SVK České Budějovice
С
Z-
^4448494^48484^4540026
_
2 6 8 1 0 5 8 4 7 /7
Obsah
Strana
1.
Uvod
8
1.1.
O becný úvod
1.2.
E ikosanoidy
10
1.2.1.
E ikosanoidový m e tab o lism u s
10
1.2.1.1.
Fosfolipázy
1 0 -1 1
1.2.1.2.
C yklooxygenáza
1 1 -1 2
1.2.1.3.
Lipoxygenázy
1 2 -1 4
1.2.1.4.
B iologické účinky lip oxygenázových m etabolitů kyse lin y arachidonové
1 5 -1 7
1.3.
P soriasis vu lgaris
17
1.3.1.
H istorické poznám ky a prevalence choroby
17
1 3.2.
P atogenetické m e ch an ism y
1 7 -1 8
1.3.3.
E ikosanoidy a psoriáza
1 8 -1 9
1.4.
Z p ra cová n í hum orálně pře ne se né inform ace buňkou
1.4.1.
E ikosanoidová vazeb n á m ísta
2 0 -2 2
1.4.2.
E fektorová aktivita
2 2 -2 3
8 -9
19
1 DERMATOLOGIE
1.4.2.1.
S ystém polyfo sfoino sitid o vý
1.4.2.2.
S ystém a d e n ylá tcyklázo vý
1.5.
H la vn í pozn a tky úvodní kapitoly
2 4 -2 5
2.
C íl p rá c e
2 6 -2 7
3.
M a te riá l a m e to d ik a
28
3.1.
M ateriál
28
3.1.1.
K eratin o cyty
28
3.1.1.1.
N orm ální ke ra tino cyty
28
3.1.1.2.
K eratin o cyty nem ocných s psoriázou
3.1.1.3.
K eratin o cyty pacientů s atopickým e kzém em
29
3.1.2.
Lab o ra to rn í chem ikálie
29
3.1.2.1.
F osfátový p ufr bez kalciových a m ag né zio vých iontů
3.1.2.2.
F o sfáto vý p ufr s kalciovým i a m agnéziovým i ionty
30
3.1.2.3.
R oztok tryp sin u
30
3.1.2.4.
K ultivační m édium pro keratinocyty
3.1.2.5.
Inkubační m édium
2
2З -2 4 24
2 8 -2 9
2 9 -3 0
3 0 -3 1 31
D E R M A T O L O G IE
3 . 1 -2 . 6 . 3.1.2.7. 3.1.2.8.
T R IS -p u fr U gandy Další použité a dosud nejm enované
31 31 _ 3 2 32
látky 3.2.
M etodika
33
3.2.1.
Z pracování kůže
3.2.2.
P ředběžné pokusy
35
3.2.2.1.
K rátkodobá a dlouhodobá kultivace buněk
35
3.2.2.2.
C harakterizace kultivovaných b u n ě k
36
3.2.2.3.
V liv tep lo ty na va zbu kyse lin y 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na keratinocyty
37
3.2.2.4.
Vliv trypsinu na vazbu kyseliny
3 3 -3 5
3 7 -3 8
1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na keratinocyty 3.2.2.5.
V azba kyseliny
38
1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na keratinocyty v suspenzi v závislosti na počtu buněk 3.2.3. 3.2.3.1.
V azebné studie s radioligandem Vazba 1 2(S )-p H ]_ h yd ro xye iko sa te tra e n o vé kyseliny v je d n o vrste vn é kultuře
39 3 9 -4 0
D E R M A T O L O G IE
3.2.3.2.
R ychlost n avázání kyseliny 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na vazeb n é m ísto keratinocytů
3.2.3.3.
R everzibilita va zby kyseliny 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na va ze b n é m ísto keratinocytů
3.2.3.4.
S atu ra ční iso term y
42
3.2.3.5.
K om petiční křivky
4 2 -4 3
3.2.3.6.
V a^ba ligandu na keratinocyty v b uněčné suspenzi
4 3 -4 4
3.2.4.
M odulace va zby kyse lin y ■ ^(S J-p H J-h y-d ro xye iko sa te tra e n o vé na ke ra tinocyty
44
3.2.4.1.
V liv b uněčné hustoty na vazbu kyseliny ^ (S J -p H J -h y d ro x y e ik o s a te tra e n o v é
4 4 -4 5
3.2.4.2.
R edukce počtu va zebných m íst kyseliny ■ ^(S J -p H j-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na keratinocytech
4 5 -4 6
3.2.4.3.
P reinkubace buněk interferonem gam a s následnou vazbou kyseliny ■ ^(S J-pH J-hydroxyeikosatetraenové
3.2.5.
M ěření proliferace keratinocytů
3.2.6
Z ko ušky a dhezivity
3.2.6.1.
P ovlečení dna otvorů v destičkách ko la ge n em G
4
46
4 6 -4 7
D E R M A T O L O G IE
A dheze keratinocytů na kolagen G
4 8 -4 9
a plastickou hm otu In te rn a liz a c e v a z e b n ý c h m íst s k y s e lin o u
4 9 -5 0
12(S)-pH]-hydroxyeikosatetraenovou A nalýza získaných d a t
50
V ý s le d k y
51
C harakterizace kultivovaných buněk
51
V ýzkum y va zby ligandu na re ce pto r
51
Předběžné pokusy
51
V liv teploty na vazbu kyse lin y 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na keratinocyty V liv trypsinu na vazbu kyse lin y
51 - 5 2
5 2 -5 3
1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na ke ra -tin o cyty Vazba kyseliny
53
1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé na n orm álni kera tino cyty v suspenzi v závislosti na počtu buněk C harakterizace vazebného m ísta pro 5 3 -5 4 yselinu 12 (S )-h yd ro xye iko sa te tra e n o vo u na keratinocytech
? ľ í í lost navázá n í kyseliny
54
2 (S )-[3H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé n a keratinocyty
5
D E R M A T O L O G IE
4.2.2.2.
R everzibilita va zby kyseliny 12 (S )-[3H ]-h yd ro e iko sa te tra e n o vé na ke ra tinocyty
4.2.2.3.
S atu ra ční iso term y
5 4 -5 5
4 .2 .2 .3 .1. S atu ra ční iso term y norm álních keratinocytů
5 5 -5 6
4 .2 .2 .3 .2. S atu ra ční isoterm y psoriatických keratinocytů
5 6 -5 7
4 .2 .2 .3 .3. S atu ra ční isoterm y keratinocytů z kůže nem ocných s a to p ickým ekzém em
5 7 -5 8
4.2.2.4.
K om petiční křivky inhibice vazby kyseliny ^ ( S H ^ - h y d r o x y e ik o s a te tr a e n o v é na norm álních keratinocytech
5 8 -5 9
4.2.2.5.
V azb a ligandu na norm ální ke ra tino cyty v buněčné suspenzi
59
4.2.3.
M odulace va zby kyse lin y ^ (S J -p H J -h y d ro x y e ik o s a te tra e n o v é
59
4.2.3.1.
V liv b uněčné husto ty na vazbu kyseliny 1 2 (S )-p H ]-h y d ro x y e ik o s a te tra e n o v é
4.2.3.2.
R edukce počtu va zebných m íst kyseliny 12 (S )-h y d ro xye iko sa te tra e n o vé
4.2.3.3.
V liv in terferonu gam a na vazbu kyseliny 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vé
5 9 -6 0
60-6 2
D E R M A T O L O G IE
4.3.
V liv kyseliny . . 12 (S )-h yd roxye iko sa te tra e no ve
62
63
na růst keratinocytů
4.4. 4.5.
5.
Zkoušky a dhezivity
63
Internalizace va zebných m íst s kyselinou 1 2 (S )-p H ]-h yd ro xye iko sa te tra e n o vo u
6 3 -6 4
D is k u z e
6 5 -6 7
5.1.
M etodika a p ro blem atika va zebných studií 6 7 - 6 8 s radioaktivně znače n ým ligandem
5.2.
Cíle provedené studie
5.2.1.
Identifikace va zebných m íst pro 6 9 -7 0 12(S )-h yd roxye iko sa te tra e no vo u kyselinu na norm álních lidských keratinocytech
5.2.2.
M odulace vazby kyseliny
69
7 0 -7 3
12(S )-h yd roxye iko sa te tra e no vé různým i faktory 5.2.3.
6.
Role 12 -h yd ro xye iko sa te tra e n o vé kyse lin y 7 3 - 7 7 za patologických podm ínek S h rn u tí
7 8 _ 79
7
