A D vitamin/D vitamin receptor rendszer szerepe a colorectalis daganatok, az osteoporosis és a 2-es típusú diabetes mellitus patomehanizmusában Doktori értekezés tézisei Dr. Speer Gábor Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, I.sz. Belgyógyászati Klinika Ph.D program: 8. sz. program témavezető: Dr. de Châtel Rudolf programvezető: Dr. Rosivall László
2001
Az utóbbi 5 évben a D vitamin szerepéről napvilágot látott publikációk alapján biztosan elmondható, hogy a D vitamin szerepe messze túlszárnyalja az oszteológia szakterületét. A kalcium és csontanyagcserén túl a legígéretesebb a tumorgenezist és tumorprogressziót gátló hatása, legújabban felmerült és legmeglepőbb szerepe pedig a diabetes mellitus patomehanizmusában lehet. Receptorának felfedezése újabb lehetőségeket adott működésének megértéséhez. Mindezeket a nem hiperkalcémizáló hatású D vitamin analógok kifejlesztése és a klinikum számára való elérhetősége támasztják alá. Mindezekből kiindulva vizsgáltuk munkatársaimmal a D vitamin/D vitamin receptor rendszer szerepét a colorectalis daganatok, az osteoporosis és a 2-es típusú diabetes mellitus patomehanizmusában. BEVEZETÉS - IRODALMI ÁTTEKINTÉS A D vitamin anyagcseréje A magasabb rendű szervezetekben szteránvázas vegyületek képezik három nagy hormoncsoport alapvegyületeit, ezek a kortikoidok, szexhormonok és a D-vitamin. A legújabb irodalom D vitamin helyett inkább D hormonról beszél. D2 vitaminhoz (ergokalciferol) táplálékkal (növények termelik), míg D3 vitaminhoz (kolekalciferol) a 7-dehidrokoleszterin biohasznosulásával jut a szervezet. A 7-dehidrokoleszterin a bőrben a nap ultraibolyasugárzásának hatására D3 previtaminná konvertálódik, majd D3 vitaminná izomerizálódik. Ezek után a májban folytatódik a metabolikus aktivációja: itt alakul ki a 25-hidroxikolekalciferol (25OHD3). A 25-hidroxiláció csak a D3 vitamin szinttől függ, így a 25(OH)D3 plazmaszintje tökéletes jelzője a D vitamin háztartás állapotának. A második lépés a D3 vitamin bioaktivációja, melyet a vese 1-alfa-hidroxiláz enzimje végez. Így alakul ki az aktív D vitamin metabolit, az 1,25-dihidroxi-kolekalciferol vagy kalcitriol (1,25(OH)2D3). Más szövetek is tartalmaznak 1-alfa-hidroxiláz enzimet, de ez az extrarenális 1,25(OH)2D3 vitaminforrás csak terhességben illetőleg bizonyos ritkább betegségekben (sarcoidosis, TBC, AIDS, candidiasis, granulomatosus betegségek, rheumatoid arthritis, silicosis, Hodgkin kór, T sejtes leukémia…) aktivizálódik, magas szérum 1,25(OH)2D3 és kalcium szintet eredményezve. Az 1,25(OH)2D3 lebontását a mitokondriális 24-hidroxiláz enzim végzi a végső termék a kalcitroik sav, mely biológiailag teljesen haszontalan. A D vitamin szintézisét végző enzimekkel ellentétben ez az enzim minden D vitaminfüggő (target) szövetben jelen van. A D vitamin és az összes hidroxilált metabolitja lipofil, jól kötődnek a plazma fehérjéihez és így is szállítódnak. A legfontosabb szállító a D vitamin kötő fehérje (DBP). Normális körülmények között az összes D vitamin és metabolit fehérjekötött állapotban van. 2
A DBP szintje májbetegségben, nephrosis szindrómában, malnutricióban csökken, terhességben és ösztrogén terápia során nő. Érdekesség, hogy eltérő DBP variánsok is léteznek és egyes variánsok előfordulásának összefüggését írták le 2-es típusú diabetes mellitus-szal (DM2T). Az albumin és a lipoproteinek is fontos D vitamin-kötő molekulák, azonban ezek affinitása sokkal kisebb. A D vitamin receptora A D vitamin receptora (VDR) a nukleáris szteroid/tiroid receptorcsalád tagja, mely a retinsav X receptorával (RXR) és számos más kofaktorral kapcsolódva a ligandkötés után a szabályozott gén ún. VDRE-régiójához kapcsolódva befolyásolja annak működését. A VDR gén a 12-es kromoszómán helyezkedik el. Szerkezete több részből épül fel, amelyek fontosak működésének megértéséhez. Ilyen az ún. ligand kötő domain (LBD), mely az 1,25(OH)2D3-at köti meg. A ligandkötés után a VDR/ligand komplex a sejtmagba transzlokálódik a nukleáris transzlokációs szignál (NLS) segítségével. A VDR-n az NLS hely pontmutációi D vitamin rezisztens rachitist okoznak, ugyanis a VDR/D vitamin komplex sejtmagba való transzlokációja sérül. Majd a VDR/D vitamin komplex az RXR-el képez heterodimert, amely konformációváltozást idéz elő a VDR-ben, ami szükséges az aktivációjához. Ha a VDR-nek az RXR-el kapcsolódó részei szenvednek pontmutációt, akkor is D vitamin rezisztencia alakul ki. A VDR-nek további fontos része a D vitamin-kötő régió (DBD), amely a D vitamin által szabályozott gének specifikus régióját ismeri fel és köt hozzá, egyeseket pozitívan, másokat negatívan regulálva. VDRE-t tartalmaz többek között a p21 (ez sejtciklust, azaz sejtproliferációt gátol), a fibronektin (ez a sejtadhézióban jelentős és a sejtek metasztázisképzésének fontos része). Az IL-12 és a PTH expresszióját regulálja negatívan a D vitamin, vagyis szintjeiket. Számos nukleáris transzkripciós koaktivátor és komponens kapcsolódik még a VDR/RXR/ligand komplexhez, amelyek szükségesek a regulált gén transzkripciójához. VDR-t tartalmaznak a bél, csont, vese, mellékpajzsmirigy, izom, emlő, placenta sejtjei, a pancreas béta setjtek, limfociták, keratinociták, a vérképzőszervi rendszer és a reproduktív szervek sejtjei és számos emberi daganatos sejtvonal. A D vitamin biológiai és klinikai hatása a tumorgenezisre A D vitaminnak a kalcium anyagcsere szabályozásán kívül számos más funkciója is van (immunmoduláns, sejtdifferenciációt indukál és sejtproliferációt/növekedést gátol, azaz antitumor hatású). A 80-as évek elején merült fel először a D vitaminnak és a kalciumnak colorectalis daganatokat, majd később más tumorokat megelőző szerepe. A kezdeti megfigyelések epidemiológiai jellegűek voltak. Régi ismeret, hogy a napsütéses órák 3
számával csökken az emlő- és prostatadaganatok előfordulása, illetve északról dél felé haladva csökken az ovariumcarcinoma gyakorisága. Mindebből a D vitamin protektív szerepére következtettek. Ezt követően kísérletes eredmények is születtek, amelyekben a D vitamin és metabolitjai gátolták többek között a normál és premalignus rectalis epithelium proliferációját illetve a colorectalis daganatsejtvonalak növekedését is. Ismert továbbá az is, hogy a D vitamin gátolja a kémiailag indukált emlőtumorok növekedését, és a hipoDvitaminozisban az emlő terminális ductusaiban epitheliális sejtproliferáció van. Humán kísérletes eredmények is születtek. 8 éves prospektív vizsgálatban 25620 embert vizsgálva és követve azt találták, hogy 3-szorosan csökkent azokban a colorectalis daganatok gyakorisága, akiknek a D vitamin szérum szintje 20 ng/ml felett volt. 1954 férfi 19 éves prospektív vizsgálatában 3,75 mikrogrammnál több D vitamin fogyasztása 50%-al redukálta a colorectalis carcinoma incidenciáját. Az ún. NHANES-1 vizsgálatban 5009 asszonyt követtek. A vizsgálatból egyértelműen kitűnt a napi D vitamin bevitel és az emlőrák csökkent rizikója közti összefüggés. A D vitamin biológiai és klinikai hatásai a csontszövetre A D vitamin legfőbb hatását a kalcium-anyagcserére fejti ki. Az 1,25(OH)2D3 a vékonybélben direkt módon segíti a kalcium felszívódását az enterocitákban. A D vitamin esszenciális faktora a csontképzésnek a csontmátrixfehérje-képzés és az ásványianyag beépítésén keresztül. A kalcium homeosztázisát a PTH és a D vitamin szoros egységben regulálja: Az 1,25(OH)2D3 gátolja a PTH szekrécióját és kontrollálja a mellékpajzsmirigy sejtek növekedését. A D vitamin hiánya parathyreoida hiperpláziát és szekunder hyperparathyreosist
is
okoz.
Egyes
feltételezések
szerint
a
VDR-nek
primer
hyperparathyreosist okozó parathyreoidea adenoma kialakulásának gátlásában is fontos szerepe lehet, emiatt újabban a VDR-t, mint a legújabb tumor szuppresszor gént említik. A D vitamin mérsékelt hiánya (12 ng/ml < szérum 25OHD3 < 20 ng/ml) osteoporosishoz (egyesek szerint osteoporomalaciához), kifejezett hiánya (szérum 25OHD3 < 12 ng/ml) osteomalaciához vezet. Elsősorban idős emberek osteoporosisa esetén, D vitaminnal a csonttörések száma jelentősen csökkenthető. D vitamin kezeléskor a csont ásványianyagtartalma nem nő számottevően, mégis a törések száma 30-70%-kal redukálódik. A D vitamin és a diabetes mellitus Állatkísérletek szerint D vitamin is szükséges az inzulinszekrécióhoz, ugyanis D vitaminhiányos egérben 48%-kal csökkent az inzulin szekréciója. Spontán diabeteses egerekben a duodenalis kalcium és D vitamin felszívódása csökkent és a plazma 1,25(OH)2D3 4
és DBP szintje alacsony. A VDR megtalálható a béta-sejtek felszínén is. Az 1-es típusú diabetes állatmodelljében (ún. NOD egér) az inzulitis (a szigetsejt pusztulás első fázisa) kialakulását
D
vitamin-kezelés
gátolja,
sőt
szigetsejt
transzplantáció
követően,
cyclsosporinnal együtt adva, a kilökődést is megelőzi. A D vitamin analógok hasonlóan jó eredménnyel voltak alkalmazhatóak a rejekció megelőzésében. A D vitamin és a kalcium inzulinszekrécióban betöltött szerepét humán megfigyelések is jól tükrözik. Azokon a földrajzi területeken, ahol a D vitamin ellátottság kevés a diabetes mellitus, a glukóz intolerancia és a metabolikus X szindróma előfordulása magasabb. Más megfigyelések szerint idős kórban D vitaminpótlással a 2. típusú diabetes mellitus (DM2T) kialakulását csökkenteni lehetett. A EURODIAB vizsgálat szerint gyermekkori D vitamin pótlással az 1. típusú diabetes mellitus (DM1T) prevalenciája csökken. Más vizsgálkatok pedig azt a következtetést vonták le, hogy a D hypovitaminosis rizikófaktora a glukóz intoleranciának. A D vitamin receptor gén polimorfizmusai A
humán genom szekvenciájának ismeretében egyre nagyobb jelentőséget
tulajdonítanak az egy báziscserén alapuló (ún. single nucleotide) polimorfizmusoknak (elterjedt néven: SNP). A polimorfizmusok olyan öröklődő, populációra jellemző géneltérések - pl. mutációk -, melyek önmagukban nem befolyásolják a gén működését, azonban összeadódva illetve más major genetikai abnormitásokhoz kapcsolódva már döntő jelentőséggel bírhatnak. „Jóindulatú” genetikai variációk, melyek az emberek egyediségét hozzák létre (?!). Az elmúlt években a VDR gén számos polimorfizmusát fedezték fel. Ezek közül elsőként az ún. BsmI polimorfizmus vált ismertté. A „BB” genotípust csökkent csont ásványianyag-tartalommal hozták összefüggésbe, bár ennek jelentősége vitatott. A „b” allél sporadikus
primer
hyperparathyreosisban
gyakori.
A
VDR
BsmI
polimorfizmusát
összefüggésbe hozták az inzulin szekrécióval is, és „BB” allélek esetén ezt csökkentnek találták DM1T esetében. A BsmI után a VDR más polimorfizmusai is ismertté váltak. D vitamin analógok A
D
vitamin
tehát
bizonyítottan
antiproliferációs,
immunszuppresszív,
sejdifferenciálódást serkentő hatású, azonban a kezelés alkalmazhatóságát a hiperkalcémizáló hatása gátolja. Ezért folynak világszerte kutatások a hiperkalcémiát nem vagy kevésbé okozó analóg vegyületek előállítására. Jelenleg a következő betegségek gyógyítására kaphatóak forgalomban illetőleg vannak klinkai fázisú kipróbálás alatt D vitamin analógok: osteoporosis, renalis osteodystrophia, psoriasis, osteomalacia, hipokalcémia, leukemia, emlő- és prostatadaganat, SLE, hyperparathyreosis, autoimmun graft kilőködés. 5
BEVEZETÉS A MUNKAHIPOTÉZISBE A colorectalis karcinogenezis lépcsői, résztvevői és lehetséges kapcsolatuk a D vitamin/VDR rendszerrel A colorectalis daganatok kialakulása összetett folyamat, amelyben a tumor szuppresszor gének genetikai abnormalitásai, a növekedési faktoroknak és receptoraiknak strukturális illetve regulatórikus változásai és a különböző protoonkogének aktivációi vezetnek a kontrollálatlan sejtproliferációhoz, létrehozva ezzel a neoplasztikus fenotípust. Ismert, hogy colorectalis daganatokban az erbB-2 onkogénnek és az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) expressziójának diagnosztikus és prognosztikus jelentősége van. A colorectalis daganat a nyugati világban a második helyen álló halálok. Az utóbbi években egyre több adat látott napvilágot, melyek szerint a colorectalis epithel sejtciklusának regulációjában a szteroid hormon receptorok is szerepet játszanak. Ezek közé tartozik a VDR mellett az ösztrogén receptora (ER) is. Számos daganatsejt, így pl. a colondaganat-sejtvonalak expresszálnak VDR-t. Úgy tűnik, hogy a D vitamin antiproliferációs és differenciációt indukáló hatása nem csak a VDR szintektől, hanem a VDR poszttranszlációs módosításától és más nukleáris faktorokkal való kölcsönhatásától is függ. Ezeket a folyamatokat mutációk, polimorfizmusok jelentősen befolyásolhatják, funkcionálisan különböző receptorfehérjéket eredményezve. Posztmenopauzában az ösztrogén-pótló kezelés 30-50%-kal csökkenti a colorectalis daganatok incidenciáját. Az ösztrogén fokozza a VDR expresszióját, így a D vitamin/VDR rendszer hatásait is befolyásolja. ER expressziót is leírtak colontumor sejtvonalakban és humán colorectalis daganatokban. Az ER is a nukleáris szteroid/tiroid receptorcsaládba tartozik. Az ER polimorfizmusai is számos betegségben jellemző megoszlást mutatnak. Az erbB-2 és az EGFR a tirozin-kináz receptorok családjába tartozik, foszforilációs kaszkádrendszert elindítva a sejtosztódás és a sejtdifferenciálódás szabályozásáért felelős gének expresszióját szabályozzák. Mindkettő expresszálódik a normális humán colon epitheliumban, túlzott expressziójuk azonban malignitást okozhat, sőt az erbB-2 fokozott expresszióját már a premalignus léziókban is megfigyelték. Az osteoporosis Az osteoporosis egész lakosságra vonatkoztatott incidenciája 9-15 % között van, ez a világ fejlett részét tekintve 75 millió beteget jelent. Az Amerikai Egyesült Államokban a posztmenopauzás nők 30%-a szenved osteoporosisban. Az osteoporosis kialakulásának és a csonttörések gyakoriságának veszélye a felnőttkorban elért csúcs csonttömegtől valamint a későbbi csontvesztés mértékétől függ. Az osteoporosis patogenezisében a genetikai faktorok a 6
BMD-t befolyásoló életmódbeli tényezőkkel együtt játszanak szerepet. Ilyen lehet a VDR gén BsmI polimorfizmusa is. A szakirodalom szerint a BMD-ben mért különbségek 70%-ért genetikai faktorok a felelősek. Az osteocalcin (OC) a csontban legnagyobb mennyiségben előforduló nem kollagén tipusú protein, a csont turnover markereként használható. A keringésben cirkuláló OC egy része nem teljesen karboxilált, ezt alulkarboxilált frakciónak is nevezik. A közelmúltban nagyszámú nő vizsgálatával igazolták, hogy a szérum alulkarboxiált osteocalcin szintjének a mérésével kombinálva a BMD meghatározást, tökéletesebben lehet következtetni a csípőtáji törések valószinüségére. A diabetes mellitus 2-es típusa és a D vitamin/VDR rendszer A 2-es típusú diabetes mellitus patomehanizmusában mind inzulinrezisztencia, mind az inzulin szekréció zavara szerepet játszik. A DM2T előfordulása obesitásban gyakoribb, különösen annak abdominális típusában. A DM2T prevalenciáját ismerve nem meglepő, hogy igen nagy erőfeszítések történnek olyan újabb faktorok kiderítésére, melyek a béta-sejtek inzulinszekréciós kapacitását befolyásolják. Irodalmi adatok alapján a Dvitamin/D vitamin receptor komplex – mint transzkripciós faktor – befolyásolhatja a béta-sejtek inzulin szekrécióját. D vitamin hiányban nő a DM2T előfordulása és D vitaminpótlással az inzulin szekrécióját növelni lehet. VDR expresszálódik a pancreas beta-sejtjein is, és a BsmI polimorfizmusa befolyásolja az 1-es típusú diabetes mellitusra való hajlamot. Az ösztrogén is befolyásolhatja DM2T-ben az inzulin szekréciót. Adatok szerint a DM2T előfordulása azon nőkben ritkább, akik ösztrogén-pótló kezelésben részesülnek. Hasonlóan, ovariektomizált egérben az ösztrogén pótlása csökkentette a diabetes kialakulását. CÉLKITŰZÉSEK 1. Vizsgálni kívántuk a VDR gén BsmI és az ER gén XbaI és PvuII polimorfizmusainak
eloszlását
colorectalis
tumorban
szenvedőkben.
Megvizsgáltuk a fenti genotípusok összefüggését az erbB-2, EGFR expressziójával - mint a colorectalis tumorgenesis prognosztikai és diagnosztikai faktoraival – valamint az UICC stádiumokkal. 2. Vizsgálni kívántuk továbbá a különböző genotípusok kombinációinak kapcsolatát a fenti onkogének expressziójával és az UICC stádiumokkal, valamint a prognózissal. A betegeket 5 évig követtük.
7
3. Vizsgálni kívántuk a VDR gén BsmI polimorfizmusának, illetőleg az ER gén XbaI és PvuII polimorfizmusainak eloszlását 2-es típusú diabetes-es és android típusú elhízott betegekben (akik CH-anyagcsere eltéréssel nem rendelkeztek). 4. Vizsgálni kivántuk a fenti génpolimorfizmusok kapcsolatát az éhomi és a posztprandiális (pp.) C-peptid szintekkel, mind az inzulinszekréció jellemzőivel. 5. Vizsgáltuk a VDR és ER gének fenti polimorfizmusai kombinációinak eloszlását és kapcsolatát az éhomi és pp. C-peptid szintekkel. 6. Vizsgálni kívántuk a VDR gén BsmI és az ER gén XbaI és PvuII polimorfizmusaianak eloszlását posztmenopauzás osteoporosis-os nőkben, illetve a polimorfizmusok kapcsolatát a csontok ásványianyag tartalmával. 7. Vizsgálni kívántuk a VDR és ER gének fenti genotípusai kombinációinak kapcsolatát a csont ásványianyag tartalommal. 8. Megvizsgáltuk a szérum karboxilált (az osteoblast aktivitás markere) és alulkarboxilált (a csonttörési rizikó prediktív markere) osteocalcin koncentrációk összefüggését a VDR gén BsmI genotípusával. 9. Mindezen vizsgálatokhoz kontroll személyeket is vizsgáltunk, azaz meghatároztuk a VDR gén BsmI és az ER gén XbaI és PvuII polimorfizmusaianak megoszlását a hazai populációban. BETEGEK és MÓDSZEREK Betegeink A VDR genotípusok daganatban betöltött szerepének vizsgálatához 56 sebészileg kezelt betegből, 1992-94 között eltávolított colorectalis adenocarcinoma került feldolgozásra. Az átlagos követési idő 60 hónap volt. A vizsgált 5 év alatt 16 beteg halt meg a betegségben. A diagnózistól számított átlagos túlélés 19 hónap volt. Kontroll csoportban is meghatároztuk a VDR és ER genotípusokat. A kontroll csoportba 112 korban illesztett egészséges személyt vontunk be, gastrointestinalis fájdalom hiánya, negatív családi anamnézis a colorectalis daganatokra és Weber negativítás alapján. Szövettani vizsgálat magából a tumorból illetőleg az ép környező szövetből is történt. Az osteoporosis vizsgálatában a VDR genotípusok, a BMD és a szérum OC/alulkarboxilált OC szintek meghatározását 187 posztmenopauzás nőn vizsgáltuk (életkoruk: 44-61 év), akik kórtörténetében nem szerepelt olyan betegség vagy gyógyszer szedése amely befolyásolja a csontanyagcserét.
8
A VDR polimorfizmusok diabetesben betöltött szerepének vizsgálatához 49, jó CHanyagcsere állapotban lévő (HbA1c<7%) DM2T-ben szenvedő beteget, 29, normal CHanyagcsere állapotú android típusú elhízott beteget (BMI>30 kg/m2, waist to hip ratio [WHR] >0.9 férfiakban, >0.8 nőkben) és 138 egészséges kontroll személyt választottunk be. A kontroll csoportban 75 gram OGTT-vel igazoltuk a normál glucose toleranciát. DNS izolálása A polimorfizmusok meghatározásához genomikus DNS-t izoláltunk a sebészileg eltávolított daganatokból és a mellette lévő normális mucosaból. A kontroll csoport DNS mintáit illetőleg az osteoporosis és diabetes mellitus vizsgálatához a DNS-t perifériás vér mononuclearis sejtfrakciójából Promega KIT segítségével izoláltuk. Genotipizálás, RFLP technikával A VDR gén BsmI és az ER gén XbaI és PvuII polimorf régiót tartalmazó szekvenciáját PCR technikával amplifikáltuk. Az amplifikált PCR terméket az ER polimorfizmusnál XbaI és PvuII, míg a VDR polimorfizmusok meghatározásához BsmI restrictios enzimmel emésztettük. Értékelés: X, P, B jellel jelöljük az allélt, ha az nem tartalmazza az XbaI, PvuII, BsmI restrictios enzim helyet – x, p, b ha tartalmazza azt, és az enzim emészt. Így (mivel minden génből apai és anyai is van) a genotípusok a következők: XX, Xx, xx és PP, Pp, pp illetőleg BB, Bb, bb. Immunhisztokémia és protein blotting Az erbB-2, EGFR fehérjék expresszóját immunhisztokémiai módszerekkel is meghatároztuk. Szérum CEA és CA19-9 meghatározás A szérum karcinoembrionális antigén (CEA) és CA19-9 meghatározása Abbott Imx technikával történt. Szérum C-peptid meghatározás Az inzulin szekréció meghatározására éhomi és posztprandiális (pp.) (30 gramm CH-t tartalmazó, diabeteszes beteg számára általánosan előírt, tesztétkezés elfogyasztása utáni) Cpeptid szinteket mértünk. A C-peptid szinteket a kereskedelmi forgalomban is kapható RIA kit-tel határoztuk meg. Szérum össz- és alulkarboxilált osteocalcin mérése OC mérést radioimmunoassay-vel indirekt módon határoztuk meg. Osteodenzitometria A BMD-t a gerinc lumbalis szakaszán (L2-4), a combnyakban és a radius harmadolópontjában mértük dual-foton emissziós röntgen abszorpciometriával (DEXA) 9
illetve single-foton abszorpciometriával (SPA) módszerrel. A mért értékekből z és t scoreokat számoltunk. A z score a mért BMD eltérése a kor és nem szerinti normális átlagértéktől, míg a t score a mért adatot hasonlítja a populáció legnagyobb, fiatalkori átlagértékéhez. Statisztikai analízis A daganatok és a VDR és ER genotípusok összefüggéseinek vizsgálatakor a polimorfizmusok eloszlásának és a különböző genotípusok és onkoprotein expressziók közti korrelációk meghatározásához Chi2 és Fisher exact tesztet használtunk. Diabeteszben a genotípus eloszlások összehasonlításához szintén Chi2 tesztet használtunk. Fischer vagy randomizációs teszttel értékeltünk abban az esetben, mikor erre volt szükség. Mivel a Cpeptid értékek eloszlása széles volt az adatokat log-transzformáltuk és az átlagértékeket student T teszt alkalmazásával értékeltük. A különböző genotípusokhoz tartozó C-peptid változásokat (posztprandiális – éhomi C-peptid szint) Mann-Whitney teszttel vizsgáltuk. Bonferroni korrekciót alkalmaztunk ahol szükség volt rá. Az adatokat korrigáltuk a BMI-re is. EREDMÉNYEK 1. Kimutattuk, hogy a VDR B allél jelenléte (azaz a BB és Bb genotípusaiban) esetén szignifikánsan magasabb az erbB-2 gén expressziója, szemben a bb genotípussal. Hasonlóan, az ER gén xx és Xx genotípusaiban szignifikánsan gyakoribb erbB-2 expressziót mutattunk ki ellentétben az XX genotípussal. Ezen felül az ER gén XX genotípusában szignifikánsan ritkább EGFR külső domain expressziót is találtunk. 2. Az ER gén XbaI és a VDR gén BsmI polimorfizmusának kombinációja esetén az XXbb genotípusú betegekben szignifikánsan kevésbé expresszálódott az erbB-2, szemben más genotípuskombinációkkal. Hasonlóan, az Xxbb és XxBb genotípusok esetén szignifikánsan gyakoribb EGFR expresszió volt látható eltérően más genotípusokkal. Az erbB-2, EGFR expressziója a daganatszövetben szignifikánsan magasabb volt, mint a normális mucosaban és korrelált a rossz prognózissal. 3. Az ER gén XbaI polimorfizmusát vizsgálva annak xx genotípusa gyakrabban, míg az XX ritkábban fordult elő a diabeteszes és az obes csoportokban, szemben a kontrollal. 4. A diabeteses és obes csoportokban a pp. C-peptid szintek szignifikánsan magasabbak voltak azon betegek között, akik BB genotípussal rendelkeztek, szemben a Bb genotípusuakkal, hasonlóan ebben a két csoportban a pp. C-peptid
10
szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az XX genotípusúak körében, ellentétben az Xx genotípussal rendelkezőkénél. 5. A BBXx allélkombináció ritkább volt a diabeteses betegek között mint a kontrolloknál. A BBXx genotípuskombináció szignifikáns összefüggést mutatott a magasabb pp. C-peptid szintekkel mind a két betegcsoportban, míg a BbXX kombinációban szignifikánsan alacsonyabb pp. C-peptid szinteket találtunk. A BbXX allélkombináció sokkal gyakoribb volt a diabeteses csoportban, mint a kontrollok között. 6. Kimutattuk, hogy a VDR gén BB allélpárjával rendelkező személyek lumbalis gerinc ásványianyag tartalma szignifikánsan alacsonyabb a többi genotípusban észlelhető értékekhez képest. Ugyanez nem volt kimutatható a combnyak és radius esetében. 7. Kombinálva a VDR és ER gén allétípusokat, találtunk olyan kombinációt (BPPXX), mely jelentősen alacsonyabb lumbalis és combnyak BMD-vel jár, mint önmagában a BB, azaz az ER polimorfizmus tovább erősíti a VDR BB negatív hatását a csonton. 8. Kimutattuk, hogy a szérum össz- és alulkarboxilált OC koncentrációja szignifikánsan magasabb a VDR BB genotípus esetében. 9. Meghatároztuk a magyar populáció VDR gén BsmI polimorfizmus eloszlását. A csonttömeg szempontjából kedvezőtlen BB genotípus 24,6%-os fordulása az egyik legmagasabb a világon. Meghatároztuk továbbá a magyar populáció ER gén XbaI és PvuII polimorfizmus eloszlását is. Ez a polimorfizmus a mi adataink szerint önmagában nem befolyásolja a csontok ásványianyag tartalmát. MEGBESZÉLÉS VDR (és ER) genotípusok a colorectalis daganatban Munkánk szerint a D vitamin/VDR és az ösztrogén/ER a sejtproliferációt részben az erbB-2 és EGFR expressziójának szabályozásával befolyásolhatja. Megfigyelésünk segíthet a colorectalis tumorgenesis patomehanizmusának jobb megértéséhez is. VDR genotípusok és az osteoporosis kapcsolata Az elmúlt néhány évben kapott adatok arra utalnak, hogy a BMD legalább részben genetikailag determinált. Az utóbbi időben a D vitamin receptor gén polimorfizmust tartják a meghatározó genetikai faktorok egyikének. Tanulmányunk során elsőként muttatunk ki különbséget az egyes VDR genotípusok szérum alulkarboxilált OC koncentrációiban. Ez 11
felveti annak lehetőségét, hogy a VDR genotípus hatással lehet az OC karboxilációjának mértékére is. Az alulkarboxilált OC magas szérum szintje viszont prediktív az idősebb nők csípőtáji törése szempontjából. VDR (és ER) genotípusok és a 2-es típusú diabetes mellitus Diabeteszes és obes betegek körében tett megfigyelésünk felveti a lehetőségét, hogy a különböző VDR és ER genotípusok az eltérő inzulin szekréciók által szerepet játszanak a 2-es típusú diabetesz mellitus patomehanizmusában. KÖVETKEZTETÉS Munkánkkal a D vitamin/VDR rendszer szerteágazó szerepét próbáltuk bizonyítani, mely meghaladja a korábban egyedülállóként vizsgált osteologiai szakterületet. Bizonyítani kivántuk, hogy a tumorgenezis egyes lépcsőiben, illetőleg az inzulinszekrécióban is szerepe lehet a D hormonnak és receptorának. Munkánkkal az irodalomban eddíg még nem ismert adatokkal szolgáltunk az általunk vizsgált betegségek patomehanizmusában ismerten szerepet játszó faktorok és a különböző VDR genotípusok közti kapcsolat kimutatásában. A klinikum számára való következtetésünk pedig abban áll, hogy a kalcium-, és a D vitamin-anyagcsere fiziológiás állapota fontos jelentőséggel bír a colorectalis daganatok kialakulásának megelőzésében illetőleg a 2-es típusú diabetes mellitus kezelésében. Úgy gondoljuk továbbá, hogy a szérum kalcium szint meghatározása legyen része a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek gondozásának.
12
„Belső világunk teljesen valóságos, és lehet, hogy valóságosabb a látható világnál. Fantáziának, vagy mesének nevezni mindazt, ami logikátlannak tűnik, a természet meg nem értéséről tanúskodik” Marc Chagall Köszönetnyilvánítás Tisztelt Kollégáim, Barátaim! Mindig is mesterekre, példaképekre volt szükségem. Szerencsém is volt, mert sosem kellett sokat keresni, az utamba kerültek. Azt, hogy az egyetemet nem hagytam abba és nem folytattam az ELTE esztétika szakán tanulmányaimat Cseh Károly dr. barátomnak és pártfogómnak köszönhettem, aki mellett harmadéves medikus korom óta dolgozom (még az akkori „rózsadombi” 3.sz. Belklinika Immunológia laboratóriumában diákkörösként) és azóta is számos ponton keresztezzük egymást és dolgozunk együtt továbbra is - a barátságon túl. Sulyok Margit dr. tanították meg először a sürgősségi betegellátás alaptehnikáit. Vele jutottam el még ötödévesen Amerikában, az Immunológus Világkongresszusra, ahol rájöttem, ha nem látok világot érdeklődő amatőr maradhatok csupán. Ezért köszönhető jórészt Neki, hogy ötödév után egy évre Heidelbergbe mentem a Német Rákkutató Központba dolgozni. Itt sem volt másképpen, rögtön megtaláltam az egyik legnagyobb gyakorlati molekuláris biológiai és biokémiai tapasztalattal és tudással bíró kutatót, a már évek óta ott dolgozó Török István dr.-t. Jóformán csak aludni jártam haza, folyamatosan dolgoztunk. A tudomány szentségében voltam, minden ennek volt alárendelve. Nemcsak az eredmény volt felejthetetlen – egy új tumor szuppresszor gén leírásában és karakterizálásában vettem részt – de az ott tanultakat a mai napig örzöm és a legtöbb tudásom erre alapszik. Majd egy év reménytelenség után Nagy Zsolt dr. segítségével ismerkedtem meg következő mesteremmel Lakatos Péter dr.-ral. Nagy Zsolt még Cseh Károly első diákkörös hallgatója volt, utána csatlakoztam én is az akkor még kétfős munkacsoporthoz. Hozzá az első amerikai út és a lilarüredi Immunológus Konferencia köt felejthetetlenül. Vele jelenleg is együtt dolgozom. Lakatos Péter segítségével jutottam a klinikára dolgozni, ami pedig deChâtel Rudolf professzor beleegyezése és bizalma nélkül lett volna lehetetlen. Korábban nem ismertem a klinikát, csak deChâtel professzor megjelenése és tisztelete miatt volt számomra a klinika elérhetetlen szentély. Lakatos Péterről hamar kiderült, hogy az én emberem: tudomány iránti elkötelezettsége, ugyanakkor a belgyógyászat iránti szeretete, humánuma azonnal feltűnt. Azt, 13
hogy azt csinálhattam, ami tetszik és a publikációkban sem volt hiány mind Neki köszönhetem. A labor, amit létrehozott nemzetközi színvonalú. Köszönöm Neki, hogy mindig és mindenben támogatott, előadásokkal bízott meg. Vele is felejthetetlen személyes élmények fűznek össze, hasonlóan a jelenlegi kis létszámú munkacsoport negyedik tagjával: Takács István dr.-ral. Tőle az életről tanultam sokat, a racionalitásom kialakításának fontos mestere Ő. Az egykori diákkörös csapat harmadik tagja Salamon Dániel dr. szintén a közelemben dolgozik. A segítségével és támogatásával jutottam el a regensburgi Egyetem egyik laborjába, ahol Tőle és Hans-Helmut Niller dr. segitségével az egyik legmagasabb színvonalú molekulárbiológiai módszert tanultam meg, a DNS szekvenálást. Igen jól sikerült a munka, szép eredménnyel tértem haza. Köszönöm Nekik. A klinikán hamar nyilvánvalóvá vált, hogy számos kitűnő orvos működik a házban. Sokukkal sikerült is együtt dolgozni nemcsak a betegellátásban, de a kutatásban is. Az is gyorsan kiderült, hogy a „Holló iskola” még mindig érezteti hatását a szakmán. Holló István professzort kezdetben távolról szemléltem, majd kezdtünk munkakapcsolatba is kerülni, azóta én is tisztelői közé tartozom. Tőle retorikát és elemzést tanultam. Egykori tanítványai révén magam is ízelitőt kaptam (koromnál fogva keveset bár) az egykori és sokat emlegetett Korányi-Magyar-Holló belgyógyász-iskola szelleméből. Ezek a tanítványok: Szűcs János professzor, Zséli János dr., Lakatos Péter dr., Kiss László dr., Horváth Csaba dr. és Szathmári Miklós dr. voltak. Kiss Lászlónak köszönöm barátságát, Zséli Jánostól filozófiát és Szathmári Miklóstól precizitást tanultam. Sajnálom, hogy az egykori csapatot a történelem mára ellenfelekké zilálta. Sokat kaptam Tamás Gyula professzortól is, akitől a kutatási eredmények klinikai gyakorlatba való bevezetését tanultam. Köszönöm, hogy tanított a diabetológiára és kiváló orvost fedeztem fel benne. Azóta közös és igen jó eredménnyel kecsegtető munkáink vannak. Más igen kiváló diabetológus is volt az életemben, Winkler Gábor dr., akivel számos közös munkánk született és akitől energikusságot tanultam és sok szeretetet kaptam, Kempler Péter dr., akitől koncepcionalitást tanultam, és Gerő László professzor, aki kiváló kutató, dr. Turbucz Piroska dr. és Bibók György dr., akik sok gyakorlati útmutatást adtak, hasonlóan Tóth Tamás dr.-hoz, akihez mindig fordulhattam. Varga Fatima dr.-tól az idős ember és a művészet szeretetét kaptam. Demeter Juditnak dr.nak köszönöm megbecsülését és sok segitségét. Szalay Ferenc professzortól a betegek nyelvén való szótértést tanultam meg. Köszönöm Mucsi István dr.-nak a közös (és eredményes) munkáinkat a laborban, lendületességét. Számomra a Gara Ákos dr. szobája a kardiológia szentélye volt és marad mindig is, köszönöm Neki állandó segítségét és továbbképzését. Sok gyakornoktársamtól tanultam a szakmát, így Kenéz András dr.-tól, 14
Fuszek Péter dr.-tól. Hálás vagyok Sződy Róbet dr. barátomnak is, akiben a kifogyhatatlan tenni akarást találtam meg. Végezetül nagyon köszönöm Rosivall László professzor állandó és önzetlen támogatását, bármikor fordulhattam hozzá, azonnal segített. Köszönöm dr. Szekanecz Zoltánnak az opponenciában való részvételét és állandó támogatását. Sok más kitűnő klinikus dolgozik a klinikán akikkel még nem kerültem szakmai kapcsolatba, várom nagyon ezt a lehetőséget is. Valóban nem sikerült volna a szabadidőmből a kutatásra fordítani semmit, ha feleségem, Maja, nem viseli el időigényes hobbimat és támogat ebben. Sosem felejtem el. Azt mondják, hogy akinek szép gyermekkora volt az meg van mentve. Ezt köszönöm szüleimnek és testvéremnek. Köszönöm rokonomnak Takács Endre dr.-nak állandó és őszinte érdeklődését előrehaladásom iránt. Katona Viktor, Ádám János, Szánti Iván, Nektek is köszönök mindent. Végül azt gondolom, hogy ez alatt a négy év alatt eltelt időben olyan eredmények születtek, melyek a D hormon és receptora szerepének új területeit világítják meg (talán az osteológiai fontosságát is túlszárnyalván), azonban részben annál fogva, hogy nem profiként és még számos metodikai tudás hiányában dolgoztam az eredmények nem tekinthetőek befejezettnek. Úgy érzem, hogy mintegy „feldobtuk a labdát” és azt másoknak kell majd „leütni”. Arra azonban büszke vagyok, hogy munkám minden egyes lépése itthon és saját erőből született, a betegágy mellett töltött napi munka mellett, és arra is, hogy sohasem a „pipetta” volt az első, hanem mindig a Beteg ember. Tisztelettel és Hálával Dr. Speer Gábor 2001 augusztusa
15
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó saját közlemények listája, absztraktok nélkül I.
Lakatos P., Nagy Z., Takács I., Speer G., Horváth C., Vargha P.: Az alfacalcidiol kalcium- és csontanyagcserére kifejtett hatásának felmérése. Ca és Csont 1: 15-19, 1998
II.
Nagy Z., Speer G., Kiss L., Horváth C., Takács I., Földes J., Bossányi A., Lakatos P.: Az alfacalcidol szerepe a glükortokoidkezelés okozta osteoporosis megelőzésében. Hároméves követéses vizsgálat. Ca és Csont 1 (S1): S20-S24, 1998
III.
Speer G., Cseh K., Bori Z., Dworak O., Vargha P., Salamon D., Winkler G., Nagy Z., Takács I., Kucsera M., Lakatos P.: A D vitamin receptor gén BsmI polimorfizmusa korrelál az erbB-2/HER-2 oncogen expressziójával humán rectalis daganatban. Magyar Belorvosi Archivum 52: 173-178, 1999
IV.
Kucsera M., Takács I., Nagy Z., Speer G., Bori Z., Demeter J., Horváth C., Kiss L., Lakatos P.: A D vitamin receptor génjének polimorfizmusa és a szérum alulkarboxilált osteocalcin szintjének összefüggése. Ca és Csont 2: 54-58, 1999
V.
Lakatos P., Nagy Z., Kiss L., Horváth C., Takács I., Földes J., Speer G., Bossányi A.: Prevention of corticosteroid induced osteoporosis by alfacalcidol. Zeitschrift für Rheumatologie 59:S1: I48-I52, 2000
VI.
IF: 0.464
G. Speer, O. Dworak, K. Cseh, Z. Bori, D. Salamon, I. Török, G. Winkler, P. Vargha, Z. Nagy, I. Takács, M. Kucsera, P. Lakatos: Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism correlates with the erbB-2/HER-2 expression in human rectal cancer. Oncology 58: 242-247, 2000
VII.
IF: 2.684
Speer G., Lakatos P.: D vitamin és kalcium szerepe a tumorgenezis gátlásában. Ca és Csont 3: 53-56, 2000
VIII.
Cseh K., Salamon F., Szekeres O., Speer G., Tóth J., Winkler G.: Az elhízás, az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú diabetes mellitus kapcsolatának molekuláris mechanizmusai. Lege Artis Medicinae 10: 776-784, 2000
IX.
G. Speer, K. Cseh, G. Winkler, P. Vargha, E. Braun, I. Takács, P. Lakatos: Vitamin D and estrogen receptor gene polymorphisms in type 2 diabetes mellitus and in android type obesity. European Journal of Endocrinology 144: 385-389, 2001 IF: 2.421
16
X.
Speer G., Cseh K., Fuszek P., Dworak O., Vargha P., Takács I., Nagy Z., Lakatos P.: Ösztrogén-, D-vitamin- és kalcium-érzékelő receptorok genotípusainak szerepe a colorectalis daganatok patogenezisében. Orvosi Hetilap 142: 947-951, 2001
XI.
G. Speer, K. Cseh, G. Winkler, I. Takács, I. Barna, Z. Nagy, P. Lakatos: Estrogen and vitamin D receptor genotypes and the expression of erbB-2 and EGF receptor in human rectal cancer. European Journal of Cancer 37: 1463-1468, 2001 IF: 2.537
XII.
Szathmári M., Speer G.: „Életmentő” osteomalacia. Magyar Belorvosi Archivum 54: 94-95, 2001
XIII.
Lakatos P., Speer G.: A D vitamin biológiai és klinikai hatásai. Lege Artis Medicinae (közlés alatt)
Az értekezéshez közvetlenül nem kapcsolódó saját közlemények listája, absztraktok nélkül Könyvrészlet: XIV.
K. Cseh, C. Keszthelyi, P. Szénási, G. Speer, Z. Nagy, D. Salamon, Á. Kovács: Increased tumor necrosis factor production of peripheral blood mononuclear cells in Crohn's disease. 22nd Congress of the International Society of Internal Medicine, International Proceedings Division, Monduzzi Editore 1994; 525-528.
Közlemények: XV.
Winkler G., Salamon F., Salamon D., Speer G., Tóth J., Telegdy A., Szilvási I., Karádi I., Cseh K., Romics L.: Emelkedett szérum tumor necrosis factor szint diabeteses microangiopathiában. Magyar Belorvosi Archivum 50: 657-661, 1997
XVI.
Winkler G., Dworak O., Salamon F., Salamon D., Speer G., Cseh K.: Increased interleukin-12 plasma concentrations in both, insulin-dependent and noninsulin-dependent diabetes mellitus. (research letter) Diabetologia 41: 488, 1998 IF: 4.98
XVII.
Winkler G., Salamon F., Salamon D., Speer G., Simon K., Cseh K.: Elevated serum TNF-a bioactivity can contribute to insulin resistance in type II (non-insulindependent) diabetes and in obesity. (research letter) Diabetologia 41: 860-861, 1998 IF: 4.986
XVIII.
Winkler G., Lakatos P., Nagy Z., Speer G., Salamon F., Szekeres O., Kovács M., Cseh K.: Elevated serum tumor necrosis factor-a and endothelin 1 levels correlate
17
with increased C-peptide concentration in android type obesity. (research letter) Diabetes Care 21: 1778-1779, 1998 XIX.
IF: 4.180
G. Winkler, F. Salamon, G. Harmos, D. Salamon, G. Speer, O. Szekeres, P. Hajós, M. Kovács, K. Simon, K. Cseh: Elevated serum tumor necrosis factor-alpha concentrations and bioactivity in type Type 2 diabetics patients with android type obesity. Diabetes Research and Clinical Practice 42: 169-174, 1998
XX.
IF: 0.590
G. Winkler, P. Lakatos, F. Salamon, Z. Nagy, G. Speer, M. Kovács, G. Harmos, O. Dworak, K. Cseh: Elevated serum TNF-a level as a link between endothelial dysfunction and insulin resistance in normotensive obese patients. Diabetic Medicine 16: 207-211, 1999
XXI.
IF: 2.170
Winkler G., Lakatos P., Salamon F., Speer G., Baranyi É., Melczer Z., Cseh K.: Contribution of tumor necrosis factor (TNF)-a in insulin resistance in patients with android type obesity. (research letter) Diabetes Care 22: 870, 1999
XXII.
IF: 5.076
Török, D. Herrmann-Horle, I. Kiss, G. Tick, G. Speer, R. Schmitt, BM. Mechler: Down-regulation of RpS21, a putative translation initiation factor interacting with P40, produces viable minute imagos and larval lethality with overgrown hematopoietic organs and imaginal discs. Molecular and Cellular Biology 19: 23082321, 1999
XXIII.
IF: 9.866
Takács I., Bajnok É., Nagy Z., Speer G., Bori Z., Kucsera M., Horváth C., Kiss L., Lakatos P.: Az interleukin-1 receptor antagonista protein génjének polimorfizmusa és a csontásványianyag-tartalom összefüggése postmenopausás nőknél. Magyar Belorvosi Archivum 52: 169-172, 1999
XXIV.
Winkler G., Salamon F., Szekeres O., Braun E., Bernát I., Speer G., Kovács M., Simon K., Cseh K.: A szérum tumor necrosis faktor-α tartalom android típusú elhízottakon és változása testsúlycsökkenést követően (előzetes megfigyelések). Diabetologia Hungarica 8:29-34, 2000
XXV.
Nagy Z., Speer G., Cseh K., Mohari K., Jánoki G., Takács I., Horváth C., Földes J., Lakatos P.: Tumor necrosis faktor alfa termelés és csont ásványianyag tartalom hyperthyreosisban. Ca és Csont 3: 11-15, 2000
XXVI.
P. Lakatos, J. Földes, Z. Nagy, I. Takács, G. Speer, C. Horváth, S. Mohan, DJ. Baylink, PH. Stern: Serum IGF-I, IGF binding proteins and bone mineral content in hyperthyroidism. Thyroid 10: 417-423, 2000
18
IF: 1.899
XXVII.
É. Bajnok, I. Takács, Vargha P, G. Speer, Z. Nagy, P. Lakatos: Lack of
association between IL-1ra gene polymorphism and bone mineral density in Hungarian postmenopausal women. Bone 27: 559-562, 2000 XXVIII.
IF: 3.961
Winkler G., Pogátsa G., Speer G., Cseh K.: A sulfanylurea-receptorstruktúrák
és szerepük a differenciált sulfanylurea kezelésben. Diabetologia Hungarica 8: 157166, 2000 XXIX.
G. Speer, K. Cseh, I. Mucsi, I. Takács, O. Dworak, G. Winkler, R. Sződy, A. Tislér, P. Lakatos: Calcium-sensing receptor A986S polymorphism in human rectal cancer. International Journal of Colorectal Diseases (közlés alatt)
Kumulatív impakt faktor absztraktok nélkül: Kumulatív impakt faktor absztraktokkal:
19
47. 004 123. 847
IF.: 1.184
VITAMIN D/VITAMIN D RECEPTOR SYSTEM AND COLORECTAL CANCER Introduction Estrogen replacement therapy has been shown to decrease the incidence of colorectal cancer in postmenopausal women by 30-50 %. Estrogen receptor (ER) has been demonstrated in colon tumor cell lines, as well as in human colorectal cancer. Estrogens can upregulate vitamin D receptor (VDR) expression thus influencing the effects of vitamin D3. Both estrogen and vitamin D3 regulate calcium metabolism, cellular proliferation and differentiation. Colorectal tumor cells and human colorectal epithelial cells also express VDR. In vitro and in vivo studies have shown decreased colorectal cancer incidence and epithelial cell proliferation after treatment with vitamin D3. Some reports have raised the possibility that the ligands of the steroid/thyroid receptor family (such as 17β-estradiol, vitamin D3, progesterone and retinoic acid) may regulate cellular proliferation by increasing the transcription rate of erbB-2 and epidermal growth factor receptor (EGFR). ErbB-2 and EGFR belong to the tyrosine kinase receptor family and regulate the expression of genes involved in cellular proliferation and differentiation leading to the development of tumors such as colorectal cancer. The diagnostic and prognostic significance of the erbB-2 and EGFR expression has been repeatedly proposed in colorectal cancer. The erbB-2 gene has an estrogen responsive element while the EGFR gene contains a vitamin D responsive element (VDRE). In our study, we investigated the relationship between VDR and ER genotypes and the expression of erbB-2 and EGFR in human rectal cancer. Patients In our study, 56 patients with rectal cancer were studied. All patients underwent surgery. The mean follow-up period was 48 months. During the follow up period, 16 patients died. The mean survival period from the time of diagnosis was 19 months. In the control group, ER and VDR genotypes of 112 age-matched healthy subjects were determined. The enrolment criteria in the control group included the lack of gastrointestinal pain, family history for colorectal cancer and detection of blood in stool as well as no pathological finding on abdominal ultrasound.
20
Analysis of the restriction site polymorphisms of the VDR and ER genes Genomic DNA was isolated from peripheral blood. The BsmI polymorphic site of the VDR gene as well as the XbaI and PvuII polymorphic regions of the ER gene were amplified by PCR technique. The amplified PCR product was digested by using BsmI restriction enzyme The BsmI restriction site is missing in the B allele and is present in the b allele. For the ER gene the PCR product was subsequently digested by using XbaI and PvuII restriction enzymes. The lack of the XbaI/PvuII restriction sites correspond to the X/P alleles and they are present in the x/p alleles. Immunohistochemistry and protein blotting The expression of erbB-2 and EGFR was examined. Statistical analysis Analysis of relations among clinical data, ER and VDR polymorphisms, oncoprotein expression and coexpression was performed by using Chi-square and Yates corrected Chisquare test if it was needed. Results In genotype xx or Xx, significantly increased erbB-2 and EGFR expression was found in contrast to patients with XX alleles. Also the overexpression of erbB-2 was significantly more frequent in the presence of the B allele of the VDR gene. The XXbb allelic combination of ER/VDR genes was associated with a significantly lower erbB-2 expression, whereas in the other genotypes significantly higher oncogene expression was seen. Significant differences were found in oncoprotein expression pattern of normal and tumor tissue. Discussion In our present study, we have demonstrated an association between the XbaI polymorphism of the ER gene and the overexpression of two cooperative members of the tyrosine kinase receptor family, the erbB-2 and EGFR external domain in human colorectal cancer. The expression of erbB-2 was more pronounced also in the presence of the B allele of the VDR gene. Moreover, combinations of ER/VDR genotypes containing x and B alleles markedly influenced the expression of erbB-2. The cytoplasmatic overexpression of erbB-2 is 21
considered to be a prognostic factor in colorectal cancer, while EGFR plays an important role in the development of hyperproliferative state of colonic mucosa and colon carcinogenesis. Estrogen-ER and vitamin D-VDR systems may play an important role in the pathogenetic processes leading to the development of colorectal cancer. A recent metaanalysis shows that estrogen replacement therapy decreases the risk of colorectal cancer in postmenopausal women, however, some contradictory results also exist. Increased dietary calcium and vitamin D3 intakes are correlated with decreased epithelial cell proliferation in some tumors such as colorectal cancer. In animal models, carcinogen-induced tumor size is decreased after dietary treatment with calcium and vitamin D3. In addition, estrogens upregulate VDR, thus influencing the effect of vitamin D3. Short-term estrogen therapy in rats after ovariectomy also corrects the level and activity of VDR, which might contribute to its protective effect against colorectal cancer. A possible site of interaction between estrogen and vitamin D systems could be the aromatase gene possessing a VDRE in its promoter. The aromatase enzyme directs the peripheral conversion of androgens to estrogen. Several indirect observations have already been made about the mutual interaction of the nuclear steroid/thyroid receptor family and the tyrosine kinase receptor superfamily. 17βestradiol and vitamin D3 may regulate cellular proliferation by increasing the transcription rate of erbB-2 and EGFR. Polymorphisms of the ER and VDR may be associated with altered receptor expression and function. Polymorphisms of the ER and VDR genes have been suggested to be associated with the occurrence of several disorders, including breast cancer. Our present findings may add to the list of disorders related to the polymorphisms of the ER and VDR genes. Potential interactions between ER and VDR genes have been suggested by others, as well. In conclusion, our data raise the possibility that ER and VDR gene polymorphisms accompanied with variable oncogene expression might be part of the pathogenetic processes resulting in the development of colorectal cancer. VITAMIN D/VDR SYSTEM AND OSTEOPOROSIS Introduction Bone mass is under strong genetic control and twin studies suggest that up to 70% of the variability in bone mineral density (BMD) can be explained by genetic factors. The VDR gene is a candidate gene for BMD and osteoporosis, and has been investigated in a plethora of 22
populations, giving rise to conflicting data. Since Morrison et al. first revealed that the VDR genotypes, defined by BsmI, could account fot up to 75% of the variation in peak bone mass, other studies refuting an association with BMD have been presented. VDR acts as a transcriptional factor and regulates the activity of a number of genes, such as osteocalcin (OC) gene. The increase of serum undercarboxylated OC has been shown to be a predictive factor for the risk of osteoporotic fractures. In our study, comprising postmenopausal women, we have investigated the possible association of VDR BsmI polymorphism with BMD and circulating levels of osteocalcin (OC). Subjects Hundred-eighty-seven Caucasian postmenopausal women were investigated. None of the patients was related, had any disease, or was taking medications known to affect bone metabolism. Biochemical analysis Undercarboxylated osteocalcin was assayed indirectly by radioimmunoassay before and after the addition of hydroxiapatite adsorbent. Techniques for estimating BMD BMD of the lumbar spine, femoral neck and radius midshaft was measured by DEXA and SPA, respectively. Results Lumbar BMD of women with BB genotype was significantly lower than in case of other genotypes (p<0.05). There was no difference in femoral neck and radius BMD among genotypes. Serum total and undercaroxylated OC of subjects with BB alleles were significantly higher (total: BB = 6.8+0.5 ng/ml, Bb = 3.9+0.3 ng/ml, bb = 3.7+0.4 ng/ml; p<0.05; undercarboxylated: BB = 4.3+0.4 ng/ml, Bb = 2.1+0.3 ng/ml, bb = 1.8+0.4 ng/ml; p<0.05). There was no correlation between BMD and serum total or undercarboxylated OC.
23
Discussion In conclusion, we show that VDR gene polymorphism, defined by BsmI, is related to lumbar spine BMD and to circulating levels of osteocalcin in postmenopausal women. Our results indicate that VDR genotype may have an impact not only on circulating total but undercarboxylated OC, and thus on the risk of bone fractures, as well. VITAMIN D/VDR SYSTEM AND TYPE 2 DIABETES MELLITUS Introduction In the pathogenesis of type 2 diabetes, both insulin resistance and altered insulin secretion may be present. The prevalence of type 2 diabetes is increased in obesity, especially of the abdominal type. There is an ongoing effort to identify new factors, which may influence the secretory capacity of beta-cells. Vitamin D and its receptor complex - as a transcription factor - may play a regulatory role in the insulin secretion of the beta-cell. Vitamin D deficiency enhances the prevalence of type 2 diabetes, and the replacement of vitamin D may increase the secretion of insulin. Vitamin D receptor (VDR) is a member of the steroid/thyroid hormone receptor family. VDR is expressed in pancreatic beta-cells, and the BsmI restriction enzyme polymorphism of the gene influences susceptibility to type 1 diabetes mellitus. Estrogen may also influence the insulin secretion in type 2 diabetes. The prevalence of type 2 diabetes is significantly lower among patients with estrogen replacement therapy. Similarly, in ovariectomized mice, estrogen replacement can also prevent the onset of diabetes. The estrogen receptor (ER) is also a member of the nuclear steroid/thyroid receptor family. The XbaI and PvuII restriction enzyme polymorphisms of the ER gene has been suggested to be involved in the pathogenesis of different diseases. Estrogen may increase the expression of the VDR gene. Certain allelic combinations of ER and VDR genes have been shown to influence bone mineral density more markedly than ER or VDR genotypes alone. In our work, we studied the BsmI polymorphism of the VDR gene, as well as the XbaI and PvuII polymorphisms of the ER gene in patients with type 2 diabetes, android type obesity without disturbances of the carbohydrate metabolism, and in healthy controls. We have also investigated the relationship between these genetic polymorphisms and serum fasting and 1 hour postprandial (pp.) C-peptide levels.
24
Subjects Forty-nine Caucasian patients with type 2 diabetes in acceptable (HbA1c<7%) metabolic state, 29 patients with android type obesity (BMI>30 kg/m2, waist to hip ratio [WHR] >0.9 in men, >0.8 in women) with normal carbohydrate metabolism, and 138 healthy subjects. Serum C-peptide measurement Insulin secretion was evaluated by the determination of serum fasting and pp. (1 hour after the consumption of a 30 gram carbohydrate-containing standard test-meal C-peptide values. C-peptide levels were measured post test feeding. C-peptide was measured by a commercial RIA kit. Statistical analysis The comparison of genotype distributions was carried out by using Chi2 test. Fischer’s or randomization tests were applied where it was appropriate. Because of the skewed distribution of the C-peptide baseline values, the data were log-transformed and the mean values were compared by student T test. The relation of genotypes to C-peptide changes (postprandial - fasting serum C-peptide levels) was evaluated by Mann-Whitney test. Bonferroni corrections have been performed
where it was appropriate. Data have been
adjusted for BMI. Results Postprandial serum C-peptide levels of BB genotypes were significantly higher in the diabetes and obese groups (6.18±5.09 ng/ml) compared to other genotypes (2.71±2.45 vs. 1.72±1.97 ng/ml, respectively, p=0.05). Among patients with type 2 diabetes and obese subjects, the XX allelic variant of the ER gene was more frequent (p=0.00015). Postprandial C-peptide levels of subjects exhibiting XX genotype were significantly lower compared to those with Xx (1.67±2.16 vs. 3.8±3.72 ng/ml, p=0.021). The BBXx allelic combination of the VDR/ER receptor genes was less frequent in diabetic patients than in healthy subjects or in obese patients. The BBXx genotype was associated with significantly elevated postprandial C-peptide levels in all subjects compared to other combinations (9.65±3.14 vs. 1.35±2.82 ng/ml, p=0.003). 25
Discussion We have demonstrated that the BB genotype of the VDR gene is associated with higher postprandial (pp.) C-peptide levels. We have also found an ER genotype, XX, which is associated with lower basal and pp. C-peptide secretion in contrast to those with Xx. The ER genotype distribution as well as C-peptide secretion of obese subjects were similar to that of type 2 diabetic patients. Type 2 diabetes is more prevalent among obese people, so our genetic findings are consistent with this observation. VDR and ER genotypes could be predisponing factors that might contribute to the pathogenetic processes leading to type 2 diabetes in android type obesity. Our data suggests an allelic combination of the VDR and ER genes (BBXx genotype) in type 2 diabetic patients which is associated with higher pp. C-peptide levels as compared to other combinations. The frequency of this genotype was less prevalent among diabetic patients. A potential interaction between VDR and ER genes in bone metabolism has already been suggested by other investigators. A possible site of the interaction between estrogen and vitamin D system can be the aromatase gene possessing a vitamin D response element in its promoter region. The aromatase enzyme directs the peripheral conversions of androgens to estrogens. In type 2 diabetes, aromatase activity is decreased. Our observations in diabetic and obese people raise the possibility that certain VDR and ER genotypes associated with altered insulin secretion might contribute to the development of type 2 diabetes.
26
