felelőssé az irinotecán gastrointestinális melléhatásaiért. A camptothecin és származékai gátolják a topoizomeráz-I működésének második szakaszát, a láncok újraegyesítését. A topoizomeráz I mutációja, vagy egyéb oknál fogva kialakult csökkent aktivitása esetén a hatás elmarad. Lehetséges az irinotecan (CPT-11) aktiválásának az elmaradása, ha a karboxileszteráz nem működik, így azok a

23

tumorsejtek rezisztensek irinotecannal szemben, amelyek karboxileszteráz aktivitása lényegesen lecsökkent. A gastrointestinális toxicitás (diarrhoea, hányás) tekinthető az adagolást korlátozó legfontosabb szöveti toxicitásnak, amelynek korai és késői formái ismeretesek. Az infúziós kezelés során vagy azt követően rövid időn belül fellépő súlyos hasi görcsöket és diarrhoe-t az arc elvörösödése is kísérheti. Mivel vazoaktív hatóanyagok felszabadulása tételezhető fel a tünetek csökkenthetők antikolinerg (scopolamin, atropin) gyógyszerek adagolásával. Profilaktikus kezelésre serotonin receptor (5-HT3) blokkolók és H1 hisztamin antagonisták alkalmazhatók. A gastrointestinális toxcitás másik formája a loperamiddal és kodeinnal nehezen befolyásolható diarrhoea. A haematológiai toxicitás (neutropaenia) súlyos formája minden ötödik betegnél várható. (71) Oxaliplatin Az oxaliplatin (Eloxatin) harmadik generációs platina származék. Igen erősen kötődik a vörösvértestekhez. A DNS láncok között illetve a láncokon belül keresztkötéseket hoz létre, és ez a génállomány károsodásához vezet. Bár hatásmódja hasonló a ciszplatinéhoz, ennek ellenére ciszplatin rezisztens esetekben is alkalmazható. A DNS-re gyakorolt hatása révén apoptosist indukál (72) Az 5-FU-val erősen szinergista hatású nem csak preklinikai modellben, (73) hanem klinikai vizsgálatban is. (74) A szinergizmusnak az a háttere, hogy az oxaliplatin „down-regulálja” a TS enzimet, és ezáltal fokozza az 5-FU hatását. (75) Toxicitási profilja a vesekárosítás, halláskárosítás és az alopecia tekintetében kedvezőbb a cisplatinnál és a carboplatinnál, viszont gyakrabban okoz neuropathiát. (76) A mellékhatások közül a perifériás neuropathia a legjelentősebb. Ma a FOLFOX kezelést a III stádiumú CRC standard adjuváns kemoterápiájának tekintik. 1.4.5. Molekuláris célpontra tervezett biológiai (immun-) terápiás szerek A molekuláris biológiai alapkutatások rohamos fejlődése folytán egyre több olyan molekuláris célpont került azonosításra, amelyek ellen specifikus monoklonális antitesteket sikerült kifejleszteni. Általuk lehetővé vált a daganatnövekedés, -túlélés és

24

áttétképzés több celluláris útvonalának a célzott, specifikus gátlása. A célzott biológiai kezelési módok mellékhatásprofilja általában kedvezőbb, mint a lényegesen toxikusabb kemoterápiás szereké. A XXI. század első éveiben két új ígéretes célzott molekuláris biológiai gyógyszert vezetettek be az előrehaladott CRC kezelésére, a vascularis endotheliális növekedési faktor (VEGF) ellenes bevacizumabot (Avastin), és az epidermális növekedési faktor receptor

(EGFR,

HER-1

receptor)

elleni

cetuximabot

(Erbitux).

Mindkettő

monoklonális antitest. Előbbivel a IV stádiumú betegség első vonalbeli irinotecan és 5FU alapú kemoterápiája tehető hatásosabbá, utóbbival pedig második-harmadik vonalban helyreállítható a tumor irinotecan iránti érzékenysége. Bevacizumab (Avastin) Az angineogenesisnek a tumor növekedésben betöltött szerepére Folkman munkássága hívta fel a figyelmet. (77) Az angiogenesis gátlásának eddigi legsikeresebb módja a VEGF (78) elleni rekombináns humán IgG1 típusú monoklonális antitest, a bevacizumab (Avastin) alkalmazása. A bevacizumab megakadályozza a VEGF kötődését a receptoraihoz (Flt-1, KDR) az endothelsejtek felszínén. A VEGF kötődése a receptoraihoz endothel sejtproliferációt és új érképződést indít el, amelyet a bevacizumab alkalmazása csökkent. Populációs farmakokinetikai vizsgálatok szerint 120 mg/kg/hét bevacizumab adagolása után az eliminációs félidő (t1/2) kb 20 nap. A clearance értéke összefüggést mutat a testtömeggel, nemmel és a tumor méretével, amely azonban nem befolyásolta a hatékonyságot. Előrehaladott CRC-ban 5-FU és irinotecan alapú kemoterápiával kombinálva több klinikai vizsgálatban sikerült jótékony hatását bizonyítani. (79, 80) IV stádiumú CRC kezelése során az IFL (bolus FUFA+irinotecan) kemoterápiához adott bevacizumab szignifikánsan fokozta a tumorválaszt, és 4,7 hónappal (15,6 hónapról 20,3 hónapra) meghosszabbította a teljes túlélést. (80) FUFA-hoz adva ugyancsak javította a tumorválaszt, és a progresszióig eltelt időt is meghosszabbította. (81) FOLFOX-hoz adva, irinotecan kezelés után, progrediált áttétes CRC-s betegek teljes túlélését szignifikánsan meghosszabbította. A bevacizumab mellékhatási közül a magas vérnyomás és a proteinuria emelhető ki. A hypertonia standard gyógyszeres kezeléssel uralható.

25

Cetuximab (Erbitux) Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR, HER-1 receptor) egy transzmembrán glikoprotein

intracelluláris

tirozinkináz

doménnel,

amely

a

sejtnövekedést,

differenciálódást, proliferációt és apoptosist ellenőrző jelátviteli útvonal fontos szereplője. (82) Számos tumorban, így a CRC-k jelentős részében is fokozottan jelenik meg a rákos sejtek felszínén. Ez az ún. overexpressio a rossz prognózis jelének tekinthető. (83) A cetuximab (Erbitux) egy rekombináns human/egér kiméra monoklonális ellenanyag, amely specifikusan kötődik az EGFR receptor extracelluláris doménjéhez, és ezáltal kompetitíven gátolja az EGF és más ligandok (pl. TGFα) kötődését a receptorhoz. A cetuximab blokkolja a receptorral kapcsolatos kinázok foszforilációját, aktivitását ezáltal gátolja a sejtproliferációt, és apoptozist indukál elsősorban azokban a daganatokban amelyek az EGFR-t overexpresszálják. Az EGFR elleni monoklonális antitest a cetuximab praeklinikai vizsgálatokban szinergista hatásúnak bizonyult kemoterápiás szerekkel, és képes volt áttörni az irinotecan elleni rezisztenciát is. (84) Klinikai vizsgálatokban bebizonyosodott, hogy a cetuximab, irinotecan-rezisztens, előrehaladott CRC-ban önmagában adva 11%-ban, irinotecannal kombinálva viszont 23%-ban idézett elő objektív tumorválaszt. (85) A cetuximab mellékhatásprofilja kedvező. Elsősorban akne-szerű bőrelváltozásokat okoz bőrszárazsággal és berepedésekkel. Ezek a bőrjelenségek csak ritkán súlyosak, és intenzitásuk összefügg a tumorválasz mértékével. (86) Az EGFR expresszió mértéke és a tumorválasz között viszont nem találtak korrelációt. (87)

1.5. Lehetőségek a lemoterápiás kezelés hatékonyságának fokozására A gyógyszeres kezelés korlátozott eredményességében vagy az eredménytelenségben a beteggel (életkor, fizikai állapot, tápláltság, szervek funkciói, immunológiai paraméterek, farmako-genetikai paraméterek) és a daganattal (kiterjedtség, növekedési ütem, sejtciklus paraméterek, szövettani típus, stádium, differenciáltság) kapcsolatos jellemzők mellett számos, a gyógyszerrel, a gyógyszeres kezeléssel kapcsolatos tényező

26

játszhat szerepet. Ezek között is jelentős szerepe lehet a gyógyszer farmakokinetikai sajátosságainak, a kezelés során kialakuló plazmakoncentrációnak (Cmax, Css) a koncentráció-idő görbe alatti területnek (AUC) és az eliminációnak. Fentiek mellett természetesen jól ismert, hogy a gyógyszeres kezelés hatására kialakuló mellékhatások időpontja, súlyossága, kivédésük illetve ellátásuk lehetőségei, a rezisztencia formái és leküzdésének lehetőségei, valamint egyes gyógyszerek esetében a kronofarmakológiai sajátosságok is szerepet játszanak a kezelés hatékonyságában. Az egyes gyógyszerek, gyógyszercsoportok hatékonyságának fokozására számos lehetőség van, amelyek közül kiemelkedő jelentőségű a gyógyszerek farmakokinetikai vizsgálatán alapuló terápia optimalizálása, illetve az a relatíve új irányzat amely a hatékonyabb, egyénre szabott kezelés megtervezéséhez farmakogenetikai módszereket, molekuláris prognosztikai és prediktiv markerek meghatározását veszi igénybe. 1.5.1. Farmakokinetikai módszerek jelentősége az optimális dózis kiválasztásában A terápiás gyógyszermonitorozás (TDM), amelyet gyakran „klinikai vagy alkalmazott farmakokinetikának” is neveznek, egy adott gyógyszer alkalmazása után kialakuló gyógyszerkoncentrációk

vizsgálatát

jelenti,

melyek

a

belőlük

kiszámított

farmakokinetikai jellemzők és a hatásukra kialakuló farmakodinámiás változások összevetésével

felhasználhatók

az

egyes

betegek

gyógyszeres

terápiájának

optimalizálására. A terápiás gyógyszermonitorozás egyfelől a gyógyszeres kezelés rutinszerű követésével (a dózis egyéni beállításával) a mindennapi betegellátás fontos részét képezheti, másfelől az új gyógyszerek racionális fejlesztésének nélkülözhetetlen eszköze. A farmakokinetikai vizsgálatok fontossága a klinikai gyakorlatban több szempontból indokolt. Az optimális terápiás válasz létrejöttéhez a plazma gyógyszer koncentrációjának egy adott tartományban kell lennie, ugyanakkor az adagolás módja valamint az egyes betegek közötti különbségek a gyógyszer felszívódásában, megoszlásában, metabolizmusában

és

eliminációjában

igen

különböző

plazmakoncentrációkat

ered-

ményezhetnek, amely befolyásolja a betegnek a gyógyszeres kezelésre adott válaszát.

27

Jó példa az elmondottakra a CRC-k adjuváns és palliativ kezelésében igen széleskörben alkalmazott 5-FU kétféle adagolás módja, a bolus és infúziós kezelés, amelyek teljesen különböző farmakokinetikai paramétereket más támadási pont károsítását és mellékhatás-profilt eredményeznek. A kétféle kezelést más-más plazmakoncentráció és AUC érték követ. A bolus (Mayo séma) 300-600 mg/m2/nap adagolást követően igen magas plazma csúcskoncentrációt (Cmax = 0,1-1 mM) eredményez egy igen rövid ideig, amely a vegyület RNS szintézist gátló hatásának kedvez, ugyanakkor súlyos myelotoxicitást és mucositist okozhat. Az infúziós kezelés ezzel szemben tartós, nem túl magas egyensúlyi „steady state” plazmakoncentrációhoz (Css) vezet, 190-600 mg/m2/nap dózis alkalmazása esetén a Css = 0,43-1,43 μM, amely kedvező, az 5-FU legfontosabb molekuláris targetje az S-fázisspecifikus timidilátszintáz gátlása szempontjából. Ennél az utóbbi kezelési formánál ugyanakkor a mellékhatások közül a hasmenés, neurotoxicitás és a kéz-láb syndroma kerül előtérbe. Ezek, a kétféle adagolásnál tapasztalható, farmakokinetikai, hatékonyságbeli és mellékhatásbeli különbségek vezettek az ún. De Gramont séma kidolgozásához, amelynél a bolus és tartós infúziós kezelés kombinációját alkalmazzák, így az 5-FU kétféle adagolásmódjának eltérő, de a tumorgátlás szempontjából előnyös hatásmechanizmusa érvényesül. Egyes

betegek

között

igen

nagy

individuális

különbség

van

egy

adott

plazmakoncentráció biztosításához, illetve az optimális terápiás válasz létrehozásához szükséges dózist illetően. Emellett számos tanulmány igazolta, hogy gyakran jobb összefüggés mutatható ki egyes farmakokinetikai paraméterek (pl. a plazmakoncentráció (Css) koncentráció-idő görbe alatti terület (AUC)) és a farmakodinámiás hatás között, mint a dózis és hatás között. A farmakokinetikai tényezők figyelembevételével történő individuális dózis adaptáció igen hasznos a toxicitás csökkentésében, a kezelés hatásosságának növelésében azonban még kevéssé tisztázott a szerepe. (88) Folyamatos infúziós kezelésben részesülő betegekben összefüggést találtak az 5-FU „steady-state” plazmakoncentrációja és az akut toxicitások megjelenése között, mely a testfelületre számított dózissal nem mutatott korrelációt. Ez arra utal, hogy a testfelületre számított standard dózisú kezelés igen különböző plazmakoncentrációkhoz, tumorgátló és toxikus hatásokhoz vezethet. (89) Az 5-FU terápiás indexe igen szűk, vagyis a maximálisan tűrt dózis és a minimálisan effektív hatékony dózis közel van egymáshoz. Mivel a farmakokinetikai tényezők

28

(szisztémás clearance, AUC, Cmax) nagy interindividuális különbségeket mutatnak, a standard dózisú kezelés különböző hatékonysághoz vezet az egyes betegekben. Folyamatos infúziós kezelés esetén növekvő 5-FU dózisok mellett a plazmakoncentráció, a dózis emelésével nem lineárisan, hanem meredekebben emelkedett, tehát

ebben

az

esetben

lehetetlennek

tűnik

egy

adott

dózishoz

tartozó

plazmakoncentráció előrejelzése, ugyanakkor a toxikus esetekben a clearance csökkenését figyelték meg. (90) Ebben az emelkedésben szerepe van a lebontás (dihidropirimidin dehidrogenáz, DPD) telítődésének. A DPD aktivitásban megfigyelt igen nagy egyéni különbségek, figyelembe véve a DPD szerepét az 5-FU plazmakoncentráció szabályozásában arra utalnak, hogy az alacsony DPD aktivitású betegek fokozott toxicitásnak, míg a magas DPD aktivitású betegek az aluldozírozásnak lehetnek kitéve a hagyományos, standard dózisú 5-FU terápia során. Bár számos tanulmány született az 5-FU farmakokinetikája és a DPD összefüggésének tisztázása céljából,

a

kérdés

még

napjainkban

sem

tekinthető

lezártnak.

(91,

92

)

Fentiek figyelembevétele vezetett az 5-FU farmakokinetikája és a DPD aktivitás közötti összefüggés vizsgálatára CRC-s betegeink esetében. 1.5.2. A terápia optimalizálásának lehetőségei farmakogenetikai prognosztikai és prediktív markerek alapján Az 5-FU központi szerepet játszik a CRC kezelésében. Bár az adjuváns kezelésről kimutatták, hogy szignifikáns mértékben javít a betegek túlélésén, különösen Dukes C stádiumú betegek esetén, de a betegek egy részénél semmilyen bizonyítható klinikai előnnyel nem jár. (93, 94) A legújabb kutatások javaslatai alapján a tumorméret, stádium, differenciáltság, nem, p53 módosulás és a mikroszatellita instabilitás fontos meghatározói lehetnek a kezelés hatásosságának, de szükséges újabb prediktív és prognosztikai markerek azonosítása, amelyek előrejelezhetik a betegek válaszadását a terápiára annak érdekében, hogy elkerülhessük a szükségtelen és olykor toxikus kezeléseket. (95) Az 5-FU egyik legfontosabb molekuláris célpontja a timidilát szintáz (TS), melynek szintje és az 5-FU-ra adott válasz közti összefüggést in vitro rendszerben is kimutatták. (96,

97

) Klinikai tanulmányokban a tumorszövetben mért magas TS szinteket (mRNS,

29

protein, enzim aktivitás) általában kapcsolatba hozták a rossz válaszadási készséggel, főként előrehaladott CRC-ban. (98,

99

) Számos tanulmányban, függetlenül a Dukes

stádiumtól a magas TS szintet összefüggésbe hozták a rossz posztoperatív eredménnyel. (94,

100

) Ezzel ellentétben más munkacsoportok arról számoltak be, hogy azoknál a

betegeknél volt eredményesebb az adjuváns 5-FU-alapú kemoterápia, akiknél magas TS expressziót találtak. (101, 102) Különböző

faktorok

azonosítása,

melyek

szignifikánsak

a

TS

expresszió

szabályozásában meghatározó értékűek az 5-FU érzékenység és rezisztencia mechanizmusának a megértésében. A TS gén (TYMS) promoter enhancer régiója polimorf, egy 28-bázispár hosszúságú szekvencia kettős (2R) vagy hármas (3R) tandem ismétlődésével, amely a transzkripten is jelen van, és ismereteink szerint a TS expresszió transzlációs autoregulációjának a mechanizmusában játszik szerepet. (27) A 3R/3R homozigóta genotípusról kimutatták, hogy a magas TS mRNS expresszióval van összefüggésben. (103) A második, hasonlóan gyakori polimorfizmus egy 6 bp ins/del típusú polimorfizmus a TS mRNS 3’-UTR-on a 1494del6 locusnál. Ez a polimorfizmus befolyásolja a messenger RNS stabilitását. A 0bp homozigóta egyedek szignifikánsan alacsonyabb TS mRNS szinttel rendelkeznek, mint a heterozigóták. (104) A legtöbb tanulmányban a TS polimorfizmust a tumor szövetből határozták meg, habár nagy előnye lenne a normál szövet genotipizálásának, mely gyors és nem invazív megközelítés. A metiléntetrahidrofolát reduktáz (MTHFR) a folát anyagcsere kritikus enzime, mely irreverzibilisen katalizálja az 5,10-metiléntetrahidrofolát (MTHF) → 5-metiltetrahidrofolát átalakulást és elősegíti a homocisztein remetilációját, ezáltal metildonort szolgáltatva a DNS metilációhoz. (105, 106) Az eddig leírt MTHFR génpolimorfizmusok közül a C677T (Ala →Val) SNP fordul elő leggyakrabban. (107) A homozigóta mutáns (TT) esetekben az enzimaktivitás 30%-ra csökken. Emiatt felhalmozodik az MTHF, mely a timidilát de novo bioszintézis kofaktora, és ezáltal a DNS szintézis előnybe kerül a DNS metilációval szemben. (106) A metasztatikus colorectalis daganatok kezelésében, amely során legtöbbször az 5-FUalapú kemoterápia kerül alkalmazásra az MTHF felhalmozódásnak szerepe lehet az

30

betegek 5-FU-alapú kezelésre adott válaszában, mivel az 5-FU metabolitja, az 5-fluoro2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát (FdUMP), a timidilát szintáz (TS) és az MTHF közötti ternier komplex stabilitása, és így az 5-FU citotoxikus hatása fokozódik. Ez tehár azt jelenti, hogy az MTHFR polimorfizmusok meghatározása prediktív jelentőségű az 5fluoropirimidinek hatékonyságának előrejelzésében. Az 5-FU kezeléssel párhuzamosan adott leucovorin, mely az MTHF egyik prekurzora, szintén fokozza az 5-FU sejtkárosító hatását azáltal, hogy a TS-MTHF-FdUMP ternier komplex stabilitását megnöveli. (108) A CRC-k adjuváns terápiájában alkalmazott egyéb gyógyszerek – irinotecan, oxaliplatin – hatékonyságának és toxicitásának előrejelzésére szintén számos farmakogenetikai marker tanulmányozása van folyamatban. Az irinotecan aktív metabolitjának az SN-38nak a glukuronidációjában (detoxifikálásában) az UDP-glukuronát transzferázok (UGT) játszanak szerepet. Az UGT izoformák közül az UGT1A1 a legaktívabb, melynek promoter régiójában a TATA box-ban dinukleotid TA ismétlődések vannak. amely megváltoztatja az UGT1A1 expressziót. A 7 TA ismétlődést tartalmazó variáns allél (UGT1A1*28) (TA)7 akár hetero-, akár homozigóta formában az SN-38 csökkent glukuronidációját és súlyos toxicitást - diarrhoea, neurotoxicitást - okoz. A platinavegyületek és így az oxaliplatin hatékonyságát a detoxifikáló GST és az DNS károsodásokat kijavíto nukleotid exciziós repair (NER) rendszer egyes tagjainak polimorfizmusai pl. GSTP1 Ile105Val, XPD Lys751Gln, ERCC1Asn118Asn stb. befolyásolják. (109) Fenti genetikai változások vizsgálata nem tartozik az értekezés témakörébe, ezért részletes ismertetésüktől eltekintünk.

31

2. CÉLKITŰZÉS Vizsgálataink során a pirimidin és folát anyagcsere (1. ábra.) egyes génjeinek és polimorfizmusainak jelentőségét tanulmányoztuk a colorectális daganatok progreszsziójában és 5-fluorouracil alapú terápiájában, valamint összehasonlítottuk a gyógyszeradagolás különböző módozatainak hatását a betegek túlélésére. Az alábbi célkitűzések vizsgálatát terveztük: 1.) Az 5’-TSER és 3’-TSUTR genotípusok megoszlási gyakoriságának összehasonlításával a relatív CRC rizikót kívántuk megállapítani eset-kontrollos tanulmányban. 2.) Vizsgálni kívántuk a tartós infúziós 5-FU±LV, valamint bolusban adott 5-FU+LV kezelés hatásossága közötti különbséget a CRC adjuváns terápiájában. 3.) Tanulmányt végeztünk annak a megállapítására, hogy a 5’-TSER és 3’-TSUTR polimorfizmusok vizsgálata és kombinált kiértékelésük jelent-e prediktív értéket az adjuváns 5-FU-alapú kemoterápiával kezelt CRC-s betegek betegségmentes (DFS) és teljes túlélésére (OS) vonatkozóan. 4.) Választ kerestünk arra, hogy milyen összefüggés mutatható ki az 5-FU farmakokinetikai tulajdonságai és a DPD aktivitás között metasztatikus CRC-s betegeken. 5.) Összefüggést kerestünk a metasztatikus CRC-s betegek MTHFR C677T genotípusa és az 5-FU alapú kezelésre adott válasza illetve túlélése között.

DPD 5-FU 5-FU

H 2FU

dUMP

Pirimidin szintézis dTMP

MTHFR

TS

5,10-metilén THF

SHMT

5-metil THF

DHF THF

10-formil THF

MS Homocisztein

Metionin

Purin szintézis

DHFR

SAM

SAH

CH 3 X

X

DNS metiláció

1. ábra. A pirimidin és folát anyagcsere mechanizmusa és az értekezésben tanulmányozott paraméterek

32

3. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Betegek 3.1.1. A CRC rizikó vizsgálatába bevont betegek és egészséges kontroll egyének A CRC-s betegek 5’-TSER 3’-TSUTR (TS1494del) lokuszainak genotipizálását prospektív vizsgálatban végeztük annak érdekében, hogy összefüggést keressünk a különböző TS genotípusok és a CRC relatív rizikója között . Az adatok kiértékeléséhez egy egészséges kontroll csoportot is vizsgáltunk, mely földrajzilag ugyanarról a területről származott, mint a betegek. A vizsgálatba az Országos Onkológiai Intézetben (OOI) kezelt CRC-s betegeket soroltunk be. Az OOI az ország egész területéről fogad betegeket. 100 újonnan észlelt CRC-s beteget választottunk be és genotipizáltunk. A betegek beleegyező nyilatkozatot írtak alá az intézet etikai útmutatása alapján. Egy esetet később kihagytunk eltérő diagnózis miatt, tehát 99 beteg adatait értékeltük. A betegek megoszlása kor, nem, földrajzi és területi népesség, (III. táblázat) tumor lokalizáció (colon: 58; rectum: 41 beteg) és Dukes stádium (B: 43; C: 43; D: 13 beteg) szerint megközelítően egyenletes volt. A 100 egymást követő beteget úgy választottuk ki, hogy biztosítsuk az országos CRC-s populációból történő mintavétel véletlenszerűségét, és a mintavétel hibáját kontingencia teszttel ellenőriztük a demográfiai adatok alapján csoportosított genotípusok esetében. (III. táblázat) A kontroll populáció genotípus megoszlásának a meghatározásához 102 egészséges, hasonló népességből származó egyed vérmintáit kaptuk meg az Országos Vérellátó Szolgálattól (OVSZ). Mivel az eset-kontrollos tanulmány célja a genotípus megoszlások összehasonlítása révén a relatív rizikó megállapítása volt, ezért a mintavétel ugyanabból a populációból történt. Az OVSZ a fővárosban az ország egész területén lévő vérbegyűjtő központoktól kapja a vérmintákat. Az egyéni adatokhoz való hozzáférés etikai megfontolásból a nemre és az életkorra korlátozódott, és az életkor is csak két vérgyűjtő központ esetében volt megadva. Mindemellett a minták begyűjtési helysége és területe jellemző az egész országra: az 1. központ (OVSZ) lefedi Budát és a 30 km-es vonzáskörzetét, a 2. központ Pest és vonzáskörzete több, mint 3 millió lakossal és a 3.

33

III. táblázat. Az 5’-TSER genotípusok megoszlása a demográfiai adatok alapján betegekben és kontrollokban Paraméterek

n

2R/2R

%

2R/3R

%

3R/3R

%

P

Betegek

98*

24

24

38

39

36

37

0,05°

< 55 éves

26

8

31

10

38

8

31

0,35

55-65 éves

41

12

29

12

29

17

42

> 65 éves

31

4

13

16

52

11

35

nők

49

12

24

18

37

19

39

férfiak

49

12

24

20

41

17

35

főváros

40

8

20

17

43

15

37

< 100 km

28

9

32

6

21

13

47

> 100 km

30

7

23

15

50

8

27

nagyváros

40

8

20

17

43

15

37

város

35

12

34

11

32

12

34

kisváros-falu

23

4

17

10

44

9

39

Kontrollok

102

18

18

59

57

25

25

0,16°

< 30 éves

33x

4

12

17

52

12

36

0,21

30-40 éves

22

5

23

13

59

4

18

> 40 éves

26

6

23

17

65

3

12

nő

47

7

15

28

60

12

25

férfi

55

11

20

31

56

13

24

1.-2. központ

81¤

15

19

47

58

19

23

3. központ

21

3

14

12

57

6

29

*

0,75

0,29

0,61

0,80

0,84

- az egyetlen 3R/4R genotípust nem foglaltuk bele a számításokba. ° - a Hardy-

Weinberg egyensúlytól való eltérés p értéke. x – az életkor a 3. központ mintáinál nem ismert.

¤

- az 1. és 2. vérvételi központ fővárosi, a 3. központ 100 km-re van a

fővárostól.

34

központ 100 km-re van a fővárostól. Bár az átlagéletkor (± SD) a betegek és kontrollok esetében különbözik (60,9±11,4 vs 35,1±8,9), az életkor önmagában egy kevert populációban nem befolyásolja a genotípus frekvenciákat. Az életkort is magába foglaló adott demográfiai paraméterektől nem függ a TS genotípus megoszlása sem a betegek, sem pedig a kontrollok esetében. (III. táblázat) 3.1.2. Az adjuváns kezelési formák összehasonlításába illetve a TS polimorfizmusok és a túlélés összefüggéseinek vizsgálatába bevont betegek A tanulmányba 166 Dukes B2 és C stádiumú CRC-s beteget választottunk be, akiket 1995 májusa és 2004 júniusa között operáltak az OOI Sebészeti osztályán és 5fluoropirimidin-alapú adjuváns kezelésben részesültek. A medián életkor 58 év volt (2382 év). Minden beteg beleegyező nyilatkozatot írt alá és a tanulmányt az OOI Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A betegek demográfiai és kliniko-pathológiai jellemzőit a IVa.IVb. táblázatban foglaltuk össze. 3.1.3. A farmakokinetikai követéses vizsgálatba bevont betegek A vizsgálati periódusban 14 colon- és 11 rectumtumoros IV stádiumú CRC-s beteg (átlag életkor 54 év) 5-FU kezelése során (81 ciklus) követtük a kialakuló 5-FU koncentrációját. Ugyanakkor mértük a kezelés előtt a PBMC dihidropirimidindehidrogenáz (DPD) aktivitását és a szérum kreatinin szinteket is. A DPD aktivitás magyarországi megoszlását 1373 CRC-s beteg értéke alapján adtuk meg. 3.1.4. A palliatív 5-FU-alapú kezelésben részesült betegek A vizsgálatban 101 metasztatikus CRC-s beteget választottunk be véletlenszerűen, akik az OOI belgyógyászati osztályain palliatív 5-FU-alapú kezelést kaptak. A medián követési idő 18,5 (3-30) hónap volt. Minden beteg beleegyező nyilatkozatot írt alá, és a

35

vizsgálat az OOI Etikai Bizottságának előírásai alapján történt. A betegek klinikai jellemzőit az V. táblázat tartalmazza. IVa. táblázat. A bolus és folyamatos infúziós 5-FU kezelést és a kliniko-pathológiai paramétereket összehasonlító vizsgálatban részt vett betegek adatai adjuváns 5-FU kezelés Paraméterek

összes beteg

n

%

bolus

folyamatos infúzió

n

%

n

%

166

100

70

42

96

58

férfi

91

55

38

42

53

58

nő

75

45

32

43

43

57

<58

84

51

35

42

49

58

≥58

82

49

35

43

47

57

B2

46

28

27

59

19

41

C

120

72

43

36

77

64

p*

Nem ns

Kor (év) ns

Dukes stádium 0,009

Tumor differenciáltsági fok jó/közepes

145

87

63

43

82

57

rossz

21

13

7

33

14

67

rectum

82

49

18

22

64

78

sigma/colon

84

51

52

62

32

38

ns

Tumor lokalizáció

* exact teszt

36

<0,001

IVb. táblázat. A 5’-TSER és 3’-TSUTR genotípusok és a klinikopathológiai paraméterek vizsgálatába bevont betegek adatai Paraméterek

n

%

5'-TSER

p*

2R/2R 2R/3R 3R/3R Összes beteg

166 100

%

3'-TSUTR

P*

0bp/0bp 0bp/6bp 6bp/6bp

29

80

57

17

79

70

18

48

34

10

48

42

14

38

39

3

41

31

8

41

35

9

38

35

4

20

22

13

59

48

15

65

62

1

12

8

6

41

35

Nem férfi

91

55

18

40

33

nő

75

45

11

40

24

<58

84

51

15

42

27

≥58

82

49

14

38

30

B2

46

28

9

21

16

C

120 72

20

59

41

0,477

0,035

Kor (év) 0,837

0,924

Dukes stádium 0,847

0,699

Tumor differenciáltsági fok 1/2

145 87

27

67

51

3

21

13

2

13

6

0,425

0,622

Tumor lokalizáció rectum

82

49

15

40

27

0,958

sigma

35

21

6

18

11

5

21

9

colon

49

30

8

22

19

6

17

26

bolus

70

42

12

35

23

11

31

28

folyamatos

96

58

17

45

34

6

48

42

0bp/0bp

17

10

0

8

9

0bp/6bp

79

48

11

38

30

6bp/6bp

70

42

18

34

18

0,074

Kezelési típus 0,934

3'-TSUTR

*

exact teszt; n, a betegek szám

37

0,038

0,152

V. táblázat. A palliatív 5-FU-alapú kezelésben részesült betegek klinikopathológiai jellemzői esetszám

%

101

100

Összes beteg Nem

esetszám

%

Kor (év) átlag (-tól –ig) 57,8 (23-82) Metasztázis lokalizáció

férfi

56

55

Máj

41

41

nő

45

45

Máj+egyéb

24

24

Tüdő

8

8

Tumor lokalizáció rectum

48

48

tüdő+egyéb

0

0

colon+sigma

53

52

nyirokcsomó

2

2

nyirokcsomó+egyéb

1

1

Tumor differenciáltsági fok jó

2

2

Egyéb

7

7

közepes

82

81

lokális recidíva

18

18

rossz

17

17

Meghaltak száma

50

50

3.2. Kezelés 3.2.1. Adjuváns kezelés Minden beteg esetében adjuváns 5-FU-alapú kemoterápiát alkalmaztunk. A rectum carcinomás betegeket preoperatív radioterápiával is kezeltük. A kemoterápiát a Mayo séma szerinti bolus FUFA (FA 20 mg/m2, 5-FU 425 mg/m2/nap, 1.-5. napon, minden 28 napban, 6 ciklus), folyamatos 5-FU infúzió + FA (deGramont protokoll: FA 200 mg/m2, 5-FU bolus 400 mg/m2, 5-FU folyamatos infúzió 600 mg/m2/nap, 1.-2. napon, minden 14 napban, 12 ciklus) vagy folyamatos 5-FU infúzió (400 mg/m2/nap 1.-5. nap, minden 28 napban, 6 ciklus) formájában alkalmaztuk. A Dukes B stádiumú betegek esetében kemoterápiát csak nagy kiújulási kockázat (obstructio, perforatio, grade 3 tumor, fiatal kor, lymphovascularis vagy perineuralis tumor sejt invázió, stb.) esetén alkalmaztunk.

38

3.2.2. Palliatív kezelés A palliatív pre- vagy posztoperatív radio- és/vagy 5-FU-alapú kemoterápiát a nemzetközi protokolloknak megfelelően alkalmaztuk. (110) (lásd Bevezetés) 3.3. Módszerek 3.3.1. DNS izolálás A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) 3-10 ml EDTA-s (15%) vérből vontuk ki Ficoll gradienssel. A pelyhes réteget mostuk, majd a vörösvértesteket lizálással eltávolítottuk. A DNS-t Master Pure DNA purification kittel (Epicentre, Madison, WI, USA) izoláltuk a gyártó utasításai alapján. A DNS-t szelektív kicsapásos eljárással tisztítottuk, a megadott protokoll szerint. Végül a PBMC DNS-t TE pufferben vettük fel. Az egészséges véradók mintáinak esetében a szérummentesített natív vér üledékét használtuk DNS forrásként. A DNS-t ReadyAmp Genomic DNA kittel (Promega, Madison, WI, USA) izoláltuk. A; 100-400 μl alvadt vér került feldolgozásra a gyártó utasítása alapján, a teljesvér tisztítási protokollját alkalmazva. Röviden: az alvadékot hidratáltuk és mostuk, azután felvettük és szétválasztottuk a megadott gyantás oldat segítségével. A szelektív oldási metódus olyan DNS oldatot eredményezett, ami megfelelő a PCR analízishez. 3.3.2. Az 5’-TSER locus genotipizálása Az 5’-TSER polimorfizmust PCR analízissel határoztuk meg Kawakami és mtsai (111) leírása alapján a 5’-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3’ (forward) és 5’-TCCGAGCCG GCCACAGGCAT-3’(reverse) primerekkel. Az amplifikációs reakciót Minicyclerrel (MJ Research, Watertown, MA, USA) 50 μl térfogatban végeztük, amiben volt 0.2 μg genomikus DNS, 10 mM Tris (pH 8.8), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 , 0.08% Nonidet P40, 0.2 mM dNTP-k, 0.5 μM mindkét primer, 10% DMSO és 1.5 egység rekombináns Taq polimeráz (Fermentas, Hanover, MD, USA). A PCR körülmények a következők: 1 ciklus 5 perc 94°C-on forró indítás; 30 ciklus 40 másodperc 94°C-on, 1 perc 62°C-on és

39

40 másodperc 72°C-on; 1 ciklus száleldolgozás 5 perc 72°C-on. A reakciótermékeket nem-denaturáló 10%-os PAGE-sel elemeztük és a 28 bp allélhossz különbség (220 bp a 3R allélnél és 192 bp a 2R allélnél) alapján diszkrimináltunk az allélek között SybrGreen I (Sigma) vagy etidium-bromid (Sigma) festék segítségével UV fényben BioRad 2000 géldokumentációs rendszeren (2. ábra.). A heteroduplex PCR reakciótermék állandó kísérője a heterozigóta amplifikációnak és a teljesen más migrációs tulajdonságú heteroduplex sávok jelenléte segített a heterozigóták validációjánál.

5’-TSER polimofizmus PCR-PAGE

3’-TSUTR polimofizmus MTHFR C677T polimofizmus PCR - RFLP PCR - RFLP -

+

+

+

DraI

3R/3R 2R/2R

+

+

+ HinfI

–144 bp –78 bp –66 bp

–220 bp –192 bp 2R/3R

-

0bp/0bp 0bp/6bp 6bp/6bp

–198 bp –175 bp TT

CT CC

2. ábra. A 5’-TSER, 3’-TSUTR és MTHFR C677T polimorfizmus meghatározása PCR-(RFLP)-PAGE módszerrel 3.3.3. A 3’-TSUTR locus genotipizálása A TS1494del6 locust Ulrich és mtsai (28) leírása alapján PCR amplifikációval vizsgáltuk, melyet RFLP analízis követett. Az alkalmazott primerek a következők voltak: 5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’ (forward) és 5’-CAGATAAGTGGCA GTACAGA -5’ (reverse). Összesen 0,2 μg genomikus DNS-t amplifikáltunk 50 μl-ben, aminek összetétele: 75 mM TRIS (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP-k, 0.5 μM mindkét primerből és 1.5 egység rekombináns Taq polimeráz (Fermentas, Hanover, MD, USA). A PCR-körülmények: 1 ciklus 5 perc 94°C-on forró indítás; 30 ciklus 40 másodperc 94°C-on, 1 perc 58°C-on és 40 másodperc 72°C-on; 1 ciklus száleldolgozás 5 perc 72°C-on. A PCR terméket, előzetes

40

tisztítás nélkül DraI (Fermentas) endonukleázzal emésztettük. A reakcióelegy 10 μl PCR termék 1:1 hígítva B+ pufferrel és 2 egység DraI enzimmel. Egy órás 37°C-on történő emésztés után a termékeket 10%-os nemdenaturáló PAGE-sal választottuk szét. Az RFLP analízis a TS mRNS 1494-es helyén (gb:X02308) a 3’-TSUTR polimorf locus 6bp insert (6bp) alléljén található DraI felismerő hely jelenlétén alapul. Az 6bp allél emésztett fragmensei 70 és 88 bp hosszúak, míg az emésztetlen 152 bp hosszú fragmens a 6bp hiányos (0bp) allélnek felel meg, amit SybrGreen I (Sigma) vagy etidium-bromid (Sigma) festék segítségével UV fényben azonosítottuk BioRad 2000 géldokumentációs rendszeren (2. ábra.). A heterozigóták esetében itt is a heteroduplex DNS sáv (ellenáll a DraI-nek) jelenléte segít a valódi heterozigóták és az esetleg részlegesen megemésztett homozigóták megkülönböztetésében. 3.3.4. Az MTHFR C677T genotípus meghatározása A DNS-ből PCR-RFLP módszerrel határoztuk meg az MTHFR genotípust. A PCR amplifikáció az SNP-t közrefogó specifikus primerpárral történt. A 198 bp hosszúságú amplikont HinfI (Fermentas) restrikciós endonukleázzal emésztettük. A vad típus nem, míg a mutáns amplikon 23 bp és 175 bp hosszúságú egységekre emésztődik. A hasítási termékeket PAGE segítségével választottuk el és SybrGreen I (Sigma) vagy etidiumbromid festék segítségével UV fényben azonosítottuk BioRad 2000 géldokumentációs rendszeren. (2. ábra.) Mindhárom PCR elemzés metodikájában a fragmenshossz mellett, szekvenálást alkalmaztunk az amplifikált termék validálására. 3.3.5. A DPD enzimaktivitás meghatározása perifériás vér mononukleáris sejtekből (PBMC) A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) 3-10 ml EDTA-s (15%) vérből vontuk ki Ficoll gradienssel. A pelyhes réteget mostuk, majd a vörösvértesteket lizálással eltávolítottuk. A sejtszámolás után folyékony N2-ben 3-szoros fagyasztás-olvasztással a sejteket feltártuk, majd 20000 g-n centrifugáltuk. A citoszolt

41

14

C-jelzett 5-FU-t

tartalmazó szubsztráttal 0 és 20 percig inkubáltuk 37 °C-on. A reakció etanolos leállítása után a mintákat szűrtük, majd radiodetektoros (Bioscan) HPLC (Merck) alkalmazásával

meghatároztuk

a

H2FU

és

5-FU

koncentrációkat.

A

DPD

enzimaktivitást a kialakult H2FU mennyiség és a kezdeti 5-FU szint arányából számoltuk ki, és a teljes PBMC számra vonatkoztattuk. 3.3.6. A szérum 5-FU koncentrációinak illetve kreatinin szintjének a meghatározása A kezelés mindkét napján a kezelés kezdete után 4 órával és az infúzió várható befejezése előtt 2 órával EDTA-s csőbe történt a vérvétel. Centrifugálással a plazmát elválasztottuk, és feldolgozásig -20° C-on tároltuk. A gyógyszerszint meghatározáshoz 500 μl plazmához belső standardként brómuridint (BrU) adunk, majd a pirimidinszármazékok etilacetáttal kerültek extrahálásra. Az elemzést fordított fázisú HPLC (Merck) segítségével végeztük (Aquasil 3C18-as oszlop, 0,4 %-os metanol tartalmú 12,5 mM foszfát pufferes eluens, UV detektor). A szerum kreatinin szinteket az Intézet Központi Laboratóriumi Osztálya határozta meg Olympus laborautomata segítségével. 3.3.7. Statisztikai módszerek A populációs genetikai elemzést GenePop szoftverrel végeztük, és Fisher exact tesztet alkalmaztunk a csoportok összehasonlítására a kétváltozós analízisben és a kontingencia tábláknál. Az

5’-TSER,

3’-TSUTR

és

MTHFR

C677T

polimorfizmusok

gyakoriság-

megoszlásának a vizsgálatára a betegeket a különböző klinikopathológai paraméterek alapján osztottuk csoportokba. A különbségeket kontingencia táblázat exact teszttel értékeltük. A vizsgált paramétereket, mint a túlélés potenciális prognosztikai faktorait, egyváltozós technikával teszteltük. A túlélést Kaplan-Meier módszerrel számoltuk, és a log rank tesztet használtuk az összehasonlításra. Egy- és többváltozós Cox regressziós analízist végeztünk az NCSS statisztikai szoftver (NCSS Kaysville, Utah, USA) segítségével a relatív rizikó (RR) és a 95%-os konfidencia intervallum kiszámítására. A

42

többváltozós Cox analízis esetében a „hierarchical forward with switching” modellt is alkalmaztuk.

4. EREDMÉNYEK 4.1. A CRC rizikó vizsgálata A 99 CRC-s beteg és 102 egészséges kontroll vérmintáiból kivont genomiális DNS-t mindkét, 5’-TSER és 3’-TSUTR polimorfizmusra genotipizáltuk. A III. táblázat bemutatja a betegek és a kontrollok 5’-TSER genotípus szerinti megoszlását. Az 5’TSER genotípusainak etnikai változatossága ismert a szakirodalomból, és a magyar egészséges kontrollok genotípus gyakorisága (2R/2R 18%, 2R/3R 57%, 3R/3R 25%) hasonló a Marsh és mtsai (32) által leírt kontrollokéhoz (2R/2R 18%, 2R/3R 54%, 3R/3R 28%). A 3’-TSUTR esetén a saját kontroll megoszlásunk (6bp/6bp 46%, 0bp/6bp 44%, 0bp/0bp 10%) nagyon hasonló a kaukázusiakról közölt adatokhoz, (28) (6bp/6bp 48%, 0bp/6bp 44%, 0bp/0bp 7%) és mindkét locuson a kontrollok megoszlása megfelelt a Hardy-Weinberg-féle elvárásnak. Hasonlóan, a két genotipizált csoport (betegek + kontrollok) matrix megoszlásának elemzése alapján a korábban leírt kapcsoltság a két polimorfizmus között (24) igazolódott, és úgy találtuk, hogy ebben a tanulmányozott populációban erősen szignifikáns módon a 3R allél a 0bp-vel és a 2R a 6bp alléllel áll kapcsolatban (nem ábrázolt adatok). A vizsgált 201 esetben nem volt jelen 2R/2R 0bp/0bp genotípus-kombináció, és csak egyetlen 3R/4R 5’-TSER típust találtunk. (VI. táblázat) Ez azt mutatja, hogy a kaukázusiakra jellemzően ritka, többszörös tandem ismétlődésű allélek (35) mellett a nagyon kis gyakoriságú TS haplotípusok is jelen vannak a populációban. A betegek populációs analízise az előbbiekkel ellentétben szignifikáns eltérést mutatott a Hardy-Weinberg egyensúlyhoz képest (p=0,05), mely 2R/3R heterozigóta hiányban jelentkezik (38% vs elméleti 49,5%, p=0,01).

43

VI. táblázat. A betegek és kontrollok genotípus matrixa 5’-TSER (n beteg / n kontroll)

a

3’-TSUTR

2R/2R

2R/3R

3R/3R

6bp/6bp

18/12

17/26

8/9

43/47

0bp/6bp

6/6

18/28

20/11a

44/45

0bp/0bp

0/0

3/5

8/5

1/0

12/10

Összes

24/18

38/59

36/25

1/0

99/102

3R/4R

összes

p<0,05 Fisher-féle előfordulási arány: a 0bp/6bp típus a 2R/3R és 3R/3R típusban a

betegekben vs. kontrollokban A betegek megoszlása, ellentétben a kontrollokkal, hasonló volt a kaukázusi latino rectum tumoros populációban találthoz (2R/2R 20%, 2R/3R 38,5%, 3R/3R 41,5%). (33) Tanulmányunkban azt találtuk, hogy az 5’-TSER heterozigóták gyakorisága szignifikánsan kisebb a kontrollhoz képest (p<0,01; VII. táblázat), ellentétben a heterozigóta gyakoriság nem szignifikáns csökkenésével, amit kis esetszámú tanulmányokban tapasztaltak, pl. Kawakami és mtsai gyakorisági adatai (111) összehasonlítva Marsh és mtsai (30) vagy Villafranca és mtsai (33) megfelelő egészséges kontroll csoportjainak latino populációs értékeivel. Hasonlóan, Ulrich és mtsai (24) nagy esetszámú colorectalis adenoma tanulmányában sem éri el a heterozigóták számának csökkenése a szignifikancia szintet. A relatív rizikó megítélésére kétváltozós elemzést alkalmaztunk összehasonlítva a 2R/3R előfordulást a betegekben és kontrollokban (VII. táblázat). A betegek 5’-TSER genotípus megoszlásában több mint 20 %-os csökkenést tapasztaltunk a 2R/3R heterozigóták esetében a kontrollok megoszlásához viszonyítva (OR=0,47; CI=0,270,83; p=0,008). A 3’-TSUTR szerint rétegesen analizálva, a teljes 2R/3R heterozigóta hiány nagyrészt a 0bp/6bp típusra korlátozódik (OR=0,42; CI=0,18-0,98; p=0.05). Az 5’-TSER heterozigóták száma a 3’-TSUTR homozigótákon belül ( 6bp/6bp; 0bp/0bp) ugyanakkor nem mutat szignifikáns eltérést a betegek és a kontrollok között. (VII. táblázat).

44

VII. táblázat. Az 5’-TSER heterozigóták előfordulásának összehasonlítása betegekben és kontrollokban

3’-TSUTR

betegek

kontrollok

5’-TSER

5’-TSER

RR

hetero-

homo-

hetero-

homo-

zigóták

zigóták

zigóták

zigóták

6bp/6bp

17

26

26

21

0,52

0bp/6bp

18

26

28

17

0,42

0bp/0bp

3

8

5

5

0,37

összes

38

60

59

43

0,47

a

95% CI

p

0,14 0,18-0,98

0,05a 0,38

0,27-0,83 0,008a

Fisher féle Pearson valószínűség, RR - relatív rizikó, CI - konfidencia intervallum

A betegek 3’-TSUTR genotípus gyakorisága sem a Hardy-Weinberg arányokhoz, sem a kontrollokhoz viszonyítva nem mutatott eltérést, mint ahogy ez várható lett volna az erős kapcsoltság miatt. Az 5’-TSER genotípus szerinti réteges vizsgálat (VI. táblázat.) ellenben kimutatta, hogy a 3’-TSUTR heterozigóta előfordulás csökkenésének hiánya, ami a nem-réteges vizsgálatban tapasztalható, és a kapcsoltság miatt várható, annak az eredménye, hogy a 3’-TSUTR heterozigóták száma növekedett a 3R/3R homozigótákon belül, és ez elfedi a valódi csökkenést a dupla heterozigóták esetén. Valóban a Fisherféle összehasonlításban szignifikáns különbség mutatkozott a 3’-TSUTR heterozigóták arányában (beteg vs kontroll) a 2R/3R és 3R/3R csoportokban (p=0,037), míg a megoszlási matrixban más párosításokban nem volt különbség. Más szavakkal, a CRC-s betegcsoportban szignifikánsan nagyobb lehet a 3R/3R 0bp/6bp genotípusúak vagy kevesebb a duplán heterozigóták aránya, vagy mindkettő. Ez egy, az 5’-TSER heterozigóta hiánytól független eredmény lehet, attól függően, hogy mennyire erős a kapcsoltság hatása. 4.2. Az adjuváns bolus és folyamatos infúziós kezelés összehasonlítása A betegeket a kliniko-pathológiai paraméterek alapján csoportosítottuk, és kiszámoltuk a relapszus és a halálozás relatív kockázatát. A folyamatos infúzióhoz viszonyítva

45

szignifikánsan nagyobbnak (p=0,038) bizonyult a relapsus rizikója (RR=1,73) a bolus kezelési mód esetében. A teljes túlélést nem befolyásolja a kezelési mód (VIII. táblázat.). VIII. táblázat. A betegségmentes és teljes túlélés egyváltozós Cox regressziós kiértékelése Paraméterek

Betegségmentes túlélés

Teljes túlélés

n

RR

95% CI

p

RR

95% CI

p

férfi

91

1,686

0,98-2,9

0,059

0,869

0,41-1,85

0,716

nő

75

1

0,32-1,45

0,315

0,18-1,25

0,129

0,35-3,84

0,817

0,78-3,57

0,189

0,57-2,59

0,614

Nem

1

Kor (év) <58

84

≥58

82

1,066 0,64-1,79

0,809

1

0,677 1

Dukes stádium B2

46

C

120

0,813 0,46-1,45

0,481

1

0,471 1

Tumor differenciáltsági fok jó/közepes

145 0,803 0,38-1,70

rossz

21

0,568

1

1,153 1

Tumor lokalizáció rectum

82

1,618 0,96-2,72

colon/sigma

35

1

bolus

70

1,73

folyamatos infúzió

96

1

0,07

1,666 1

Adjuváns 5-FU kezelés 0,31-2,9

0,038

1,215 1

RR, relatív rizikó; CI, konfidencia intervallum; n, betegek száma

46

A túlélések Kaplan-Meier módszerrel történő kiértékelése is szignifikáns különbséget eredményezett a betegségmentes túlélés esetén a tartós infúzió javára (p=0,036) (3. ábra). Betegségmentes túlélés 1

Teljes túlélés

folyamatos infúzió n=96

1

Túlélési arány

bólus n=70 0,75

0,75

0,5

0,5

0,25

0,25

0 0

15

30

45

60

0

0

15

hónap

30

45

60

hónap

Log rank teszt p=0,036

p=0,615

3. ábra. A kezelési formák szerint csoportosított adjuváns 5-FU kezelésben részesülő CRC-s betegek túlélése A tumor lokalizációt és az életkort véve figyelembe a folyamatos infúzió után a betegségmentes túlélés erősen szignifikánsan (p<0,01) hosszabbnak bizonyult a colon/sigma tumoros (4. ábra) és az átlagnál fiatalabb betegek esetében. (5. ábra) Ugyanakkor a rectum tumoros betegek esetében sem a betegségmentes, sem a teljes túlélésben nem volt szignifikáns a különbség a kezelési formák között (p=0,446 és p=0,944). Hasonlóan az 58 évnél idősebb CRC-s betegek esetében sem a betegségmentes, sem a teljes túlélésben nem volt szignifikáns eltérés a különböző kezelési formák között (p=0,73 és p=0,678). A IX. táblázat. alapján látható, hogy a betegségmentes túlélés közel kétszer hosszabb a colon/sigma tumoros és a fiatalabb (<58 év) betegek esetében ha tartós 5-FU infúziót alkalmaztak.

47

Túlélési arány

Betegségmentes túlélés

Teljes túlélés

1

1

0,75

0,75

0,5

0,5

0,25

0,25

folyamatos infúzió n=32 bólus n=52 0

0

15

30

45

60

0

0

15

hónap

30

45

60

hónap

Log rank teszt p=0,004

p=0,388

4. ábra. A kezelési formák szerint csoportosított adjuváns 5-FU kezelésben részesülő colon/sigma tumoros betegek túlélése

Túlélési arány

Betegségmentes túlélés

Teljes túlélés

1

1

0,75

0,75

0,5

0,5

0,25

0,25

folyamatos infúzió n=49 bólus n=35

0 0

15

30

45

60

hónap

0 0

15

30

45

hónap

Log rank teszt p=0,007

p=0,825

5. ábra. A kezelési formák szerint csoportosított adjuváns 5-FU kezelésben részesülő 58 évnél fiatalabb CRC-s betegek túlélése

48

60

IX. táblázat. A különböző adjuváns kezelési formák után mért átlagos betegségmentes és teljes túlélés a tumor lokalizáció és életkor szerint csoportosított betegek esetében

Paraméterek

Betegségmentes túlélés

Teljes túlélés

(hónap)

(hónap)

tartós

bolus

p*

20,3

bolus

p

infúzió

infúzió Összes beteg

tartós

14,9

0,036

24,8

24,5

0,615

Tumor lokalizáció rectum

15,1

10,7

0,446

20,4

30,4

0,944

colon/sigma

31,8

15,7

0,004

31,8

23,1

0,388

<58 év

23

14,2

0,007

25,7

27

0,825

≥58 év

18,7

18,8

0,730

22,8

22,8

0,678

<58 év

19,9

10,4

0,086

23,2

30,4

0,428

≥58 év

11,1

29,1

0,369

17,1

30,5

0,657

<58 év

28,4

14,9

0,037

29,2

24,6

0,550

≥58 év

37,9

18,2

0,017

37,9

22.0

0,134

Életkor (év)

Rectum

Colon/sigma

* log rank teszt Többváltozós Cox regressziós analízissel vizsgálva, a betegségmentes túlélés független prognosztikai tényezője a Dukes stádium és a tumor lokalizáció mellett az adjuváns kezelési mód, míg a teljes túlélés esetén csak a Dukes stádium és a tumor lokalizáció bizonyult független prognosztikai markernek. (X. táblázat.)

49

X. táblázat. A betegségmentes és teljes túlélés többváltozós Cox regressziós kiértékelése Paraméterek

n

Betegségmentes túlélés

Teljes túlélés

RR

95% CI

p

RR

95% CI

p

0,94-2,91

0,084

0,782

0,35-1,77

0,554

0,23-1,17

0,116

0,11-0,93

0,037

0,31-3,46

0,964

1,22-7,98

0,018

0,85-4,67

0,114

Nem Férfi

91

1,65

Nő

75

1

<58

84

0,972

≥58

82

1

B2

46

0,43

C

120

1

1

Életkor (év) 0,58-1,64

0,92

0,524 1

Dukes stádium 0,22-0,85

0,016

0,324 1

Tumor differenciáltsági fok jó/közepes

145

0,714

rossz

21

1

rectum

82

2,45

colon/sigma

35

1

bolus

70

2,82

folyamatos infúzió

96

1

0,33-1,52

0,383

1,029 1

Tumor lokalizáció 1,30-4,64

0,006

3,12 1

Adjuváns 5-FU kezelés 1,53-5,22

0,001

1,99 1

RR, relatív rizikó; CI, konfidencia intervallum; n, betegek száma 4.3. TS polimorfizmusok vizsgálata az adjuváns kezelés során A 166 CRC-s beteg klinikopathológiai jellemzőit és a két TS polimorfizmus genotípusai szerinti megoszlását a IVb. táblázat tartalmazza. A betegek 5’-TSER polimorfizmus szerinti megoszlása a következő: 18% 2R/2R, 48% 2R/3R és 34% 3R/3R, míg a 3’-TSUTR polimorfizmus esetében: 10% 0bp/0bp, 48%

50

0bp/6bp és 42% 6bp/6bp. Nem találtunk szignifikáns különbséget az 5’-TSER és 3’TSUTR

genotípus

gyakoriságokban

a betegek

kor,

Dukes

stádium,

tumor

differenciáltsági fok, tumor lokalizáció és a kemoterápia típusa szerinti csoportosítása esetén. Ellenben a 3’-TSUTR genotípus megoszlás szignifikánsan (p=0,036) különbözött a férfiak és nők esetében; a 0bp/0bp homozigoták gyakorisága a férfiak esetében 15%, míg a nőknél csak 4%. Az 5’TSER genotípusok esetében ilyen különbség nem igazolható. Szignifikáns összefüggést találtunk az 5’-TSER és a 3’TSUTR polimorfizmusok megoszlása között is (p=0,038). A 19±14 hónap (medián±SD) követési idő alatt 58 beteg (34.9%) betegsége kiújult (11 lokális recidíva, 47 távoli metasztázis). A log-rank teszt és az egyváltozós Cox regressziós modell eredményei alapján (XI. táblázat) megfigyeltük, hogy a folyamatos 5-FU infúziós kemoterápiával kezelt betegeknél a betegség kimenetele szignifikánsan jobb volt (p=0,036), mint azoké, akiket bolussal kezeltek. Figyelembe véve a colon- és sigmatumorok közötti klinikopatológiai hasonlóságokat, a túlélés elemzésekor a colon/sigmatumoros betegcsoport túlélését hasonlítottuk össze a rectumtumoros betegekével. A colon/sigmatumoros betegek betegségmentes túlélése jobb (p=0,065), mint a rectumtumoros betegeké, bár a különbség nem volt szignifikáns. Kiértékelve a túlélés és TS genotípusok közti összefüggést, megfigyeltük, hogy azoknak a betegeknek, akik legalább egy 2R 5’-TSER allélel rendelkeznek, szignifikánsan rövidebb a betegségmentes- és teljes túlélése, mint a 3R homozigóta pácienseké (p=0,048). Ugyanakkor sem a 3’-TSUTR polimorfizmus, sem a többi vizsgált paraméter nem befolyásolja szignifikánsan a DFS-t és OS-t. Bár a 3’-TSUTR polimorfizmusnak nem volt szignifikáns hatása a túlélésre, a 0bp/0bp genotípusú csoportban magasabb volt a relatív rizikó azokhoz viszonyítva, akik legalább egy 6 bp alléllel rendelkeznek. A két polimorfizmus kombinált értékelésekor a betegek nyolc csoportba oszthatók (2R/2R 0bp/0bp genotípus kombináció nem fordult elő a betegek között). A KaplanMeier túlélési görbék szignifikáns különbséget mutattak a genotípus kombinációk között (DFS - 6. ábra: log-rank teszt p=0,039 és a trend p=0,027; OS - 7. ábra: log-rank teszt p=0,029 és a trend p=0,016).

51

túlélési arány

5’-TSER és 3’-TSUTR genotípusok

hónap Log rank teszt p=0,039; trend p=0,027

6. ábra. A betegek betegségmentes túlélésének Kaplan-Meier analízise a különböző 5’-TSER és 3’-TSUTR genotípus kombinációk szerinti csoportokban

túlélési arány

5’-TSER és 3’-TSUTR genotípusok

hónap Log rank teszt p=0,029; trend p=0,016

7. ábra. A betegek teljes túlélésének Kaplan-Meier analízise a különböző 5’-TSER és 3’-TSUTR genotípus kombinációk szerinti csoportokban

52

Az 5’-TSER homozigóták esetében (3R/3R és 2R/2R) a két polimorfizmus kombinációja nyomán nem alakult ki szignifikáns különbség a túlélési görbék között. Ezzel ellentétben a heterozigótákat (2R/3R) (n=80) a 3’-TSUTR polimorfizmus alapján csoportosítva a túlélések analízise szignifikánsan hosszabb DFS-t és OS-t mutatott a 6bp/6bp genotípus esetében (p=0,049 és p=0,043), mint azoknál a betegeknél, akik legalább egy 0bp alléllel rendelkeznek. Annak igazolására, hogy a TS polimorfizmusok kombinációja a túlélés független prognosztikai markere, többváltozós Cox regressziós elemzést alkalmaztunk. A többkategóriás változók alkalmazásának kiértékelési nehézségei miatt hasznosnak bizonyult a TS polimorfizmusok esetében a nyolc genotípus kombináció helyett bináris változók képzése. Figyelembe véve a 6bp homozigóták szignifikánsan hosszabb túlélését az 5’-TSER heterozigóta csoportban (2R/3R 6bp/6bp), logikusnak tűnt, hogy ezt a csoportot összekapcsoljuk a 3R homozigótákkal, akiknek a DFS-e és OS-e szignifikánsan hosszabbnak bizonyult. (XI. táblázat) A nyolc kombinált genotípus csoport egyváltozós Cox regressziós elemzéssel kapott relapszus-rizikó aránya szintén alátámasztotta a két fő prognosztikai csoport kialakítását. Az A csoportban, ahova a 3R homozigóta betegek tartoznak, függetlenül a 3’-TSUTR

polimorfizmustól,

a

2R/3R

heterozigóta

csoport

3’-TSUTR

6bp

homozigótáival együtt, kisebb a relapszus rizikója (RR≤1). Ezzel ellentétben a B csoportban, ahova a 2R homozigóták tartoznak, függetlenül a 3’-TSUTR genotípustól, együtt a 2R/3R genotípusúakkal, akik legalább egy 0bp allélel rendelkeznek, nagyobb a relapszus megjelenésének kockázata (RR>1). (XII. táblázat) Az A és B csoportba osztott betegek további túlélési kiértékelése erősen szignifikáns különbséget igazolt a két csoport között mind a DFS (p=0,002) (8. ábra), mind az OS tekintetében (p=0,001). (9. ábra) A többváltozós Cox regressziós modellben a Dukes stádium, tumor lokalizáció és kezelési típus mellett a TS A és B prognosztikai csoportba történő besorolása független prognosztikai faktornak biznyult a DFS esetében. A tumor lokalizáció és a TS prognosztikai besorolása az OS esetében is független prognosztikai értékkel bír. (XIII. táblázat)

53

XI. táblázat. A túlélés egyváltozós analízise Paraméter

n

Betegségmentes túlélés á.t.

RR†

95% CI

Teljes túlélés p*

á.t.

RR

0,055

26

1

25

1,15

27

1

24

1,48

29

1

24

2,12

26

1

25

0,87

23

1

95% CI

p

Nem férfi

91

20

1

nő

75

22

0,59

<58

84

21

1

≥58

82

21

0,94

B2

46

24

1

C

120

20

1,23

0,35-1,02

0,718 0,54-2,45

Életkor (év) 0,877 0,56-1,57

0,267 0,69-3,16

Dukes stádium 0,481 0,69-2,19

0,119 0,80-5,63

Tumor differenciáltsági fok 1-2 3

145

21

1

21

20

0,8

0,559 0,38-1,70

0,817 0,26-2,89

Tumor lokalizáció 1. rectum

82

18

1

0,182

2. sigma

35

23

0,59

0,29-1,21

1 vs 2

0,120

28

0,35

0,10-1,20

1 vs 2

0,094

3. colon

49

24

0,64

0,35-1,16

1 vs 3

0,137

28

0,8

0,35-1,82

1 vs 3

0,353

0,62

0,37-1,04

1 vs 2+3

0,6

0,28-1,29

1 vs 2+3

0,065

0,214

0,184

Kezelési típus bolus

70

20

1

folyamatos 96

22

0,58

0,036 0,35-0,97

27

1

25

0,82

29

1

0,615 0,39-1,75

5'-TSER 1. 3R/3R

57

24

1

0,134

2. 2R/3R

80

20

1,73

0,94-3,21

1 vs 2

0,093

24

3,99

1,35-11,84

1 vs 2

0,012

3. 2R/2R

29

18

1,95

0,92-4,14

1 vs 3

0,080

23

3,19

0,85-11,9

1 vs 3

0,081

1,79

1,00-3,22

1 vs 2+3

3,79

1,31-10,98

1 vs 2+3

0,048

0,027

0,009

3'-TSUTR 1. 0bp/0bp

17

20

1

2. 0bp/6bp

79

22

0,69

0,32-1,52

1 vs 2

3. 6bp/6bp

70

20

0,65

0,29-1,47

1 vs 3

0,67

0,32-1,42

1 vs 2+3

* Log-rank teszt;

†

0,552

26

1

0,325

27

0,75

0,25-2,27

1 vs 2

0,696

0,307

24

0,59

0,18-1,91

1 vs 3

0,406

0,68

0,23-1,95

1 vs 2+3

0,285

0,659

0,467

RR a Cox regressziós modellel kiszámolva; RR, relatív rizikó; CI,

konfidencia intervallum; á.t,, átlagos túlélési idő (hónap); n, betegek száma

54

XII. táblázat. A prognosztikai csoportok kialakítása a különböző genotípuskombinációk betegségmentes túlélésének Cox regressziós analízise alapján Genotípus csoport

n

RR

3R/3R 6bp/6bp

18

1,0

3R/3R 0bp/6bp

30

0,5

0,15-1,49

3R/3R 0bp/0bp

9

0,9

0,27-3,44

2R/3R 6bp/6bp

34

0,7

0,23-1,96

2R/3R 0bp/6bp

38

1,6

0,62-3,97

2R/3R 0bp/0bp

8

3,0

0,84-10,75

2R/2R 6bp/6bp

18

1,6

0,55-4,56

2R/2R 0bp/6bp

11

1,1

0,31-3,88

*

95% CI

Prognosztikai csoport* A

B

Azokat a genotípusokat, akiknél a RR≤1 az „A” prognosztikai csoportba (alacsony

relapsus rizikó), azokat akiknél a RR>1 a „B” prognosztikai csoportba (magas relapsus rizikó) soroltuk be; n, betegek száma; RR, relatív rizikó; CI, konfidencia intervallum

túlélési arány

Prognosztikai csoport

hónap Log rank teszt p=0,001 p=0.039; trend p=0,027

8. ábra. Az A és B prognosztikai csoportba tartozó betegek betegségmentes túlélése. Az A és B prognosztikai csoportok meghatározását lásd a szövegben.

55

túlélési arány

Prognosztikai csoport

hónap Log rank teszt p=0,002

9. ábra. Az A és B prognosztikai csoportba tartozó betegek teljes túlélése. Az A és B prognosztikai csoportok meghatározását lásd a szövegben. A DFS „hierarchical forward with switching” többváltozós Cox regressziós modellje a tumor lokalizációt (p=0,003), kezelési módot (p=0,001) és a TS polimorfizmust (p=0,004), az OS esetében pedig csak a TS polimorfizmust (p=0,004) válogatta ki, mint független változókat. 4.4. Az 5-FU kezelés farmakokinetikai követése metasztatikus CRC-s betegek esetén A betegek 5-FU plazma szintje fordított arányosságot mutat a DPD enzimaktivitással. Ez az összefüggés szignifikáns (p=0,012) azon betegek esetében, ahol a szérum kreatinin szintek az átlagérték alatt maradnak (< 75 μM) (10. ábra.). A vizelettel történő 5-FU kiürülés befolyásolja az 5-FU plazmaszinteket, és az alacsonyabb koncentrációk esetében ezt a szintet a DPD - aktivitásától függően -, tovább csökkenti. Figyelembe véve az infúziók tényleges időtartamát, az alacsonyabb szérum kreatinin szintű (< 75 μM) betegek esetében az 5-FU átlag AUC értékei szignifikáns összefüggést

56

(p=0,015) mutatnak a DPD aktivitással, míg a magasabb kreatinin szintek esetében az AUC-t nem befolyásolja a DPD értéke. XIII. táblázat. A túlélés többváltozós analízise Paraméter

n

Betegségmentes túlélés RR*

95% CI

p

Teljes túlélés RR

95% CI

p

1.25

0.54-2.90

0.600

1.83

0.83-4.06

0.137

2.68

0.91-7.87

0.074

0.81

0.24-2.78

0.742

0.36

0.14-0.95

0.039

0.46

0.19-1.10

0.082

0.30

0.13-0.69

0.005

Nem férfi

91

1

nő

75

0.60

<58

84

1

≥58

82

1.03

B2

46

1

C

120

2.04

1 0.34-1.07

0.086

Életkor (év) 1 0.61-1.75

0.904

Dukes stádium 1 1.03-4.06

0.042

Tumor differenciáltsági fok 1/2

145

1

3

21

1.33

1 0.62-2.85

0.466

Tumor lokalizáció rectum

82

1

sigma/colon

84

0.44

bolus

70

1

folyamatos

96

0.35

1 0.23-0.83

0.011

Kezelési típus 1 0.19-0.65

0.001

TS prognosztikai csoport B

57

1

A

80

0.46

1 0.27-0.79

0.005

* RR a Cox regressziós modellel kiszámolva; n, betegek száma; RR, relatív rizikó; CI, konfidencia intervallum

57

1,8

1,6

5-FU Css

5-FU Css (μM)

1,4

R = 0,313 p = 0,379

1,2

1

0,8

R = 0,674 p = 0,012

kreatinin

0,6

_ 75 µM < > 75 µM 0,4 0

5

10

15

20

25

30

35

6 6 PBMC) (pmol/perc/10 DPD DPD (pmol/perc/10 PBMC)

10. ábra. A folyamatos 5-FU infúzió nyomán kialakuló átlag koncentráció (Css „steady state”) és a DPD enzim aktivitás összefüggése alacsony (≤75 μM) és magas (>75 μM) szerum kreatinin szint esetén A 11. ábra. alapján arra is következtethetünk, hogy ha a DPD aktivitás kb. 15 pmol/perc/106 PBMC értéknél magasabb és ez alacsony szérum kreatinin szintekkel (≤75 μM) párosul, akkor az 5-FU kezelés hatékonyságát meghatározó AUC érték akár a felére is csökkenhet. Az 1373 CRC-s beteg DPD értékeinek megoszlási grafikonján megfigyelhető, hogy a 15 pmol/perc/106 PBMC értéknél magasabb DPD szint fordul elő a betegek több mint a felénél. Feltételezve, hogy a betegek kb. 50 %-nál a szérum kreatinin szint az átlagosnál alacsonyabb, arra következtethetünk, hogy minden negyedik 5-FU-val kezelt CRC-s beteg esetén az alacsonyabb AUC a kezelés hatékonyságának a csökkenését jelentheti. (11. ábra.)

58

60

R = 0,042 p = 0,907

5-FU AUC (µM·óra)

50

40

30

300 Esetszám

20

10

R = 0,656 P = 0,015

200 100 0

kreatinin 0

10

<_ 75 µM > 75 µM

20 30 40 50 60 70 80 90 6

DPD (pmol/perc/10 (pmol/perc/10 PBMC) 6 PBMC sejt) DPD

0 0

5

10

15

20

25

30

35

DPD (pmol/perc/106 PBMC)

11. ábra. A folyamatos 5-FU infúzió nyomán kialakuló átlag 5-FU AUC értékek és a DPD enzim aktivitás összefüggése alacsony (≤75 μM) és magas (>75 μM) szérum kreatinin szint esetén. A kis ábra 1373 CRC-s beteg DPD enzimaktivitásának megoszlását mutatja. 4.5. Az MTHFR C677T génpolimorfizmus vizsgálata palliatív kezelés során Az MTHFR C677T genotípusok klinikai paraméterek szerinti megoszlását a XIV. táblázat tartalmazza. A T mutáns allélt tartalmazó genotípusokat (CT és TT) egy csoportba összesítettük. A betegek genotípus szerinti megoszlása a kontroll csoporttal megegyezett. Nem találtunk szignifikáns eltérést a nem, tumor lokalizáció, differenciáltsági fok valamint a kezelési típus (kemo- vs radio-kemoterápia és 5-FU vs 5-FU+irinotecan/oxaliplatin) szerinti genotípus megoszlásokban. A követési idő alatt meghaltak részaránya sem különbözött a két alcsoportban. Az átlag túlélés viszont hosszabb a T alléllel rendelkező betegek esetében, és ez a különbség a Kaplan-Meier kiértékelésnél szignifikáns (p=0,035). (XIV. táblázat, 12. ábra)

59

XIV. táblázat. A MTHFR genotípusok megoszlása a kliniko-pathológiai jellemzők alapján Paraméterek

CC

CT+TT

p

Kontroll+

84

97+15

Összes beteg

46

48+7

férfi

28

28

nő

18

27

rectum

25

22

colon+sigma

21

32

jó

0

2

közepes

37

45

rossz

9

8

kemoterápia

35

41

kemo-radioterápia

11

14

CIFUFA

15

19

CIFUFA + CPT/oxaliplatin

31

36

ns*

24

26

ns*

20,7

27,6

0,036**

ns*°

Nem

ns*

Tumor lokalizáció

ns*

Tumor differenciáltsági fok

ns*

Kezelési típus

ns*

Kezelési protokoll

Meghaltak száma Túlélés (hónap) átlag +

A 196 kontroll minta egészséges véradóktól származott *- exact teszt,

**- log rank teszt, °- vs kontroll, CPT - irinotecan A lokalizáció szerint csoportosított túlélési görbék esetében is megállapítható, hogy a hosszabb túlélés a CT és TT genotípusok esetében nyilvánvaló, de a különbség csak a

60

colon/sigma tumoros betegek esetében volt szignifikáns (p=0,0212). (13. ábra és 14. ábra) MTHFR genotípus n CC 46 CT+TT 55

túlélési arány

1.0

0.5

0.0

0

10

20

30

hónap Log rank teszt p=0,0358

12. ábra. A MTHFR C677T polimorfizmus alapján csoportosított metasztatikus colorectalis tumoros betegek teljes túlélése

MTHFR genotípus n CC 21 CT+TT 32

túlélési arány

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

0

10

20

30

hónap Log rank teszt p=0,0212 13. ábra. A MTHFR C677T polimorfizmus alapján csoportosított metasztatikus colon+sigma tumoros betegek teljes túlélése

61

túlélési arány

1.0

MTHFR genotípus n CC 25 CT+TT 23

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0

10

20

30

hónap Log rank teszt p=0,3708 14. ábra. A MTHFR C677T polimorfizmus alapján csoportosított metasztatikus rectum tumoros betegek teljes túlélése

CC n kezelési típus csak első vonalbeli 18 több vonalbeli 28 p=0,1375*

túlélési arány

1.0

0.5

0.0

CT+TT kezelési típus csak első vonalbeli 24 több vonalbeli 31 p=0,0154* 0

10

20

30 *Log rank teszt

hónap

15. ábra. A MTHFR C677T polimorfizmus és a kezelési típus (csak első vonalbeli vs több vonalbeli kezelés) alapján csoportosított metasztatikus colorectalis tumoros betegek teljes túlélése Feltételezve, hogy az 5-FU-alapú kemoterápia eredményesebb a hosszan tartó, több kezelési vonalon átnyúló esetekben, ennek megfelelően csoportosítottuk azokat a betegeket, akik csak első vonalbeli kezelést kaptak, szemben azokkal, akik másod vagy

62

harmad vonalban is 5-FU-alapú kezelésben részesültek. Mindkét genotípusnál a hosszan tartó kezelés esetén nyilvánvaló a hosszabb túlélés, és ez a különbség a T alléllal rendelkező betegek esetén szignifikáns (p=0.0154). (15. ábra) A Cox regressziós analízis alapján, - a kor, nem, tumor lokalizáció, differenciáltsági fok, MTHFR genotípus és kezelési mód (csak első vonal vs több vonalbeli kezelés) változókat figyelembe véve -, az MTHFR genotípus és a kezelési mód mutatott erősen szignifikáns összefüggést a túléléssel. A relatív rizikó a CC genotípus esetében 2,8 a T allélel rendelkezőkhöz viszonyítva. A csak első vonalbeli kezelésben részesülők esetében a relatív rizikó 2,5 a több vonalbeli kezelésben részesülőkhöz viszonyítva. (XV. táblázat) XV. táblázat. A Cox regressziós analízis eredményei Paraméterek

RR

95% CI

p

Kor (folyamatos változó)

0,9978

0,97-1,03

0,8813

Nem (férfi vs nő)

0,7840

0,42-1,48

0,4533

Tumor lokalizáció (rectum vs colon+sigma)

0,4665

0,23-0,95

0,0343

Differenciáltsági fok (jó+közepes vs rossz)

0,5228

0,23-1,20

0,1274

Kezelés (csak első vonalbeli vs több vonalbeli)

2,4720

1,27-4,83

0,0081

MTHFR (CC vs CT+TT)

2,8399

1,41-5,73

0,0036

RR - relatív rizikó, CI – konfidencia intervallum

63

5. MEGBESZÉLÉS 5.1. A CRC rizikó vizsgálata Az 5’-TSER genotípusok hatását a leukémiás megbetegedés rizikójával kapcsolatban már 2002-ben leírták, (26) és újabb adatok alapján a colorectalis adenomák esetében is igazolták. (24) Megállapításunk, hogy a 5’-TSER heterozigóták esetén kisebb a CRC rizikója új bizonyíték arra, hogy a 5’-TSER genotípus módosítja a CRC rizikót. Bár más szerzők szerint a 3R allél dózis-függő módon védettséget biztosít, tanulmányunkban úgy találtuk, hogy a 5’-TSER heterozigóták kevésbé fogékonyak a CRC kialakulására. Eredményünk egy összetett genetikai rizikóprofil lehetőségét veti fel. Hasonlóan ehhez, összetett genetikai hatást találtak Ulrich és mtsai (24) is, akik szerint a 3R/3R homozigótaság alacsonyabb rizikót jelent a colorectalis adenomákra nézve, ha a folát bevitel magas volt, míg a 2R/2R genotípusúak voltak a legkevésbé fogékonyak alacsony folát bevitel mellett. A komplex, alacsony penetranciájú és feltehetően folát-modulált 5’-TSER hatása a carcinogenezisre lehet az egyik magyarázata annak, hogy más, kis populáción történt vizsgálatoktól eltérő eredményt kaptunk az 5’-TSER gyakoriságát illetően. (32,

33

,

34

) A magyar populációra számos megemelkedett környezeti és

méginkább táplálkozási rizikófaktor hat a CRC vonatkozásában. Ez tükröződik az Európára vonatkoztatott ijesztő morbiditási és vezető mortalitási adatokban. (36) A kiemelkedően magas fehérje- és állati zsír- ill. az alacsony rosttartalmú étkezés kiemelkedő genotoxikus terhet jelenthet (112), míg az általánosan alacsony folát és mikroelem bevitel a népesség nagy hányadát érinti (36,

113

) lecsökkentve a protektív

faktorok biológai érvényesülését. Általánosan elfogadott, hogy a 3R/3R genotípus magas TS expresszióval társul a tumor szövetben, (114) és ez igaz lehet a premalignus szövetekre is. A magas TS expresszió a sejtek nagyobb proliferációs arányával (115) és kevésbé hatásos apoptózissal (116) függhet össze, ami elősegítheti a carcinogén-indukált DNS léziókat. Az alacsonyabb TS aktivitású 2R/2R genotípusú egyénekben ellenben az alacsony folát státus az összes gyorsan osztódó sejt esetében gyakoribb DNS károsodást okoz az uracil hibás beépülése és a kettősszálú törések miatt. Leukémiákban, ahol az uracil hibás beépülése okozta DNS károsodás etiológiai fontossága uralkodóvá válhat, a 3R allél dózis-függő módon

64

jelentkező rizikócsökkentő hatását leírták. (26) Míg a CRC-ben, ahol mindkét mechanizmus (u.m. a carcinogén-indukált és a kettős száltöréssel összefüggő DNS károsodás) egyformán fontos a patogenezisben, látható, hogy a folát bevitel módosíthatja mind a 2R/2R, mind a 3R/3R genotípus rizikóját a colorectális adenómák genetikai epidemiológiájában. (24) Elméletileg a TS expresszió különböző szerepet játszik a két DNS-károsító mechanizmusban, és ami a rizikót illeti - a magas TS aktivitás káros lehet az egyikben és előnyös a másikban. Ezért a genotípushoz kötött TS expresszióbeli különbség ellentétes allél dózis-függő irányt ad a fogékonyságra. Ennélfogva, a kevert CRC etiológiájú népcsoportok, melyek összefüggésbe hozhatóak a két mechanizmussal, általában egy pszeudonormális genotípus megoszlást alkotnak, ami a két ellentétes irány átfedésének eredménye, és a genotípus hatások leárnyékolását adja. Ez lehet a másik oka az 5’-TSER genotípus gyakoriság torzulás hiányának, amit hasonló, korábbi tanulmányokban tapasztalunk. A pszeudonormális eloszlás alóli kivétel akkor fordul elő, ha a fenti két mechanizmus, ami a gén-környezet együttes hatását érinti, közel ugyanolyan penetranciájú, és ekkor az 5’-TSER heterozigótáknak lehetne epidemiológiailag a legkisebb CRC rizikója, és ez az elmélet megmagyarázhatja eredményeinket. Az a megfigyelés, hogy a CRC-s betegek között az 5’-TSER heterozigóta hiány főként egy bizonyos 3’-TSUTR genotípusból, a heterozigótákból ered, és a megfigyelt aránytalanság a 3’-TSUTR heterozigóta megoszlásban a réteges vizsgálatokban elég érdekes, és alátámasztja azt a megállapítást, hogy a 3’-TSUTR régió szerepet játszik a TS szabályozásában. (29) A 3’-TSUTR genotípus-megoszlás eltolódásának a hiánya az erős kapcsoltság ellenére szintén megmagyarázható a nem tökéletes kapcsoltsági teoriával, amely meggátolja, hogy ugyanolyan genotípus-fenotípus megoszlást találjunk mindkét polimorfizmusra, amint azt a colorectalis adenomákra javasolják. (24) Ugyanakkor a TS szabályozásában és a közvetített rizikóban feltételezhetünk egy összetett hatást a különböző haplotípusok esetében, amit alátámaszt a 3R/3R 0bp/6bp genotípus megemelkedett aránya a betegcsoportban. Új bizonyítékot, ami ismét felveti, hogy a TS1494del6 egy lehetséges funkcionális polimorfizmus, szintén közöltek. (117) Összefoglalva, a TS polimorfizmusok nagy valószínűséggel befolyásolják a CRC fogékonyságot, és a magyar populációban a TS heterozigóták kevésbé fogékonyak a CRC kialakulására. További kutatás szükséges ahhoz, hogy megerősítsük fenti

65

megfigyeléseinket, és kiderítsük ezek táplálkozási vagy genetikai összefüggéseit. Mindemelett revidiálni kell a TS szerepét a colorectalis carcinogenezisben. 5.2. Az adjuváns bolus és folyamatos infúziós kezelés összehasonlítása Metasztatikus CRC-ban randomizált tanulmányok, amelyekben összehasonlították a bolus versus folyamatos infúziót (CIFU), kimutatták, hogy nagyobb volt a válaszadók aránya a CIFU esetében, és szignifikánsan hosszabb volt a progressziómentes túlélés, de nem volt szignifikáns javulás a teljes túlélésben. (118) Egy meta-analízis csoport szintén metasztatikus CRC-ban arra a következtetésre jutott, hogy a CIFU jobb a bolus 5-FU kezelésnél, ami a tumor választ és a túlélést illetei, de ez utóbbiban a különbség kicsi. (119) Egy másik tanulmányban a bolus 5-FU kezelést hasonlították össze a CIFU±leucovorin kezelésekkel előrehaladott metasztatikus CRC-ban, és az előbbiekhez hasonló következtetésre jutottak, azzal a kiegészítéssel, hogy a CIFU+leucovorin csoportban a progressziómentes túlélés szignifikánsan jobb, mint a CIFU esetén. (120) Ezt a kezelési stratégiát alkalmazva az adjuváns kemoterápiában a SWOG csoport a folyamatos 5-FU+levamisol kezelést hasonlította össze a bolus 5-FU/leucovorin +levamisol terápiával. (121) 1078 beteg adatainak rövidtávú kiértékelése után befejezték a vizsgálatot kimutatva, hogy nem eredményez jobb túlélést a folyamatos infúzió. Ez a csonka trial sok klinikust ösztönzött arra az USA-ban, hogy a bolus kezeléseket folytassa. Másrészről számos nyugat-európai vizsgálat, köztük a GERCOR és a PETACC is, kimutatta, hogy a toxicitás csökken ugyanolyan válaszadási arány mellett. (122, 123) Ez akkor is így volt, ha 3 hónapos vagy csak 2 hetes (de Gramont) folyamatos infúziót alkalmaztak. Az amerikai CALGB trial nagyon korai befejezését az okozta, hogy a bolus 5FU/leucovorint irinotecannal kombinálták, és ez nagyszámú halálesetet eredményezett a gastrointestinalis toxicitások vagy a tromboemboliás megbetegedések következtében. (124) Ezzel ellentétben, a PETACC-3 vizsgálatban, melyben 2 hetes folyamatos 5-FU infúzót kombináltak irinotecannal, nem nőtt a halálesetek száma. Az oxaliplatin (kombinálva 5-FU-val a NSABP C-07 trialban) szintén a bolus adagolás miatt lerontotta a hatásosságot a nagy toxicitási költségeknek köszönhetően, míg az európai MOSAIC tanulmány (oxaliplatin/5-FU-LV) alacsony mortalitást eredményezett.

66

Chau és mtsai 801 II és III stádiumú CRC-s beteg esetében hasonlította össze a bolus és a folyamatos infúziós 5-FU kezelést. A teljes túlélés közel szignifikánsan (p=0.083) hosszabb volt a folyamatos infúzió esetében. Saját eredményeinkkel ellentétben, ez a tanulmány nem a colon/sigma tumoros, hanem a rectum tumoros betegek esetében igazolt szignifikánsan jobb DFS-t a folyamatos infúziós kezelésnél (p=0,025). (125) Az adjuváns 5-FU kezelési formákat összehasonlító tanulmányok kis száma talán nem véletlen, tekintettel arra, hogy a két kezelési mód költséghatékonysága közti különbség a bolus kezelési formának kedvez, és az USA-ban csak most történnek javaslatok a folyamatos infúziós kezelés standardként történő bevezetésére. (126) Az országos intézeti háttér lehetőséget nyújtott a két kezelési mód összehasonlítására, és eredményeink ösztönzést nyújtanak arra, hogy az esetszám növelésével további vizsgálatot

tervezzünk,

azért

is,

mivel

a

következő

fejezetben

ismertetett

farmakogenetikai paraméterek mellett is, az adjuváns kezelési forma független prediktív prognosztikai markernek bizonyult. 5.3. TS polimorfizmusok vizsgálata az adjuváns kezelés során Az utóbbi időkben a TS státusz meghatározásának lehetősége normál szövetből vagy éppen PBMC-ből nagy figyelmet kapott, mivel ez utóbbi egy könnyen elérhető szövetmintát jelent a gazdaszervezet TS státusának jellemzésére. (127) Ugyanakkor megválaszolandó az a kérdés, hogy van-e korreláció a gazdaszervezet TS státusa/polimorfizmusa és a beteg prognózisa (DFS és OS) között. Tanulmányunkban elsőként igazoltuk, hogy az adjuváns 5-FU-alapú kemoterápában részesülő

CRC-s

betegek

PBMC-jéből

azonosított

3’-TSUTR

és

5’-TSER

polimorfizmus kombináció a túlélés független prognosztikai faktora. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy azon csirasejtes TS genotípusok, melyekről kimutatták, hogy magas TS expressziót indukálnak (103, 104, 128, 129, 130) szignifikánsan jobb DFS-t és OS-t prediktálnak. Korábbi közlésekre alapozva, melyek összefüggést találtak a TS 3R/3R vagy 6bp/6bp genotípusok és a magas protein vagy mRNS expresszió között, (104,

128

,

129

)

feltételezhető, hogy azok a betegek, akik a 3R/3R kombinálva bármely 3’-TSUTR genotípussal vagy a 2R/3R 6bp/6bp genotípus hordozói a magas TS-t expresszáló

67

csoporthoz tartoznak (A csoport). Ezzel ellentétben, minden más TS genotípus kombináció az alacsony TS expresszióval hozható összefüggésbe (B csoport). A tumorból mért TS, mint az adjuváns kemoterápiát követő túlélés prognosztikai faktora szempontjából tanulmányozva a korábbi közleményeket, a publikált eredmények ellentmondásosak. Számos tanulmány jelezte, hogy adjuváns kezelés mellett a tumorból mért magas TS expresszió szignifikáns rövid DFS-nek és/vagy OSnek az előrejelzője, (93,

100

,

131

,

132

,

133

,

134

,

135

,

136

) míg mások szignifikánsan jobb

túlélési arányt igazoltak olyan betegek esetében, ahol az intratumorális TS magas volt. (94, 101, 137, 138, 139) Egy nemrég közölt tanulmány kimutatta, hogy a 3R/3R csirasejtes genotípusú metasztatikus CRC-s betegek jobban reagáltak az 5-FU kezelésre, magasabb válaszadási hányaddal és hosszabb progressziómentes túléléssel. (140) Ugyanakkor azonban meg kell jegyezni, hogy a palliatív kemoterápia eredményei nem vonatkoztathatóak az adjuváns kezelésre sem fordítva Az adjuváns kemoterápia célja a keringő tumorsejtek vagy mikrometasztázisok megsemmisítése. (94) Létezhetnek a TS-től független mechanizmusok is (pl. az 5-FU RNS irányú hatása vagy az apoptózis beindítása, mely felelős a magas TS expresszióval kapcsolatba hozható TS polimorfizmusú betegek kedvezőbb prognózisáért). Az 5-FU által indukálható apoptózis mediátor, Fas (CD95/Apo1), tanulmányozásával Longley és mtsai (141) kimutatták, hogy egyes tumorok annak ellenére, hogy magas TS szinteket expresszálnak, az 5-FUval a Fas mediált apoptózisra érzékennyé tehetők. A CRC-s betegek túlélését a folát-hiányos állapot szintén befolyásolhatja, amely kapcsolatba hozható a TS polimorfizmussal. Odin és mtsai (142) kimutatták, hogy CRC-s betegek esetén a magas folilpoliglutamát szintáz (FPGS) génexpresszió az ép nyálkahártyában összefüggésben van a jobb tumor-specifikus túléléssel. A magas FPGS szinttel rendelkező mucosa minták magas TS és folát szinteket is mutattak. A folát szint és TS polimorfizmus közötti kapcsolatról számolt be Chen és mtsai (143) A 3R/3R genotípusú egyének átlag folát szintjét összehasonlítva a 2R/3R és 2R/2R genotípusúakéval, ez utóbbiaknál alacsonyabb volt a plazma folát szint (p=0,03; a trendre p=0,03). A 3’-TSUTR polimorfizmusnak nem volt hatása a plazma folát szintekre. Ezzel ellentétben Trinh és mtsai (144) összefüggést mutattak ki kínai

68

egyénekben a 3R/3R genotípus és az alacsony plazma folát szint között. Ezen túlmenően Kealey és mtsai (145) azt találták, hogy az átlag vörösvértest folát koncentráció sokkal magasabb volt a 3’-TSUTR 0bp/0bp homozigóta, mint a 6bp/6bp vagy 0bp/6bp egyénekben. A 3R homozigoták nem szignifikáns kapcsolatot mutattak a CRC-s betegek tumorszövetében mért alacsony folát intermedier (tetrahidrofolát és MTHF) szintekkel. (146) Hasonlóan, a 5’-TSER polimorfizmus nem mutatott összefüggést a fiatal kaukázusi egészséges egyének szérum folát koncentrációival. (147) További tanulmányok szükségesek a folát szintek és a TS polimorfizmus közötti tényleges összefüggés kiderítésére, ha egyáltalán létezik ilyen. Továbbá ez a feltételezett

kapcsolat

különböző

lehet

az

egészségesekben,

a

colorectalis

carcinogenesisben vagy az antifolát (5-FU, methotrexat, stb.) kemoterápia során. Másrészről a súlyos toxicitás, melyet azoknál a betegeknél figyeltek meg, ahol a normál szövetben alacsony a TS expresszió vagy olyan TS genotípusúak, ami alacsony TS expresszióval

jár,

szintén

hozzájárulhat

ezeknek

a

betegeknek

a

rosszabb

prognózisához. (148, 149) A B csoportba (alacsony TS) tartozó saját betegeinknél sokkal gyakrabban jelentkezett toxikus mellékhatás, mint az A csoportba tartozóknál (30% vs 22%, p=0,034). Jól tudott, hogy az 5-FU-okozta toxicitás többek között hasmenés, hányinger, étvágytalanság, hányás formájában jelentkezik, és emiatt alacsony az energiafelvétel. Dray és mtsai (150) CRC-s betegeken bizonyították, hogy az alacsony energiafelvétel összefügg a szignifikánsan rövidebb túléléssel; ezért feltételezhetően azon betegeknek, akiknek alacsony a TS expressziója, és ebből adódóan komoly mellékhatások alakulnak ki, az adjuván 5-FU kezelést követően rosszabb lehet a prognózisuk. A sejtszintű TS aktivitás gátlása és a fluor-nukleotidok beépülése az RNS-be és DNS-be a normál nyálkahártya és más szövetek regenerációját (megújúlását) lassíthatja, és ezáltal rosszabb kimenetelt eredményezhet. Az alacsony tumor TS mRNS szinttel rendelkező betegekben, akik 5-FU kemoterápiát kaptak, sokkal gyakrabban fejlődött ki recidíva, mint azoknál, akiknek magas volt a tumorban a TS szint. (139)

69

Bár az eredményeink pontos magyarázatát egyelőre nem tudjuk, de adataink mégis azt sugallják, hogy a gazdaszervezet 5’-TSER és 3’-TSUTR polimorfizmusa prognosztikai értékű az adjuváns 5-FU kezelésben részesülő CRC-s betegek túlélésében. További klinikai vizsgálatok folynak abból a célból, hogy meghatározzák, hogy az 5FU-alapú adjuváns kemoterápia kombinálható-e más rendelkezésre álló szerekkel, pl. oxaliplatinnal vagy irinotecannal, azoknál a betegeknél, akiknek kedvezőtlenebb a prognózisa. A farmakogenetika a rákellenes kemoterápiában egyre nagyobb szerepet játszik. A betegek genetikai háttere befolyásolja a kezelések hatásosságát és a betegek túlélési esélyeit. Szükség van tehát olyan molekuláris diagnosztikai módszerek kidolgozására, melyek lehetővé teszik a kezelések kimenetelének pontosabb előrejelzését és az egyénre szabott kemoterápia kidolgozását. 5.4. Az 5-FU kezelés farmakokinetikai követése metasztatikus CRC-s betegek esetén Már húsz évvel ezelőtt de Bruijn és mtsai megfigyelték, hogy a fluropirimidin kezelés előtt mért alacsony serum kreatinin clearance (vesekárosodás miatt) korrelált az alacsony fluropirimidin ürítéssel és a hosszú tartózkodási idővel, valamint a toxicitások gyakoriságával. Ugyanakkor megjegyzik, hogy az 5-FU lebomlásának szintje is esetleg összefügghet a toxicitás fokával. (151) Japán kutatók folyamatos 5-FU infúzió során összefüggést igazoltak a vizelet uracil szintje és az 5-FU clearance között. Ha a vizelet uracil szintje 25,1 nmol/g kreatinin értéknél kisebb volt, az 5-FU koncentrációja lecsökkent a nagy 5-FU clearance miatt, veszélyeztetve a kezelés hatásosságát, míg ha az uracil szint 99,9 nmol/g kreatinin értéknél nagyobb volt, akkor mellékhatások jelentkeztek a kezelés folyamán. (152) CMF kezelt 65 évesnél idősebb emlőrákos nők esetében Hurria és mtsai kimutatták, hogy a csökkent kreatinin clearance és a magas kreatinin szint multivariáns analízissel is szignifikáns összefüggést mutatott a láz, neutropenia és hematológiai toxicitás nagyobb kockázatával. (153) Oralis 5-FU kezelések kapcsán Ikeda és mtsai állatkísérletekben szignifikáns linearis összefüggést igazoltak a kreatinin clearance és az 5-FU clearance között, valamint az 5-

70

FU AUC szignifikánsan nagyobb volt a ciszplatin-indukált csökkent veseműködés mellett, mint a kontroll csoportban. Hasonló eredményre jutottak a betegek esetében is, ahol az 5-FU AUC értéke kétszer nagyobb azoknál a betegeknél, akiknek a kreatinin clearance alacsonyabb. (154) A bolus 5-FU farmakokinetikai elemzése nyomán tapasztalták, hogy az 5-FU AUC szignifikánsan nagyobb azoknál a betegeknél, akiknek az 5-FU clearance értéke szignifikánsan alacsonyabb és ugyanakkor ezeknél a betegeknél a súlyos mellékhatások (> grade 3) is gyakoribbak. (155) Flemming és mtsai vizsgálataik során azt igazolták, hogy nincs összefüggés a kreatinin és az 5-FU clearance között a 24-órás 5-FU infúzió alatt vesekárosodás esetében, de hangsúlyozza a farmakokinetika hasznosságát ezeknél a betegeknél. (156) A fenti eredményekkel összhangban kimutattuk, hogy a metasztatikus CRC-s betegek tartós infúziós 5-FU kezelésében jelentősége van a farmakokinetikai vizsgálatoknak. A DPD aktivitás mellett a betegek veseműködését jellemző serum kreatinin értékének ismerete is fontos, ugyanis a betegek mintegy negyedénél az alacsonyabb szerum 5-FU szintek a kezelés hatékonyságát veszélyeztethetik. Ezeknél a betegeknél (átagosnál alacsonyabb kreatinin szint és nagyobb DPD aktivitás) a csak 5-FU-t tartalmazó kezelések helyett az 5-FU+oxaliplatin kombináció alkalmazása megoldás lehet. 5.5. Az MTHFR C677T génpolimorfizmus vizsgálata palliatív kezelés során Számos közlemény beszámol az MTHFR polimorfizmus és a colorectalis ill. más lokalizációjú rákrizikó kapcsolatáról. (107,

157

) A colorectalis rák kialakulása és az

alacsony folát státus között ismert a kapcsolat, (158) ugyanakkor a folát státus és az MTHFR polimorfizmus szoros kölcsönhatásban hatnak: a TT genotípus esetén 50%-os a rizikó csökkenés a magas folátszintű egyének esetében, ugyanakkor az alacsony folátszinttel rendelkezők körében ez a tendencia eltűnik. (159) A magyarországi népességre jellemző a T allélel rendelkezők relatív magas aránya és az alacsony folát bevitel. (160) Vizsgált anyagunkban mind az egészséges kontrollok, mind pedig a colorectalis tumoros betegek esetében a T alléllal rendelkezők aránya 57 ill 54 %, ami Czeizel és mtsai (160) eredményével (56%) jól egyezik. A CT és TT genotípus részarányának egyezése az egészséges és colorectalis tumoros betegcsoportban

71

valószínűvé teszi, hogy a folátszint az egészséges populációban valóban nem magas, és ezért az MTHFR polimorfizmus nem fejtheti ki a rákrizikót csökkentő hatását. Vizsgálatunkban a fő munkahipotézis annak igazolása volt, hogy azok a betegek, akik az MTHFR gén C677T polimorfizmusát hordozzák, feltehetően másként reagálnak az 5-fluoropirimidin-alapú kezelésre. Amennyiben ez a polimorfizmus lecsökkenti az enzim aktivitást, megnövelheti a folát szintet (főként a sejten belüli MTHF koncentrációt), mely a TS reakcióhoz szükséges, és ezáltal a TS inhibitor, 5-FU hatását fokozhatja. Állatkísérletekben is megállapították, hogy az 5-FU hatásosságát növelte, ha MTHF-t is adtak. (161) Más szerzők kimutatták, hogy az MTHFR in vivo antiszenz gátlása foszforotioát oligonukleotidok alkalmazásával csökkentette számos transzformált colon sejtvonal növekedését, ami szintén azt az elvet bizonyítja, hogy az MTHFR aktivitásnak csökkenése, mutáció vagy antiszenz kezelés révén, a tumor növekedését csökkenti. (162) Érdekes módon 5-FU±folsavval kezelt emlő, fej-nyak, colon, vékonybél és pancreas tumor sejtvonalak vizsgálatakor nem tapasztaltak a várakozásoknak megfelelő IC50 szint csökkenést a CT és TT MTHFR polimorfizmusú sejtek esetében, ellenben a MTHFR A1298C polimorfizmus esetén igen. (163) Ez lehetséges, hogy annak a következménye, hogy egyrészt a vizsgált 19 sejtvonal nagyon heterogén lokalizációból származott (6-6 emlő és colon, 5 fej-nyak, 1-1 vékonybél és pancreas), másrészt az MTHFR C677T és A1298C polimorfizmus típusok megoszlása nagyon jelentős eltérést mutatott a kaukázusi populációra megállapítotthoz viszonyítva. (164, 165) Más szerzők ezzel szemben, részletes tanulmányukban colon és emlőrák sejtvonalakon valamint egér xenograftokon igazolták, hogy az MTHFR C677T polimorfizmus megnöveli az 5-FU-val szembeni érzékenységet. (166) Klinikai vizsgálatban a folát (LV) és 5-FU kombináció alkalmazása előrehaladott colorectalis tumoros betegek esetében növelte a válaszadók arányát a csak önállóan 5FU-val kezeltekkel összehasonlítva. (167) Más klinikai vizsgálatban III. stádiumú colon tumoros betegek 5-FU+LV kezelése kapcsán nem szignifikáns, de jobb túlélést találtak a T allélt hordozók esetében. (168) Metasztatikus colorectalis tumoros betegek 5-FU-alapú kezelésre adott válaszának MTHFR genotípus szerinti kiértékelése eddig csak egy kisszámú betegcsoport esetében

72

történt meg. A 43 vizsgált beteg esetében jelentősen magasabb volt a jó eredménnyel kezelhetők részaránya a CT+TT genotípusú csoportban. (169) Jelen vizsgálatunk eredményei az eddigi tanulmányok eredményeinek túlnyomó többségét és kezdeti feltételezésünket megerősítik. Ezen túl figyelemre méltó az az eredmény, mely a hosszantartó, több vonalban alkalmazott 5-FU-alapú palliatív kezelést kapcsolatba hozza a jobb túléléssel, ill. 2,5-ször kisebb relatív kockázattal, és ez a legkifejezettebb a CT és TT genotípusú betegek esetén. Következtetésként

megállapítható,

hogy

a

MTHFR

C677T

polimorfizmus

meghatározása a 5-fluoropirimidin kezelésű metasztatikus colorectalis tumoros betegek esetében prognosztikai értékkel bír. Ezen felül segítséget nyújthat a személyre (csoportra) szabott terápia megtervezéséhez; pl. rosszabb prognózisú CC genotípusú betegek esetében a szekvenciális kemoterápia (első vonalban 5-FU+LV, második vonalban 5-FU+LV+Irinotecan/oxaliplatin alkalmazása), vagy ha egyéb kontraindikáció nincs, az első vonalbeli 5-FU+LV+Irinotecan majd 5-FU+LV+oxaliplatin kombináció javasolható.

73

6. KÖVETKEZTETÉSEK A TS polimorfizmusok úgy tűnik, hogy befolyásolják a CRC fogékonyságot és a magyar populációban a TS heterozigóták kevésbé fogékonyak a CRC kialakulására. További kutatás szükséges, hogy megerősítsük megfigyeléseinket, és kiderítsük megfigyeléseink táplálkozási vagy genetikai összefüggéseit. Mindemelett újra kell értékelni a TS szerepét a colorectalis carcinogenezisben. Az adjuváns 5-FU kezelési formák a CRC-s betegek esetében szignifikánsan különböző betegségmentes túlélést eredményeznek, ám a teljes túlélést nem befolyásolják. A folyamatos infúziós terápiához viszonyítva szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a relapsus rizikója a bolus kezelési mód esetében, és ez különösen igaz a colon/sigma tumoros és az 58 évnél fiatalabb betegeknél, akiknek a betegségmentes túlélése közel kétszer hosszabb, ha tartós infúziós 5-FU kezelést kapnak. A vizsgált farmakogenetikai paraméterek mellett is az adjuváns kezelés módja független prediktív prognosztikai markernek bizonyult. Tanulmányunkban elsőként igazoltuk, hogy azok a csirasejtes TS genotípusok, melyekről kimutatták, hogy magas TS expressziót indukálnak (5’-TSER 3R/3R kombinálva bármely 3’-TSUTR genotípussal vagy a 2R/3R 6bp/6bp genotípus hordozó = A csoport) szignifikánsan jobb betegségmentes és teljes túlélést prediktálnak az adjuváns 5-FU kezelést követően, mint az alacsony TS expresszióval összefüggésbe hozható TS genotípusú betegek (5’-TSER 2R/2R kombinálva bármely 3’-TSUTR genotípussal vagy a 2R/3R és 0bp allélel rendelkezők = B csoport). Kimutattuk, hogy az adjuváns 5-FU-alapú kemoterápiában részesülő CRC-s betegek csirasejtes 3’-TSUTR és 5’-TSER polimorfizmus-kombinációja a túlélés független prognosztikai faktora. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a metasztatikus CRC-s betegek tartós infúziós 5FU kezelésében jelentősége van a farmakokinetikai vizsgálatoknak. A DPD aktivitás mellett a betegek veseműködését jellemző serum kreatinin szintjének ismerete is fontos, ugyanis a betegek mintegy negyedénél az alacsonyabb szerum 5-FU szintek a kezelés hatékonyságát veszélyeztethetik. Ezeknél a betegeknél (átagosnál alacsonyabb kreatinin

74

szint és nagyobb DPD aktivitás) a csak 5-FU kezelés helyett 5-FU+oxaliplatin kombináció alkalmazása megoldás lehet. Megállapítottuk, hogy a MTHFR C677T polimorfizmus meghatározása a 5fluoropirimidin kezelésű metasztatikus CRC esetében prognosztikai értékkel bír. Ezen felül segítséget nyújthat a személyre (csoportra) szabott terápia megtervezésében (pl. a rosszabb prognózisú CC genotípusú betegek esetében a szekvenciális kemoterápia /első vonalban 5-FU+LV, második vonalban 5-FU+LV+irinotecan/oxaliplatin alkalmazása/, vagy ha egyéb kontraindikáció nincs, az első vonalbeli 5-FU+LV+irinotecan majd 5FU+LV+oxaliplatin kombináció javasolható).

A farmakogenetika a rákellenes kemoterápiában egyre nagyobb szerepet játszik. A betegek genetikai háttere befolyásolja a kezelések hatásosságát és a betegek túlélési esélyeit. Szükség van tehát olyan molekuláris diagnosztikai módszerek kidolgozására, melyek lehetővé teszik a kezelések kimenetelének pontosabb előrejelzését és az egyénre szabott terápia kidolgozását.

75

7. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 3’-TSUTR - TS „untranslated region” 5’-TSER - TS „promoter enhancer region” 5-FU – 5-fluorouracil 5-HT3 - 5-hidroxitriptamin3 ACF – aberráns kripta fókuszok AJCC – „American Joint Committee on Cancer” AP – alkalikus foszfatáz APC - adenomatosus polyposis coli AUC - görbe alatti terület BrU - brómuridin BSC - legjobb tüneti/támogató kezelés CEA – karcinoembrionális antigén CI - konfidencia intervallum CIFUFA – folyamatos 5-FU infúzió + folinsav CIN - kromoszómainstabilitás Cmax - maximális koncentráció COX - ciklooxigenáz CPT - camptothecin CRC - colorectalis carcinoma Css – „steady state” koncentráció dATP - dezoxiadenin-5'-trifoszfát dCTP - dezoxicitidin-5'-trifoszfát DFS - betegségmentes túlélés dGTP - dezoxiguanin-5'-trifoszfát DHF - dihidrofolát DHFR - DHF reduktáz DMSO - dimetilszulfoxid DNS - dezoxiribonukleinsav dNTP – dezoxiribonukleotid trifoszfát DPD - dihidropirimidin dehidrogenáz dTMP - dezoxitimidin-5'-monofoszfát dTTP - dezoxitimidin-5'-trifoszfát dUMP - 2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát dUTP - dezoxiuridin-5'-trifoszfát EDTA – etiléndiamin tetraecetsav EGF - epidermalis növekedépsi faktor EGFR – EGF receptor EORTC - Európai Szervezet a Rák Kutatására és Kezelésére FA - folinsav FAP - familiáris adenomatosus polyposis FdUMP - 5-fluoro-2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát FdUTP - 5-fluoro-2’-dezoxiuridin-5’-trifoszfát FOLFIRI - folinsav + 5-FU + irinotecan FOLFOX - folinsav + 5-FU + oxaliplatin FPGS - folilpoliglutamát szintáz FUFA – 5-FU + folinsav

76

FUTP - 5-fluorouridine-5’-trifoszfát H2FU - dihidro 5-FU HNPCC - herediter nonpolyposus CRC HPLC - nagynyomású folyadékromatográfia IC50 – 50%-os inhibitor koncetració IFL - bolus 5-FU + folinsav + irinotecan IRI - irinotecan LOH - heterozigóta állapot elvesztése LV - leukovorin MMC – mitomycin C MMR – „mismatch repair” mOS - átlagos OS mRNS – „messenger” RNS MS - metionin szintáz MSI – mikroszatellita instabilitás MTHF – 5,10-metiléntetrahidrofolát MTHFR - MTHF reduktáz ns - nem szignifikáns OOI - Országos Onkológiai Intézet OS - teljes túlélés OVSZ - Országos Vérellátó Szolgálat PAGE - poliakrilamid gél elektroforézis PBMC - perifériás vér mononukleáris sejtjei PCR - polimeráz láncreakció R0 – mikroszkóposan daganatmentes RFA – radiofrekvenciás ablatio RFLP - restrikciós fragmenshossz polimorfizmus RFS - relapszusmentes túlélés RNS - ribonukleinsav RR - relatív rizikó SHMT - szerin hidroximetiltranszferáz SN-38 - 7-etil-10-hidroxicamptothecin SNP - egyetlen nukleinsav bázis polimorfizmus t1/2 - felezési idő TDM - terápiás gyógyszermonitorozás TE puffer - TRIS-EDTA puffer TGFb – transzformáló növekedési faktor b THF - tetrahidrofolát TK - timidin kináz TNM - tumor-nyirokcsomó-metasztázis TRIS - tris (hidroximetil)aminometán TS - timidilát szintetáz UFT - ftorafur + uracil UGT - uridindifoszfát-glukuronát transzferázok VEGF - vascularis endothelialis növekedési faktor WHO - Egészségügyi Világszervezet

77

8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani Dr. Kásler Miklós professzor úrnaknak, aki lehetővé tette, hogy az intézetben a betegellátást a kutatással összhangban végezhessem. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Kralovánszky Judit tudományos osztályvezetőnek, aki éveken keresztül mindig nagy odafigyeléssel, türelemmel segített tudományos munkámban. Köszönettel tartozom Dr. Láng István professzor úrnak, aki ösztönzött a Ph.D. munka elvégzésére és biztosította a tudományos munka klinikai hátterét. Köszönetet mondok Dr. Kopper László professzor úrnak, hogy lehetővé tette számomra, hogy a Doktori Iskola Onkológiai Programjához csatlakozzam. Köszönöm Dr. Czeglédi Ferenc főorvos úrnak önzetlen segítségét a klinikai adatok szolgáltatásában. Hasonlóan köszönöm Dr. Juhos Éva és Dr. Gyergyay Fruzsina főorvosoknak, Dr. Horváth Zsolt, Dr. Szabó Eszter, Dr. Ganofszky Erna és Dr. Nagy Tünde adjunktusoknak, valamint az osztályokon dolgozó, áldozatos munkát végző nővérek segítségét a klinikai tevékenységemben. Köszönöm továbbá Dr. Köves István főorvos úrnak és az egész Sebészeti Osztálynak, Dr. Orosz Zsolt osztályvezető főorvosnak és a az egész Pathológiai Osztálynak valamint Dr. Lövey József főorvosnak és a Sugárterápiás osztálynak a betegek ellátásában nyújtott magas szakmai szinvonalú együttműködését. Külön köszönettel tartozom a Klinikai Kísérleti Laboratóriumi Osztály minden dolgozójának, akik odaadó munkája nélkül tudományos munkám nem valósulhatott volna meg, ugyanakkor külön hálámat fejezem ki Dr. Budai Barna, Dr. Adleff Vilmos és Pap Éva munkatársaknak tudományos eredményeink megvalósításában nyújtott nélkülözhetetlen segítségükért. Köszönöm Dr. Somogyi János professzor úrnak aki értékes tanácsaival már az egyetemi tanulmányaim elejétől fogva is segített az élet dolgaiban eligazodni. Hasonlóan szeretettel gondolok Dr. Sréter Lídia tanárnőre, aki mellett különösen megkedveltem a belgyógyászatot és az onkológiát. Végül, de nem utolsó sorban hálás vagyok édesanyámnak, férjemnek és gyerekeimnek, akik lehetővé tették számomra azt, hogy eljuthassak idáig és biztosították a türelmes és stabil családi hátteret.

78

9. IRODALOMJEGYZÉK 1. Weitz J, Koch M, Debus J, Hohler T, Galle PR, Buchler MW: Colorectal cancer. Lancet 2005, 365(9454):153-65. 2. Kasler M: Current state and future perspectives of oncology care in Hungary based on epidemiologic data. Orv Hetil 2005, 17;146(29):1519-30. 3. Otto S, Kasler M: Trends in cancer mortality and morbidity in Hungarian and international statistics. Characteristics and potential outcome of public health screening programmes, Magy Onkol 2005, 49(2):99-101. 4. Di Costanzo F, Doni L: Adjuvant therapy in colon cancer: which treatment in 2005? Ann Oncol 2005, 16(Suppl.4):iv69-iv73. 5. Johns LE, Houlston RS: A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk. Am J Gastroenterol 2001, 96(10):2992-3003. 6. Fuchs CS, Giovannucci EL, Colditz GA, Hunter DJ, Speizer FE, Willet WC: A prospective study of family history and the risk of colorectal cancer. N Engl J Med 1994, 22;331(25):1669-74. 7. Rozen P, Fireman Z, Figer A, Legum C, Ron E, Lynch HT: Family history of colorectal cancer as a marker of potential malignancy within a screening program. Cancer 1987, 15;60(2):248-54. 8. Hawk ET, Umar A, Viner JL: Colorectal cancer chemoprevention--an overview of the science. Gastroenterology 2004, 126(5):1423-47. 9. Singh PN, Fraser GE: Dietary risk factors for colon cancer in a low-risk population. Am J Epidemiol 1998, 15;148(8):761-74. 10. Slattery ML, Potter J, Caan B, Edwards S, Coates A, Ma KN, Berry TD: Energy balance and colon cancer-beyond physical activity. Cancer Res 1997, 1;57(1):75-80. 11. Willet WC,Stampfer MJ, Colditz GA, Rosner BA, Speizer FE: Relation of meat, fat and fiber intake to the risk of colon cancer in a prospective study among women. N Engl J Med 1990, 323:1664. 12. Key TJ, Fraser GE, Thorogood M, Appleby PN, Beral V, Reeves G, Burr ML, Chang-Claude J, Frentzel-Beyme R, Kuzma JW, Mann J, McPherson K: Mortality in vegetarians and nonvegetarians: detailed findings from a collaborative analysis of 5 prospective studies. Am J Clin Nutr 1999, 70(Suppl.3):516S-524S.

79

13. Howe GR, Aronson KJ, Benito E, Castelleto R, Cornee J, Duffy S, Gallagher RP, Iscovich JM, Deng-ao J, Kaaks R, Kune GA, Kune S, Lee HP, Lee M, Miller AB, Peters RK, Potter JD, Riboli E, Slattery ML, Trichopoulos D, Tuyns A, Tzonou A, Watson LF, Whittemore AS, Shu Z, et al: The relationship between dietary fat intake and risk of colorectal cancer: evidence from the combined analysis of 13 case-control studies. Cancer Causes Control 1997, 8(2):215-28. 14. Schatzkin A, Lanza E, Corle D, Lance P, Iber F, Caan B, Shike M, Weissfeld J, Burt R, Cooper MR, Kikendall JW, Cahill J: Lack of effect of a low-fat, high-fiber diet on the recurrence of colorectal adenomas. Polyp Prevention Trial Study Group. N Engl J Med 2000, 342(16):1149-55. 15. Alberts DS, Martinez ME, Roe DJ, Guillen-Rodriguez JM, Marshall JR, van Leeuwen JB, Reid ME, Ritenbaugh C, Vargas PA, Bhattacharyya AB, Earnest DL, Sampliner RE: Lack of effect of a high-fiber cereal supplement on the recurrence of colorectal adenomas. Phoenix Colon Cancer Prevention Physicians' Network. N Engl J Med 2000, 342(16):1156-62. 16. Potter JD Colorectal cancer: molecules and populations. J Natl Cancer Inst 1999, 91(11):916-32. 17. Heavey PM, McKenna D, Rowland IR: Colorectal cancer and the relationship between genes and the environment. Nutr Cancer 2004, 48(2):124-41. 18. Angus SP, Wheeler LJ, Ranmal SA, Zhang X, Markey MP, Mathews CK, Knudsen ES: Retinoblastoma tumor suppressor targets dNTP metabolism to regulate DNA replication. J Biol Chem 2002, 277(46):44376-84. 19. Martomo SA, Mathews CK: Effects of biological DNA precursor pool asymmetry upon accuracy of DNA replication in vitro. Mutat Res 2002, 499(2):197-211. 20. Choi SW, Mason JB: Folate and carcinogenesis: an integrated scheme. J Nutr 2000, 130(2):129-32. 21. Choi SW, Mason JB: Folate status: effects on pathways of colorectal carcinogenesis. J Nutr 2002 132(8 Suppl):2413S-2418S. 22. Blount BC, Mack MM, Wehr CM, MacGregor JT, Hiatt RA, Wang G, Wickramasinghe SN, Everson RB, Ames BN: Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(7):3290-5.

80

23. Flood A, Caprario L, Chaterjee N, Lacey JV Jr, Schairer C, Schatzkin A: Folate, methionine, alcohol, and colorectal cancer in a prospective study of women in the United States. Cancer Causes Control 2002, 13(6):551-61. 24. Ulrich CM, Bigler J, Bostick R, Fosdick L, Potter JD: Thymidylate synthase promoter polymorphism, interaction with folate intake, and risk of colorectal adenomas. Cancer Res 2002, 62(12):3361-4. 25. Trinh BN, Ong CN, Coetzee GA, Yu MC, Laird PW: Thymidylate synthase: a novel genetic determinant of plasma homocysteine and folate levels. Hum Genet 2002, 111(3):299-302. 26. Skibola CF, Smith MT, Hubbard A, Shane B, Roberts AC, Law GR, Rollinson S, Roman E, Cartwright RA, Morgan GJ: Polymorphisms in the thymidylate synthase and serine hydroxymethyltransferase genes and risk of adult acute lymphocytic leukemia. Blood 2002, 99(10):3786-91. 27. Chu E, Koeller DM, Casey JL, Drake JC, Chabner BA, Elwood PC, Zinn S, Allegra CJ. Autoregulation of human thymidylate synthase messenger RNA translation by thymidylate synthase. Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88(20):8977-81. 28. Ulrich CM, Bigler J, Velicer CM, Greene EA, Farin FM, Potter JD: Searching expressed sequence tag databases: discovery and confirmation of a common polymorphism in the thymidylate synthase gene. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000, 9:1381-5. 29. Chu J, Dolnick BJ: Natural antisense (rTSalpha) RNA induces site-specific cleavage of thymidylate synthase mRNA. Biochim Biophys Acta 2002, 1587(2-3):183-93. 30. Marsh S, Collie-Duguid ES, Li T, Liu X, McLeod HL: Ethnic variation in the thymidylate synthase enhancer region polymorphism among Caucasian and Asian populations. Genomics 1999, 58(3):310-2. 31. World Cancer Research Fund / American Institute for Cancer Research. Food, nutrition and the prevention of cancer: a global perspective. Washington: World Cancer Research Fund / American Institute for Cancer Research, 1997. 32. Marsh S, McKay JA, Cassidy J, McLeod HL: Polymorphism in the thymidylate synthase promoter enhancer region in colorectal cancer. Int J Oncol 2001, 19(2):383-6. 33. Villafranca E, Okruzhnov Y, Dominguez MA, Garcia-Foncillas J, Azinovic I, Martinez E, Illarramendi JJ, Arias F, Martinez Monge R, Salgado E, Angeletti S,

81

Brugarolas A: Polymorphisms of the repeated sequences in the enhancer region of the thymidylate synthase gene promoter may predict downstaging after preoperative chemoradiation in rectal cancer. J Clin Oncol 2001, 19(6):1779-86. 34. Iacopetta B, Grieu F, Joseph D, Elsaleh H: A polymorphism in the enhancer region of the thymidylate synthase promoter influences the survival of colorectal cancer patients treated with 5-fluorouracil. Br J Cancer 2001, 85(6):827-30. 35. Marsh S, Ameyaw MM, Githang'a J, Indalo A, Ofori-Adjei D, McLeod HL: Novel thymidylate synthase enhancer region alleles in African populations. Hum Mutat 2000, 16(6):528. 36. Rodler I, Zajkás G: Hungarian cancer mortality and food availability data in the last four decades of the 20th century. Ann Nutr Metab 2002, 46(2):49-56. 37. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR: Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 1988, 319:525-532. 38. Abramowitz MJ: Biology of colorectal cancer: An overview of genetic factors. In: Colorectal Cancer. Szerk: Bleiberg H, Kemeny N, Rougier P, Wilke H. Martin Dunitz Ltd, 2002, pp.3-9. 39. Fearon ER, Vogelstein B: A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990, 61(5):759-67. 40. Houlston RS: What we could do now: molecular pathology of colorectal cancer. Mol Pathol 2001, 54(4):206-14. 41. Mori Y, Yin J, Sato F, Sterian A, Simms LA, Selaru FM, Schulmann K, Xu Y, Olaru A, Wang S, Deacu E, Abraham JM, Young J, Leggett BA, Meltzer SJ: Identification of genes uniquely involved in frequent microsatellite instability colon carcinogenesis by expression profiling combined with epigenetic scanning. Cancer Res 2004, 64(7):2434-8. 42. Jen J, Powell SM, Papadopoulos N, Smith KJ, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW: Molecular determinants of dysplasia in colorectal lesions. Cancer Res 1994, 54(21):5523-6. 43. Martinez-Lopez E, Abad A, Font A, Monzo M, Ojanguren I, Pifarre A, Sanchez JJ, Martin C, Rosell R: Allelic loss on chromosome 18q as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Gastroenterology 1998, 114(6):1180-7.

82

44. Saito M, Yamaguchi A, Goi T, Tsuchiyama T, Nakagawara G, Urano T, Shiku H, Furukawa K: Expression of DCC protein in colorectal tumors and its relationship to tumor progression and metastasis. Oncology 1999, 56(2):134-41. 45. Abbruzzese JL, Evans DB, Willett CG, Fenoglio-Preiser C: Gastrointestinal Oncolgy, Oxford, 2004. 46. Shih IM, Zhou W, Goodman SN, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B: Evidence that genetic instability occurs at an early stage of colorectal tumorigenesis. Cancer Res 2001, 61(3):818-22. 47. Lakatos PL, Lakatos L: A herediter és sporadikus colorectalis daganatok genetikája és a genetikai ismeretek jelentősége a mindennapi gyakorlatban. Orv Hetil 2006, 147(8):363-8. 48. Plentz RR, Wiemann SU, Flemming P, Meier PN, Kubicka S, Kreipe H, Manns MP, Rudolph KL:

Telomere shortening of epithelial cells characterises the adenoma-

carcinoma transition of human colorectal cancer. Gut 2003, 52 (9):1304-7. 49. Bechter OE, Zou Y, Walker W, Wright WE, Shay JW: Telomeric recombination in mismatch repair deficient human colon cancer cells after telomerase inhibition. Cancer Res 2004, 64(10):3444-51. 50. DeVita VT, Hellman S Jr, Rosenberg SA: Cancer Principles, Practice of Oncology, 7th Edition, 2005. 51. Wolmark N, Fisher B, Rockette H, Redmond C, Wickerham DL, Fisher ER, Jones J, Glass A, Lerner H, Lawrence W: Postoperative adjuvant chemotherapy or BCG for colon cancer: results from NSABP protocol C-01. J Natl Cancer Inst 1988, 80(1):30-6. 52. Sobin LH, Wittekind C: UICC: TNM classification of malignant tumors. 6th ed. London: John Wiley and Sons, 2002. 53. Le Voyer TE, Sigurdson ER, Hanlon AL, Mayer RJ, Macdonald JS, Catalano PJ, Haller DG: Colon cancer survival is associated with increasing number of lymph nodes analyzed: a secondary survey of intergroup trial INT-0089. J Clin Oncol 2003, 21(15):2912-9. 54. Benson AB 3rd, Schrag D, Somerfield MR, Cohen AM, Figueredo AT, Flynn PJ, Krzyzanowska MK, Maroun J, McAllister P, Van Cutsem E, Brouwers M, Charette M, Haller DG: American Society of Clinical Oncology recommendations on adjuvant chemotherapy for stage II colon cancer. J Clin Oncol 2004, 22(16):3408-19.

83

55. Andre T, Colin P, Louvet C, Gamelin E, Bouche O, Achille E, Colbert N, Boaziz C, Piedbois P, Tubiana-Mathieu N, Boutan-Laroze A, Flesch M, Billiau V, Buyse M, Gramont A: Groupe d'Etude et de Recherche Clinique en Oncologie Radiotherapies. Randomized adjuvant study comparing two schemes of 5-fluorouracil and leucovorin in stage B2 and C colon adenocarcinoma: study design and preliminary safety results. Groupe d'Etude et de Recherche Clinique en Oncologie Radiotherapies. Semin Oncol 2001, 28(1 Suppl 1):35-40. 56. Gill S, Loprinzi CL, Sargent DJ, Thome SD, Alberts SR, Haller DG, Benedetti J, Francini G, Shepherd LE, Francois Seitz J, Labianca R, Chen W, Cha SS, Heldebrant MP, Goldberg RM: Pooled analysis of fluorouracil-based adjuvant therapy for stage II and III colon cancer: who benefits and by how much? J Clin Oncol 2004, 22(10):1797806. 57. O'Connell MJ, Mailliard JA, Kahn MJ, Macdonald JS, Haller DG, Mayer RJ, Wieand HS: Controlled trial of fluorouracil and low-dose leucovorin given for 6 months as postoperative adjuvant therapy for colon cancer. J Clin Oncol 1997, 15(1):246-50. 58. Efficacy of adjuvant fluorouracil and folinic acid in colon cancer. International Multicentre Pooled Analysis of Colon Cancer Trials (IMPACT) investigators. Lancet 1995, 345(8955):939-44. 59. Van Cutsem E, Dicato M, Wils J, Cunningham D, Diaz-Rubio E, Glimelius B, Haller D, Johnston P, Kerr D, Koehne CH, Labianca R, Minsky B, Nordlinger B, Roth A, Rougier P, Schmoll HJ: Adjuvant treatment of colorectal cancer (current expert opinion derived from the Third International Conference: Perspectives in Colorectal Cancer, Dublin, 2001). Eur J Cancer 2002, 38(11):1429-36. 60. O'Connell JB, Maggard MA, Ko CY: Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J Natl Cancer Inst. 2004, 96(19):1420-5. 61. André T, Boni C, Mounedji-Boudiaf L, Navarro M, Tabernero J, Hickish T, Topham C, Zaninelli M, Clingan P, Bridgewater J, Tabah-Fisch I, de Gramont A: Multicenter International Study of Oxaliplatin/5-Fluorouracil/Leucovorin in the Adjuvant Treatment of Colon Cancer (MOSAIC) Investigators

Oxaliplatin,

fluorouracil, and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer. N Engl J Med 2004, 350(23):2343-51.

84

62. Sargent DJ, Wieand HS, Haller DG, Gray R, Benedetti JK, Buyse M, Labianca R, Seitz JF, O'callaghan CJ, Francini G, Grothey A, O'connell M, Catalano PJ, Blanke CD, Kerr D, Green E, Wolmark N, Andre T, Goldberg RM, De Gramont A: Disease-Free Survival Versus Overall Survival As a Primary End Point for Adjuvant Colon Cancer Studies: Individual Patient Data From 20,898 Patients on 18 Randomized Trials. J Clin Oncol 2005, 23(34):8664-70. 63. Di Costanzo F, Doni L: Adjuvant therapy in colon cancer: which treatment in 2005? Ann Oncol 2005, 16(Suppl.4):iv69-iv73. 64. Sakamoto J, Ohashi Y, Hamada C, Buyse M, Burzykowski T, Piedbois P: MetaAnalysis Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum; MetaAnalysis Group in Cancer. Efficacy of oral adjuvant therapy after resection of colorectal cancer: 5-year results from three randomized trials. J Clin Oncol 2004, 22(3):484-92. 65. Fernandez FG, Drebin JA, Linehan DC, Dehdashti F, Siegel BA, Strasberg SM: Five-year survival after resection of hepatic metastases from colorectal cancer in patients screened by positron emission tomography with F-18 fluorodeoxyglucose (FDG-PET). Ann Surg 2004, 240(3):438-47. 66. Adam R, Lucidi V, Bismuth H: Hepatic colorectal metastases: methods of improving resectability. Surg Clin North Am 2004, 84(2):659-71. 67. Grothey A, Sargent D, Goldberg RM, Schmoll HJ: Survival of patients with advanced colorectal cancer improves with the availability of fluorouracil-leucovorin, irinotecan, and oxaliplatin in the course of treatment. J Clin Oncol 2004, 22(7):1209-14. 68. Tournigand C, Andre T, Achille E, Lledo G, Flesh M, Mery-Mignard D, Quinaux E, Couteau C, Buyse M, Ganem G, Landi B, Colin P, Louvet C, de Gramont A: FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study. J Clin Oncol 2004, 22(2):229-37. 69. Meyerhardt JA, Mayer RJ: Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med 2005, 352(5):476-87. 70. Kralovánszky J, Katona Cs: Nukleotid bioszintézis gátlók. In: Onkofarmakológia, Szerk: Jeney A, Kralovánszky J. Medicina, Budapest, 2005. 71. Jeney A: Topoizomeráz gátlók. In: Onkofarmakológia, Szerk: Jeney A, Kralovánszky J. Medicina, Budapest, 2005.

85

72. Raymond E, Faivre S, Chaney S, Woynarowski J, Cvitkovic E: Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin. Mol Cancer Ther 2002, 1(3):227-35. 73. Raymond E, Buquet-Fagot C, Djelloul S, Mester J, Cvitkovic E, Allain P, Louvet C, Gespach C: Antitumor activity of oxaliplatin in combination with 5-fluorouracil and the thymidylate synthase inhibitor AG337 in human colon, breast and ovarian cancers. Anticancer Drugs 1997, 8(9):876-85. 74. Rothenberg ML, Oza AM, Bigelow RH, Berlin JD, Marshall JL, Ramanathan RK, Hart LL, Gupta S, Garay CA, Burger BG, Le Bail N, Haller DG: Superiority of oxaliplatin and fluorouracil-leucovorin compared with either therapy alone in patients with progressive colorectal cancer after irinotecan and fluorouracil-leucovorin: interim results of a phase III trial. J Clin Oncol 2003, 21(11):2059-69. 75. Raymond E, Faivre S, Chaney S, Woynarowski J, Cvitkovic E: Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin. Mol Cancer Ther 2002, 1(3):227-35. 76. Grothey A: Oxaliplatin-safety profile: neurotoxicity. Semin Oncol 2003, 30 (4 Suppl.15):5-13. 77. Folkman J: Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971, 285(21):1182-6. 78. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003, 9(6):669-76. 79. Kabbinavar F, Hurwitz HI, Fehrenbacher L, Meropol NJ, Novotny WF, Lieberman G, Griffing S, Bergsland E: Phase II, randomized trial comparing bevacizumab plus fluorouracil (FU)/leucovorin (LV) with FU/LV alone in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2003, 21(1):60-5. 80. Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, Cartwright T, Hainsworth J, Heim W, Berlin J, Baron A, Griffing S, Holmgren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, Ross R, Kabbinavar F: Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004, 350(23):2335-42. 81. Kabbinavar FF, Schulz J, McCleod M, Patel T, Hamm JT, Hecht JR, Mass R, Perrou B, Nelson B, Novotny WF: Addition of bevacizumab to bolus fluorouracil and leucovorin in first-line metastatic colorectal cancer: results of a randomized phase II trial. J Clin Oncol 2005, 23(16):3697-705.

86

82. Baselga J: Why the epidermal growth factor receptor? The rationale for cancer therapy. Oncologist 2002, 7(Suppl4):2-8. 83. Mayer A, Takimoto M, Fritz E, Schellander G, Kofler K, Ludwig H: The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal cancer. Cancer 1993, 71(8):2454-60. 84. Baselga J, Albanell J: Epithelial growth factor receptor interacting agents. Hematol Oncol Clin North Am 2002, 16(5):1041-63. 85. Saltz LB, Rubin M, Hochster H, et al: Cetuximab (IMC-C225) plus irinotecan (CPT-11) is active in CPT-11 refractory colorectalé cancer (CRC) that expresses epidermal growth factor receptor (EGFR). Proc Am Soc Clin Oncol 2001, 20:3a. 86. Saltz LB, Meropol NJ, Loehrer PJ Sr, Needle MN, Kopit J, Mayer RJ: Phase II trial of cetuximab in patients with refractory colorectal cancer that expresses the epidermal growth factor receptor. J Clin Oncol 2004, 22(7):1201-8 87. Cunningham D, Humblet Y, Siena S, Khayat D, Bleiberg H, Santoro A, Bets D, Mueser M, Harstrick A, Verslype C, Chau I, Van Cutsem E: Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004, 351(4):337-45. 88. Desoize B and Robert J: Individual dose adaptation of anticancer drugs. Eur J Cancer 1994, 30A: 844-851. 89. Lennard L: Therapeutic drug monitoring of cytotoxic drugs. Brit J Pharmacol 2001, 52:755-875. 90. Yoshida T, Araki E, Iigo M, Fujii T, Yoshino M, Shimada Y, Saito D, Tajri H, Yamaguchi H, Yoshida S, Yoshino M, Ohkura H, Yoshimori M, Okazaki N: Clinical Significance of monitoring serum levels of 5-fluorouracil by continuous infusion in patients with advanced colonic cancer. Cancer Chemother Pharmacol 1990, 26:3352354. 91. Di Paolo A, Danesi R, Ciofi L, Vannozzi F, Bocci G, Lastella M, Amatori F, Martelloni BM, Ibrahim T, Amadori D, Falcone A: Improved analysis of 5-Fluorouracil and 5,6-dihydro-5-Fluorouracil by HPLC with diode array detection for determination of cellular dihydropyrimidine dehydrogenase activity and pharmaco-kinetic profiling. Ther Drug Monit 2005, 27:362-368.

87

92. Jiang H, Lu J, Jiang J, Hu P: Important role of the dihydrouracil/uracil ratio in marked

interpatient

variations

of

fluoropyrimidine

pharmacokinetics

and

pharmacodynamics. J Clin Pharmacol 2004, 44:1260-72. 93. Popat S, Matakidou A, Houlston RS: Thymidylate synthase expression and prognosis in colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis. J Clin Oncol 2004, 22:529-36. 94. Formentini A, Henne-Bruns D, Kornmann M: Thymidylate synthase expression and prognosis of patients with gastrointestinal cancers receiving adjuvant chemotherapy: a review. Langenbecks Arch Surg 2004, 389:405-13. 95. Elsaleh H, Powell B, McCaul K, Grieu F, Grant R, Joseph D, Iacopetta B: P53 alteration and microsatellite instability have predictive value for survival benefit from chemotherapy in stage III colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 2001, 7:1343-9. 96. van Triest B, Peters GJ: Thymidylate synthase: a target for combination therapy and determinant of chemotherapeutic response in colorectal cancer. Oncology 1999, 57:17994. 97. van Triest B, Pinedo HM, van Hensbergen Y, Smid K, Telleman F, Schoenmakers PS, van der Wilt CL, van Laar JA, Noordhuis P, Jansen G, Peters GJ: Thymidylate synthase level as main predicitve parameter for sensitivity to 5-fluorouracil but not for folate-based thymidylate synthase inhibitors in 13 nonselected colon cancer cell lines. Clin Cancer Res 1999, 5:643-54. 98. Ichikawa W, Uetake H, Shirota Y, Yamada H, Nishi N, Nihei Z, Sugihara K, Hirayama R: Combination of dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase gene expressions in primary tumors as predictive parameters for the efficacy of fluoropyrimidine-based chemotherapy for metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res 2003, 9:786-91. 99. Etienne MC, Chazal M, Laurent-Puig P, Magne N, Rosty C, Formento JL, Francoual M, Formento P, Renee N, Chamorey E, Bourgeon A, Seitz JF, Delpero JR, Letoublon C, Pezet D, Milano G: Prognostic value of tumoral thymidylate synthase and p53 in metastatic colorectal cancer patients receiving fluorouracil-based chemotherapy: Phenotypic and genotypic analyses. J Clin Oncol 2002, 20:2832-43.

88

100. Kralovánszky J, Köves I, Orosz Z, Katona C, Tóth K, Rahóty P, Czeglédi F, Kovács T, Budai B, Hullán L, Jeney A: Prognostic significance of the thymidylate biosynthetic enzymes in human colorectal tumors. Oncology 2002, 62:167-74. 101. Kornmann M, Schwabe W, Sander S, Kron M, Strater J, Polat S, Kettner E, Weiser HF, Baumann W, Schramm H, Hausler P, Ott K, Behnke D, Staib L, Beger HG, Link KH: Thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase mRNA expression levels: predictors for survival in colorectal cancer receiving adjuvant chemotherapy. Clin Cancer Res 2003, 9:4116-24. 102. Edler D, Glimelius B, Hallstrom M, Jakobsen A, Johnston PG, Magnusson I, Ragnhammar P, Blomgren H: Thymidylate synthase expression in colorectal cancer: a prognostic and predictive marker of benefit from adjuvant fluorouracil based chemotherapy. J Clin Oncol 2002, 20:1721-8. 103. Danenberg PV: Pharmacogenomics of thymidylate synthase in cancer treatment. Front Biosci 2004, 9:2484-94. 104. Mandola MV, Stoehlmacher J, Zhang W, Groshen S, Mimi C, Iqbal S, Lenz HJ, Ladner RD: A 6bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associated with decreased intratumoral TS mRNA level. Pharmacogenetics 2004, 14:319-27. 105. Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AM, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen R: Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet 1994, 7(2):195-200. 106. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, Rozen R: A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet 1995, 10(1):111-3. 107. Ueland PM, Hustad S, Schneede J, Refsum H, Vollset SE: Biological and clinical implications of the MTHFR C677T polymorphism. Trends Pharmacol Sci 2001, 22(4):195-201. 108. Kuhn JG: Fluorouracil and the new oral fluorinated pyrimidines. Ann Pharmacother 2001, 35(2):217-27. 109. Marsh S: Pharmacogenetics of colorectal cancer. Expert Opin Pharmacother 2005, 6: 2607-2616.

89

110. Flieger D, Keller R, Fischbach W: A colorectalis carcinoma kezelési stratégiái. Kommentár: Láng I. Orvostovábbképző Szemle 2004, 6:67-76. 111. Kawakami K, Omura K, Kanehira E, Watanabe Y: Polymorphic tandem repeats in the thymidylate synthase gene is associated with its protein expression in human gastrointestinal cancers. Anticancer Res 1999, 19:3249-52. 112. Rieger MA, Parlesak A, Pool-Zobel BL, Rechkemmer G, Bode C: A diet high in fat and meat but low in dietary fibre increases the genotoxic potential of 'faecal water'. Carcinogenesis 1999, 20(12):2311-6. 113. Czeizel AE, Merhala Z: Bread fortification with folic acid, vitamin B12, and vitamin B6 in Hungary. Lancet 1998, 352(9135):1225. 114. Pullarkat ST, Stoehlmacher J, Ghaderi V, Xiong YP, Ingles SA, Sherrod A, Warren R, Tsao-Wei D, Groshen S, Lenz HJ: Thymidylate synthase gene polymorphism

determines

response

and

toxicity

of

5-FU

chemotherapy.

Pharmacogenomics J 2001, 1(1):65-70. 115. Derenzini M, Montanaro L, Trere D, Chilla A, Tazzari PL, Dall'Olio F, Ofner D: Thymidylate synthase protein expression and activity are related to the cell proliferation rate in human cancer cell lines. Mol Pathol 2002, 55(5):310-4. 116. Longley DB, Ferguson PR, Boyer J, Latif T, Lynch M, Maxwell P, Harkin DP, Johnston PG: Characterization of a thymidylate synthase (TS)-inducible cell line: a model system for studying sensitivity to TS- and non-TS-targeted chemotherapies. Clin Cancer Res 2001, 7(11):3533-9. 117. Kumagai K, Hiyama K, Oyama T, Maeda H, Kohno N: Polymorphisms in the thymidylate synthase and methylenetetrahydrofolate reductase genes and sensitivity to the low-dose methotrexate therapy in patients with rheumatoid arthritis. Int J Mol Med 2003, 11(5):593-600. 118. De Gramont A, Bosset JF, Milan C, Rougier P, Bouché O, Etienne PL, Morvan F, Louvet C, Guillot T, Francois E, Bedenne L: Randomized trial comparing monthly lowdose leucovorin and fluorouracil bolus with bimonthly high-dose leucovorin and fluorouracil bolus plus continuous infusion for advanced colorectal cancer: a French intergroup study. J Clin Oncol 1997, 15(2):808-15.

90

119. Efficacy of intravenous continuous infusion of fluorouracil compared with bolus administration in advanced colorectal cancer. Meta-analysis Group In Cancer. J Clin Oncol 1998, 16(1):301-8. 120. Kohne CH, Wils J, Lorenz M, Schoffski P, Voigtmann R, Bokemeyer C, Lutz M, Kleeberg C, Ridwelski K, Souchon R, El-Serafi M, Weiss U, Burkhard O, Ruckle H, Lichnitser M, Langenbuch T, Scheithauer W, Baron B, Couvreur ML, Schmoll HJ: Randomized phase III study of high-dose fluorouracil given as a weekly 24-hour infusion with or without leucovorin versus bolus fluorouracil plus leucovorin in advanced colorectal cancer: European organization of Research and Treatment of Cancer Gastrointestinal Group Study 40952. J Clin Oncol 2003, 21(20):3721-8. 121. Poplin E. Benedetti J, Estes N, Haller D, Mayer R, Goldberg R, Macdonald J: Phase III randomized trial of bolus 5-FU/leucovorin/levamisole versus 5-FU continuous infusion/levamisole as adjuvant therapy for high risk colon cancer (SWOG 9415/INT0153). Proc Am Soc Clin Oncol 2000, 19:240a(931). 122. Saini A, Cunningham D, Norman A, Hill M, Tait D, Hickish T, Iveson T, Lofts F, Jodrell D, Ross P, Oates J: Multicentre randomized trial of protracted venous infusion 5-FU compared to 5-FU/folinic acid as adjuvant therapy for colorectal cancer. Proc Am Soc Clin Oncol 2000, 19:240a(928). 123. Andre T, Colin P, Louvet C, Gamelin E, Bouche O, Achille E, Colbert N, Boaziz C, Piedbois P, Tubiana-Mathieu N, Boutan-Laroze A, Flesch M, Billiau V, Buyse M, Gramont A: Randomized adjuvant study comparing to schemes of 5-fluorouracil and leucovorin in stage B2 and C colon adenocarcinoma. Study design and preliminary safety results - Group d'Étude et de Recherche Clinique en Oncologie Radiotherapies. Semin Oncol 2001, 28:35-40. 124. Rothenberg ML, Meropol N, Poplin EA, Van Cutsem E, Wadler S: Mortality associated with irinotecan plus bolus fluorouracil/leucovorin: Summary findings of an independent panel. J Clin Oncol 2001, 19:3801-3807. 125. Chau I, Norman AR, Cunningham D, Tait D, Ross PJ, Iveson T, Hill M, Hickish T, Lofts F, Jodrell D, Webb A, Oates JR: A randomised comparison between 6 months of bolus fluorouracil/leucovorin and 12 weeks of protracted venous infusion fluorouracil as adjuvant treatment in colorectal cancer. Ann Oncol 2005, 16(4):549-57.

91

126. El-Khoueiry AB, Lenz HJ: Should continuous infusion 5-Fluorouracil become the standard of care in the USA as it is in Europe? Cancer Invest 2006, 24(1):50-5. 127. McLeod HL: Individualized cancer therapy. Molecular approaches to the prediction of tumor response. Expert Rev Anticancer Ther 2002, 2:113-9. 128. Kawakami K, Salonga D, Park JM, Danenberg KD, Uetake H, Brabender J, Omura K, Watanabe G, Danenberg PV: Different lengths of a polymorphic repeat sequence in the thymidylate synthase gene affect translational efficiency but not its gene expression. Clin Cancer Res 2001, 7:4096-101. 129. Soong R, Boedefeld WM, Heslin MJ, Wang K, Johnson MR, Diasio RB: Correlation between thymidylate synthase (TS) enhancer region sequence variants and RNA and protein levels in colorectal normal mucosa and tumors. Proc Am Soc Clin Oncol 2003, 22:123. 130. Kawakami K, Ishida Y, Danenberg KD, Omura K, Watanabe G, Danenberg PV: Functional polymorphism of the thymidylate synthase gene in colorectal cancer accompanied by frequent loss of heterozygosity. Jpn J Cancer Res 2002, 93:1221-9. 131. Cascinu S, Graziano F, Valentini M, Catalano V, Giordani P, Staccioli MP, Rossi C, Baldelli AM, Grianti C, Muretto P, Catalano G: Vascular endothelial growth factor expression, S-phase fraction and thymidylate synthase quantitation in node-positive colon cancer: relationships with tumor recurrence and resistance to adjuvant chemotherapy. Ann Oncol 2001, 12:239-44. 132. Kamoshida S, Matsuoka H, Ishikawa T, Maeda K, Shimomura R, Inada K, Tsutsumi Y: Immunohistochemical evaluation of thymidylate synthase (TS) and p16INK4a in advanced colorectal cancer: implication of TS expression in 5-FU-based adjuvant chemotherapy. Jpn J Clin Oncol 2004, 34:594-601. 133. Broll R, Busch P, Duchrow M, Oevermann E, Schwandner O, Farke S, Bruch HP, Windhovel U: Influence of thymidylate synthase and p53 protein expression on clinical outcome in patients with colorectal cancer. Int J Colorectal Dis 2005, 20:94-102. 134. Sakamoto J, Hamashima H, Suzuki H, Ito K, Mai M, Saji S, Fukushima M, Matsushita Y, Nakazato H: Thymidylate synthase expression as a predictor of the prognosis of curatively resected colon carcinoma in patients registered in an adjuvant immunochemotherapy clinical trial. Oncol Rep 2003, 10:1081-90.

92

135. Allegra CJ, Paik S, Colangelo LH, Parr AL, Kirsch I, Kim G, Klein P, Johnston PG, Wolmark N, Wieand HS: Prognostic value of thymidylate synthase, Ki-67, and p53 in patients with Dukes’ B and C colon cancer: A National Cancer Institute–National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Collaborative Study. J Clin Oncol 2003, 21:241-50. 136. Lenz HJ, Danenberg KD, Leichman CG, Florentine B, Johnston PG, Groshen S, Zhou L, Xiong YP, Danenberg PV, Leichman LP: p53 and thymidylate synthase expression in untreated stage II colon cancer: associations with recurrence, survival, and site. Clin Cancer Res 1998, 4:1227-34. 137. Suh KW, Kim JH, Kim YB, Kim J, Jeong S: Thymidylate synthase gene polymorphism as a prognostic factor for colon cancer. J Gastrointest Surg 2005, 9:33642. 138. Fernandez-Contreras ME, Jimenez De Ayala B, Garcia De Paredes ML, Velasco A, Majano PL, Palacios J, Gamallo C. Thymidylate synthase expression pattern is a prognostic factor in patients of colorectal cancer treated with 5-fluorouracil. Int J Oncol 2004, 25:877-85. 139. Kornmann M, Link KH, Galuba I, Ott K, Schwabe W, Hausler P, Scholz P, Strater J, Polat S, Leibl B, Kettner E, Schlichting C, Baumann W, Schramm H, Hecker U, Ridwelski K, Vogt JH, Zerbian KU, Schutze F, Kreuser ED, Behnke D, Beger HG. Association of time to recurrence with thymidylate synthase and dihydropyrimidine dehydrogenase mRNA expression in stage II and III colorectal cancer. J Gastrointest Surg 2002, 6:331-7. 140. Jakobsen A, Nielsen JN, Gyldenkerne N, Lindeberg J. Thymidylate synthase and methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism in normal tissue as predictors of fluorouracil sensitivity. J Clin Oncol 2005, 23:1365-9. 141. Longley DB, Allen WL, McDermott U, Wilson TR, Latif T, Boyer J, Lynch M, Johnston PG: The roles of thymidylate synthase and p53 in regulating Fas-mediated apoptosis in response to antimetabolites. Clin Cancer Res 2004, 10:3562-71. 142. Odin E, Wettergren Y, Nilsson S, Willen R, Carlsson G, Spears CP, Larsson L, Gustavsson B: Altered gene expression of folate enzymes in adjacent mucosa is associated with outcome of colorectal cancer patients. Clin Cancer Res 2003, 9:6012-9.

93

143. Chen J, Hunter DJ, Stampfer MJ, Kyte C, Chan W, Wetmur JG, Mosig R, Selhub J, Ma J: Polymorphism in the thymidylate synthase promoter enhancer region modifies the risk and survival of colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003, 12:958-962. 144. Trinh BN, Ong CN, Coetzee GA, Yu MC, Laird PW: Thymidylate synthase: a novel genetic determinant of plasma homocysteine and folate levels. Hum Genet 2002, 111:299-302. 145. Kealey C, Brown KS, Woodside JV, Young I, Murray L, Boreham CA, McNulty H, Strain JJ, McPartlin J, Scott JM, Whitehead AS: A common insertion/deletion polymorphism of the thymidylate synthase (TYMS) gene is a determinant of red blood cell folate and homocysteine concentrations. Hum Genet 2005, 116:347-53. 146. Kawakami K, Ruszkiewicz A, Bennett G, Moore J, Watanabe G, Iacopetta B: The folate pool in colorectal cancers is associated with DNA hypermethylation and with a polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase. Clin Cancer Res 2003, 9:5860-5. 147. Brown KS, Kluijtmans LA, Young IS, McNulty H, Mitchell LE, Yarnell JW, Woodside JV, Boreham CA, McMaster D, Murray L, Strain JJ, Whitehead AS: The thymidylate synthase tandem repeat polymorphism is not associated with homocysteine concentrations in healthy young subjects. Hum Genet 2004, 114:182-5. 148. Santini D, Vincenzi B, Perrone G, Rabitti C, Borzomati D, Caricato M, La Cesa A, Grilli C, Verzi A, Coppola R, Tonini G: Thymidylate synthase expression in normal colonic mucosa: a predictive marker of toxicity in colorectal cancer patients receiving 5fluorouracil-based adjuvant chemotherapy. Oncology 2004, 67:135-42. 149. Lecomte T, Ferraz JM, Zinzindohoue F, Loriot MA, Tregouet DA, Landi B, Berger A, Cugnenc PH, Jian R, Beaune P, Laurent-Puig P: Thymidylate synthase gene polymorphism predicts toxicity in colorectal cancer patients receiving 5-fluorouracilbased chemotherapy. Clin Cancer Res 2004, 10:5880-8. 150. Dray X, Boutron-Ruault MC, Bertrais S, Sapinho D, Benchamiche-Bouvier AM, Faivre J: Influence of dietary factors on colorectal cancer survival. Gut 2003, 52:86873. 151. de Bruijn EA, van Oosterom AT, Tjaden UR, Reeuwijk HJ, Pinedo HM: Pharmacology of 5'-deoxy-5-fluorouridine in patients with resistant ovarian cancer. Cancer Res 1985, 45(11 Pt 2):5931-5.

94

152. Morimoto S, Mishima H, Tsujinaka T, Kawato N, Shono Y, Tsuji T, Tabuse K, Nakata I, Saito M, Uenaka K: Combined determination of urine uracil levels and plasma 5-FU clearance for a simple order-made treatment with anticancer agents of FU derivative. Gan To Kagaku Ryoho 2003, 30(1):89-94. 153. Hurria A, Hurria A, Brogan K, Panageas KS, Pearce C, Norton L, Jakubowski A, Howard J, Hudis C: Effect of creatinine clearance on patterns of toxicity in older patients receiving adjuvant chemotherapy for breast cancer. Drugs Aging 2005, 22(9):785-91. 154. Ikeda M, Furukawa H, Imamura H, Shimizu J, Ishida H, Masutani S, Tatsuta M, Kawasaki T, Satomi T: Pharmacokinetic study of S-1, a novel oral fluorouracil antitumor agent in animal model and in patients with impaired renal function. Cancer Chemother Pharmacol 2002, 50(1):25-32. 155. Di Paolo A, Ibrahim T, Danesi R, Maltoni M, Vannozzi F, Flamini E, Zoli W, Amadori D, Del Tacca M: Relationship between plasma concentrations of 5fluorouracil and 5-fluoro-5,6-dihydrouracil and toxicity of 5-fluorouracil infusions in cancer patients. Ther Drug Monit 2002, 24(5):588-93. 156. Fleming GF, Schilsky RL, Schumm LP, Meyerson A, Hong AM, Vogelzang NJ, Ratain MJ: Phase I and pharmacokinetic study of 24-hour infusion 5-fluorouracil and leucovorin in patients with organ dysfunction. Ann Oncol 2003, 14(7):1142-7. 157. Schwahn B, Rozen R: Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences. Am J Pharmacogenomics 2001, 1(3):189-201. 158. Kim YI: Folate and carcinogenesis: evidence, mechanisms, and implications. J Nutr Biochem 1999, 10(2):66-88. 159. Levine AJ, Siegmund KD, Ervin CM, Diep A, Lee ER, Frankl HD, Haile RW: The methylenetetrahydrofolate reductase 677C->T polymorphism and distal colorectal adenoma risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000, 9(7):657-63. 160. Czeizel E, Tímár L, Botto L: A metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) gén polimorfizmusának (C677T) magyarországi gyakorisága. Orv Hetil 2001, 142:1227-9. 161. Carlsson G, Hafstrom LO, Spears CP, Gustavsson B, Larsson PA. 5-fluorouracil (5-FU) and 5,10-methylene tetrahydrofolate (5,10-CH2FH4) as adjuvant therapy in an experimental rodent colon carcinoma model. Anticancer Res 1997, 17(5A):3671-4.

95

162. Sekhon J, Pereira P, Sabbaghian N, Schievella AR, Rozen R: Antisense inhibition of methylenetetrahydrofolate reductase reduces survival of methionine-dependent tumour lines. Br J Cancer 2002, 87(2):225-30. 163. Etienne MC, Ilc K, Formento JL, Laurent-Puig P, Formento P, Cheradame S, Fischel JL, Milano G: Thymidylate synthase and methylenetetrahydrofolate reductase gene poly-morphisms: relationships with 5-fluorouracil sensitivity. Br J Cancer 2004, 90(2):526-34. 164. Chen J, Ma J, Stampfer MJ, Palomeque C, Selhub J, Hunter DJ: Linkage disequilibrium between the 677C>T and 1298A>C polymorphisms in human methylenetetrahydrofolate reductase gene and their contributions to risk of colorectal cancer. Pharmacogenetics 2002, 12(4):339-42. 165. Ogino S, Wilson RB: Genotype and haplotype distributions of MTHFR677C>T and 1298A>C single nucleotide polymorphisms: a meta-analysis. J Hum Genet 2003, 48(1):1-7. 166. Sohn KJ, Croxford R, Yates Z, Lucock M, Kim YI: Effect of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on chemosensitivity of colon and breast cancer cells to 5-fluorouracil and methotrexate. J Natl Cancer Inst 2004, 96(2):134-44. 167. Petrelli N, Herrera L, Rustum Y, Burke P, Creaven P, Stulc J, Emrich LJ, Mittelman A: A prospective randomized trial of 5-fluorouracil versus 5-fluorouracil and high-dose leucovorin versus 5-fluorouracil and methotrexate in previously untreated patients with advanced colorectal carcinoma. J Clin Oncol 1987, 5(10):1559-65. 168. Wisotzkey JD, Toman J, Bell T, Monk JS, Jones D: MTHFR (C677T) polymorphisms and stage III colon cancer: response to therapy. Mol Diagn 1999, 4(2):95-9. 169. Cohen V, Panet-Raymond V, Sabbaghian N, Morin I, Batist G, Rozen R: Methylene-tetrahydrofolate reductase polymorphism in advanced colorectal cancer: a novel genomic predictor of clinical response to fluoropyrimidine-based chemotherapy. Clin Cancer Res 2003, 9(5):1611-5.

96

10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK A disszertációval kapcsolatos közlemények Láng I, Hitre E: Az irinotecan (CAMPTO) helye a colorectalis rák első vonalbeli kezelésében. Pathology Oncology Research 2002, 2(Suppl.):53-59. Adleff V, Hitre E, Köves I, Orosz Zs, Hajnal A, Kralovánszky J: Heterozygote deficiency in thymidylate synthase enhancer region polymorphism genotype distribution in Hungarian colorectal cancer patients. International Journal of Cancer 2004, 108:852-6. IF: 4,416 Budai B, Hitre E, Adleff V, Czeglédi F, Gyergyay F, Láng I, Kralovánszky J: A metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) C677T polimorfizmus klinikai jelentősége a metasztatikus colorectalis daganatok 5-fluoropirimidin alapú kezelésében. Magyar Onkológia 2004, 48:253-7. Hitre E, Budai B, Adleff V, Czeglédi F, Horváth Zs, Gyergyay F, Lövey J, Kovács T, Orosz Zs, Láng I, Kásler M, Kralovánszky J: Influence of thymidylate synthase gene polymorphisms on the survival of colorectal cancer patients receiving adjuvant 5fluorouracil. Pharmacogenetics and Genomics 2005, 15:723-30. IF2004: 6,406 Fuszek P, Horváth CsH, Hitre E, Lakatos PL: Location and age at onset of Colorectal cancer in hungarian patients between 1993 and 2004. The high number of advanced cases supports the need fo colorectal cancer screening program in Hungary. Anticancer Research 2006, 26(1B):527-32. IF2004: 1,395

97

Egyéb onkológiai tárgyú közlemények Láng I, Hitre E, Horváth Zs, Gődény M: Resection of originally inoperable liver metastases of gastrointestinal stromal tumor after imitinab mesylate therapy. Journal of Clinical Oncology 2003, 15:3538-40. IF: 10,864 Láng I, Hitre E: Újabb irányzatok az előrehaladott colorectalis rák irinotecan kezelésében. The Lancet Oncology Magyar Kiadás 2003, 2;223-226. Láng I, Hitre E: A colorectalis carcinoma irinotecan kezelésének legújabb eredményei. Magyar Onkológia 2004, 48:281-288. Lang I, Hitre E: A gasztrointesztinális stróma tumorok (GIST) korszerű kezelése. Orvosi Hetilap 2005, 146(18 Suppl.1):935-41. Peley G, Torok K, Farkas E, Matrai Z, Horvath Z, Sinkovics I, Hitre E, Renyi-Vamos F, Orosz Z, Koves I: Az őrszemnyirokcsomó-biopszia alkalmazhatósága és jelentősége neoadjuváns kemoterápia után emlőrákban. Magyar Onkológia 2006, 50:19-23. A disszertáció témájához kapcsolódó előadások Adleff V, Kovács T, Czeglédi F, Hitre E, Gyergyai F, Orosz Zs, Kralovánszky J: Timidilátszintáz génpolimorfizmusok hatása a TS enzimaktivitás alakulására daganatos és környező szövetekben. Magyar Onkológia 2001, 45:249. Adleff V, Kovács T, Hitre E, Orosz Zs, Kralovánszky J: Thymidylate synthase (TS) promoter and 3’UTR polymorphismus in Hungarian colorectal cancer population, and their association with TS activities in colon mucosa tissues. Congress of Pharmacology, San Francisco, USA, 2002.

98

XIVth

World

Pap É, Hitre E, Pandi E, Budai B, Kralovánszky J: Vastagbél-daganatos betegek de Gramont kezelésének farmakokinetikai követése. Magyar Onkológia 2003, 47:297. Adleff V, Szarvas T, Budai B, Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky J: Heterozigótaság-vesztés jelentősége a timidilát-szintáz génlókusz környezetében (18p11.32) kolorektális daganatos szövetekben. Magyar Onkológia 2003, 47:235. Kovács T, Köves I, Vámosi-Nagy I, Adleff V, Hitre E, Orosz Zs, Kralovánszky J: The Value of Thymidylate Synthase (TS) Level in the Prognosis and Efficacy of 5fluorouracil in Colorectal Tumours, and Its Association with TS Gene Polymorphisms. Colorectal Disease 2003, 5(Suppl.2):21. Kovács T, Köves I, Vámosi-Nagy I, Adleff V, Hitre E, Orosz Zs, Kralovánszky J: The value of thymidylate synthase (TS) level in the prognosis and efficacy of 5-fluorouracil in colorectal tumours, and its association with TS gene polymorphisms. Journal of Japan Surgical Society 2003, 104:346. P. Gazdag A, Adleff V, Budai B, Czeglédi F, Hitre E, Orosz Zs, Kralovánszky J: Metiléntetrahidrofolát-reduktáz

(MTHFR)

C677T

génpolimorfizmus

vizsgálata

colorectalis daganatos betegek és egészséges kontrollok esetében. Magyar Onkológia 2003, 47:295. Kralovánszky J, Pandi E, Adleff V, Katona Cs, Budai B, Hitre E, Kovács T, Czeglédi F, Gyergyay F, P. Gazdag A, Orosz Zs: The role of prognostic and predictive markers in the selection of optimal chemotherapy in colorectal cancers. Magyar Onkológia 2003, 47:278. Hitre E: Case Report: Metastacic Colorectal Cancer. Standard terápia, ellentmondások és a jövő perspektívái a gasztrointesztinális/emésztőszervi daganatok kezelésében. A European Organization for the Research and Treatment of Cancer (EORTC) Gasztrointesztinális Tumor Kollaboratív Csoport (GITCCG), az Országos Onkológiai

99

Intézet (OOI) és a Magyar Gyógyszerterápiás Onkológiai Társaság (MAGYOT) közös szimpóziuma, Budapest, 2004. Hitre E, Adleff V, Budai B, Ganofszky E, Horváth Zs, Juhos É, Szabó E, Láng I, Czeglédi

F,

Orosz

Zs,

Gazdag

A,

Kralovánszky

J:

Timidlátszintáz

(TS)

génpolimorfizmusok összefüggése colorectalis daganatos betegek 5 fluorouracil (5-FU) terápiára adott válaszával. Magyar Kemoterápiai Társaság XVIII Kongresszusa, Budapest, 2004. Hitre E, Adleff V, Budai B, Szabó E, Horváth Z, Láng I, Czeglédi F, Orosz Zs, Gazdag A, Kralovánszky J: Thymidylate synthase gene polymorphisms affect disease free (DFS)

and overall (OS) survival of colorectal cancer (CRC) patient treated with

adjuvant 5-fluorouracil, folinic acid (FUFA). Journal of Clinical Oncology 2004, 22(Suppl.15):3581. Hitre E, Láng I: Első tapasztalataink IV. stádiumú colorectalis daganatos betegek Xeloda kezelésével. Magyar Kemoterápiai Társaság XVIII Kongresszusa, Budapest, 2004. Pap É, Hitre E, Pandi E, Budai B, Kralovánszky J.: Infúziós 5 fluorouracil kezelés farmakokinetikai követése. Magyar Kemoterápiai Társaság XVIII Kongresszusa, Budapest, 2004. Pandi E, Adleff V, Budai B, Hitre E, Czeglédi F, Gyergyay F, Szabó E, Horváth Zs, Gazdag A, Kralovánszky J.: The frequency of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) deficiency in a hungarian colorectal cancer (CRC) population: lack of correlation between very low DPD values and the DPD IVS1G A mutation. Anticancer Research 2004, 24:3581. Adleff V, Szarvas T, Budai B, Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky J: Mikroszatellita markerek vizsgálatának modszertani tanulmánya makrodisszekált

kolorektális

tumorszövetek

100

DNS

mintáinak

TS

genotipus

meghatározásában. Magyar Kemoterápiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Budapest, 2004. Adleff V, Szarvas T, Budai B, Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky J: Role of allelic imbalance at the thymidylate synthase gene locus in CRC patients. EACR Congress, Inssbruck, Austria, 2004. Budai B, Gazdag A, Adleff V, Czeglédi F, Hitre E, Kralovánszky J: Investigation of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism in 5-fluorouracil (5-FU) treated patients with colorectal cancer. EACR Congress, Inssbruck, Austria, 2004. Gazdag A, Adleff V, Buda B, Czeglédi F, Hitre E, Orosz Zs, Kralovánszky J: Összefüggés keresése a metiléntetrahidrofolát (MTHFR) C677T polimorfizmusa és a colorectalis daganatos betegek fluoropirimidin alapú terápiára adott válasza között. Magyar Kemoterápiai Társaság XVIII. Kongresszusa, Budapest, 2004. Hitre E: Campto kezelés a klinikai gyakorlatban. Onkológia a háziorvosi ellátásban Konferencia, Budapest, 2005. Hitre E, Budai B, Adleff V, Czeglédi F, Orosz Zs, Köves I, Horváth Zs, Kralovánszky J, Láng I: Comparison of the effect of continuous infusional and bolus 5-fluorouracil in the adjuvant treatment of colorectal cancer (CRC). 7th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, Spain, 2005. Hitre E, Budai B, Adleff V, Czeglédi F, Orosz Zs, Köves I, Horváth Zs, Kralovánszky J, Láng I: Tartós infúziós és bolus 5-fluorouracil adjuváns kezelés összehasonlítása colorectalis carcinomás betegeken. Magyar Onkológia 2005, 49:30. Budai B, Hitre E, Adleff V, Komlósi V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: A génpolimorfizmusok szerepe a metasztatikus colorectalis tumorok kezelésében. Magyar Onkológia 2005, 49:14.

101

Kralovánszky J, Budai B, Hitre E, Adleff V, Orosz Zs, Réti A, Komlósi V, Láng I: Farmakogenetikai vizsgálatok jelentősége az adjuváns kezelés hatékonyságának predikciójában colorectalis daganatokban (CRC). Magyar Onkológia 2005, 49:44. Kralovánszky J, Budai B, Pandi E, Hitre E, Adleff V, Katona C, Réti A, Komlósi V, Orosz Z, Láng I:The effect of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) activity and germline thymidylate synthase (TS) gene polymorphisms on the survival of colorectal cancer patients treated by adjuvant 5-fluorouracil. European Journal of Cancer 2005, 3:187. Adleff V, Komlósi V, Budai B, Réti A, Hitre E, Hajnal A, Kralovánszky J: Folátmetabolizmus enzimek génpolimorfizmusai kolorektális rákokban. Magyar Onkológia 2005, 49:3. Adleff V, Komlósi V, Budai B, Réti A, Hitre E, Hajnal A, Kralovánszky J: Interactions of genetic polymorphisms of folate metabolizing enzymes in modifying colorectal cancer risk in Hungarian population-based case-control study. European Journal of Cancer 2005, 3:69. Budai B, Hitre E, Adleff V, Komlósi V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: Role of thymidylate synthase (TS), methylenetertahydrofolate reductase (MTHFR) and cytosolic serine hydroxymethyltransferase (SHMT) gene polymorphisms in the chemotherapy of metastatic colorectal cancer. AACR Special Conference in Cancer Research, Charleston, SC, USA, 2006. Egyéb onkológiai tárgyú előadások Hitre E, Láng I, Gődény M: Operált Gastrointestinális Stromális Tumoros előrehaladott májáttétes beteg Glivec-kezelése. Magyar Onkológia 2001, 45:267.

102

Láng I, Ganofszky E, Horváth Zs, Szakolczai I, Czeglédi F, Hitre E, Juhos É, Pápai Zs, Szabó E, Telekes A: Másodválasztású taxánnal kezelt IV. stádiumú emlőrákos betegeink kétéves követési adatai. Magyar Onkológia 2001, 45:279. Láng I, Hitre E, Gődény M: Rapid Clinical Improvement and Tumor Shrinkage Following STI-571 (Glivec) Therapy in a Young Patient with Advanced Liver Metastases of Resected Jejunal Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST). Proceedings of ASCO Annual Meeting 2002, 21:2383. Ganofszky E, Horváth Zs, Láng I, Szakolczai I, Czeglédi F, Hitre E, Szabó E, Juhos É, Telekes A, Pápai Zs: Two years Follow up Results of a Prospective Case Control Study of 91 Stage IV. Breast Cancer Patients with 2th Line Taxane Treatment Outside of Clinical Trial. Proceedings of ASCO Annual Meeting 2002, 21:2049. Ganofszky E., Horváth Zs., Láng I., Szakolczai I., Czeglédi F, Hitre E., Szabó E., Juhos É., Telekes A., Pápai Zs.: 91 IV. stádiumú emlőrákos beteg másodvonalas taxán kezelésének 2 éves utánkövetési eredményei klinikai vizsgálaton kívüli prospektív case control study formájában. Magyar Onkológia 2002, 46:194. Lang I, Horvath Zs, Ganofszky E, Hitre E, Kasler M on behalf of the Hungarian Breast Cancer

Taxane

Group:

Population-based

Multicentric

Prospective

Study

of

Compassionate Second Line Taxane Treatment of 265 Patients with Metastatic Breast Cancer in Hungary. Proceedings of ASCO Annual Meeting 2003, 22:68. Komlósi V, Adleff V, Pap É, Réti A, Hitre E, Budai B, Kralovánszky J: Szerinhidroximetil transzferáz C1420T génpolimorfizmus vizsgálat colorectális daganatos betegek DNS mintáiban MGB-TaqMan próbás technikával. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság 6. Kongresszusa, Debrecen, 2004. Hitre E: Kemo-immunoterápiával elért hosszú távú túlélés metasztatikus emlőrák esetében. Roche Onkologiai Napok, Tihany, 2005.

103

Hitre E.: Kombinált kemo-immunoterápiával elért hosszú távú túlélés IV stádiumú emlőrák esetében. Membrántranszport Konferencia, Sümeg, 2005. Komlósi V, Adleff V, Pap É, Réti A, Hitre E, Budai B, Kralovánszky J: Szerinhidroximetil transzferáz C1420T génpolimorfizmus vizsgálat colorectális daganatos betegek DNS mintáiban MGB-TaqMan próbás technikával. PhD Tudományos Napok, 2005. Hitre E: A célzott biológiai terápia szerepe a távoli áttétes colorectalis carcinoma kezelésében. MAGYOT III. Kongresszusa, Budapest, 2006. Hitre E: A gyomor malignus betegségei. SE ÁOK III. évfolyam, 2006. Hitre E: Colorectalis daganatok. SE ÁOK III. évfolyam, 2006. Hitre E: Epehólyag-epeutak, a pancreas malignus daganatai. SE ÁOK III. évfolyam, 2006. Hitre E: Fej-nyak daganatok kemoterápiája. SE ÁOK III. évfolyam, 2006. Komlósi V, Budai B, Hitre E, Adleff V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: Effect of the folate cycle key enzymes, serine hydroxymethyltransferase (SHMT) in advances colorectal cancer. PhD Tudományos Napok, 2006. Komlósi V, Budai B, Hitre E, Adleff V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: The significance of the cytosolic serine hydroxymethyltransferase (SHMT) C1420T polymorphisms in the chemotherapy of metastatic colorectal cancer. EACR 19th Congress, Budapest, 2006.

104

11. ÖSSZEFOGLALÁS A colorectalis rákokat (CRC) tekintve Magyarország a daganatmortalitás terén az európai országok között a nők esetében az első, a férfiaknál pedig a második helyet foglalja el. Az alacsony penetranciájú génkombinációk, a „nyugati-életstílus” és a táplálkozás együt-tesen szerepet játszhat a sporadikus CRC patogenezisében. A timidilát szintáz (TS) gén ismert polimorfizmusairól leírták, hogy folát felvételtől függő módon módosítják az egyéni fogékonyságot a CRC-re. Vizsgálataink alapján úgy tűnik, hogy a TS két legjel-lemzőbb polimorfizmusa (5’-TSER és 3’TSUTR) befolyásolja a CRC fogékonyságot és a magyar populációban a TS heterozigóták kevésbé fogékonyak a CRC kialakulására. A CRC szakszerű kezelése számos orvosi szakma szoros együttműködését igényli. Az adjuváns kemoterápia célja az elsődleges sebészi rezekciót követően a reziduális daganatsejtek kiiktatása. A CRC-k adjuvans kemoterápiájában az 5-fluorouracil/leukovorin (5-FU/LV) kombináció az alapkezelés, melyet bolus vagy folyamatos infúziós formában alkalmaznak. Igazoltuk, hogy a folyamatos infúziós terápiához viszonyítva szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a relapsus rizikója a bolus kezelési mód esetében. Tanulmányunkban elsőként igazoltuk, hogy azok a csirasejtes TS genotípusok, melyekről kimutatták, hogy magas TS expressziót indukálnak szignifikánsan hosszabb betegségmentes és teljes túlélést prediktálnak az adjuváns 5-FU kezelést követően, mind az alacsony TS expresszióval összefüggésbe hozható TS genotípusok. Bizonyítást nyert, hogy az adjuváns 5-FU-alapú kemoterápiában részesülő CRC-s betegek csirasejtes TS polimorfizmus-kombinációja a túlélés független prognosztikai faktora. Metasztatikus CRC-s betegek kapcsán igazoltuk azt is, hogy a metiléntetrahidrofolát reduktáz gén polimorfizmusa (MTHFR C677T) az 5-FU-alapú kezelés esetében prognosztikai értékkel bír. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a metasztatikus CRC-s betegek tartós infúziós 5-FU kezelésében jelentősége van a farmakokinetikai vizsgálatoknak is. A dihidropirimidin dehidrogenáz aktivitás mellett a betegek szérum kreatinin szintje is befolyásolja az 5-FU kezelés hatékonyságát. A betegek genetikai háttere befolyásolja a kezelések hatásosságát és a betegek túlélési esélyeit. Szükség van tehát olyan farmakogenetikai módszerek kidolgozására, melyek lehetővé teszik a kezelések kimenetelének pontosabb előrejelzését és az egyénre szabott terápia kidolgozását.

105

SUMMARY Regarding the colorectal cancer (CRC) mortality among European countries Hungary is on the first place in case of women and the second in case of man. The combinations of low penetrancy genes, the ”western lifestyle” and the diet together may play role in the pathogenesis of sporadic CRCs. The known polymorphisms of the thymidylate synthase (TS) gene depending on the folate intake modify the personal susceptibilty to CRC. Based on our studies it seems that the two most characteristic polymorphisms of the TS (5’-TSER and 3’-TSUTR) influence the CRC susceptibilty and in the Hungarian population the TS heterozygtes are less susceptible for CRC development. The professional therapy of CRC needs collaboration of many medical specialities. The aim of the adjuvant chemotherapy after the primary surgical resection is to eradicate the residual tumour cells. In the adjuvant therapy of CRC the 5-fluorouracil/leucovorin (5FU/LV) combination is the ”gold standard”, which is applied as bolus treatment or continuous infusion. In case of bolus treatment the relapse risk has been proved to be significantly higher compared to the continuous infusional therapy. In our study it has been demonstrated for the first time that those germline TS genotypes, which had been shown to induce high TS expression predict significantly longer disease-free and overall survival compared to those combinations involving low TS expression. It has been confirmed that the combination of TS polimorphisms is an independent prognostic factor of survival of CRC patients receiving 5-FU-based adjuvant chemotherapy. In case of metastatic CRC patients it has been shown by us that the methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism (MTHFR C677T) has prognostic value for 5-FU-based treatment. The importance of pharmacokinetic investigations has been demonstrated in connection with the therapy of metastatic CRC patients with continuous infusional 5FU, and in addition the dihydropyrimidine dehydrogenase activity and the serum creatinine levels of patients control the efficacy of 5-FU therapy, as well. The genetic background of patients influences the efficacy of therapy and the chance for survival. Accordingly, there is a need to develop pharmacogenetic methods, which allow a more accurate prediction of therapy outcome and the planning of individually tailored treatments.

106