Stavy patologické bolesti Úloha modulace míšního synaptického přenosu

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie živočichů

Stavy patologické bolesti Úloha modulace míšního synaptického přenosu Bc. Vladimír Nerandžič Praha 2010

Školitel: MUDr. Jiří Paleček, CSc.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci s názvem Úloha modulace míšního synaptického přenosu vypracoval samostatně a použil k tomu informační prameny, které uvádím v seznamu přiloženém k diplomové práci. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů. Bc. Vladimír Nerandžič

-2-

Poděkování Rád bych poděkoval svému školiteli MUDr. Jiřímu Palečkovi za odborné vedení, konzultace, pomoc a vstřícnost, podnětné připomínky a v neposlední řadě za jeho trpělivost. Děkuji také Mgr. Dianě Špicarové za uvedení do tajů laboratorní práce a odbornou pomoc při provádění pokusů.

-3-

Abstrakt Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci. Studie z poslední doby naznačují velký význam míšních presynaptických TRPV1 (transient receptor potential vanilloid) receptorů, které na periferii působí jako integrátory nociceptivních podnětů. Mechanismy jejich aktivace a jejich vliv na modulaci synaptického přenosu ale nejsou dosud zcela známy. Předchozí studie také ukázaly vliv řady mediátorů zánětu a cytokinů na funkci TRPV1 receptorů. Cílem naší studie bylo proto ukázat, jak se mění aktivace presynaptických TRPV1 receptorů v míše po aplikaci endogenního agonisty Noleoyldopaminu s cytokinemTNFα

(OLDA) a

u jaký

modelu je

periferní

účinek

neuropatie,

prekurzoru

po

inkubaci

anandamidu

N-

acylfosfatidylethanolaminu (NAPE). V experimentech byly snímány miniaturní excitační postsynaptické proudy (mEPSC) na neuronech akutních míšních řezů metodou patch clamp. V první sérii experimentů byla testována citlivost na aplikaci endogenního agonisty OLDA 5 dnů po navození modelu periferní neuropatie. Aplikace již nízké koncentrace OLDA (0,2 μM) výrazně zvýšila frekvenci mEPSC na 250 % kontrolní hodnoty, na rozdíl od snímání u kontrolních experimentů kde je ke zvýšení potřeba vysoké koncentrace OLDA (10 μM). Inkubace řezů s TNFα ve druhé řadě pokusů u stejného modelu neuropatie vedlo mimo to také ke zvýšení základní frekvence mEPSC, které bylo podmíněno aktivací TRPV1 receptorů. Tyto výsledky svědčí o možnosti nárůstu aktivace presynaptických TRPV1 receptorů endogenními agonisty za stavů periferní neuropatie. Ve třetí sérii pokusů aplikace NAPE u kontrolních řezů snížila frekvenci mEPSC na 32 % základní hodnoty, pravděpodobně díky aktivaci CB1 receptorů. Tento pokus naznačil důležitost interakce mezi CB1 a TRPV1 receptory při modulaci nociceptivní signalizace na míšní úrovni. Získané výsledky demonstrují významnou úlohu presynaptických TRPV1 receptorů a jejich endogenních agonistů a modulátorů při vzniku patologických bolestivých stavů. Odhalení mechanismů funkce těchto receptorů a jejich modulace může přinést nové terapeutické přístupy při léčbě bolesti. Klíčová slova: Bolest, nocicepce, neuropatie, mícha, TRPV1, TNFα, Noleoyldopamin, OLDA, NAPE, míšní synapse, axotomie

-4-

Abstract (English) Modulation of synaptic transmission in dorsal horn of spinal cord plays a key role in nociceptive signalling. Recent studies have indicated a great importance of presynaptic TRPV1 receptors (transient receptor potential vanilloid) in spinal cord. These receptors act as molecular integrator of nociceptive stimulation on periphery. The way of their activation and the effect on modulation of the synaptic transmission are not clarified yet. Previous studies demonstrated the influence of many inflammatory mediators and cytokins on TRPV1 receptors. The aim of our research was to show changes in activation of presynaptic TRPV1 receptors in the spinal cord following the application of endogenous agonist N-oleoyl dopamine (OLDA) in a model of peripheral neuropathy, after incubation with cytokine TNFα and to show the effect of precursor of anandamide N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE). In our experiments, we have recorded miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSC) from neurons of acute spinal cord slices by the patch-clamp method. The first series of experiments tested sensitivity to application of the endogenous agonist OLDA 5 days after evoking peripheral neuropathy. The frequency of mEPSC increased significantly – to 250 % of base level after applying a low concentration of OLDA (0,2 μM). It was very different from the control experiments, in which a high concentration of OLDA (10 μM) was necessary. The second series of tests, - an incubation of slices with TNFα -, in the same model of neuropathy, showed also increased responsiveness to OLDA application as well as an increase of the basic frequency of mEPSC, which was partially conditioned by activation of TRPV1 receptors. These results point to important role of presynaptic TRPV1 receptors, possibly due to activation by endogenous agonists in the states of peripheral neuropathy. In the last set of experiments, NAPE was applied. It lowered the frequency of mEPSC to 32 % of the basic level, probably thanks to the activation of CB1 receptors. The results of these experiments suggested the importance of interaction between CB1 and TRPV1 receptors in modulation of nociceptive signalling in the spinal cord. Our results demonstrate a significant role of presynaptic TRPV1 receptors and their endogenous agonist and modulators in a development of pathological pain conditions. The revelation of mechanisms and modulation of these receptors can bring new therapeutic approaches in pain treatment. Keywords: Pain, nociception, neuropathic pain, spinal cord, TRPV1, TNFα, Noleoyl dopamine, OLDA, NAPE, spinal synapse, axiomy

-5-

Seznam zkratek AA

aminokyseliny

AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionátová kyselina AP-1

aktivační faktor-1

ASK1

apoptosis signal-regulated kinase-1

ATP

adenosintrifosfát

BDNF

brain-derived neurotrophic factor

CB1(2) kanabioidní receptor 1(2) CNS

centrální nervová soustava

DAG

diacylglycerol

DD

death doména

DRG

dorsal root ganglion (zadní kořen míšní)

DH

dorsal horn (zadní roh míšní)

FADD

fas-associated DD protein

H2O2

peroxid vodíku

IASP

The Interational Association for Study of Pain

IKK

IκB kináza

IL

interleukin

IκB

inhibiční protein NF-κB

JNK

c-Jun N-terminalní kináza

MEKK

mitogenem aktivovaná protein kináza/Erk kináza kináza 1

MK

mastné kyseliny

MKK

mitogenem aktivovaná protein kináza kináza

NAD+

nikotinamiddinukleotid

NAPE

N-acylfosfatidylethanolamin

NF-κB

jaderný faktor κB

NMDA

N-methyl-D- aspartát

NS

nervová soustava

OLDA

N-oleyldopamin

PI3K

fosfoinositid 3-kinasa

PIP2

fosfoinositolbifosfát

PKC

fosfokinasa C

PLC

fosfolipasa C

PNS

periferní nervová soustava

R

receptor (např. AMPA R)

RIP

receptor interacting protein

RTX

resiniferatoxin

-6-

SB

SB 366791 – antagonista TRPV1 receptorů

SODD

silencer of DD

TNFα

Tumor necrosis factor alpha

TNFR

Tumor necrosis factor alpha receptor

TRADD

TNF receptor-asociovaný DD protein

TRAF

(s) TNF-receptorem asociovaný faktor

TRP

Transient receptor potential

TRPV

Transient receptor potential vanilloid (subfamily)

VR

vanilloidní receptor

-7-

OBSAH ÚVOD ........................................................................................................................ 9 LITERÁRNÍ PŘEHLED............................................................................................. 10 1. Bolest a její typy ................................................................................................... 10 2. Mechanismy nociceptivní signalizace .................................................................. 12 2. 1. Typy senzorických vláken. ......................................................................................... 12 2. 2. Šedá hmota míšní...................................................................................... 12 2. 3. Senzorické dráhy ....................................................................................... 14 2. 4. Synapse nociceptivního systému v míše ................................................... 15 3. TRP kanály .......................................................................................................... 16 3. 1. TRPV1 (VR1) kanál. .................................................................................. 20 3. 1. 1. Výskyt TRPV1. ............................................................................... 20 3. 1. 2. Struktura TRPV1. ........................................................................... 21 3. 1. 3. Aktivace a modulace TRPV1.......................................................... 22 3. 1. 4. Mechanismy desenzitizace TRPV1. ............................................... 25 3. 1. 5. Funkce TRPV1 v nervové soustavě. .............................................. 26 4. Tumor necrosis factor alpha ................................................................................. 30 4. 1. Struktura. ................................................................................................... 30 4. 2. Signalizační kaskády TNFα. ...................................................................... 31 4. 3. Funkce v nervové soustavě. ...................................................................... 33 5. Geny časné odpovědi – c-Fos a c-Jun – a nocicepce .......................................... 35 6. Neuropatická bolest ............................................................................................. 35 6. 1. Mechanismy neuropatické bolesti. ............................................................. 36 6. 2. Modely neuropatické bolesti. ..................................................................... 41 CÍLE PRÁCE ............................................................................................................ 45 METODY .................................................................................................................. 45 1. Použité chemikálie ................................................................................................ 45 2. Použité roztoky ..................................................................................................... 46 3. Příprava míšních řezů ........................................................................................... 46 4. Elektrofyziologická měření .................................................................................... 48 4. 1. Aparatura a příslušenství. .......................................................................... 48 4. 2. Skleněné mikroelektrody............................................................................ 48 4. 3. Metoda terčíkového zámku (patch clamp).................................................. 48 4. 4. Aplikace látek. ........................................................................................... 49

-8-

5. Analýza dat ........................................................................................................... 50 6. Přetětí sedacího nervu jako model neuropatické bolesti ....................................... 50 VÝSLEDKY .............................................................................................................. 51 1. Vliv axotomie na frekvenci mEPSC ....................................................................... 51 1. 1. Aplikace nízké koncentrace OLDA zvýšila frekvenci mEPSC 5 dní po přetětí sedacího nervu. ...................................................................................... 51 2. Vliv cytokinu TNFα na modulaci nociceptivního synaptického přenosu u modelu neuropatické bolesti .................................................................................................. 53 2. 1. Inkubace míšních řezů s TNFα po axotomii zvyšuje citlivost TRPV1 receptorů na aplikaci nízké koncentrace endogenního agonisty OLDA.............. 53 2. 2. Vliv antagonisty TRPV1 SB 366791 na mEPSC frekvenci na řezech po inkubaci v TNFα u modelu neuropatické bolesti ................................................. 55 3. Vliv endogenního agonisty CB1 a TRPV1 receptorů NAPE na mEPSC v lamině I a II zadního rohu míšního ......................................................................................... 56 DISKUSE ................................................................................................................. 58 1. Vliv axotomie na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou TRPV1 receptorů N-oleoyldopaminem .................................................................................. 58 2. Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie.. 60 2. 1. Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie a vliv na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou OLDA. .. 60 2. 2. Vliv antagonisty TRPV1 receptorů (SB 366791) na frekvenci mEPSC míšních neuronů po inkubaci v TNFα u modelu neuropatie. .............................. 64 3. Modulační vliv NAPE na synaptický excitační přenos ........................................... 66 ZÁVĚR ..................................................................................................................... 69 LITERATURA ........................................................................................................... 71

-9-

ÚVOD Bolest je neoddělitelnou součástí smyslového vnímání člověka. Vedle silných citových prožitků přináší i velmi důležitou informaci o možném poškození tkání a má tak zásadní význam pro přežití. Bolest vznikla jako součást ochranných mechanismů, přítomných v různé podobě u řady živočichů a organismů. Existuje však mnoho stavů, kdy bolest přestává plnit tento ochranný účel a přerůstá v nežádoucí příznak či dokonce samostatné onemocnění. I proto je bolest již od pradávna studována, zejména ve snaze o její potlačení. V posledních letech se při výzkumu mechanismů bolesti dostaly do centra pozornosti nově objevené TRPV1 receptory. Jejich zásadní vliv na přenos bolestivých podnětů je již poměrně dobře popsán na periferii. Hojně se však vyskytují i v zadních rozích míšních, kde mohou významně modulovat účinnost synaptického přenosu. Mechanismus aktivace TRPV1 receptorů na presynaptických zakončeních, vliv jejich aktivace a modulace za patologických podmínek na přenos nociceptivní informace ale není dosud dostatečne studován. Vzhledem k tomu, že znalost těchto mechanismů by mohlo výrazně ovlivnit vývoj nových analgetik, směřovaly i naše pokusy k jejich objasnění.

- 10 -

LITERÁRNÍ PŘEHLED

1. Bolest a její typy Bolest je definována jako nepříjemná vjemová a emocionální zkušenost související se skutečným nebo potenciálním poškozením tkáně, nebo je jako takové poškození popisována. Z této definice zveřejněné mezinárodní organizací pro výzkum bolesti (IASP, 1979) vyplývá, že bolest je subjektivní. Pro úplné popsání fenoménu bolesti je potřeba do něj zahrnout čtyři pojmy: Nocicepci, bolest, utrpení a bolestivé chování (Roenn et al., 2006). Nociceptivní podnět, bolest vyvolávající, je takový, který potenciálně či skutečně způsobuje poškození tkáně (Loeser a Treede, 2008). Na druhou stranu, bolest může být přítomna i bez nocicepce – viz níže. Utrpení je negativní emociální odpověď mozku (CNS), která může být vyvolána nejen bolestí, ale i stresem, strachem, úzkostí, ztrátou milovaných objektů a dalšími psychologickými stavy (Roenn et al., 2006). U lidí je možné bolest hodnotit mimo verbální komunikaci také díky sledování bolestivého chování. Toto chování zahrnuje například grimasy, sténání, ochabování svalů či kulhání, trvalé hledání lékařské péče či pracovní selhání. Bolestivé chování lze kategorizovat různými měřítky – počátkem, trváním, intenzitou, frekvencí, pravidelností a druhem chování (Roenn et al., 2006). Bolest samotnou lze rozdělit dle více hledisek. Pokud budeme uvažovat o vzniku bolesti v rámci nervové soustavy, rozeznáváme bolest periferní (bolest v místě nociceptivního podnětu) a centrální (způsobená poškozením sensorických nervových drah v CNS). Dále lze vzít v potaz konkrétní místo na těle či uvnitř těla. Sem lze zařadit bolest muskuloskeletární, kožní, viscerální (vnitřních orgánů v trupu, zejména pak trávicí soustavy), bolest hlavy, zubů atd. Jedním z nejdůležitějších hledisek je však délka trvání. Dle ní dělíme bolest na akutní, která trvá v řádu sekund, subchronickou (hodiny až dny) a chronickou, jejíž trvání je delší než šest měsíců (Millan, 1999). Akutní bolest je okamžitá, probíhá při bolestivém podnětu. Má fyziologický význam, napomáhá reparaci organismu, hojení a úniku ze stresové situace vzniklé bolestivým podnětem. Subchronická bolest může být přítomna v průběhu léčení, zotavování poškozené tkáně. Chronická bolest naopak už může sama o sobě zvětšovat poškození tkáně (Millan, 1999). Chronická bolest není pouze příznakem,

ale je považována

za samostatné onemocnění (Ueda,

2008).

Chronickou bolest často provázejí allodynie a hyperalgesie. Allodynie je stav, kdy nebolestivý podnět (např. dotyk) je vnímán bolestivě. Hyperalgesie znamená zvýšenou odpověď (větší bolest) na podnět, který je sám o sobě bolestivý (např.

- 11 -

tepelný podnět). Rozlišujeme primární a sekundární hyperalgesii. Primární se objevuje v přímo v poškozené tkáni a vzniká senzitizací primárních senzorických aferentů, o nichž bude více informací níže. Sekundární hyperalgesie je naopak typická pro neporaněnou okolní tkáň a vzniká v CNS nejspíše tzv. centrální senzitizací (Campbell a Meyer, 2006). Dalším způsobem je rozdělení na bolest nociceptivní (neboli fyziologickou), neuropatickou a zánětlivou. Nociceptivní bolest je způsobena běžným nociceptivním stimulem (vysoká teplota, mechanické poškození tkáně). Neuropatická bolest, která vzniká při poškození senzorických nervů, ať už v centrální či periferní nervové soustavě, je velmi těžko zvratitelná, přestože její příčiny už byly v mnohém upřesněny (Ueda, 2008; Scholz a Woolf, 2002). Neuropatická bolest je přítomna i bez nociceptivních podnětů. Bolest zánětlivého původu provází, jak její název připomíná, zánětlivé procesy, např. při mechanickém poranění tkáně. Řada faktorů (např. TNFα, IL-1β, IL-6, bradykinin) se podílí na běžné zánětlivé reakci organismu vůči virům, bakteriím apod., ale i na facilitaci přenosu nociceptivních podnětů. Patologická chronická bolest se často projevuje symptomy zánětlivé i neuropatické bolesti najednou. Zánětem mohou být poškozeny nervy, čímž původně zánětlivá bolest získá prvky neuropatické. A naopak, při poškození nervu může dojít k rozvoji zánětu a v důsledku toho se neuropatická bolest stane zároveň zánětlivou. Vedle zásadní úlohy neuronů hrají roli v ovlivňování bolesti také gliové buňky, které vylučují celou řadu neuromodulátorů, ale také jsou samy schopny uvolňovat některé neurotransmitery či je naopak vychytávat a tím významně modulovat nociceptivní signalizaci. V následujících kapitolách budou popsány základní mechanismy přenosu a modulace bolesti se zaměřením zejména na míšní oblast, zejména ovlivňování za fyziologických a patologických bolestivých stavů, konkrétně při vzniku a trvání neuropatické bolesti. Příčina

Umístění

Způsob vzniku

Délka trvání

Nocicepce

periferní, viscerální

trauma (poranění), zánět, ischemie tkáně

Neuropatie

periferní, centrální (thalamická aj.), dysautonomní

poškození periferního nervu, poškození CNS, remodelace CNS, dysfunkce vegetativního nervového systému

akutní, subchronická; chronická subchronická, chronická

Tabulka 1 Srovnání nociceptivní a neuropatické bolesti dle umístění, způsobu vzniku a délky trvání. Neuropatická bolest má vždy dlouhodobější charakter (subchronická, chronická) a příčinou jejího vzniku je poškození nervového systému.

- 12 -

2. Mechanismy nociceptivní signalizace

2. 1. Typy senzorických vláken Periferní nervy jsou nezbytnou součástí senzorického systému, který zpravuje organismus o změnách ve vnějším a vnitřním prostředí. Stimulací některých typů vláken dochází k nocicepci. Za určitých patologických podmínek se však přenosu bolesti účastní i nervy běžně reagující na nebolestivé podněty, čímž přispívají k rozvoji allodynie. Axony primárních senzorických neuronů jsou dělena na Aα, Aβ, Aδ a C vlákna. Těla těchto neuronů jsou uložena ve spinálních gangliích (DRG), z nichž vychází pseudounipolární výběžek. Ten se rozvětvuje na periferní, který slouží k detekci podnětů, a centrální vedoucí do míchy. Aα vedou vzruchy ze svalových vřetének a Golgiho šlachového tělíska. Aβ přenášejí do CNS informace o změnách délky svalu, čímž podporují funkci Aα vláken, detekují nebolestivé podněty z kloubů a hlavně z kůže. Dráždění těchto periferních zakončení za běžných podmínek mírní bolest, avšak při patologických stavech, jako je neuropatická bolest, se také mohou podílet na vzniku bolestivých vjemů. Obě následující skupiny jsou polymodální nociceptory, tedy reagující na více typů podnětů. Aδ zahrnují volná nervová zakončení tlaku, chladové termoreceptory a především přenášejí rychlé bolestivé vzruchy (ostrá bolest). C vlákna přenášejí tzv. pomalou bolest (tupá, vytrvalá bolest) vyvolanou teplem, chemickými i mechanickými podněty (Julius a Basbaum, 2001). Jednotlivé typy vláken se také liší svojí myelinizací, a tím i rychlostí vedení vzruchů. Aα a Aβ jsou myelinizovaná silně a dokáží přenášet podnět rychlostí 80 – 120 m/s, resp. 33 – 75 m/s v případě Aβ vláken. Aδ mají pouze slabou myelinovou vrstvu (rychlost přenosu 3 – 30 m/s) a C vlákna nejsou myelinizovaná vůbec (0,5 – 2 m/s). Rozdíly lze nalézt také ve velikosti těl neuronů v DRG. Buňky dávající vznik C vláknům v periferii mají nejmenší těla, Aα a Aβ největší (Julius a Basbaum, 2001). 2. 2. Šedá hmota míšní Mícha je místem, kde dochází k prvnímu spojení mezi CNS a periferií. Proto také synapse na neuronech v šedé hmotě míšní hrají nejdůležitější úlohu v modulaci senzorických vjemů. Z hlediska studia nocicepce je důležité rozlišit, které neurony a synapse se podílejí na přenosu nociceptivní signalizace a které nikoliv. Za patologického stavu se tato situace může měnit a synapse s nociceptivními míšními neurony mohou tvořit i aferenty běžně nezprostředkovávající tento typ podnětu.

- 13 -

Šedou hmotu míšní dle Rexedova členění (1952) lze rozdělit na deset vrstev, tzv. lamin, podle rozdílů v hustotě a velikosti neuronů (viz obr. 1). Označeny jsou římskými číslicemi dorso-ventrální rovině. Lamina I, marginální zóna, obsahuje projekční neurony se synapsemi s Aδ vlákny. V lamině II, substantia gelatonisa, se vyskytují převážně interneurony, většinou menší než projekční. Lamina dvě byla v pozdějších studiích rozdělena na vnější IIo („outer“) a vnitřní IIi („inner“). Do laminy II projikují C vlákna a společně s laminou I jsou hlavní oblastí, kde jsou zakončeny primární nociceptivní aferenty. Souhrně se lamina I a II často označují jako superficiální oblast zadního rohu míšního. Laminy III a IV jsou také jinak nazývány nucleus proprius a přijímají informace z neuronů DRG převážně o lehkých taktilních podnětech (Aβ vlákna) a někdy na tepelné a bolestivé stimuly. V lamině V a VI konvergují vstupy z povrchnějších lamin, navíc do V. laminy ústí i C vlákna, tudíž tyto vrstvy se podílejí také na nocicepci. Ovšem poslední z dorzálních vrstev (VI), označovaná jako nucleus dorsalis, lze definovat pouze ve zduřeních v segmentech odstupu nervů končetin. Laminy VII – IX náleží přednímu rohu míšnímu, přičemž lamina VII obsahuje autonomní

motorické

neurony

sympatických

drah,

lamina

VIII

motorické

interneurony a lamina IX motorické a sympatické neurony. Lamina X vytváří prostor okolo centrálního kanálu. Obrázek 1 Rexedovo laminární členění. Levá polovina obrázku znázorňuje dělení šedé hmoty míšní do jednotlivých lamin I – X. V pravé jsou zobrazena jádra. Substantia gelatinosa odpovídá zhruba lamině II, nucleus proprius zasahuje do lamin III a IV. Nucleus dorsalis, neboli lamina VI se nalézá v míšních segmentech odstupu končetin. V lamině VII se nachází nucleus intermediolateralis v segmentu L3, kde dává vznik pregangliovým vláknům sympatického nervového systému. Motorické neurony jsou převážně v lamině VIII (Rexed, 1952; obr. Wikipedia, 2010).

V zadním rohu míšním jsou, podle cílové oblasti projekce, projekční neurony, interneurony a propriospinální neurony. Propriospinální neurony mají veškeré výběžky pouze v míše a integrují a modulují laterální a segmentální míšní signalizaci. Projekční neurony přenášejí informace do vyšších center CNS a vyskytují se zejména v laminách I, V a VI. Liší se odpovědí na signalizaci primárních aferentů způsobenou řadou podnětů. Nízkoprahové projekční neurony reagují preferenčně na nebolestivý podnět (např. dotykový vedený Aβ vlákny), naproti tomu - 14 -

vysokoprahové jsou specificky nociceptivní neurony, které odpovídají na aktivitu Aδ a C vláken. Tyto vysokoprahové projekční buňky se nacházejí především v lamině I, resp. IIo, a vzácně v laminách IV – VI. Posledním typem projekčního neuronu jsou tzv. s širokým dynamickým rozsahem, které mají za úkol konvergovat vstupy všech typů stimulů z kůže, svalů i útrobních orgánů od mechanických a chemických až po tepelné podněty z Aβ, Aδ i C vláken. Vyskytují se zejména ve vrstvách IV – VI, řidčeji v I, IIo a X (Millan, 1999). Interneurony se nejvíce vyskytují v lamině II. Mají velký význam pro modulaci nociceptivní signalizace, ať už směrem k senzitizaci či atenuaci. Jedná se o tzv. heterosynaptickou plasticitu. Interneurony jsou dvojího typu, excitační a inhibiční. Inhibiční přímo kontaktují projekční neurony i primární aferentní vlákna, čímž mohou působit tlumivě na presynaptické i postsynaptické mechanismy nocicepce. Dle přenašeče rozlišujeme inhibiční interneurony GABAergní (vylučují neurotransmiter kyselinu γ-aminomáselnou) a glycinergní (glycin). Některé však vylučují oba typy. Excitační interneurony nepřímo polysynapticky aktivují projekční neurony. Podobně jako primární nociceptivní vlákna vylučují excitačně působící glutamát a mnoho neuropeptidů jako substance P a dalších látek s neuromodulačními účinky. 2. 3. Senzorické dráhy Senzorické dráhy vedou signály z jednotlivých částí těla do mozku. Při jejich poškození je narušena schopnost zpracovávat příslušné vjemy. Je-li poškozena nociceptivní dráha, ať už na periferii či na centrální úrovni, může se vyvinout neuropatická bolest. Senzorický systém zpravuje jak o stavu vnitřního prostředí, tak o změnách ve vnějším prostředí. Nociceptivní dráhy vedou informaci z volných nervových zakončení přes těla neuronů zadními kořeny do míchy. V míše je stimul předáván přes synapse na projekční neurony lokalizované v laminách I a V, v menším počtu IV

a

VI,

ventrálních

laminách

VII

a

VIII

a centrální lamině

X.

Axony

spinothalamických neuronů vedou kontralaterálně, často už ve stejném segmentu jako je tělo tohoto neuronu či v sousedních míšní oblasti. Tato vlákna jsou sdružena do provazců ascendentních drah, která projikují do řady mozkových center. Z hlediska bolesti je velmi důležitá signalizace do thalamu a mozkového kmene. Dráhy se dělí na přímé, zahrnující spinothalamickou, spinomesencefalickou a spinoretikulární, a nepřímé. Spinothalamická dráha integruje vzruchy přicházející z vláken Aδ v lamině I a V zadních rohů míšních, kde je signál přenášen na projekční neurony (Patestas a Partner, 2006). Touto cestou jsou převáděny podněty do

ventroposterolaterálního

a

ventroposteromediálního

- 15 -

thalamu.

Spinomesencefalická dráha projikuje do jader retikulární formace středního mozku a periakvaduktální šedi. Spinoretikulární dráha končí v jádrech retikulární formace prodloužené míchy a Varolova mostu. Nepřímé vzestupné dráhy se přepojují při signalizaci do vyšších center na sekundární neurony (neurony druhého řádu). Rozeznáváme dvě hlavní dráhy, zadní provazce míšní a spinocervikothalamickou. Zadní provazce míšní jsou součástí lemniskového systému, v němž jsou i axony přenášející nebolestivé stimuly. Společně s nimi projikují do jader prodloužené míchy, nucleus gracilis a nucleus cuneatus. Zadní provazce jsou v průběhu mediálního lemnisku převedeny na kontralaterální stranu a pokračují dále do thalamu. Smyslové informace z obličejové části je vedena drahami začínajícími v trigerminálních jádrech. Změny v kterékoliv části nociceptivních senzorických drah mohou ovlivnit celkový vjem bolesti, avšak z tohoto hlediska jsou klíčové míšní synapse primárních aferentů, jimž je věnována následující kapitola. 2. 4. Synapse nociceptivního systému v míše Pro modulaci nociceptivního podnětu je nejdůležitější složkou synapse tohoto systému v míše. Na ní dochází k celé řadě procesů, jejichž objasnění může přispět k pochopení mechanismů bolesti a následně lepší léčbě patologických bolestivých stavů. Primární nociceptivní aferenty přivádějí svá vlákna převážně k neuronům v superficiální oblasti (lamina I a II) zadního rohu míšního, kde s nimi vytvářejí synapse. Zde dochází k nejdůležitějšímu ovlivnění intenzity signálu přicházejícímu z periferie. Dlouhodobé excitační změny na těchto synapsích vedou k tzv. centrální senzitizaci, což je jeden z nezbytných prvků pro rozvoj patologických bolestivých stavů. Na obou membránách, presynaptické i postsynaptické, je celá řada receptorů

a

iontových

od pravděpodobnosti

kanálů,

otevření,

které

přes

jsou

kinetiku

modulovány vazeb

mnoha

faktory,

s aktivačními

látkami,

koncentrací těchto látek až po jejich odstranění ze synaptické štěrbiny. Nociceptivní aferenty působí excitačně na spinální projekční neurony díky výlevu glutamátu z jejich centrálních zakončení, které aktivují postsynapticky uložené glutamátové ionotropní receptory umožňující vtok kladně nabitých iontů (Na+, popř. Ca2+). Jedná se o tzv. rychlý excitační synaptický přenos, do nějž jsou zapojeny

především

AMPA

a

kainátové

receptory

vyvolávající

excitační

postsynaptické proudy (EPSC). NMDA receptory se na rychlém přenosu také

- 16 -

podílejí, ale až po uvolnění Mg2+, které působí jako tonický inhibitor těchto kanálů. K uvolnění hořčíkového bloku dochází až po depolarizaci membrány. Analogicky fungují rychlé inhibiční postsynaptické proudy (IPSC). Ty jsou však vyvolávány inhibičními neurotransmitery glycinem a GABA aktivujícím příslušné ionotropní receptory, což způsobuje hyperpolarizaci vtokem Cl- těmito kanály. Excitace konkrétní synapse je zaostřena aktivací inhibičních interneuronů, které uvolňují glycin a GABA (Woolf a Salter, 2000). Pomalý excitační synaptický přenos je umožněn aktivací metabotropních glutamátových receptorů (mGluR) a dalších metabotropních receptorů spřažených s trimerními G-proteiny, jako je neurokininový receptor NK1 reagující na substanci P uvolněnou z presynaptické membrány (Woolf a Salter, 2000). Tím je spuštěna signální kaskáda, která může vést k dlouhotrvající (desítky sekund) depolarizaci postsynaptické

membrány.

Pomalá

inhibice

je

způsobena

kyselinou

γ-

aminomáselnou působící na metabotropní GABAB receptory, které jsou však uloženy především presynapticky. Dalšími důležitými látkami působícími v synaptickém přenosu je celá řada neuromodulátorů. Mezi ně patří růstové faktory NGF, adenosintrifosfát (ATP), produkty cyklooxygenázové reakce prostaglandiny, cytokin TNFα, oxid dusný NO schopný difundovat přes membránu, neuropeptidy CGRP a substance P, různé endokanabinoidy a peptidy jako neuropeptid Y, galanin a cholecystokinin (Millan, 1999). Všechny tyto látky mají své receptory, ať už pre- či postsynapticky. Mechanismy jejich působení se velmi liší. Tato práce se věnuje především TRPV1 receptorům, které mají zásadní vliv na modulaci nociceptivního přenosu. 3. TRP kanály Poměrně nedávno objevené TRPV1 receptory, které, jak se ukazuje, mají podstatné účinky na modulaci a přenos bolesti, patří do velké skupiny TRP receptorů, jejichž role však nespočívá pouze v nocicepci, ale i v celé řadě dalších pochodů. Pro lepší pochopení souvislostí a funkce TRPV1 receptoru je zde zařazena tato kapitola pojednávající o rodině proteinů, do níž tento receptor patří. TRP jsou neselektivní kationtové kanály, kterými prochází ionty Ca 2+, Na+ a Mg2+. Tyto kanály se skládají ze čtyř podjednotek (tetramer). Každá z podjednotek obsahuje šest transmembránových helixů, přičemž N- i C- konec se nachází na intracelulární straně membrány (viz obrázek 4). Mezi pátým a šestým helixem se nachází tzv. poor loop, hydrofobní smyčka, která vytváří pór pro průchod iontů celým tetramerem (Astorga a Bacigalupo, 2007).

- 17 -

TRP kanály lze rozdělit do dvou hlavních skupin dle topologické podobnosti (Montell, 2005). Každý člen skupiny 1 (viz obrázek 4) sdílí s ostatními členy prokazatelnou sekvenční homologii v transmembránových doménách (helixech) a obsahuje nejméně 3 ankyrinové domény u N-konce. Ankyrinová doména se skládá z 33 AA. Její funkce spočívá v protein-proteinové interakci, tedy například ukotvení proteinu v cytoskeletu, transkripci (nikoliv u TRP kanálů), přenosu signálu či iontu (Mosavi et al., 2002). Značný počet TRP receptorů ze skupiny 1 je exprimován v DRG a hraje důležitou úlohu v nocicepci. Proto je na ně v současné době zaměřen výzkum při hledání nových analgetik. Naproti tomu skupina 2 zahrnující

TRPP

(polycystin)

a

TRPML

(mucolipin)

je

poměrně

špatně

charakterizována. Jejich společným znakem je extracelulární smyčka mezi prvním a druhým helixem (Astorga a Bacigalupo, 2007).

Obrázek 2 TRP kanály Dvě skupiny TRP; vysvětlivky: A (zelená)) – ankyrinová doména, CC (světle fialová) – coiled-coil doména, TRP (tyrkysová) – TRP doména; P – pore loop (přizpůsobeno, Venkatachalam a Montell, 2007).

Skupina 1 se dělí na pět podskupin: TRPC (canonical), TRPV (vanilloid), TRPM (melastatin), TRPA (ankyrin) a TRPN. První čtyři se hojně vyskytují u savců, TRPN byla objevena u octomilky (Drosophila melanogaster), dánia (Danio rerio, zebrafish)

a háďátka (Cenorhabditis elegans). Tento mechanoreceptor

je

exprimován ve zrakových a sluchových orgánech (Sidi et al., 2002). Vyznačuje se větším množstvím ankyrinových domén na N-konci (Astorga a Bacigapulgo, 2007). TRPC zahrnuje devět členů, TRPC1 – 7 a TRPL a TRP D. melanogaster. V rámci savčího organismu se jedná o široce rozšířené kanály vyskytující se např. v mozku, srdci, varlatech, vaječnících, svalech a nadledvinkách (Clapham et al., 2001). Podílejí se mimo jiné na excitabilitě Purkyňových buněk, akrosomální reakci spermií i výlevu neurotransmiterů (Astorga a Bacigapulgo, 2007).

- 18 -

Podskupina TRPM dostala jméno po prvním objeveném proteinu, TRPM1. Exprese

TRPM1

nepřímo

souvisí

s metastatickým

potenciálem

některých

melanomických buněčných linií (Duncan et al, 1998). Podobně jako TRPC jsou velmi rozšířeny v různých tkáních, jako je mozek, ledviny, prostata, plíce, střeva ad. Na rozdíl od ostatních členů skupiny 1, N-konec těchto proteinů neobsahuje ankyrinové domény (viz obr. 4). Celkem je TRPM kanálů osm, z toho TRPM 5 a 8 jsou termosenzitivní, tedy aktivované i teplotou. U TRPM5 se jedná o rozmezí 15 35°C, u TRPM 8, mimo jiné reagující také na menthol, to je rozsah od 23 do 28°C. Kanál TRPM 8 zprostředkovává vnímání chladu (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Do „ankyrinové“ podskupiny patří jeden savčí protein, dva exprimované v háďátku a daniu a čtyři v octomilce. Tato podskupina je typická větším počtem ankyrinových zbytků (cca 14) na N-konci, které ji mohou kotvit k dalším signálním proteinům (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Savčí TRPA byl nalezen v DRG a vláskových buňkách ucha. Taktéž se řadí mezi termosenzitivní, aktivovaný nízkou teplotou (viz tabulka 2). Poslední poměrně početnou skupinou jsou „vanilloidové“ TRP, z nichž šest exprimují tkáně jak savčí, tak tkáně bezobratlých, octomilky a háďátka. Pro savce je typická produkce v nociceptivních neuronech DRG, v mozku, močovém měchýři, slezině, játrech a dalších orgánech. TRPV kanály dostaly své jméno díky tomu, že je možné je aktivovat vaniloidními látkami (homovaniliny), mezi něž patří celá řada dráždivých extraktů z rostlin. Jedná se o kapsaicin z paprik (Capsicum) objevený už v roce 1846, piperin z pepře, resiniferatoxin ze sukulentu Euphorbia resinifera ad. Podobně jako TRPM5 a 8 jsou někteří zástupci této podskupiny termosenzitivní. Na rozdíl od melastatinových kanálů však reagují na teplotu od 39 do 43°C. Jedná se o TRPV1 – 4, přičemž TRPV1 může být aktivován a modulován celou řadou látek a jiných než teplotních podnětů (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Tento kanál se významně podílí na nocicepci a jeho zvýšená aktivace může být příčinou mnoha patologických stavů souvisejících s bolestí (Jara-Oseguera et al., 2008). Proto je TRPV1 terčem mnoha výzkumů směřujících k tvorbě nových analgetických prostředků, je na něj zaměřena největší pozornost ze všech TRP kanálů a i v této práci mu bude věnována samostatná následující část. Na primárních nociceptorech se vedle něj nacházejí TRPV2 – 4, TRPM8 a TRPA1 receptory. Příklady aktivace jednotlivých typů kanálů shrnuje následující tabulka 2.

- 19 -

Typ Aktivace Aktivace kanálu (endogenní) (exogenní) TRPC17 DAG

Aktivace Aktivace (teplotou) (jinak)

TRPM1

TRPM2 TRPM3 TRPM4 TRPM5

Ca2+, PIP2 Ca2+, PIP2

15-35°C

TRPM6 TRPM7 TRPM8 TRPA1 TRPN

TRPV1 TRPV2 TRPV3 TRPV4

TRPV5

TRPV6

ATP, PIP2, fosforylace menthol, icilin, PIP2 DAG

23-28°C canabinoidy, bradykinin <17°C

Modulace

vyčerpání zásob Ca2+ translokace do membrány (c)ADPribosa, nukleotidy, Ca2+, H2O2, NAD+ osmotický tlak, vyčerpání zásob změnou napětí změnou napětí translokace do inhibice membrány Mg2+ inhibice Mg2+ změnou pH mechanicky mechanicky

anandamid, OLDA, PKC, kapsaicin, PIP2 olvanil, RTX >43°C mechanicky PI3K, IGF-I >52°C hypoosmoralita nenasycené MK + PLC 27 – 34°C hypoosmolarita, 33 – 39°C mechanicky nedostatek Ca2+, translokace do membrány nedostatek Ca2+, translokace do membrány

PIP2, nižší pH, cytokiny, ethanol, nikotin

Tabulka 2: Příklady aktivace a modulace jednotlivých typů TRP kanálů (Clapham et al., 2001; Astorga a Bacigapulgo, 2007).

- 20 -

3. 1. TRPV1 (VR1) kanál Důležitost TRPV1 receptorů byla v mnohém objasněna v rámci periferních zakončení primárních aferentů, je však zjevné, že svoji nezastupitelnou úlohu plní i na míšních synapsích nociceptivního systému. Zde jeho modulační účinky jsou předpokládané, ne však zcela upřesněny. I proto je ústředním prvkem zájmu této práce. Vaniloidní receptor 1 byl prvním objeveným ze své podskupiny. Je typickým zástupcem TRPV. Podrobněji viz 3. 1. 2. (Struktura TRPV1). Objev tohoto kanálu v roce 1997 znamenal průlom ve zkoumání molekulárních mechanismů bolesti, neboť právě TRPV1 umožňuje převod mezi nociceptivním podnětem a senzorickým signálem, který bolest vyvolává (Caterina et al., 1997). Bývá často označován jako molekulární integrátor fyzikálních a chemických nociceptivních podnětů (Caterina a Julius, 2001; Szallasi a Blumberg, 1999). Je aktivován teplotou přesahující 43°C, kapsaicinem, resiniferatoxinem a také algogenními látkami uvolňujícími se v místě poranění. Mezi ně patří například bradykinin, serotonin, prostaglandiny, substance P. TRPV1 je neselektivním kanálem pro Ca2+, Na+ a K+. S desetinásobnou preferencí propouští vápník oproti jednomocným kationům. 3. 1. 1. Výskyt TRPV1 TRPV1 se vyskytuje zejména na polymodálních primárních nociceptorech (Aδ a C vlákna, po celé délce). Nalezeny byly také v tělech neuronů s těmito axony ve spinálních gangliích, v menší míře na postsynaptických neuronech laminy I a II v míše, chuťových pohárcích, v mozku, epitelech, hladké svalovině. V míše je výskyt TRPV1 soustředěn především na malé a středně velké neurony s Aδ a C vlákna, která mají míšní synapse v superficiální oblasti laminy I a II. V lamině II je větší počet kapsaicin senzitivních axonů veden do její vnitřní části, IIi (Valtschanoff et al., 2001). Primární aferenty s TRPV1 vytvářejí synapse častěji s míšními neurony, které exprimují NMDA a NK1 receptory než s těmi, které exprimují AMPA a NK1 receptory (Hwang et al., 2004). Taktéž byla prokázána exprese TRPV1 na primárních viscerálních vláknech a superficiálních míšních neuronech. Tyto neurony jsou glutamátergní, nikoliv inhibiční glycin- či GABAergní (Zhou et al., 2009), některé z nich navíc exprimují receptor substance P, NK1 (Doly et al., 2004a). Vedle glutamátových receptorů se na těchto neuronech vyskytují i opioidní μ receptory (Zhou et al., 2009). Naproti tomu na primárních aferentech jsou TRPV1 kolokalizovány s purinergními P2X3 receptory a částečně také s NK1 receptory (Guo et al., 1999; Špicarová a Paleček, 2008). Aktivací TRPV1

- 21 -

glutamátergních neuronů může být posílen excitační synaptický přenos této oblasti. Vedle nervových buněk se tento kanál vyskytuje v lamině I a II také na astrocytech (Doly et al., 2004b). Distribuce TRPV1 však není rovnoměrná po celé míše. Největší hustota kanálů je v lumbálních segmentech, přičemž vzrůstá kaudálně v této části (Hwang a Valtschanoff, 2003). V mozku byl pomocí imunohistochemických metod TRPV1

receptor

lokalizován v hipokampu, hypothalamu, kortexu, mozečku, centrální amygdale, paraventrikulárních jádrech thalamu a celé řadě dalších oblastí (Gibson et al., 2008; Li et al., 2004; Mezey et al., 2000). 3. 1. 2. Struktura TRPV1 Kapsaicinový receptor je homotetramer, přičemž každá podjednotka se skládá ze šesti transmembránových segmentů s N- a C-koncem v cytosolu. Mezi S5 a S6 segmentem se nachází hydrofobní smyčka (P-loop), která v tetrameru vytváří pór pro ionty. Podjednotka obsahuje 838 AA o celkové molekulární hmotnosti 92 95 kDa (Caterina et al. 1997). Vytváření homotetrameru není jedinou možností tvorby kanálu. Podjednotky různých TRP kanálů mohou dohromady vytvářet kanál a dát tak vzniknout heterotetrameru (Smith et al. 2002). Hydrofilní N-konec podjednotky představuje více než polovinu proteinu (432 AA). Obsahuje oblasti bohaté na prolin a šest ankyrinových domén, které nejspíše slouží k interakci s cytoskeletem. Nachází se zde také arginin R114, který se podílí na vazbě kapsaicinu na tento protein. Důležitou funkční součást TRPV1 tvoří podstatně kratší C-konec (154 AA), který je rovněž položen intracelulárně. Podílí se na tetramerizaci, aktivaci a deaktivaci, senzitizaci či desenzitizaci receptoru. Také má vliv na citlivost kanálu vůči tepelným podnětům. Tetramerizaci receptoru umožňuje TRP box (GarciaMartinez et al., 2004). C-konec obsahuje fosforylační místa pro proteinkinázy (PKC, c-AMP závislá proteinkináza PKA, CaMK-II), která umožňují senzitizaci receptoru. Proti tomu desenzitizaci působí např. kalcineurin (fosfatáza), díky níž dochází ke konformačním změnám proteinu. Na C-koncové doméně se nachází i vazebná místa pro PIP2 a ATP (tzv. Walker motif). Bylo také zjištěno, že zkrácení C-konce o posledních 31 aminokyselin snižuje práh teplotní aktivace. Pokud je C-konec zmenšen na polovinu, klesá citlivost vůči kapsaicinu, pH i změně membránového potenciálu (Vlachová et al., 2003).

- 22 -

3. 1. 3. Aktivace a modulace TRPV1 TRPV1 je aktivován celou řadou látek a změněných fyzikálně chemických podmínek, díky nimž se podílí na nocicepci, rozvoji bolesti při zánětu a dalších procesech. Existuje celá řada aktivátorů tohoto kanálu. Teplota ovlivňuje veškeré chemické reakce a pochody v těle. U TRPV1 kanálu bylo zjištěno, že při zvýšené teplotě (>43°C) se otevírá díky konformačním změnám tímto způsobem vyvolaných. Tato teplota také odpovídá prahu pro vnímání bolestivých tepelných podnětů. Jestliže teplota přesáhne 53°C, práh pro teplotní aktivaci TRPV1 se sníží. Je to způsobeno částečnou denaturací kanálu, zejména distální C-koncové části zodpovědné za tento způsob aktivace (Caterina et al., 1997). Citlivost kanálu vůči teplotě však může být ovlivněna i bradykininem a dalšími mediátory zánětu. Tyto látky mohou snížit práh tepelné aktivace fosforylací TRPV1 až k fyziologickým hodnotám (Sugiura et al., 2002). Se změnou teploty souvisí i citlivost kanálu vůči změně membránového potenciálu. Napěťová závislost aktivace je úzce spojena s růstem teploty. Při teplotě 17°C je hodnota napětí poloviny maximální aktivace kanálu (V1/2) 150 mV. V rozmezí teplot mezi 40 a 45°C je tato hodnota již pouze -50mV, blízká klidovému membránovému potenciálu buňky (Voets et al., 2004). Existují dva modely vzájemné závislosti změny teploty a změny membránového potenciálu vůči aktivitě TRPV1 kanálu (Oseguera et al., 2008). První model vysvětluje výše uvedený vztah skrze přímý vliv teploty na napěťovou aktivaci. Malý vrátkový proud aktivuje TRPV1 kanál díky rozdílu volné Gibbsovy energie mezi zavřeným a otevřeným stavem, který je kladný u těchto kanálů (Voets et al., 2004, Nilius et al., 2005). Druhý model předpokládá existenci mnohočetných zavřených a otevřených stavů kanálu, přičemž pravděpodobnost otevření při změně teploty není ovlivněna napětím a naopak (Oseguera et al., 2008). V tomto případě vysoká citlivost receptoru vůči teplotě nevychází z malého vrátkového proudu, ale z velké změny entalpie mezi zavřeným a otevřeným stavem (Lattore et al., 2007, Brauchi et al., 2008). Je možné, že mnoho fyziologických stimulů aktivuje TRPV1 posunem V1/2 do rozmezí napětí, které je dosažitelné poměrně malou změnou membránového potenciálu (Nilius et al., 2005). Kapsaicin a další analogické látky (např. RTX) jsou silně lipofilní látky zvané homovanilyly, které, přestože jsou exogenního původu, aktivují TRPV1 receptor z intracelulární strany. Kapsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-monoamid) obsahuje tři funkční oblasti, které se podílejí na vazbě na receptor. Jedná o aromatickou homovanilylovou skupinu, alifatický oktanylový řetězec a ester tvořící spojku mezi nimi. Aromatická skupina se váže jak na C-, tak na N-konec, naopak oktanylový řetězec se váže do lipofilní smyčky mezi tramsmembránovými segmenty S3 a S4

- 23 -

(Jordt a Julius, 2002). Dle jedné z hypotéz je aktivace, resp. desenzitizace, kapsaicinem závislá na přítomnosti extracelulárního Ca2+ a Ca2+ vážícího proteinu kalmodulinu a ATP. Na TRPV1 je totiž přítomna doména na N-konci, jež váže kalmodulin s navázaným vápníkem nebo ATP. O vazebné místo na TRPV1 receptoru tyto dvě látky kompetují. Rozhodujícím faktorem pro senzitizaci či desenzitizaci tohoto kanálu je tedy poměr koncentrací mezi ATP a kalmodulinem. Větší množství intracelulárního ATP brání desenzitizaci kanálu (buňky) v přítomnosti kapsaicinu, naopak kalmodulin ji usnadňuje (Lishko et al., 2007). Jedním z endogenních modulátorů TRPV1 je lokální zvýšení koncentrace protonů, kdy pH klesne pod 6,8. Tato acidosa je typická pro zánět, ischemii tkáně, ale i poranění. Při této hodnotě pH je zesílena aktivace TRPV1 kapsaicinem nebo jiným ligandem. Pokud se pH ještě sníží (<6,0), tak je aktivován kapsaicinový receptor přímo protony, které interagují s negativně nabitými aminokyselinovými zbytky extracelulární strany proteinu, čímž otevírají přímo iontový kanál (Tominaga et al., 1998). Konkrétní aminokyseliny (E478, E563, E600, D601, E648) byly identifikovány v práci Jordta a Julia o čtyři roky později (Jordt a Julius, 2002). TRPV1 kanál může být aktivován také endogenními lipidickými látkami, jako je například anandamid, N-oleoyldopamin (OLDA), N-arachidonoyldopamin (NADA), oleoylethanolamid (OEA), NAPE, ω-3-nenasycené mastné kyseliny ad. (Oseguera et

al.,

2008).

Anandamid

je

endokanabinoidem

aktivující

vedle

TRPV1

i kanabinoidní receptory CB1 a CB2 hojně se vyskytující v mozku i míše. Nejen anandamid, ale i NADA a OLDA vykazují určitou afinitu ke kanabinoidním receptorům, která se mění v závislosti na koncentraci látky. Anandamid v nízkých koncentracích aktivuje CB1 a CB2, ve vyšších (0,1 – 1 μM) naopak TRPV1 (Zygmunt et al., 1999). N-oleoyldopamin vykazuje větší specifitu vůči vaniloidnímu receptoru 1 oproti anandamidu a NADA. Je naopak pouze slabým agonistou CB1 receptorů.

Schematické

srovnání

struktury

a kapsaicinem naleznete na obr. 3.

- 24 -

obou

látek

s

anandamidem

Obrázek 3 Chemické struktury NADA, OLDA, kapsaicinu a anandamidu. Všem látkám je společná peptidická vazba (N-C=O). NADA, OLDA a kapsaicin sdílejí homovanilovou strukturu, která je odvozena z katecholu a je hydrofilní. NADA, OLDA a anandamid mají společný poměrně dlouhý nevětvený alifatický řetězec s jednou či více (v případě NADA a anandamidu) dvojnými vazbami. Kratší větvený alifatický řetězec má i kapsaicin. Tato část je lipofilní a umožňuje těmto látkám průchod přes cytosolickou membránu (Chu et al., 2003).

NAPE, neboli N-acylfosfatidylethanolamin, součást enzymu NAPE-PLD, membránové fosfolipázy D (Okamoto et al., 2004), která je zodpovědná za vápníkem indukovanou syntézu anandamidu v primárních, kapsaicin senzitivních, nociceptivních neuronech (Nagy et al., 2009). NAPE je prekurzorem anandamidu. Vedle této skupiny látek sem patří i produkty štěpení kyseliny arachidonové lipooxygenasou. Tato reakce je typická pro vznik zánětu a dává vznik látkám, jako je kyselina 12- a 15-(S)-hydroperoxyeikosatetraenová (12- a 15-HPETE) a 5- a 15hydroxyeicosatetraneová (5- a 15-HETE) (Hwang et al., 2000). Poslední lipidickou skupinou jsou již zmiňované ω-3-nenasycené mastné kyseliny - linoleová, dokosahexaenová - DHA, eikosapentaenová - EPA (Matta et al., 2007). Všechny tyto látky aktivují TRPV1 kanály, přičemž ale linoleová kyselina a EPA inhibují odpověď na vaniloidní agonisty. Proto by regulace těchto látek mohla být jednou z cest léčení bolestivých stavů (Matta et al., 2007). Do výčtu látek ovlivňující aktivitu TRPV1 kanálu je třeba zařadit ještě modulátory jeho funkce. Tyto látky působí nepřímo prostřednictvím jiných membránových receptorů, jež aktivují sekundární posly se specifickými funkcemi.

- 25 -

Mezi nejdůležitější se řadí bradykinin, prostaglandiny a nervový růstový faktor (NGF), které se tvoří v průběhu zánětu. Bradykinin se váže na metabotropní receptor B2 spřažený s trimerními G-proteiny. Aktivuje tím fosfolipasu C, která vytváří fosfatidylinositolbisfosfát (PIP2). PIP2 se přímo napojuje na vazebné místo pro proteinkinasu C – S800, čímž ji vyváže (viz níže). Nervový růstový faktor spouští signální kaskádu navázáním na receptor TrkA. Díky tomu tyrosinkinasa fosforyluje TRPV1, čímž je umožněno zanoření tohoto kanálu do plazmatické membrány. NGF je retrográdně transportován do těla nociceptoru, kde indukuje zvýšenou expresi TRPV1 (Zhang et al., 2005). Zvyšuje se tak počet funkčních kanálů, a tím dochází k senzitizaci primárních nociceptorů. Jedním z důsledků je například hyperalgesie (Oseguera et al., 2008). Prostaglandiny patří mezi produkty štěpení k. arachidonové. Spouští membránovou adenylylcyklasu, čímž zvyšují hladinu c-AMP v cytosolu. Ta aktivuje proteinkinasu A (PKA), která fosforyluje konkrétní serinové a threoninové zbytky TRPV1. Fosforylace je nejvýznamnějším mechanismem vnitřní aktivace a senzitizace vaniloidního kanálu. Fosfátové zbytky jsou připojovány k S116 (c-AMP závislá PKA), T144 (c-AMP závislá PKA), Y200 (Src kinasa), T370 (c-AMP závislá PKA), T704 (c-AMP závislá PKA, CaMK-II), S502 (PKC, c-AMP závislá PKA), S774 (cAMP závislá PKA), S800(PKC), S820 (c-AMP závislá PKA) (Jeske et al, 2009, Rathee et al., 2003). Proteinkinasy PKC, PKA, fosfatasa kalcineurin, fosfolipasa C a další intracelulární enzymy jsou k TRPV1 kanálu navázány pomocí proteinkinasu A vázajícího proteinu, zkráceně AKAP (Zhang et al., 2008). AKAP také zprostředkovává modulaci TRPV1 zánětlivými mediátory, jako jsou bradykinin a prostaglandin E2 (Zhang a McNaughton, 2008). Výčet možností aktivace není zcela jistě vyčerpávající, což vyplývá z „multifunkčnosti“ a „centrálnosti“ TRPV1 jakožto molekulárního integrátoru nociceptivních podnětů. Cílem této kapitoly bylo ukázat šíři a komplexnost dějů, na nichž se tento kanál podílí. 3. 1. 4. Mechanismy desenzitizace TRPV1 Desenzitizace

znamená

snižování

odpovědi

receptoru

či

kanálu

za přítomnosti agonisty. Typickým příkladem je působení kapsaicinu na TRPV1. Dochází ke konformačním změnám uzavírajícím iontový kanál, čímž ztrácí dočasně či trvale funkci. Na tento proces má vliv zejména hladina Ca2+ a defosforylace TRPV1 (Numazaki et al., 2003). Jelikož TRPV1 preferenčně propouští vápenaté

- 26 -

ionty, jejichž vysoká intracelulární koncentrace buňkám škodí, má desenzitizace ochrannou funkci. Desenzitizace TRPV1 probíhá přinejmenším dvěma způsoby. Prvním z nich je defosforylace klíčové aminokyseliny S502 fosfatázou kalcineurinem závislým na Ca2+, čímž se snižuje aktivita kanálu (Zhang et al., 2008). Druhou variantou je vazba kalmodulinu, který se po navázání vápenatých iontů váže na C- i N-konec TRPV1. Na C-konci blokuje vazebné místo pro Src kinasu a na N-konci pro kinasy PKC a cAMP dependentní PAK, tudíž nemůže dojít k fosforylaci a kanál je desenzitizován. Desenzitizace je stav dlouhotrvající (> 20 minut) díky konformačním změnám, které se při ní projevují (Mohapatra a Nau, 2003). Existuje celá řada látek, které podobně jako kapsaicin umožňují desenzitizaci TRPV1 receptor. Mezi ně patří syntetický analog kapsaicinu kapsazepin, piperin, syntetické vaniloidy jako olvanil a nuvanil. Vedle těchto látek mají podobný vliv také oxidační činidla, jako je například Cu(II)-phenantrolin. Ta snižují aktivitu kanálu oxidací cysteinových zbytků v oblasti P-loop, která tvoří pór TRPV1. Vznikají tím disulfidické můstky stabilizující nativní neaktivní stav proteinu. Pravděpodobnost otevření kanálu je dána poměrem mezi počtem redukovaných a oxidovaných cysteinových zbytků. Oxidační činidla působí jako nekompetitivní antagonisté (Krause et al., 2005). 3. 1. 5. Funkce TRPV1 v nervové soustavě TRPV1 je exprimován především na periferních částech primárních aferentů či na jejich presynaptické membráně, nicméně vzhledem k jeho distribuci i v CNS byla zkoumána i jeho úloha v neuronech míchy a mozku. Úlohu tohoto kanálu na primárních aferentech lze rozdělit na periferní a centrální, neboť na periferním zakončení nociceptivních vláken je TRPV1 vystaven zcela jiným vlivům než na terminálách v míše, kde Aδ a C vlákna vytvářejí synapse s míšními neurony. Periferní zakončení mohou být ovlivňována bolestivou změnou teploty (nad 43°C) či mechanicky (tlakem), nefyziologicky různými exogenními látkami (např. H+, kapsaicin), ale také mediátory zánětu uvolněnými z poškozené tkáně (např. PGE2, TNFα, H+, bradykinin). TRPV1 zde tudíž fungují jako centrální aktivátory nociceptivních zakončení. Díky jejich vlastní aktivaci (viz kapitola 3. 1. 4. Aktivace a modulace TRPV1) je zvýšena intracelulární koncentrace vápníku, což způsobuje spuštění celé řady signálních kaskád a uvolnění substance P a CGRP (calcitonine-gene related peptid) ze senzorických zakončení. Tyto látky vyvolávají neurogenní zánět, který je součástí mnoha nemocí jako například astma, ekzém, psoriáza a migrény (Szallasi et al., 2007). Vedle toho se neuron depolarizuje

- 27 -

a vzniká akční potenciál putující do CNS. Avšak aktivace TRPV1 receptorů na periferních

nociceptorech

vysokou

koncentrací

kapsaicinu

může

vést

po

desenzitizaci až k degeneraci senzorických terminál a vyvolání dlouhodobé lokální anestezie (Simone et al., 1998; Pospíšilová a Paleček, 2006). Degeneraci nociceptivních vláken způsobuje dlouhodobý vtok Ca2+ do buňky, kdy po překročení určité koncentrace dochází k apoptotickým procesům v neuronu. Na periferii umožňuje TRPV1 transdukci nociceptivního podnětu (bolestivé teplo, bolestivý mechanický podnět) do elektrického stimulu – akčního potenciálu. S ním se na tom podílejí i další receptory z TRP rodiny, zejména TRPA1 (Patapoutian et al., 2009). Vaniloidní receptor 1 a TRPA1 mají výrazný vliv na periferní senzitizaci (viz obr. 5). Zmíněný vzrůst exprese (obr. 5) při periferní senzitizaci se však týká pouze zánětu nebo poranění tkáně, nikoliv však při poškození axonu (neuropatická bolest), kdy naopak na daném nociceptivním vláknu exprese TRPV1 kanálu klesá (Facer et al., 2007; Michael a Priestly, 1999). V případě neuropatického stavu dochází i k atrofii poškozeného nervového vlákna. Vedlejší, neporaněná vlákna vykazují zvýšenou expresi TRPV1, který je anterográdně transportován do periferního zakončení (Fukuoka et al., 2001). Tento jev může souviset s rozvojem a přetrváváním neuropatické bolesti, protože zvýšený počet TRPV1 receptorů je jedním z prvků s tím související hyperalgesie a allodynie (Hudson et al., 2001).

Obrázek 4 Periferní senzitizace Díky vzniku zánětu (poraněním, infekcí) je produkována celá řada zánětlivých faktorů, jejichž působení na senzorické zakončení nociceptoru spouští signální kaskády vedoucí k fosforylaci TRP kanálů, jejich zabudování do membrány. Některé růstové faktory (NGF) jsou transportovány retrográdně do těla neuronu v DRG, kde zvyšují skrze MAP kinázovou a p38 dráhu expresi TRPV1 kanálu. Ten je následně transportován do periferního zakončení. Tím může dojít až ke změně chemického fenotypu buňky a výsledkem toho je snížený prahu bolesti v zanícené oblasti tkáně (Patapoutian et al., 2009).

- 28 -

Na míšních terminálách Aδ a C vláken aktivace TRPV1 kanálů stimuluje výlev glutamátu, aspartátu, substance P a CGRP z těchto presynaptických zakončení. Substance P a CGRP samy podporují výlev neurotransmiterů glutamátu a aspartátu. To umožňuje zvýšení miniaturních i spontánních EPSC, a tím TRPV1 přispívá k vyvolání vjemu bolesti v člověku (Zhou et al., 2009). Výlev glutamátu z primárních aferentů působí jednak na excitační sekundární neurony, které exprimují na postsynaptické membráně ionotropní glutamátové receptory, za druhé, nepřímo tzv. heterosynapticky, působí na inhibiční GABAergní či GABA/glycinergní neurony v lamině II, která je pro nocicepci velmi důležitá. Nepřímé působení probíhá skrze míšní interneurony, které integrují informaci nociceptivní signál z aferentů. Tyto

interneurony

jsou

excitovány

působením

glutamátu

ze

zakončení

nociceptivních vláken, čímž u nich dochází k výlevu glutamátu na synapsi s inhibičním neuronem v lamině II. Glutamát zde působí přes své metabotropní receptory (mGluR ze skupiny II a III), kdy je následně snížen výlev inhibičního neurotransmiteru (GABA) (Zhou et al., 2007). Pokles inhibičním proudů může přispívat k zesílení bolestivého vjemu a rozvoji hyperalgesie a allodynie. Bylo však také prokázáno, že přímým působením kapsaicinu na synapsi s inhibičními GABAergními neurony se zvyšuje frekvence spontánních IPSC (Zhou et al., 2007). Tento efekt je závislý na přítomnosti a aktivaci NK1 receptorů (substance P), nikoliv na výlevu glutamátu, na těchto neuronech (Ferrini et al., 2007). Stimulace TRPV1 receptorů

na

primárních

aferentech

vede

k výlevu

dalšího

inhibičního

neurotransmiteru, glycinu (Zhou et al., 2008). Glycin, kromě své inhibiční funkce, také facilituje působení glutamátu na NMDA receptory, tudíž zůstává otázkou, zda zvýšená koncentrace glycinu funguje jako negativní zpětná vazba nociceptivního podnětu či jako zesilující efekt. Zhou a jeho kolegové navrhují vzhledem k získaným datům první variantu (Zhou et al., 2008). Stejně jako na periferii i na míšních synapsích primárních aferentů se zvyšuje exprese TRPV1 v průběhu chronického zánětu (Ji et al., 2002). TRPV1 se zde podílí na rozvoji mechanické allodynie oproti periferním vaniloidním kanálům, jejichž přítomnost hraje roli v tepelné hyperalgesii (Cui et al., 2006). Bylo také prokázáno excitační působení kapsaicinu na glutamátergní neurony DH v míšních řezech zbavených primárních aferentů dorzální rhizotomií či RTX léčbou. To ukazuje na expresi TRPV1 na těchto buňkách. Vaniloidní receptor 1 zde zesiluje excitační transmisi nociceptivního signálu primárních aferentů (Zhou et al., 2009). Vedle TRPV1 je na glutamátergních neuronech DH exprimován i μ opioidní

- 29 -

receptor, jehož aktivace inhibuje tyto neurony, což by mohlo vysvětlovat vysokou účinnost opioidních analgetik (Zhou et al., 2009). Vzhledem k rozšířenosti TRPV1 v mozku nelze předpokládat, že jeho úloha spočívá pouze v integraci a senzitizaci nociceptivních podnětů. Přesto, díky nedávno vyvinutým antagonistům tohoto kanálu A-784168 a A-795614, se ukazuje, že TRPV1 i v mozku plní roli v modulaci bolesti (Cui et al., 2006). Další výzkum antagonistů TRPV1 schopných projít hematoencefalickou bariérou by mohl napomoci při léčbě bolestivých stavů, zejména chronických a neuropatických. V hipokampu, struktury zodpovědné za paměť, prostorovou orientaci a některé

emoční

pochody,

funkce

TRPV1

spočívá

ve

vyvolání

LTD

na interneuronech a LTP v zadním hipokampu (Gibson et al., 2008; Marsch et al., 2007). Jeden z navržených mechanismů je podobný inhibici GABAergních neuronů v zadním rohu míšním. TRPV1 se vyskytuje presynapticky na excitačních glutamátergních zakončeních. Po výlevu glutamátu jsou na interneuronech aktivovány metabotropní glutamátové receptory, jež stimulují cyklooxygenasu. Ta produkuje mj., 12-S-HPETE, která otevírá presynaptický TRPV1 kanál. Vtok Ca2+ spouští signální kaskádu vedoucí k dlouhodobému snížení výlevu glutamátu, což je jedním z principů long-term deprese v hipokampu (Gibson et al., 2008). Přítomnost TRPV1 v hipokampu navíc podporuje studie neuroprotektivních účinků rimonabantu, který je zároveň antagonistou CB1 receptorů. Neuroprotektivita díky TRPV1 byla prokázána podáním kapsazepinu, který je selektivním antagonistou těchto receptorů (Pegorini et al., 2006). Behavioriální pokusy na kmenu myší s knock out genu TRPV1 ukazují vliv tohoto kanálu na úlekové reakce, kontextovou paměť související se strachem (LTP) a regulaci úzkostného chování (Marsch et al., 2007). Knock out myši vykazovaly slabší reakce na všechny typy testů než TRPV1 wild type kmen. Tyto jevy vysvětlují autoři působením CB1 receptorů, jejichž aktivace dokázala potlačit vrozenou úzkost, strach i LTP. Za běžného stavu (přítomnosti obou) jsou CB1 a TRPV1 receptory zčásti aktivovány stejnými látkami, např. anandamidem a N-arachidoyldopaminem, v závislosti na jejich koncentraci. V oblastech, kde jsou exprimovány zároveň, dochází k jejich antagonistickému působení. To je velmi důležité při hledání léků ve formě antagonistů proti těmto látkám. Periakvaduktální šeď hypothalamu také obsahuje TRPV1 receptory, zde na zakončeních míšních projekčních neuronů. Ovlivňují pouze glutamátergní neurony v této oblasti a zvyšují výlev glutamátu ze zakončení (Li et al., 2004). Dochází k aktivaci hypothalamických neuronů a následné zvýšené stimulaci sympatické dráhy, která do značné míry řídí homeostázu celého organismu. Tato studie uvádí jako teoretickou možnost aktivace TRPV1 v hypothalamu endogenními látkami

- 30 -

NADA a OLDA, podobně jako ve studiích na těchto receptorů v míše (Špicarová a Paleček, 2009; Špicarová a Paleček, 2008), avšak pokusy v ní byly prováděny pouze s kapsaicinem. Přes značnou rozšířenost TRPV1 v mozku, stále největší úsilí je věnováno zkoumání jeho funkce při bolestivých stavech, a to zejména na periferní a míšní úrovni. Nejinak tomu je i v této diplomové práci. Jeho aktivita může být modulována mnoha látkami, které jsou považovány za nedílnou součást imunitního systému. Následující kapitola se zabývá jednou z nich, TNFα, jejíž účinek na bolestivé pochody má mnohem širší dopad než „jen“ ovlivnění TRPV1 receptorů. 4. Tumor necrosis factor alpha TNFα je neopominutelnou složkou mnoha pochodů spojených s nocicepcí a zvláště patologickými stavy bolesti, při nichž vzrůstá citlivost neuronů a glií vůči této bílkovině. Ovlivnění působení TNFα může být jednou z cest k útlumu patologické bolesti, jako je neuropatická bolest. Tumor nekrotizující faktor alfa je jedním z mnoha zánětlivých cytokinů. Poprvé byl izolován v roce 1975 Oldem a jeho kolegy (Carswell et al., 1975). Je důležitým faktorem pro modulaci imunitního systému, apoptózy, zánětech, sepsi a v neposlední řadě jako ochranný protinádorový prvek. Patří také mezi tzv. proteiny akutní fáze, které jsou vylučovány v případě poranění do krevního oběhu. TNFα se vyskytuje nejen v imunitních buňkách typu makrofágů, mastocytech, ale i v gliových a nervových buňkách, kde je produkován jako odpověď na mnoho vnějších i vnitřních stimulů (Männel, 1986). TNFα je cytotoxický pro poškozené buňky či změněné (nádorem, infekcí). Zdravé buňky může aktivovat, stimulovat k proliferaci či diferenciaci. TNFα vyvolává své odpovědi díky působení na své receptory označované jako TNFR1 (TNF receptor type 1; CD120a; p55/60) a TNFR2 (TNF receptor type 2; CD120b; P75/80). TNFR1 je exprimován ve všech tělních buňkách, TNFR2 v buňkách imunitního systému (Wajant et al., 2003). Oba receptory jsou aktivovány jak membránovou, tak solubilní formou TNFα, o nichž bude řeč v podkapitole Struktura. TNFR2 je však plně aktivován pouze membránovou formou tumor nekrotizujícího faktoru alfa (Wajant et al., 2003). Vedle toho vázají také příbuzný protein lymphotoxin-α (TNF-β).

4. 1. Struktura TNFα se vyskytuje ve dvou formách. První je monomerní transmembránový prekurzor o 233 aminokyselinách (26 kDa) produkovaný především aktivovanými

- 31 -

makrofágy (Black et al., 1997). V membráně tvoří stabilní homotrimery. Druhá se tvoří jejich odštěpením od membrány metaloproteázou TACE (TNFα converting enzyme), (Black et al., 1997). Tyto solubilní homotrimery mají molekulovou hmotnost 51 kDa. Podjednotky TNFα se skládají z antiparalelních β-listů, které dohromady vytvářejí „jelly-roll“ (česky roláda) strukturu. Tato struktura je typická pro cytokiny, ale i pro virové kapsidové proteiny (Bazan, 1993).

Obrázek 5 Struktura monomeru TNFα. Modré šipky znázorňují β-listy (Wikipedia, 2010).

4. 2. Signalizační kaskády TNFα TNFα signalizace spočívá ve třech hlavních směrech. Jeden vede k aktivaci jaderného faktoru κB (NF-κB) a druhý k aktivaci kaspáz a apoptóze. Třetí slouží k aktivaci transkripčního faktoru AP-1, který se skládá z proteinů c-Fos a c-Jun (Wajant et al., 2003). Jedná se o MAPK dráhu. Tato dráha je důležitá pro nocicepci, jak bude vysvětleno dále. Vzájemné ovlivňování všech tří kaskád je založeno na fosforylaci TNFR a je tkáňově specifické. Přesné molekulární mechanismy tohoto jevu, tzv. cross-talk, jsou stále předmětem zkoumání (Ihnatko a Kubeš, 2007). Homotrimery TNFα se váží na cystein bohaté oblasti TNFR1 (nebo R2). Dochází

ke

konformačním

změnám

receptoru

a

umožňuje

formování

intracelulárních proteinových komplexů vázaných na receptor (viz obr. 6). Nejprve se uvolňuje inhibiční protein SODD (silencer of death domain) z death domény – DD (tu má pouze TNFR1, nikoliv R2), což umožňuje vazbu řadě proteinů, které spolu navíc navzájem interagují (Jiang et al., 1999). Jedná se o adaptorový protein TRADD (TNF receptor-asociovaný DD protein), jenž funguje jako lešení pro další bílkoviny – RIP (receptor interacting protein), TRAF2 (TNF-receptorem asociovaný faktor) a FADD (fas-associated DD protein) – v závislosti na druhu spouštěné signální kaskády. Aktivace NF-κB, resp. AP-1, je způsobena komplexem TNFα/receptor/TRADD/RIP/TRAF2.

Apoptóza, - 32 -

resp.

aktivace

AP-1,

naopak

komplexem TNFα/receptor/TRADD/FADD (Ihnatko a Kubeš, 2007). Transkripční faktor AP-1 může být tedy spouštěn jak přes TRAF2 a RIP a další proteiny (ASK1, MKK, JNK), tak pomocí FADD a kapsázové signální kaskády vedoucí k apoptóze (Wajant et al., 2003). Aktivace NF-κB začíná vazbou TRADD na TNF-R1 s TNFα. K TRADDu se připojuje kináza RIP a TRAF, který k sobě připoutává IKK (IκB kináza). RIP fosforyluje IKK, čímž ji aktivuje. IKK následně fosforyluje inhibiční protein NF-κB (IκB), který tvoří komplex s NF-κB. Tím dochází k rozpadu komplexu a odhalení translokačního jaderného místa na NF-κB. Tento transkripční faktor putuje do jádra, kde spouští transkripci mnoha proteinů umožňujících proliferaci, zánětlivou odpověď (produkce cytokinů), a produkci antiapoptotických faktorů, např. Bcl-2 (Chen a Goeddel, 2002). Kaspázová dráha vedoucí k apoptóze je často maskována antiapoptotickým efektem NF-κB kaskády. FADD aktivuje kaspázu-8, protein ze skupiny cysteinových proteáz, jejichž hlavní úloha spočívá v programové buněčné smrti, nekróze a zánětlivých procesech. Kaspáza-8 štěpením aktivuje další kaspázy. Mezi nimi kaspázu-3, která vedle funkce v apoptóze stimuluje MEKK1 (mitogenem aktivovaná protein kináza), což je jedna z klíčových bílkovin v kaskádě aktivace transkripčního faktoru AP-1 – viz obrázek 6 (Wajant et al., 2003).

Obrázek 6 Signalizační kaskády TNFα a TNF-R1. Šedé přerušované šipky zahrnují více kroků. Rudé tečky vyznačují jádro, lebka – apoptóza. Červená šipka značí propojení proapoptotické dráhy s aktivační drahou AP-1 (upraveno, Wikipedia 2010).

TNFα vyvolává silnou aktivaci MAPK dráhy vedoucí k aktivaci c-Jun Nterminální kinázy (JNK), resp. transkripčního faktoru AP-1. Vedle toho evokuje i další MAPK dráhu, p38-MAPK, díky níž jsou aktivovány jiné transkripční faktory – p53, ELK1. Počátek těchto drah je společný (TNFα → TNF-R → TRADD → - 33 -

TRAF2). JNK je aktivována dalším sledem reakcí, kdy TRAF2 stimuluje kinázy ASK1 (apoptosis signal-regulated kinase-1) a MEKK1, které fosforylují další kinázu MKK7. ASK1 také reaguje na přítomnost volných kyslíkových radikálů (ROS). Její hlavní úloha spočívá v TNFα nebo ROS indukované apoptóze (Tobiume et al., 2001). Kináza MKK7 fosforyluje JNK, čímž tomuto proteinu umožní vstup do jádra. Tam JNK přidává fosfátové zbytky na seriny či threoniny řady transkripčních faktorů. Touto reakcí zesiluje JNK jejich působení, nebo je přímo aktivuje. Jedním z nich je i c-Jun, který vzápětí dimerizuje s dalším aktivovaným transkripčním faktorem c-Fos, a dohromady vytvářejí protein AP-1 (Shaulian a Karin, 2002). Výsledkem je exprese genů, resp. proteinů, podporujících buněčnou diferenciaci a proliferaci. Jedním z takto exprimovaných proteinů může být i TRPV1 (Kochukov et al., 2009). Naopak, pokud c-Jun dimerizuje s již zmiňovaným ATF-2, dochází k downregulaci c-Fos a následné apoptóze. To se týká zejména neuronální apoptózy (Yuan et al., 2009). Mapování komplexu signálních kaskád začínající TNFα zcela jistě není u konce, jejich vzájemnou provázanost jsem se pokusil naznačit v této kapitole. Následující oddíl se zabývá působením TNFα v nervové soustavě. 4. 3. Funkce v nervové soustavě Přestože je mozek imunologicky privilegovaná tkáň, i v něm může probíhat zánět a další procesy spojené s imunitní odpovědí. A to nejen za patologických podmínek. Mnoho neurologických chorob, jakými jsou Parkinsonova a Alzheimerova demence, je spojeno s expresí cytokinů, zánětlivými pochody a průnikem bílých krvinek do mozku (Keigan et al., 2008). Tumor nekrotizující faktor alfa je exprimován v CNS astrocyty, mikrogliemi a samotnými neurony. Stejně jako další cytokiny (IL-1 – 4, -6, TGFβ ad.) TNFα moduluje funkci nervové soustavy (Hanisch, 2002). Jedním z mechanismů působení je výlev neuropřenašečů a neuromodulátorů z gliových buněk, například glutamátu a NO. Vedle toho mikroglie samy produkují tento cytokin i v jeho solubilní formě. Tím může přímo na nervových buňkách stimulovat inzerci kainátových a AMPA receptorů do membrány (Ogoshi et al., 2005), v myším kortexu navíc zvyšuje aktivitu NMDA receptorů (Jara et al., 2007), čímž také senzitizuje buňky vůči glutamátu. Další možností ovlivnění hladiny vápníku pomocí TNFα je regulace exprese IP3 receptorů. To je způsobeno aktivací JNK dráhy a tato změna koncentrace vápníku je nezávislá na jeho vtoku, Ca2+ dependentním uvolňování vápníku i na Ca2+ clearance (Keigan et al., 2008). Receptory IP3 po vazbě svého agonisty (inositol – 1, 4, 5 – trisfosfát) uvolňují tento důležitý kationt

- 34 -

z vnitrobuněčných koncentrace Ca

2+

zásob

v endoplazmatickém

retikulu.

Zvýšená

endogenní

vyvolává neuronální stres a jedním z možných následků je

buněčná smrt. TNFα však v nervové soustavě působí i pozitivně, „neapopticky“. Podporuje remyenilizaci, tedy proliferaci či regeneraci oligodendrocytů, a to působením přes TNFR2 receptory (Arnett et al, 2001). Zabraňuje také apoptóze neuronů v přítomnosti

β-amyloidu,

který

je

pravděpodobně

hlavní

příčinou

vzniku

Alzheimerovy choroby. V tomto případě je podporována NF-κB kaskáda, díky níž je potlačeno hromadění ROS a vápníku (Barger et al., 1995). Z hlediska této práce je nejdůležitějším vliv cytokinu TNFα na nocicepci. Jak je uvedeno v předchozí kapitole, TNFα spouští signalizační kaskádu vedoucí mimo jiné i k expresi TRPV1 kanálu. Vedle toho zvyšuje produkci eikosanoidů, především prostaglandinu E2, jehož působením dochází k modulaci aktivity TRPV1. Obecně, prostaglandiny se podílejí na vzniku allodynie a hyperalgesie, ať v periferních oblastech nebo míše. Také zesilují odpovědi na zánětlivé faktory, jakým je například bradykinin (Huang et al., 2006). Přítomnost TNFα byla prokázána i při vzniku a rozvoji neuropatické a zánětlivé bolesti (Schäfers et al., 2003a). Jedním z mechanismů neuropatické bolesti je tzv. long-term potenciace (LTP) na synapsích C-vláken v zadních rozích míšních (Zhang et al., 2004). Dochází k senzitizaci spinálních neuronů vůči periferní stimulaci zvýšením počtu receptorů na synapsi i jejich vyšší aktivitě. Jednou z možností pro vyvolání LTP je působení TNFα, kdy jsou aktivovány dráhy NF-κB, JNK a p38, další MAPK kaskády (Liu et al., 2007). Důležitou součástí vzniku LTP je také aktivace mikroglií, resp. exprese proteinů v těchto buňkách a interakce s neurony, v míše, což je taktéž podmíněno přítomností TNFα (Ikeda et al, 2007; Zhong et al., 2010). Nedávná studie Zhoua a jeho kolegů naznačuje, že podobnou roli jako tumor nekrotizující faktor alfa by mohl mít BDNF (brain-derived neurotrophic factor), který je schopen aktivovat tytéž transkripční faktory – p38 MAPK a NF-κB (Zhou et al., 2007). Exogenní TNFα podaný intraneurálně vyvolává hyperalgesii a allodynii (Wagner a Myers, 1996). Jak bylo prokázáno na myších s „vypnutým“ TRPV1 genem, TNFα aplikovaný na periferii nevyvolává tepelnou hyperalgesii sám o sobě, na rozdíl od mechanické. Vedle výše uvedených působení tumor nekrotizujícího faktoru alfa v nervové soustavě byl prokázán jeho vliv i na hipokampus, kortex a další části mozku, s přihlédnutím na rozšíření jeho receptorů v CNS (Kinouchi et al., 1991).

- 35 -

5. Geny časné odpovědi – c-Fos a c-Jun – a nocicepce Studium genů časné odpovědi je nezbytné pro pochopení dějů v buňce následující po jejím podráždění, jakým může být nociceptivní podnět. Geny časné odpovědi v tomto případě vyvolávají změny, jejichž důsledkem může být i senzitizace neuronů při stavech neuropatické bolesti. Do dané skupiny patří celá řada genů kódující proteiny, které jsou exprimovány jako první odpověď na stimulaci buňky. Mezi tyto bílkoviny patří i virové regulační proteiny, které jsou syntetizovány těsně po infekci buňky. K nim homologní jsou buňkám vlastní transkripční faktory, řadící se také mezi geny (resp. proteiny) časné odpovědi, jako je c-Fos, c-Jun a c-Myc, označované jako protoonkogeny (potenciálně onkogenní). Vedle transkripčních faktorů spadají do této skupiny i růstové faktory, jejich receptory a cytoskeletární proteiny. Všechny tyto bílkoviny, ať už přímo, nebo nepřímo, ovlivňují expresi dalších, a proto jsou vstupní branou genomické odpovědi buňky. Podílejí na proliferaci buněk, odpovědi na ischemii, nebo nervové podněty (Sukhatme, 1991). V rámci nocicepce je významným ukazatelem neuronové aktivity transkripční faktor c-Fos, jehož klidová koncentrace v míše je nízká, ale po nociceptivním podnětu dochází k prudkému zvýšení jeho exprese. C-Fos je tedy možné využít jako marker nociceptivní aktivace, neboť produkce tohoto transkripčního faktoru v míše je omezena právě na tento druh stimulů a to i anatomickou příslušností k lamině I, II a V zadních rohů míšních, kam vedou Aδ a C-vlákna. Tato výlučnost však neplatí pro neuropatickou bolest, kdy c-Fos je exprimován i v lamině III a IV, kde se přepínají Aβ-vlákna, jež běžně nevedou bolest. Jejich aktivace v neuropatických stavech může částečně vysvětlovat allodynii při nich pozorovanou (Munglani a Hunt, 1995). C-Fos a c-Jun dohromady tvoří transkripční faktor AP-1, díky němuž dochází v DH ke zvýšené expresi neuropeptidů, opioidů, růstových faktorů, ale také TRPV1 (Kochukov et al., 2009). To vede k modulaci synaptického přenosu, strukturním a funkčním změnám synapsí směrem k nárůstu citlivosti vůči nociceptivním podnětům (Munglani a Hunt, 1995). Jedná se o součást tzv. centrální senzitizace (Scholz a Woolf, 2002). 6. Neuropatická bolest Fyziologická bolest je velmi komplexním a komplikovaným jevem, který lze studovat na mnoha úrovních, a dosud nejsou zcela objasněny všechny mechanismy, jimiž působí. Pokud však přestane plnit svoji funkci a stane patologickým symptomem či nemocí, mechanismy jejího vlivu se změní. Zkoumání

- 36 -

tohoto zvratu, zejména na míšní úrovni synapsí primárních aferentů, je velmi důležité pro pochopení a vývoj analgetik účinných při těchto stavech. Velkou pozornost si zaslouží vývoj modulace synaptického přenosu, na níž se mimo jiné podílejí, dosud ne zcela vysvětlenými mechanismy, TRPV1 kanály a tumor nekrotizující faktor alfa. Neuropatická bolest je chronická bolest způsobená poškozením nebo dysfunkcí nervového systému. Často se projevuje jako druhotný symptom některých autoimunitních chorob (roztroušená skleróza), metabolických (diabetes mellitus), infekcí (pásový opar), cévních nemocí (infarkt), traumat a rakoviny či jako vedlejší efekt chemoterapeutické léčby (Campbell a Meyer, 2006, Matsumoto et al., 2006). Jakožto druh chronické bolesti (v některých případech) však může být považována za samostatné onemocnění projevující se vnímáním bolesti bez adekvátních stimulů (spontánní bolest), allodynií, hyperalgesií a také ztrátou senzorických schopností poškozených nervů. Přes dlouhodobý charakter neuropatické bolesti, řada mechanismů s ní spojených se projevuje již po krátké době v řádu dní. U neuropatické bolesti je vždy poškozena nociceptivní signální dráha. Nejedná se ale pouze o poškození periferních nervů (např. syndrom karpálního tunelu), ale může jít i o poranění míchy nebo poruchu přímo v mozku (např. po mozkové mrtvici v oblasti thalamu) (Scholz a Woolf, 2002). 6. 1. Mechanismy neuropatické bolesti Vznik a trvání neuropatické bolesti je provázen řadou změn jak v periferní, tak centrální nervové soustavě na buněčné i molekulární úrovni. Periferně dochází k následujícím jevům (Bridges et al., 2001; Ueda, 2008): 1. Senzitizace nociceptorů 2. Změny v expresi iontových kanálů 3. Ektopické a spontánní výboje (akční potenciál) 4. Demyenilizace Aβ a Aδ vláken a jejich efáze - laterální spojení dvou nervových buněk, kdy signály mezi nimi jsou přenášeny přímo v tomto kontaktu membrán a ne přes synapsi (Mosby's Medical Dictionary, 8th edition, 2009) 5. Efáze Aδ a C vláken 6. Souběžné „pučení“ výběžků primárních aferentů – vznik nových synapsí mezi nimi, nahrazení poškozeného vlákna 7. Inervace DRG vlákny sympatických neuronů Centrálně se projevují tyto změny (Bridges et al., 2001): 1. Centrální senzitizace

- 37 -

2. Spinální reorganizace 3. Kortikální reorganizace 4. Pokles inhibičních proudů K senzitizaci nociceptorů v DRG dochází díky ostatním uvedeným procesům. Změna exprese se týká zejména Na+ a Ca2+ iontových napěťově řízených kanálů. Sodné kanály lze rozdělit na TTX-senzitivní a TTX-rezistentní, které se za normálního stavu vyskytují na tělech neuronů C-vláken. Po nervovém poranění dochází k výrazné upregulaci TTX-senzitivních kanálů, konkrétně typu III, jenž se běžně nenachází v DRG, na úkor rezistentní skupiny (Waxman et al., 1994). Jeden z TTX-rezistentních kanálů je následně exprimován v místě poškození vlákna, někdy také označovaného jako neuroma. To by mohlo vysvětlovat hypersenzitivitu v této oblasti (Bridges et al., 2001). Zde hraje velmi důležitou roli NGF, jehož přítomnost podporuje produkci TTX-rezistentních kanálů. Všechny tyto pochody hrají neopominutelnou úlohu při vzniku ektopických a spontánních akčních potenciálů. Je to umožněno snížením prahového potenciálu a velmi rychlou regenerací sodíkových kanálů po vzniku akčního potenciálu (Waxman et al., 1999). Blokováním TTX-senzitivních kanálů typu III je možno omezit allodynii. Napěťově řízené kanály pro vápník typu N ovlivňují vznik allodynie a hyperalgesie, které je možné ztlumit antagonisty tohoto kanálu nebo aktivací kanabioidního receptoru 1 (CB1) (Bridges et al., 2001). Následná větší napěťová citlivost a zvýšená frekvence akčních potenciálů vede nejen ke spontánní bolesti, ale i centrální senzitizaci, která je však tvořena i dalšími mechanismy. Souběžná

regenerace

sensorických

axonů

umožňuje

inervaci

oblastí

denervovaných nervovým poraněním. Tento jev byl pozorován ve dvou modelech neuropatické bolesti označovaných jako SCI a CCI, o nichž bude řeč v následující kapitole. Je podporován NGF vylučovaným z přítomných imunitních buněk a keratinocytů

a

bývá

považován

rovněž

za

jednou

z příčin

pozorované

hyperalgesie, byť korelace mezi prorůstáním sensorických axonů do denervovaných oblastí a závažností hyperalgesie není jednoznačná (Kingery a Vallin, 1989). V nedávné době bylo prokázáno na modelu neuropatické bolesti CCI, že další růstový faktor, neurotrofin-3 (NT-3), působí antagonisticky proti NGF a snižuje expresi řady receptorů, kanálů (např. TTX rezistentních) a látek majících vliv na rozvoj patologické bolesti, včetně samotného NGF a receptoru pro něj, TrkA (Wilson-Gerwing et al., 2005, Wilson-Gerwing et al., 2008). Jedním z potlačených receptorů je TRPV1, kdy NT-3 spouští p38 MAPK signální dráhu a dochází k atenuaci exprese vaniloidního receptoru, čímž je negativně ovlivněna tepelná hyperalgesie. Za fyziologického stavu NT-3 se nachází v kůži ve vyšší koncentraci

- 38 -

než NGF, ale jeho koncentrace velmi dramaticky klesá při vzniku zánětu. Tato změna přispívá k rozvoji hyperalgesie a její objev naznačil roli NT-3 v regulaci nociceptivních mechanismů (Watanabe et al., 2000). Inervace sympatických vstupů směrem k senzorickým neuronům ve spinálních gangliích zvyšuje excitabilitu v DRG. Tvoří se synapsím podobné struktury mezi sympatickými vlákny a těly neuronů DRG. Hypotézu, že abnormální excitabilita je podporována propojením sympatických vláken s DRG, podporují elektrofyziologické studie stimulace sympatických nervů, při nichž dochází ke zvýšené ektopické aktivitě senzorických vláken (Devor et al., 1994). Centrální senzitizaci lze popsat mnoha změnami mechanismů, které modulují synaptický přenos na míšní úrovni. K této modulaci dochází dvěma hlavními způsoby. Jednak posttranslační modifikací iontových kanálů, receptorů, popřípadě jejich regulačních proteinů. Druhou možností je změna exprese receptorů a iontových kanálů v zadním rohu míšním i primárních aferentních vláken a regulace jejich inzerce do membrány neuronů či internalizace do cytosolu (Ji et al., 2003). Nocicepce je pak signalizována nejen nociceptivními aferenty, ale i jinými primárními senzorickými vlákny (Aβ), jež běžně odpovídají na taktilní podněty, nikoliv na bolest. Centrální senzitizace je však především spojena s výrazně zvýšenou citlivostí sekundárních nociceptivních neuronů v zadních rozích míšních vůči aferentním senzorickým vstupům (Wall, 1993). Důležitou

roli

v centrální

senzitizaci

hraje

zvýšený

výlev

glutamátu

a neuropeptidů ze synapsí primárních aferentů a zvýšení počtu receptorů na postsynaptické membráně, které na ně odpovídají. Vyšší výlev glutamátu z příchozích vláken může být způsoben aktivací přítomných TRPV1, P2X3 receptorů, tvorby prostaglandinů cyklooxygenasou, aktivací presynaptických NMDA receptorů (Ji et al., 2003) a downregulací μ-opioidních receptorů na míšních neuronech (Kohno et al., 2005). Vedle většího počtu glutamátových receptorů je ovlivňována i jejich aktivita, zejména pomocí fosforylace podjednotek jak NMDA receptoru (NR1),

tak

AMPA

receptoru

(podjednotka

GluR1).

Klíčovým

receptorem

v centrální senzitizaci je ionotropní NMDA, jehož aktivace je nezbytná pro posílení excitačního synaptického přenosu (Bridges et al., 2001). Díky tomu je tento receptor cílem farmakologických studií, protože působení některých jeho antagonistů (např. MK-801) skutečně vedlo k utišení projevů neuropatické bolesti (Davar et al., 1991). Vedle NMDA se na centrální senzitizaci podílejí již zmiňované AMPA receptory, receptory

pro

substanci

P

(NK1),

BDNF

TRPV1(Thompson et al., 1999; Cui et al., 2006).

- 39 -

(trkB)

a v neposlední

řadě

Mezi krátkodobě posilující mechanismy u synaptického přenosu patří tzv. windup. Jedná se o nárůst počtu generovaných akčních potenciálů na neuronech zadních

rohů

míšních

při

Z excitovaných centrálních

opakované

nízkofrekvenční

stimulaci

C-vláken.

zakončení těchto vláken jsou vedle

glutamátu

uvolňovány také substance P a CGRP, které na postsynaptické membráně aktivují „své“ metabotropní receptory (Battaglia a Rustioni, 1988). Tím je způsobena pomalá depolarizace membrány, dochází k uvolnění Mg2+ z NMDA receptoru a je umožněna časová sumace vstupů. Díky tomu se zvyšuje pravděpodobnost vzniku akčního potenciálu. Wind-up se zřejmě podílí na vzniku sekundární hyperalgesie. Vedle této tzv. homosynaptické facilitace, kdy je zesilována účinnost synaptického přenosu vláken aktivovaných původním stimulem (např. wind-up), se v míše projevuje i heterosynaptická facilitace, v níž jsou posíleny synapse v tomto případě

nízkoprahových

Aβ

vláken,

které

běžně

nociceptivní

podněty

nezprostředkovávají. Heterosynaptickou facilitaci ovlivňuje míšní reorganizace po nervovém zranění a nejspíše také efáze Aβ vláken s Aδ, která jsou nociceptivní (Bridges et al., 2001). Za normálního stavu C a Aδ vlákna končí v superficiální oblasti DH, lamině I (Aδ) a II (C), a nízkoprahové mechanoreceptory Aβ ústí do laminy III a IV. V lamině V vstupy konvergují. Bylo ukázáno, že po přetětí sedacího nervu (n. ischiadicus) dochází k pučení mechanosenzitivních Aβ vláken do laminy II (Koerber et al., 1994, Woolf et al., 1992). V lamině II se nacházejí sekundární neurony, které za běžných podmínek vlastní především vstupy z vysokoprahových senzorických vláken, což se pučením mění a neurony v této oblasti následně dostávají po zranění signály z mechanoreceptorů (Woolf et al., 1995). To může vést ke „zmatení“ a desinterpretaci vstupního signálu, kdy běžný nízkoprahový senzorický vstup (vyvolaný např. dotykem) je vnímán jako nociceptivní podnět. Spinální reorganizací je tedy možné vysvětlit přítomnost mechanické allodynie v rámci neuropatické bolesti. Je však nutno podotknout, že k největšímu prorůstání nervových vláken do laminy II dochází až po dvou týdnech od nervového zranění (Woolf et al., 1995). Zároveň s pučením Aβ degenerují C-vlákna, která vytvářela původní synapse (Woolf et al., 1992). Obojímu je možné zabránit pomocí NGF, který se výrazně podílí nejen na proliferaci a diferenciaci neuronů, ale stimuluje i regeneraci C vláken (Krenz et al., 1999, Bennet et al., 1999). Následná studie Baa a jeho kolegů však zpochybňuje význam prorůstání Aβ vláken do laminy II, protože použité markery těchto aferentů jsou zároveň vychytávány i C vlákny (Bao et al., 2002). Jak bylo uvedeno v kapitole o TNFα, podmínkou pro vznik neuropatické bolesti je LTP na synapsích C vláken, která součástí mechanismů centrální senzitizace.

- 40 -

Někdy jsou tyto dva pojmy postaveny na roveň (Fang et al., 2002). Kromě TNFα dependentní

long-term

potenciace

je

možné

ji

vyvolat

krátkodobou

vysokofrekvenční stimulací C vláken (Randić et al., 1993). Tím dochází k dlouhodobé

homosynaptické

facilitaci

postsynaptické

membrány.

Vzrůstá

2+

intracelulární koncentrace Ca , částečně i díky vtoku NMDA receptory či TRPV1 kanálu, částečně uvolněním z vnitrobuněčných zásob. Touto změnou je aktivován kalmodulin, jenž spouští aktivaci CaMKII. Ta fosforyluje podjednotku GluR1 AMPA receptoru. Tím zesiluje jeho aktivitu a umožňuje inzerci ještě nezabudovaných AMPA receptorů do postsynaptické membrány (Fang et al., 2002). CaMKII způsobuje také fosforylaci transkripčního faktoru CREB, čímž ho aktivuje. Podobně působí i např. Erk kináza, což je také následek výlevu glutamátu a neuropeptidů ze zakončení primárních aferentů. Díky aktivitě CREBu jsou transkribovány nejprve časné geny (c-Fos, c-Jun aj.) a následně i geny pozdní odpovědi, mezi něž patří enzym cyklooxygenasa 2, prodynorfin, receptory pro BDNF (trkB) a substanci P – NK1 a mnoho dalších (Ji et al., 2002). Změny genové exprese mohou vést až ke změně fenotypu primárních senzorických neuronů (Campbell a Meyer, 2006). Opačný mechanismus k LTP, long-term deprese (LTD), je jedním z možných vysvětlení poklesu aktivity inhibičních neuronů. LTD je výsledkem internalizace AMPA receptorů ze synapsí. Vedle LTD je po zranění periferního nervu na inhibičních, GABAergních buňkách, snížen počet GABA receptorů, stejně tomu je i na míšních zakončení primárních aferentů (Kohn et al., 2005). Na GABAergních neuronech se snižuje i počet chlorido-draselného transportéru KCC2, což má za následek změnu rovnovážného potenciálu pro Cl- způsobujícím depolarizaci dostatečnou pro excitaci buňky. V souladu s těmito nálezy knockout KCC2 transportéru vede k hyperalgesii (Coull et al., 2003). Některé inhibiční neurony v DH podléhají zhruba po týdnu po nervovém zranění apoptóze. Jedním z důvodů může být nadměrný výlev glutamátu, který je ve vyšší koncentraci excitoxický, nebo působení TNFα uvolněného z mikroglií (Scholz et al., 2005). TNFα se podílí také na vzniku tepelné hyperalgesie, jak ukázala studie Sommera a Schäferse (1998). V míše je zvýšena exprese receptorů TNFR1 pro tento cytokin zejména na centrálním zakončení primárních aferentů, ale i na neuronech DH a gliích (Li et al., 2004). Dochází také k up-regulaci TNFR2 v poškozených neuronech v DRG, oproti TNFR1, které zvyšuje excitabilitu sousedních nepoškozených vláken, jak bylo ukázáno na zvířatech s porušenými míšními kořeny (Schäfers et al., 2008). Na rozvoji neuropatické bolesti se také podílejí gliové buňky a buňky imunitního systému. Zejména jsou za tohoto stavu důležité astrocyty a mikroglie produkující cytokiny (TNFα, IL-1β ad.), chemokiny (atraktans pro imunitní buňky – např. IL-8)

- 41 -

a další algogenní látky typu substance P. Glie proliferují, čímž je zvýšen jejich počet a v důsledku toho i koncentrace látek, které exprimují. Přítomnost glií je nezbytná pro vznik i přetrvání hyperalgesie, jak bylo prokázáno po subkutánní injekci Freundova adjuvans, používaného pro experimentální navození periferního zánětu (Raghavendra et al., 2004). Na úrovni mozku byl u lidí s chronickou neuropatickou bolestí zad pozorován úbytek neokortikální šedé hmoty o 5 – 11 % oproti lidem bez těchto potíží (Apkarian et al., 2004). V kortexu, konkrétně na S1 neuronech, dochází také ke změnám synaptické plasticity a síly synapsí po poškození primárních aferentů, kdy jsou S1 neurony senzitizovány (Millan, 1999). V thalamu, např. také po mrtvici v této oblasti, může dojít k rozvoji chladové allodynie díky porušení interakce mezi termosenzory a chladovými kanály v zadních jádrech (Millan, 1999). Obecně, i v mozku se při poškození nervů reorganizují některé struktury, vznikají nové synapse a některé neurony jsou senzitizovány. Tyto procesy napomáhají také rozvoji hyperalgesie a allodynie. Neuropatická bolest je v rámci lidských chorob velkou komplikací řady či dokonce samostatným onemocněním. Největším problémem léčby tohoto druhu bolesti je centrální senzitizace, která umožňuje vznik takové nociceptivní signalizace, která je nezávislá na stimulaci primárních aferentů (Campbell et al., 2006). Tudíž léčení periferních nervů není účinné a je nutné se zaměřit na ovlivnění míšních neuronů a mozku. Mechanismy popsané v této kapitole byly studovány na různých zvířecích modelech. Těm bude věnována kapitola následující. 6. 2. Modely neuropatické bolesti Pro účely této práce bylo nezbytné zvážit výhody a nevýhody modelů neuropatické bolesti. Vzhledem k tomu, že hlavním cílem bylo studium modulace míšních nociceptivních synapsí na akutních řezech, nikoliv behaviorální pozorování, jevilo se jako nezbytné zvolit způsob, který rovnoměrně ovlivní celou lumbální část míchy, z nichž byly řezy připravovány. Studium neuropatické bolesti, stejně jako kterýkoliv jevů, je silně závislé na přesnosti vytvářených modelů. Zvířecí modely neuropatické bolesti jsou založeny na poškození části periferního nervu, v nejjednodušším případě na přerušení, tzv. axotomii, celého nervu. Všechny typy však vedou k určitým prvkům abnormálního bolestivého chování. Je snížen práh odpovědi na mechanické i tepelné podněty. V současné době však neexistuje model, který by simuloval (opakovaně a měřitelně) a integroval všechny prvky bolestivého chování pozorovaného na zvířecích modelech, ale i na lidech (Bridges et al., 2001; Meyer a Ringkamp, 2008).

- 42 -

Je nutné poznamenat, že neexistují lidské modely neuropatické bolesti. Zvířecí modely ve srovnání s pozorovanými neuropatickými problémy na lidech jsou nedostatečné z hlediska času. Kvůli etickým a zákonným důvodům je většina neuropatických modelů studovaná v řádech týdnů, zatímco v klinické praxi je neuropatická bolest pozorována roky (Bridges et al., 2001). V současné době jsou využívané modely, jejichž hlavním prvkem je sledování kožních (povrchových) senzorických prahů za místem poškození nervu. Je zkoumána citlivost vůči tepelným, mechanickým i chladovým podnětům – hyperalgesie i allodynie. Široce rozšířené jsou čtyři modely využívající částečné poškození sedacího nervu. Jedná se o trvalé stažení (podvázání) sedacího nervu, označované CCI (z angl. chronic constriction injury), uvedené poprvé Bennetem a Xiem před více než dvaceti lety (Bennet a Xie, 1988). Dalším modelem je přerušení spinálních nervů, SNL (spinal nerve ligation), kdy jsou pevně podvázána a přeťata nervová vlákna vedoucí z míšních segmentů L5 a L6, nebo pouze ze segmentu L5 (Kim a Chung, 1992). Neúplné přerušení vláken, PNL (partial nerve ligation) či PSL (partial sciatic ligation), využívá podvázání pouze části sedacího nervu (Seltzer et al., 1990). Posledním využívaným modelem je tzv. ušetření vlákna, SNI – spared nerve injury, kdy jsou přeťata dvě ze tří vláken sedacího nervu ve vzdálenějších oblastech od míchy (Decostered a Woolf, 2000). Jejich porovnání vidíte na obrázku č. 7.

Obrázek 7 Modely neuropatické bolesti Zobrazeny jsou tři nejčastější modely (SNL, CCI a SNI) a jeden odvozený, kdy dochází k zaškrcení pouze části sedacího nervu (PSL). V každém z těchto modelů dochází k lézi pouze části vláken sedací nervu (Campbell et al., 2006). Všechny modely existují v jedno- i oboustranné variantě (poškození jednoho či obou sedacích nervů v jednom zvířeti).

- 43 -

CCI se sestává z volného podvázání střední částí nervu ischiadicu. Podvazuje se těsně nad trifurkací, neboli roztrojením, sedacího nervu za použití čtyř chromových vlákének. Hyperalgesie a allodynie se v tomto modelu rozvíjejí již druhý pooperační den a přetrvávají dva měsíce (Bennet a Xie, 1988). Projevuje se i zánětlivá reakce na chromová vlákénka a následná degenerace mnoha Aβ a Aδ vláken a části C vláken. Odumírá poměrně málo těl neuronů těchto vláken, avšak jsou zasaženy především buňky C vláken (Tandrup et al., 2000). Variabilita CCI spočívá

především

v pevnosti

podvázání

nervu.

Dochází

k senzitizaci

spinothalamických neuronů (Paleček et al., 1999). SNL je modelem podvázání a přerušení vláken vycházejících z míšního segmentu L5 a L6 a náležejících sedacímu nervu. K sedacímu nervu také patří vlákna z oblasti L4, a proto je tento model možné využít k porovnání rozdílné signalizace v míše z poškozených a „zdravých“ částí n. ischiadicus při rozvoji neuropatické bolesti. SNL vyvolává dlouhotrvající mechanickou allodynií (10 týdnů) a tepelnou hyperalgesii (5 týdnů) v poškozené končetině (Kim a Chung, 1992). PNL je modelem podobným chronické konstrikci, ale zde je pevně podvázáno jen 33 až 50 % sedacího nervu v jeho střední části. Stejně jako v CCI se rozvíjí hyperalgesie i allodynie, ale zánětlivá reakce je menší. PNL se liší v množství podvázaných vláken na jedno zvíře (Seltzer et al., 1990). Navíc je obtížné rozlišit na úrovni dorzálních ganglií a míchy (segmenty L4 a L5), kam vedou poškozená a kam nepoškozená vlákna. Spared nerve injury je chronologicky nejmladším chirurgickým modelem neuropatické bolesti. Anestezovaným zvířatům jsou přetnuta, popřípadě podvázána a přetnuta, dvě distální části sedacího nervu ležící až za trifurkací. Jsou to nervus tibialis a nervus peronaeus, ponechána je třetí větev nervus cutaneus surae, která je de facto součástí nervus peronaeus (Decostered a Woolf, 2000). Přerušení je prováděno však až za jejich anatomickým rozdělením. Tento model umožňuje sledovat odděleně sousedící oblasti pokožky neovlivněné a ovlivněné poškozením nervu. Je možné tyto oblasti porovnávat behaviorálními testy (mechanickým, tepelným drážděním pokožky) přímo na jednom zvířeti. Pokožka inervovaná nervus cutaneus surae vykazovala výraznou a rychlou (již po 24 hodinách) mechanickou i tepelnou hyperalgesii. Podobně se projevovaly i oblasti původně inervované nervus tibialis a nervus peronaeus, nicméně u nich došlo k návratu k původním prahům po sedmi až devíti týdnech (Decostered a Woolf, 2000). Existují studie porovnávající citlivost vůči jednotlivým podnětům mezi těmito modely (Kim et al., 1997; Dowdall et al., 2005). Druhá z těchto studií zahrnuje i námi použité prosté přetětí sedacího nervu. Ve všech případech modely neuropatické

- 44 -

bolesti hyperalgesii a allodynii, liší se však dobou vzniku a přetrváváním odpovědí na mechanické a tepelné podněty. Přetětí všech vláken sedacího nervu, které jsme v našich experimentech použili, má nespornou výhodu v jednoduchosti provedení zákroku. Pro studium neuropatické bolesti na akutních míšních řezech je vhodný i pro zasažení celé lumbální intumescence (segmenty L3 – L6). Na druhou stranu, neumožňuje porovnávat změny na míšní úrovni jako SNL, ani není vhodné na behaviorální testy jako SNI, a oproti chronickému stažení nervu se neprojevuje úbytek IPSC zprostředkovaných GABA neurony (Kohn et al., 2003). Avšak, stejně jako ve všech výše uvedených modelech, se i zde projevuje tepelná i mechanická hyperalgesie a allodynie (Kohn et al., 2003). Je přetínána podobná oblast jako v CCI, tedy nad trifurkací, neboť zde je téměř jistota přerušení všech axonů patřících sedacímu nervu. Vzhledem k menší šíři využití je i tento model méně rozšířen a studován. Každý z výše uvedených zákroků lze provádět unilaterálně i bilaterálně v závislosti na typu experimentu (např. pro srovnání citlivosti zadních končetin je vhodnější unilaterální provedení). Kromě chirurgických modelů neuropatické bolesti byly vytvořeny ještě chemické, které napodobují stavy některých nemocí. Jedná se například o streptozotocin, jehož periferní aplikace vyvolává v potkanech diabetes a následně hyperalgesii a allodynii (Bridges et al., 2001). Jako modely je taktéž využíván pásový opar, jehož původce virus varicella zoster přetrvává v nervových gangliích a způsobuje vznik neuropatické bolesti (Fleetwood-Walker et al., 1999). Další možností je vystavení sedacího nervu ischemickému působení laseru, kdy dochází k lézi nervových vláken a po několika dnech rozvoji allodynie a hyperalgesie (Kupers et al., 1998). Většina modelů byla původně zavedena na potkanech, nicméně některé z nich už byly konvertovány na myši. To je důležité zejména při genetických studií neuropatické bolesti, protože lze využít transgenních myších kmenů (Bridges et al., 2001). Přesto však potkaní modely mají ve vědě stále své nezastupitelné místo, z důvodu kvalitativní i kvantitativní odlišnosti odpovědí na bolestivé podněty mezi nimi a myšmi.

- 45 -

CÍLE PRÁCE 1. Změna citlivosti míšních TRPV1 receptorů na aplikaci endogenních agonistů u modelu periferní neuropatie. 2. Vliv TNFα na excitační synaptický přenos nociceptivní signalizace u modelu periferní neuropatie. Vliv na citlivost TRPV1 receptorů. 3. Objasnění modulačního účinku NAPE, endogenního agonisty TRPV1 a CB1 receptorů, na synaptický excitační přenos nociceptivní signalizace.

METODY V popisovaných experimentech byly využívány zejména elektrofyziologické metody in vitro na akutních řezech z lumbální míchy. Byly snímány miniaturní postsynaptické excitační proudy na opticky identifikovaných neuronech superficiální oblasti zadního rohu míšního pomocí metody terčíkového zámku v uspořádání snímání z celé buňky. 1. Použité chemikálie V našich pokusech byly použity následující chemikálie: Agarosa (b. t. 80 – 85°C) - pro agarový blok fixující míchu při krájení Bicuculline methiodide D-glukosa Dihydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4) EGTA (C14H24N2O10) HEPES (C8H18N2O4S) Hydrogenuhličitan sodný (NaHCO3) Dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4) Hydroxid cesný (CsOH) Chlorid cesný (CsCl) Chlorid draselný (KCl) Chlorid hořečnatý (MgCl2) Chlorid sodný (NaCl) Chlorid vápenatý (CaCl2) Glukonát delta lakton (C6H10O6) Strychnin TTX

- 46 -

N-oleoyldopamin Capsaicin SB366791 NAPE TNFα BSA DMSO Veškeré látky byly dodány společnostmi Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika), Tocris Bioscience (Bristol, Velká Británie) či AnalaR (Londýn, Velká Británie). 2. Použité roztoky Na přípravu akutních míšních řezů jsme používali disekční extracelulární roztok (ESC) se sníženou koncentrací vápenatých iontů. Pro jejich následnou inkubaci byl aplikován snímací ECS s normální koncentrací vápníku. Oba roztoky byly po celou dobu experimentu syceny karbogenem (Linde Technoplyn, a. s., Praha, Česká Republika), 95 % O2 a 5 % CO2, za účelem dostatečného okysličení a udržení stabilního pH. Pro krájení řezů bylo nutné míchu fixovat, proto byla vložena mezi dva agarové bločky. Roztok na přípravu agaru měl následující složení (v mM): 160 NaCl, 2,5 KCl, 5 MgCl2, 0,5 CaCl2, 10 D-glukosa, 10 HEPES. Disekční ECS obsahoval (v mM): 95 NaCl; 1,8 KCl; 7 MgCl2; 0,5 CaCl2; 26 NaHCO3; 1,25KH2PO4; 25 D-glukosa; 50 sacharosa. Snímací ECS obsahoval (v mM): 127 NaCl; 1,8 KCl; 1,3 MgSO4; 2,4 CaCl2; 26 NaHCO3; 1,2 NaH2PO4; 25 D-glukosa. Intracelulární roztok, kterým byly plněny elektrody, se skládal (v mM): 125 glukonodelta-lakton; 15 CsCl; 10 EGTA; 10 HEPES; 1 CaCl2; 2 Na2ATP; 0,5 NaGTP; pH roztoku bylo vyrovnáno pomocí CsOH na hodnotu 7,2. K přípravě všech roztoků byla použita redestilovaná voda. 3. Příprava míšních řezů Míšní řezy z lumbální oblasti byly připraveny dle metody dříve popsané (Paleček et al., 1999; Špicarová a Paleček, 2009). Experimentálními zvířaty byli samci laboratorního potkana (Rattus norvegicus) z kmene Wistar v postnatálním stáří 19 – 23 dnů (P19 – P23). V rámci studie vlivu TNFα v neuropatickém stavu bylo navíc prováděno přetětí sedacího nervu pět dní před vlastní přípravou míšních řezů.

- 47 -

Laboratorní potkan byl přiveden do celkové anestesie ketaminem (100 mg/kg, i. p., Narkamon, Zentiva) a xylazinem (10 mg/kg, i. p., Rometar, Zentiva). Následně byla provedena dorzální laminektomie, mícha vyjmuta a ihned přesunuta do disekčního ECS, jehož teplota byla maximálně 4°C pro zpomalení ischemických procesů. Zde byly z míchy odstraněny obaly dura a pia mater a odděleny zadní kořeny, bez poškození neuronů v zadním rohu v míšním. Očištěná mícha byla upevněna do žlábku mezi dvěma pevnými agarovými bločky připevněnými k podložce kráječe vteřinovým lepidlem. Pomocí kráječe (Leica, VT 1000 S, Nussloch, Německo) se žiletkou či safírovým nožem byly připraveny transversální míšní řezy o tloušťce 350 μm. Po celou dobu krájení byla mícha ponořena v disekčním roztoku o teplotě 4°C a nižší. Krájení probíhalo za vysokých vibrací a nízké posuvné rychlosti, aby se co nejvíce zmenšilo mechanické poškození neuronů. Anestesie, disekce míchy, očištění míchy a její řezání byly nejkritičtějšími fázemi celého experimentu z hlediska jeho úspěšnosti. Rychlost a preciznost provedení těchto částí největším dílem ovlivnila vitalitu neuronů v akutních řezech. Řezy byly následně inkubovány po dobu 30 minut v disekčním roztoku o teplotě ~33°C v komůrce ponořené v inkubační komoře (Memmert, Schwabach, Německo). Po této půlhodině byly řezy přeneseny do komůrky se snímacím ECS o laboratorní teplotě 21 – 24°C, kde byly uchovány až do zahájení snímání. První elektrofyziologické měření probíhalo nejdříve 1 hodinu po disekci míchy. Neurony v řezech připravených tímto způsobem byly vitální po dobu pěti až sedmi hodin. Při přípravě TNFα inkubovaných řezů byly přeneseny do snímacího extracelulárního roztoku s 60 nM TNFα, kde byly ponechány minimálně po dobu dvou hodin. Elektrofyziologické snímání v tomto případě začínalo nejdříve 3 hodiny po disekci. Přibližný časový rozvrh experimentu: 1. Příprava akutních míšních řezů

25 min.

Celková anestesie

0 min.

Dorzální laminektomie a vyjmutí míchy

0 – 3 min.

Odstranění míšních obalů

3 – 8 min.

Vložení do agarového bločku

8 – 10 min.

Míšní řezy – 350 μm

10 – 25 min.

2. Inkubace řezů disekčním roztoku (33°C)

30 min.

3. Přenos do pokojové teploty snímacího roztoku 30 – 32 min. (3 A. Inkubace v 60 nM TNFα v pokojové teplotě

30 min – 2,5 hod.)

4. Uchování řezů a vlastní elektrofyziologie

1 – 7 hod.

- 48 -

4. Elektrofyziologická měření 4. 1. Aparatura a příslušenství Jednotlivé míšní řezy byly umístěny do snímací komůrky o objemu zhruba 2 ml, kudy neustále protékal snímací roztok z aplikačního systému rychlostí ~2 ml za minutu. Řez byl fixován pomocí platinové podkovičky s napnutými nylonovými vlákny.

Vizualizace

buněk

probíhala

pod mikroskopem

s diferenciálním

interferenčním kontrastem, DIC (Leica, DM LFSA, Německo) za pomoci kamery (IR kamera Hitachi KP-200P, Japonsko) v infračervené oblasti spektra. Obraz byl pozorován na standardním TV/video monitoru (Hitachi VM-172, Japan). Pohyb snímací elektrody byl řízen mikromanipulátorem. Snímané proudy byly zaznamenávány pomocí Axopatch-1D zesilovače a analogově-digitálního převodníku (Axon Instruments, Inc., CA, USA) propojeným s počítačem. Zde byla data analyzována softwarem pClamp 9.0 a 10.0 (Axon Instruments, Inc., CA, USA). Tento software byl využit i při pozdější off-line analýze. Registrované proudy byly filtrovány při 2 kHz a digitálně vzorkovány na 10 kHz. Snímací

aparatura

pro

elektrofyziologické

měření

byla

umístěna

ve Faradayově kleci, ostatní elektronické přístroje mimo ni. 4. 2. Skleněné mikroelektrody Na snímání dat byly použity terčíkové skleněné mikroelektrody vytažené z borosilikátových trubiček (Rückl Glass, Otvovice, Česká Republika) o vnějším průměru 1,6 mm a vnitřním 0,97 mm. Připravovány byly na tahači kapilár modelu P97 (Sutter Instrument Co.). Po vytažení byly plněny snímacím intracelulárním roztokem pomocí stříkačky zakončené tenkou PVC trubičkou. Výsledný sériový odpor byl v extracelulárním roztoku 3,5 – 7,0 MΩ. 4. 3. Metoda terčíkového zámku (patch clamp) Postsynaptické

miniaturní

EPSC

zprostředkované

AMPA

receptory

v neuronech v superficiální oblasti zadního rohu míšního byly snímány metodou terčíkového zámku v konfiguraci snímání z celé buňky při stálém napětí, tedy napěťového zámku (Hamill et al., 1981). Neurony, ze kterých jsme snímali, měly zřetelný tvar a některé i viditelné dendrity. Nacházely se většinou 5 – 20 μm pod povrchem řezu. Snímání bylo prováděno pomocí mikroelektrody (viz předchozí kapitola), v jejíž špičce byl vytvořen přetlak na odstranění zbytků membrán poškozených buněk, erytrocytů a extracelulární hmoty. Mikromanipulátory jsme elektrodu velmi

- 49 -

pomalu přiblížili k neuronu, následně jsme se dotkli hrotem plazmatické membrány s viditelnou lehkou deformací této membrány. Vzápětí jsme sáním vytvořili podtlak v kapiláře, čímž došlo ke vzniku těsného kontaktu špičky kapiláry a membrány neuronu. Tento podtlak jsme udržovali až do vytvoření řádově 1 GΩ odporu na rozhraní mikroelektrody a buňky. S tím jsme nastavili hodnotu potenciálu na -70 mV. Následoval krátký prudší podtlak v kapiláře k protržení membrány buňky přisáté ke špičce. Tím vzniklo vodivé spojení mezi cytoplazmou neuronu a mikroelektrodou. Díky tomu bylo možné sledovat a zaznamenávat spontánní postsynaptické proudy. Sériový odpor neuronů byl kompenzován na 80 % a sledován po celou dobu snímacího protokolu.

Obrázek 8 Metoda terčíkového zámku na neuronu v akutním míšním řezu. Vlevé části obrázku je vidět obrys hrotu skleněné mikroelektrody přibližující se k vybrané buňce. Na neuronu jsou zřetelné výběžky – dendrity a axon.

4. 4. Aplikace látek Díky aplikačnímu systému je možná rychlá výměna extracelulárního roztoku a látek. Abychom izolovali AMPA-EPSC, byly do snímacího roztoku následující látky: 1. Strychnin (5 μM) – kompetitivní antagonista glycinových receptorů 2. Bikukulin (10 μM) – reverzibilní antagonista GABAA receptorů 3. Navíc TTX (0,5 μM) – reverzibilní antagonista Na+ kanálů – jako zábrana vzniku akčního potenciálu U dvou skupin s modelem periferní neuropatické bolesti byl testován vliv aplikace nízké koncentrace OLDA. V předchozích experimentech bylo ukázáno, že 0,2 μM OLDA vyvolává odpověď pouze za změněných podmínek (Špicarová a Paleček, 2009). Tato koncentraci byla aplikována ve většině případů. V několika případech byla aplikována také 0,5 μM OLDA.

- 50 -

Na konci experimentálního protokolu byl aplikován capsaicin (0,5 μM) pro zjištění, zda míšní neuron má vstupy z TRPV1 pozitivních primárních aferentních vláken. 6. Analýza dat V této práci byly vyhodnoceny frekvence a velikosti amplitud mEPSC v úseku dlouhém 2 minuty v kontrolních a experimentálních částech záznamu podobně, jak již bylo popsáno (Špicarová a Paleček 2009). Pro analýzu frekvence a amplitudy byla použita shodná kritéria hodnocení a stejné úseky záznamu. Nejmenší započítané mEPSC měly velikost ≥ 5 pA, tedy zhruba dvojnásobku velikosti šumu. Frekvence a velikosti mEPSC jsou vyjádřeny v průměrech se střední chybou průměru (SEM). Získaná data byla vztahována vůči kontrolním hodnotám bez aplikací jakýchkoliv látek (vyjma výše uvedených antagonistů) – tyto kontroly odpovídaly tedy 100 %. Druhou variantou, uváděnou zde pouze v grafických zobrazeních, nikoliv pro účely statistického hodnocení, je porovnání absolutní frekvence mEPSC (Hz) v jednotlivých záznamech. Statisticky významný rozdíl mezi skupinami byl vypočítán metodou jednocestné analýzy rozptylu ANOVA, nebo t-testem při porovnání dvou skupin. Za signifikantní byla určena hladina významnosti P < 0,05. Ke statistickému hodnocení a grafickému zobrazení byly použity programy SigmaStat 3.1 a SigmaPlot 9.0. 7. Přetětí sedacího nervu jako model neuropatické bolesti Axotomie sedacího nervu byla prováděna na samcích potkana kmene Wistar (P14 – 17) pět dní před přípravou akutních míšních řezů. Zvířeti byl v celkové éterové anestezii přeťat sedací nerv na obou zadních končetinách nad jeho roztrojením, kvůli jistotě přerušení všech vláken tohoto nervu. Poté byla rána stažena a zalepena. Potkan byl vrácen do své klece, až do dne přípravy řezů.

- 51 -

VÝSLEDKY

1. Vliv axotomie sedacího nervu na frekvenci mEPSC Základní frekvence mEPSC snímaná u neuronů po pětidenní axotomii byla 0,71 ± 0,27 Hz (n=5). Ve srovnání s předchozí studií naší laboratoře, která sledovala aktivitu neuronů za stejných podmínek na akutních míšních řezech z kontrolních zdravých zvířat, zde byl tedy pouze minimální rozdíl v základní frekvenci mEPSC (0,76 ± 0,08 Hz; n=25; Špicarová a Paleček, 2009). 1. 1. Aplikace nízké koncentrace OLDA zvýšila frekvenci mEPSC 5 dní po přetětí sedacího nervu Z předchozích experimentů naší laboratoře mimo jiné vyplývá, že nízká koncentrace OLDA (0,2 μM) za kontrolních podmínek nezvyšuje frekvenci mEPSC (Špicarová a Paleček, 2009). V našich pokusech na řezech 5 dnů po axotomii aplikace nízké koncentrace OLDA (0,2 μM, po dobu 4 minut) výrazně zvýšila frekvenci mEPSC v porovnání se základní aktivitou před aplikací OLDA (249,9 ± 68,6 %). Tento nárůst byl statisticky významný (P ≤ 0,001; n=5, obr. 9A a 9B). Po aplikaci OLDA byl po dobu 10 minut aplikován antagonista TRPV1 receptorů SB 366791 (10 μM). Odpovědí na vymytí OLDA a podání antagonisty byl pokles frekvence mEPSC na nižší hladinu, než byla frekvence na začátku snímání při aplikaci snímacího roztoku (92,3 ± 20,1 %). Tato změna byla ve srovnání s frekvencí při aplikaci OLDA statisticky signifikantní (P ≤ 0,01; n=5; obr. 9A a 9B), vůči základní frekvenci však tento rozdíl nedosáhl statistické významnosti. Na závěr experimentálního protokolu byl aplikován kapsaicin (0,5 μM), který u všech buněk vyvolal masivní zvýšení frekvence oproti frekvenci snímané na začátku pokusu (1268,0 ± 567,1 %). Velikost mEPSC byla porovnávána vůči amplitudám při aplikaci snímacího roztoku. Během aplikace OLDA i SB3566791 došlo k mírnému, avšak statisticky jednoznačnému poklesu amplitudy mESPC (86,5 ± 1,5 %, resp. 90,2 ± 1,8 %; P ≤ 0,001; obr. 9B).

- 52 -

Obrázek 9 Aplikace nízké koncentrace OLDA zvýšila frekvenci mEPSC 5 dní po přetětí sedacího nervu. A: Aplikace nízké koncentrace OLDA zvýšila frekvenci ve srovnání se základní aktivitou po pětidenní axotomii. Po aplikaci SB klesla frekvence v průměru lehce pod základní hladinu. Horní záznamy odpovídají zhruba 1 s snímání, dolní 30 s (měřítka 200 ms/20 pA, resp. 5 s/20 pA). B: Zvýšení frekvence mEPSC po aplikaci 0,2 µM OLDA bylo statisticky významné (249,9 ± 68,6 %; ***P ≤ 0,001; n=5), stejně jako následný pokles po aplikaci antagonisty TRPV1 receptorů ve srovnání se frekvencí po aplikaci OLDA (92,3 ± 20,1 %; **P ≤ 0,01; n=5). C: Porovnání amplitud mEPSC. Po podání OLDA i SB 366791 se amplituda mEPSC mírně zmenšila (86,5 ± 1,5 %, resp. 90,2 ± 1,8 %; ***P ≤ 0,001; n=5).

- 53 -

2. Vliv cytokinu TNFα na modulaci nociceptivního synaptického přenosu u modelu neuropatické bolesti. 2. 1.

Inkubace míšních řezů s TNFα po axotomii zvyšuje citlivost TRPV1

receptorů na aplikaci nízké koncentrace endogenního agonisty OLDA Neuronální aktivita byla snímána u řezů po navození modelu periferní neuropatie, axotomií n. ischiadicus. Před vlastním snímáním byly řezy inkubovány nejméně 2 hodiny v 60 nM TNFα při laboratorní teplotě. Celkem byla aktivita zaznamenávána z 9 neuronů superficiálního zadního rohu. Základní frekvence mEPSC u snímaných neuronů na řezech po axotomii nervu a inkubaci s TNFα dosahovala v průměru 2,91 ± 1,00 Hz (n=9). Tato frekvence byla výrazně vyšší ve srovnání se skupinou snímanou na řezech po axotomii ale bez inkubace TNFα (0,71 ± 0,27 Hz; n=5) – obr. 10A a 10B. Po zaznamenání kontrolní frekvence mEPSC byl aplikován 0,2 μM OLDA po dobu 4 min. Ve srovnání se základní frekvencí (100 %) mEPSC, se zvýšila frekvence po aplikaci OLDA na v průměru na 171,3 ± 28,3 % (P ≤ 0,01; n = 9; obr. 10C). Zvýšení četnosti mEPSC v reakci na podání nízké koncentrace OLDA jsme naměřili u osmi z celkového počtu devíti buněk. Tento nárůst však nebyl tak silný jako u kontrolní skupiny po axotomii, která nebyla inkubována v TNFα, kde po aplikaci OLDA vzrostla frekvence na 249,9 ± 68,6 %. Při srovnání frekvence mEPSC po aplikaci OLDA mezi skupinami po axotomii nervu bez inkubace a s inkubací TNFα nebyl statisticky signifikantní rozdíl.

- 54 -

Obrázek 10 Inkubace míšních řezů s TNFα po axotomii, zvyšuje citlivost TRPV1 receptorů vůči působení nízké koncentrace endogenního agonisty OLDA. A: Inkubace s TNFα po axotomii zvýšila základní frekvenci mEPSC ve srovnání s buňkami po axotomii bez této inkubace – nativní záznam aplikace snímacího roztoku bez dalších látek. Horní záznamy odpovídají zhruba 1 s snímání, dolní 30 s (měřítka 200 ms/20 pA, resp. 5 s/20 pA). B: Inkubace s TNFα po axotomii zvýšila základní frekvenci mEPSC ve srovnání s buňkami po axotomii bez této inkubace. C: Nízká koncentrace OLDA zvýšila frekvenci mEPSC na neuronech inkubovaných v TNFα po axotomii (n=9; **P ≤ 0,01).

- 55 -

2. 2. Vliv antagonisty TRPV1 receptorů SB 366791 na mEPSC frekvenci na řezech po inkubaci v TNFα u modelu neuropatické bolesti Podobně jako u skupiny neuronů snímaných na řezech po axotomii, byl v této skupině u sedmi neuronů po aplikaci OLDA aplikován roztok TRPV1 antagonisty (10 μM SB 366791). Během aplikace tohoto antagonisty klesla frekvence mEPSC v průměru téměř na základní hodnotu zaznamenané před aplikací látek (101,0 ± 30,1 %; n=7, P ≤ 0,01; obr. 11A). Při podrobnější analýze se ale ukázalo, že z celkového počtu sedmi neuronů u pěti buněk došlo ke zřetelnému snížení frekvence ve srovnání se základní frekvencí (62,2 ± 16,2 %). Dva zbývající neurony reagovaly naopak zvýšením frekvence i ve srovnání s OLDA. Na závěr experimentálního protokolu u celé skupiny buněk po axotomii s inkubací v TNFα byl aplikován kapsaicin (0,5 μM), který u šesti buněk vyvolal razantní zvýšení frekvence mEPSC (1041,1 ± 425,1 %). Zbývající tři buňky během působení kapsaicinu vykázaly sníženou frekvenci ve srovnání se základní (58,4 ± 33,7 %). Amplitudy mEPSC byly vyhodnoceny vůči amplitudám naměřeným, během kontrolního záznamu na začátku snímání (100 %). Analýza amplitud mEPSC během kontrolního záznamu, aplikace OLDA a SB 366791 ukázala, že došlo k průkaznému snížení amplitudy během působením antagonisty TRPV1 receptorů (83,3 ± 4,7 %; P = 0,012; N = 7; obr. 11B). Mezi amplitudami mEPSC během kontrolního záznamu a aplikace OLDA nebyl signifikatní rozdíl. Srovnání amplitud mEPSC naměřených u skupin neuronů na řezech po axotomii a po axotomie s inkubací s TNFα neukázalo žádný rozdíl.

- 56 -

Obrázek 11 Vliv antagonisty TRPV1 receptorů SB 366791 na frekvenci mEPSC na řezech po inkubaci s TNFα a axotomii. A: Záznam poklesu frekvence po aplikaci SB 366791 ve srovnání s aplikací OLDA. Horní záznamy odpovídají zhruba 1 s snímání, dolní 30 s (měřítka 200 ms/20 pA, resp. 5 s/20 pA). B: Srovnání průměrné hodnoty četnosti mEPSC při aplikaci OLDA (171,3 ± 28,3 %; n=9) a SB 366791. Při působení antagonisty TRPV1 receptorů došlo ke statisticky signifikantnímu poklesu (101,0 ± 30,1 %; n=7; **P ≤ 0,01). C: Signifikantní snížení amplitudy mEPSC po aplikaci SB 366791 ve srovnání se základní velikostí (83,3 ± 4,7 %; n=7; *P ≤ 0,05).

3. Vliv endogenního agonisty CB1 a TRPV1 receptorů NAPE na mEPSC neuronů v lamině I a II zadního rohu míšního Na neuronech superficiální oblasti zadního rohu míchy byly testovány změny miniaturních EPSC v závislosti na působení NAPE, prekurzoru endogenních kanabinoidů, který sám může ovlivňovat aktivitu TRPV1 a CB1 receptorů. Po snímání v kontrolním roztoku byl aplikován 20 μM roztok NAPE po dobu pěti minut. V průběhu této doby došlo k výraznému poklesu frekvence mEPSC na 31,91 ± 7,87 % kontrolní frekvence (P ≤ 0,01; n = 4; obr. 12A a 12B). Znatelný pokles je vidět i při vyjádření četnosti v absolutních hodnotách (obr. 12C). Na konci experimentálního protokolu byly buňky vystaveny 0,5 μM kapsaicinu pro ověření přítomnosti TRPV1 pozitivních vstupů. Všechny buňky zvýšily svoji frekvenci po aplikaci kapsaicinu (288,0 ± 65,9 %).

- 57 -

Obrázek 12 Vliv endogenního agonisty CB1 a TRPV1 receptorů NAPE na mEPSC neuronů v lamině I a II zadního rohu míšního. A: Při aplikaci 20 μM NAPE se snížila frekvence mEPSC. Horní záznamy odpovídají zhruba 1 s snímání, dolní 30 s (měřítka 200 ms/20 pA, resp. 5 s/20 pA). B: Pokles frekvence byl statisticky významný (31,91 ± 7,87 %; **P ≤ 0,01; n = 4). C: Absolutní hodnoty (Hz) frekvence mEPSC za působení snímacího roztoku a 20 μM NAPE.

- 58 -

DISKUSE

Informace o stimulech z periferních tkání je přenášena primárními aferenty do zadního rohu míšního. Zde dochází k prvotnímu synaptickému přenosu a modulaci informace o nociceptivních podnětech, což je velmi významné i pro vznik vjemu bolesti, k němuž ale dochází až ve vyšších centrech mozku. Míšní synaptická aktivita se silně mění také při řadě patologických situací, jako je poškození nervů či periferní zánět tkáně, kdy dochází i k výrazné modulaci a přestavbě těchto spojení. Mechanismy modulace synaptického přenosu na míšní úrovni tak představují významný

cíl

pro

terapeutické

ovlivnění

patologických

bolestivých

stavů.

V následujících oddílech této práce jsou diskutovány výsledky našich pokusů týkající se modulace nociceptivních míšních synapsí na míšních řezech in vitro za fyziologických i patologických podmínek. 1. Vliv axotomie na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou TRPV1 receptorů N-oleoyldopaminem Neuropatická bolest postihuje v průběhu života až jednu šestinu populace, ale současné léčebné možnosti jsou stále nedostatečné. Pochopení mechanismů jejího vzniku tak může ukázat cestu k novým způsobům její léčby (Campbell a Meyer, 2006). Studie z poslední doby ukázaly, že vaniloidní receptor typu 1 hraje klíčovou roli v mnoha mechanismech při vzniku a trvání neuropatické bolesti (Hudson et al., 2001; Cui et al., 2006). Tuto úlohu plní nejen na periferii, kde je podkladem pro vznik tepelné hyperalgesie. V současnosti se uvažuje také nad úlohou TRPV1 receptorů u stavů neuropatické bolesti na míšních synapsích, na něž jsme se v této práci zaměřili. Je známo, že u modelů poškození periferního nervu dochází ke zvýšení exprese TRPV1 v neuronech primárních aferentů a jejich aktivaci celou řadou přítomných agonistů – bradykinin, NGF ad. (Zhang et al., 2005). TRPV1 receptory se vyskytují zejména na presynaptické membráně, kde mohou modulovat výlev neurotransmiterů. Jedním z cílů této práce bylo zjistit, jak se na aktivaci těchto receptorů podílejí potenciální endogenní agonisté. V této práci jsme proto k aktivaci TRPV1 receptorů použili endogenního agonistu Noleoyldopamin (OLDA), který byl identifikován poměrně nedávno (Chu et al., 2003). Pokusy v naší laboratoři ukázaly, že intrathekální podání OLDA vede k aktivaci TRPV1 receptorů a rozvoji tepelné hyperalgesie u laboratorního potkana. Při aplikaci OLDA na akutní řezy z lumbální intumescence a snímání mEPSC

- 59 -

s neuronů superficiálního zadního rohu se zvyšuje frekvence mEPSC, avšak až po aplikaci vysoké koncentrace 10 μM (Špicarová a Paleček, 2009). Jako model neuropatie byla v této práci použita axotomie n. ischiadicus pět dní před přípravou akutních míšních řezů. V následných pokusech jsme prokázali, že se u tohoto modelu periferní neuropatie po pěti dnech od axotomie koncentrace OLDA potřebná k signifikantnímu nárůstu frekvence mEPSC výrazně snižuje na 0,2 μM. Zvýšení frekvence mEPSC po aplikaci nízké koncentrace OLDA, která je hluboko pod koncentrací nutnou k podobnému efektu u kontrolních, zdravých zvířat, je pravděpodobně způsobeno zvýšením citlivosti TRPV1 receptorů k agonistům. Jako nejpravděpodobnější mechanismus se jeví fosforylace tohoto receptoru. Fosforylací dochází mimo jiné k zanořování TRPV1 do membrány například působením neurotropního růstového faktoru, NGF, který tak činí přes receptor trkA s tyrosinkinasovou aktivitou. Bylo ukázáno, že NGF také zvyšuje expresi vaniloidního receptoru v neuronech spinálních ganglií (Zhang et al., 2005). NGF je další z mnoha prvků podílejících se na rozvoji neuropatické bolesti (Wilson-Gerwing et al., 2005, Wilson-Gerwin et al., 2008). Dalšími, podobně působícími látkami, jsou TNFα a substance P. Nárůst koncentrace TNFα byl prokázán při neuropatické bolesti na periferii (Wells et al., 1992, Schäfers et al., 2003b), avšak u substance P dochází k signifikantnímu poklesu, jak ukázala studie na modelu SNL, a naopak vzrůstu po podání Freudova adjuvans jako modelu zánětlivé bolesti (Honore et al., 2000). Substance P tedy pravděpodobně v našem modelu neuropatie nehrála zásadní roli. Fosforylace ovlivňuje také citlivost TRPV1 receptorů vůči působení agonistů, jako je OLDA, změnám pH, další senzitizaci, tepelným podnětům a také změnám membránového potenciálu (Sugiura et al., 2002; Nilius et al., 2005; Špicarová a Paleček, 2008). Dochází pravděpodobně k celé řadě konformačních změn kanálu, které ústí v jeho zvýšenou citlivost. Působením fosforylace může být oddálena idesenzitizace receptoru (Bhave et al., 2003). Tento jev byl prokázán například na cAMP-dependentní PKA (Bhave et al., 2002). Dvěma hlavními mechanismy zvýšené citlivosti na agonisty TRPV1 receptorů jsou tedy jejich fosforylace a nárůst exprese. Specifická aktivace TRPV1 receptorů při zvýšené frekvenci mEPSC po aplikaci nízké koncentrace OLDA byla potvrzena užitím kompetitivního antagonisty tohoto kanálu SB 366791 v předchozích pokusech (Špicarová a Paleček, 2009). V pokusech této práce bylo použití tohoto selektivního antagonisty využito k testování možnosti tonické aktivace míšních presynaptických TRPV1 receptorů. Naše výsledky ukázaly, že TRPV1 receptory nejsou tonicky aktivovány za podmínek

- 60 -

in vitro u zvoleného modelu neuropatie, pět dní po axotomii. Tyto závěry podporuje i porovnání průměrné základní frekvence mEPSC po axotomii (0,71 ± 0,27 Hz) se základní frekvencí za kontrolních podmínek (0,76 ± 0,08 Hz), která byla naměřena v předchozích experimentech naší laboratoře (Špicarová a Paleček, 2009). Rozdíly mezi skupinami jsou minimální, přičemž ani za kontrolního stavu nedochází k tonické aktivaci TRPV1 receptorů (Špicarová a Paleček, 2009). Z toho vyplývá, že pětidenní axotomie neovlivňuje základní frekvenci snímaných neuronů, avšak výrazně posiluje modulační vliv TRPV1 receptorů na nociceptivní synaptický přenos ve srovnání s fyziologickým stavem. V průběhu působení OLDA a SB 366791 došlo také k mírnému poklesu amplitudy mEPSC ve srovnání se začátkem snímání. Změny amplitudy mEPSC jsou ovlivněny postsynaptickými receptory. Vzhledem k tomu, že TRPV1 receptory jsou lokalizovány v míše zejména presynapticky (Špicarová a Paleček 2008), nebyl pokles amplitudy pravděpodobně způsoben přímým vlivem aplikovaných látek na postsynaptické receptory. V našem případě ale po aplikaci OLDA mohlo dojít k aktivaci nebo zvýšené aktivaci synaptických spojení neaktivních před aplikací agonisty TRPV1 receptorů. Mohla se tak projevit změna aktivovaných synaptických kontaktů, k registraci populace mEPSC z jiných synaptických spojení, a tím také ke změně profilu a průměrné hodnoty amplitud mEPSC. Vzhledem k celkově nízkému počtu pozorování nemůžeme vyloučit ani vliv nárůstu sériového odporu elektrody během snímání, který by mohl snížit amplitudu snímaných mEPSC. Objasnění tohoto poklesu vyžaduje další experimenty, které by umožnily podrobnější amplitudovou analýzu mEPSC. Výsledky našich pokusů ukazují na zvýšenou citlivost presynaptických TRPV1 receptorů na endogenní agonisty po pěti dnech od provedené axotomie. To nastiňuje jejich možnou roli při modulaci synaptického přenosu na míšní úrovni a podíl na rozvoji neuropatické bolesti. Zablokování mechanismů vedoucích k senzitizaci TRPV1 receptorů, zejména jejich fosforylace, se v tomto světle jeví jako potenciální cíl pro analgetika při neuropatických stavech. 2. Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie 2. 1. Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie a vliv na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou OLDA Tumor nekrotizující faktor alfa je zánětlivým cytokinem, který se podílí na procesech provázející některé stavy chronické bolesti. S rozvojem neuropatické

- 61 -

bolesti vzrůstá jeho produkce zmnoženými gliovými buňkami ve spinálních gangliích i míše a na periferii Schwannovými buňkami, neurony a imunitními buňkami (Wells et al., 1992, Schäfers et al., 2003b). Zvýšená exprese TNFα Schwannovými buňkami byla pozorována i u lidí s neuropatickou bolestí (Empl et al., 2001) V našich experimentech jsme testovali vliv TNFα na excitační synaptický přenos v povrchové oblasti zadního rohu míšního při navozené neuropatii a na modulaci funkce klíčového nociceptivního receptoru TRPV1 tímto cytokinem. Již snímání za kontrolních podmínek z míšních řezů s axotomií a po inkubaci s TNFα ukázalo silně zvýšenou frekvenci mEPSC ve srovnání se skupinou axotomie z předchozí části této práce. Vysoká základní frekvenci (ve srovnání se skupinou axotomie) byla naměřena u šesti z celkového počtu devíti (~67 %) snímaných neuronů. Nebyl při tom zjištěn žádný rozdíl amplitudy mezi těmito skupinami. Výrazný nárůst frekvence mEPSC v našich experimentech to byl i v porovnání se skupinu jen po inkubaci s TNFα snímanou za stejných podmínek v naší laboratoři (Špicarová a Paleček, 2010, v recenzním řízení). Tato kontrolní skupina neuronů na řezech inkubovaných v TNFα, stejně jako zde diskutovaná skupina modelu neuropatie, měla zvýšenou základní frekvenci na 1,21 ± 0,17 Hz, ale tato hodnota je více než dvakrát nižší než u neuronů po pětidenní axotomii inkubované TNFα (2,91 ± 1,00 Hz). Účinek TNFα je pravděpodobně zprostředkován aktivací receptorů TNFR1 a TNFR2. První z nich jsou konstitutivně exprimovány na neuronech a gliích, druhé jsou

přítomny

na

imunitních

buňkách.

Za neuropatických

stavů

dochází

na spinálních neuronech ke zvýšené expresi TNFR1, k nimž se přidávají i TNFR2 receptory (Shubayev a Myers, 2001; Schäfers et al., 2003b; George et al. 2005; Leung a Cahill, 2010). Zároveň s nárůstem počtu receptorů dochází i k větší produkci samotného cytokinu v neuronech spinálních ganglií a jeho exprese se rozšiřuje i na buňky o větším průměru dávající vznik například Aβ vláknům, jak bylo prokázáno na CCI modelu neuropatie (Schäfers et al., 2002). Zvýšenou expresi cytokinu za stavu neuropatické bolesti vykazují i gliové buňky a míšní neurony, na nichž se také zvedá počet obou typů receptorů TNFR1 a TNFR2 (Li et al., 2004). V zadním rohu míšním byla zjištěna přítomnost TNFR1 na presynaptických i postsynaptických membránách neuronů a v hojné míře na gliových buňkách (Holmes et al. 2004). Tumor nekrotizující faktor alfa indukuje mechanickou allodynii, projev centrální senzitizace,

spouštěním

p38 MAP

kinázové kaskády, což bylo

demostrováno za použití antagonistů TNFα i p38 v SNL modelu neuropatie na neuronech spinálních ganglií (Schäfers et al., 2003c). Blokováním TNFR1

- 62 -

neutralizačními protilátkami byla také výrazně snížena tepelná hyperalgesie i mechanická allodynie v CCI modelu neuropatické bolesti, jak prokázala práce Sommersové a kolegů (1998). To odpovídá hypotéze o stěžejní úloze TNFα v mechanismech neuropatické bolesti. V našich experimentech inkubace míšních řezů s tímto cytokinem vedla ke zvýšení základní frekvence mEPSC, což ukazuje na presynaptický mechanismus působení TNFα. Pozorovaný jev mohl být zapříčiněn po aktivaci TNFR1 receptorů indukcí aktivace IP3 a ryadoninových receptorů

vnitrobuněčných

otevřením Ca

2+

kompartmentů

uskladňujících vápenaté

ionty,

a

membránových kanálů (Pollock et al, 2002; Keigan et al., 2008),

čímž vzrůstá počet váčků s neuropřenašeči splývající procesem „kiss and run“, který je velmi rychlý (< 1 ms), s cytosolickou membránou směrem do synaptické štěrbiny (An a Zenisek, 2004). Větší množství neurotransmiteru uvolněného na synapsi zvyšuje sledovanou frekvenci mEPSC. Některé Ca2+ kanály jsou napěťově závislé, aplikace TNFα však dokáže aktivovat TTX rezistentní Na+ kanály na neuronech spinálních ganglií, čímž dochází ke zvýšení sodíkových proudů a depolarizaci. To následně vede k aktivaci Ca2+ napěťově závislých kanálů. Toto bylo pozorováno na kultuře neuronů spinálních ganglií (Jin a Gereau, 2006). Zvednutí intracelulární koncentrace vápníku ale může být způsobeno i TRPV1 kanálem, který by, jak je diskutováno v následujícím oddíle, mohl být tonicky aktivován po inkubaci s TNFα v modelu pětidenní axotomie. Výsledky (viz 2. 2.) naznačují v tomto směru markantní podíl TRPV1 receptorů na zvýšení základní frekvence mESPC, neboť aktivací vaniloidního receptoru 1 do presynaptického zakončení vtékají kationty s výraznou preferencí pro Ca2+, čímž dochází k facilitaci splývání vesikulů se synaptickou membránou. Některé studie ukazují také vliv akutní aplikace TNFα na synaptický přenos v superficiální oblasti zadního rohu míšního (Kawasaki et al., 2008; Youn et al., 2008). V těchto studiích byl prokázán rychlý excitační vliv TNFα na frekvenci mEPSC bez ovlivnění amplitudy a zvýšenou účinnost stimulovaných AMPA a NMDA EPSC (Kawasaki et al., 2008). V druhé práci (Youn et al., 2008) vedle potvrzení těchto výsledků na druhou stranu také zjistili nárůst stimulovaných inhibičních postsynaptických proudů. Zajímavým se jeví rozdíl mezi monosynaptickými a polysynaptickými evokovanými EPSC, kdy u monosynaptických byl pozorováno dlouhodobé snížení amplitudy po aplikaci TNFα. Oba typy EPSC byly významně zablokovány inhibicí vazby TNFα na TNFR1 receptor. Ke zvýšené aktivitě nervových zakončení po inkubaci TNFα mohou přispívat i astrocyty, na nichž je aktivován signální kaskádou enzym TACE, který svojí činností produkuje další tumor nekrotizující faktor alfa (Leung a Cahill, 2010). Další

- 63 -

nárůst koncentrace cytokinu může vést k aktivaci většího počtu jeho receptorů na presynaptické membráně, a tím i posílení již spouštěných signálních kaskád. V rámci téže kaskády je produkován IL-1 a -6, prostaglandiny, oxid dusný a ATP, které samy posilují neuronální aktivitu nejen při neuropatické bolesti (Watkins et al., 2007). Působení cytokinu TNFα na neurony v lamině I a II vyvolalo také změny senzitivity TRPV1 kanálu díky aktivaci receptorů pro tumor nekrotizující faktor alfa, a tím i vzrůst četnosti mEPSC po působení agonistů TRPV1 receptorů (Špicarová a Paleček, 2010, v recenzním řízení). Aplikace nízké koncentrace OLDA (0,2uM), která za kontrolních podmínek nestimuluje zvýšení frekvence mEPSC, vyvolala odpověď u osmi z devíti neuronů (~90 %), přičemž šest neuronů (~67 %) reagovalo také na podání velmi účinného agonisty TRPV1 receptorů kapsaicin. Neurony odpovídající na aplikaci OLDA nebo kapsaicinu měly pravděpodobně synaptický vstup z primárních aferentů exprimujících TRPV1 receptory. Dva neurony tedy odpovídaly na aplikaci OLDA, ne však na následující aplikaci kapsaicinu. Jedním z možných vysvětlení tohoto rozporu je desenzitizace TRPV1 receptorů po první aplikaci OLDA, kdy v silně aktivovaném zakončení primárního aferentu vzrůstá koncentrace Ca2+.

Tím

mohou být

aktivovány na Ca2+

závislé proteiny

vyvolávající desenzitizaci (kalcineurin, kalmodulin – viz kapitola 3. 1. 4. Mechanismy desenzitizace TRPV1). K tomu může přispívat i působení TNFα, který podporuje uvolňování vápníku z vnitrobuněčných zásob i otevírání příslušných iontových kanálů na povrchu buňky (Pollock et al., 2002). Zvýšení frekvence mEPSC po aplikaci nízké koncentrace OLDA na míšních neuronech inkubovaných v TNFα v modelu neuropatie prezentované v této práci je, stejně jako u předchozích pokusů, způsobeno presynaptickým vlivem obou látek. Z toho vyplývá, že snímané buňky měly synapse s primárními aferenty, na jejichž povrchu byly společně přítomny TRPV1, TNFR1 a případně i TNFR2 receptory. Kolokalizace TRPV1 a TNFR1 receptorů v neuronech spinálních ganglií byla prokázána sledováním hladiny jejich mRNA ve studii Li a kolegů (2004). Druhý typ receptorů pro TNFα zvyšuje svoji expresi v neuronech až za patologických stavů – viz výše. V řadě prací bylo ukázáno, že působení TNFα zvyšuje hladinu mRNA TRPV1 receptorů a navíc tyto receptory senzitizuje vůči kapsaicinu (Nicol et al., 1997; Hensellek et al., 2007; Khan et al., 2008). V závislosti na délce inkubace a uspořádání experimentů bylo zjištěno, že například vzrůstá počet TRPV1 imunopozitivních neuronů v DRG kultuře po 48 hodinách působení TNFα (Hensellek

- 64 -

et al., 2007). Také dochází ke změně fenotypu na trigerminálních neuronech a zvýšení mRNA TRPV1 již po půlhodinové inkubaci v TNFα (Khan et al., 2008). Tumor nekrotizující faktor alfa zde může působit rychlými mechanismy, jako je

například

fosforylace

TRPV1

receptorů

vlivem

zvýšené

koncentrace

prostaglandinů, či pomalými transkripčními pochody. Tyto možné způsoby regulace exprese a senzitivity TRPV1 vedou k většímu výlevu glutamátu ze zakončení po jejich aktivaci TRPV1 agonisty. Nedávná studie (Fa et al., 2009) však ukazuje ovlivnění TNFR1 díky TRPV1 receptoru. Aktivace TRPV1 zvyšuje počet TNFR1 díky nárůstu volných kyslíkových radikálů (ROS), které stimulují TNFR1. Toto pozorování bylo učiněno na buněčné kultuře neuronů spinálních ganglií. Aplikací TNFα je ovlivněna i postsynaptická část, mechanismy však nejsou dosud zcela objasněny. Možností je například aktivace CCR2 receptorů pro chemokin MCP-1 na míšních neuronech. Tím je ovlivněna účinnost sEPSC a jsou potencovány AMPA a NMDA proudy (Gao et al., 2009). Při neuropatické bolesti je také tonicky aktivována JNK dráha v astrocytech (Zhuang et al., 2006) a to působením TNFα, resp. aktivací TNFR1 a R2, díky nimž se zvyšuje produkce MCP1 (Gao et al., 2009). Z našich výsledků vyplývá, že značná část popisovaných vlivů cytokinu TNFα se ve výrazné míře projevuje již po pětidenní axotomii. Je pravděpodobné, že klíčovým prvkem je vzrůst počtu obou typů receptorů TNFR1 a TNFR2 na presynaptickém zakončení. Signální dráhy, které aktivují, se však mohou lišit. V souladu s dostupnými studiemi i naše experimenty potvrzují zásadní úlohu tumor nekrotizujícího faktoru alfa a jeho receptorů v mechanismech neuropatické bolesti na míšní úrovni. 2. 2. Vliv antagonisty TRPV1 receptorů (SB366791) na frekvenci mEPSC míšních neuronů po inkubaci v TNFα u modelu neuropatie Aplikace kompetitivního antagonisty TRPV1 receptorů (SB 366791) byla testována po aplikaci OLDA s cílem zjistit možný podíl aktivace TRPV1 receptorů na zvýšené bazální frekvenci mEPSC. Silná reakce na SB 366791 u pěti buněk, kdy se frekvence mEPSC po aplikaci snížila v průměru o téměř 40 %, by mohla ukazovat na příspěvek TRPV1 receptorů k základní aktivitě buněk po inkubaci v TNFα v modelu neuropatické bolesti. Vedle nutného zvýšení počtu TRPV1 receptorů na povrchu buňky by muselo dojít nejen k jejich senzitizaci, ale i aktivaci. Senzitizace je možná například stimulací

cyklooxygenasy

pomocí

TNFα,

respektive

aktivovaných

TNFR1.

Cyklooxygenasa produkuje mimo jiné prostaglandin E2, jehož senzitizační působení

- 65 -

přes PKA či PKC na TRPV1 receptory již bylo prokázáno (Smith et al., 2000; Gu et al., 2003; Moriyama et al., 2005; Zhang a McNaughton, 2008). Jedním z aktivátorů může být 12-HPETE, která je produktem 12-lipooxygenasy, enzymu aktivovaném působením bradykininu. Bradykininový receptor 1 (BK1), který se vyskytuje na nociceptivních neuronech dorzálních ganglií, je upregulován stejnými mechanismy jako cyklooxygenasa (Calixto et al., 2004), tudíž do jeho stimulace lze započítat i cytokin TNFα a jeho receptory, jejichž zvýšený počet na primárních aferentech provází neuropatickou bolest. Rovněž byl prokázán nárůst mRNA pro bradykininový receptor 1 po sedmi dnech od navození modelu neuropatie typu PNL v poškozeném sedacím nervu (Ferriera et al., 2005). Bradykininové receptory typu 2 mohou mít při své aktivaci rovněž presynaptický účinek na zvýšení frekvence a zvýšením výlevu glutamátu (Wang et al, 2005; Špicarová a Paleček, 2008). Jedním z možných vysvětlení pozorovaného snížení mEPSC pod základní hladinu při aplikaci SB 366791 je tedy tonická aktivace TRPV1 způsobená TNFα, jež přes své receptory způsobil nárůst hladiny prostaglandinu E2 a stimuloval aktivitu BK1 receptoru. Díky PGE2 došlo k senzitizaci TRPV1 receptorů. Pomocí BK1 byla spuštěna signální kaskáda aktivující TRPV1. Antagonista SB 366791 mohl zablokovat aktivní TRPV1 receptory, které přispívaly k vysoké bazální frekvenci mEPSC. U dvou neuronů došlo po aplikaci SB 366791 ke zvýšení frekvence mEPSC. Vzhledem k ojedinělému výskytu tohoto jevu není jasné, zda se jednalo o artefakt, nebo o jev daný nějakým fyziologickým mechanismem. Velmi nepravděpodobným vysvětlením by mohlo být i působení DMSO, v němž je rozpouštěn SB 366791. DMSO má excitační účinky zvýšeným vtokem Ca2+ na glutamátergní synapse v závislosti na koncentraci tohoto rozpouštědla (Lu a Mattson, 2001; Matsumoto et al., 1985). V našich experimentech jsme používali 0,1 % roztok DMSO, což je pětinová hodnota účinné koncentrace DMSO v novější z těchto studií a třicetinová ve srovnání se starší. Stejná koncentrace rozpouštědla byla použita ve všech pokusech a proto je nepravděpodobné, že by se i tato teoretická možnost projevila pouze u několika měření. Při působení roztoku SB 366791 jsme naměřili mírné snížení amplitudy ve srovnání se základní amplitudou po inkubaci s TNFα. Vzhledem k tomu, že k poklesu amplitudy, byť statisticky nesignifikantnímu, došlo již při aplikaci OLDA, je stejně jako u skupiny axotomie nutné připustit jinou možnost než působení na postsynaptické TRPV1 receptory. Pravděpodobně se jeví postupné ucpávání mikroelektrody ke snímanému neuronu, kdy dochází k nárůstu odporu v elektrodě. Vzrůstající odpor znamená pokles zaznamenávaných amplitud mEPSC. Tím by se stal pokles amplitudy arteficielní záležitostí, analogicky ke stavu u skupiny axotomie.

- 66 -

Druhou možností je, analogicky k podobnému jevu pozorovanému u skupiny bez inkubace s TNFα, možnost zapojení jiné populace presynaptických zakončení. Pozorovaný vliv SB 366791 na snížení bazální frekvence mEPSC naznačuje možnost tonické aktivace presynaptických TRPV1 receptorů na míšních řezech po inkubaci s cytokinem TNFα u modelu periferní neuropatie. Toto zjištění v případě jeho dalšího potvrzení by mohlo ukazovat na zapojení TRPV1 receptorů v klinicky pozorovaných patologických bolestivých stavech, kdy často dochází k propojení symptomů zánětlivé (zvýšení exprese TNFα) a neuropatické bolesti (senzitizace a zvýšení exprese TRPV1 receptorů). V důsledku daného zjištění by dalším potenciálním cílem nových analgetik mohly být blokátory exprese TNFα a TRPV1 receptorů, zároveň s již zmíněnou inhibicí mechanismů senzitizace vaniloidního kanálu 1. 3. Modulační vliv NAPE na synaptický excitační přenos N-acylfosfatidylethanolamin

(NAPE)

je

endogenním

prekurzorem

anandamidu, který je součástí metalohydrolázového membránového enzymu NAPE-PLD (Okamoto et al., 2004). NAPE-PLD je koexprimován s TRPV1 na primárních nociceptivních aferentech DRG, což bylo ukázáno v loňském roce (Nagy et al., 2009). Působení NAPE-PLD na synapsích je ilustrováno na obr. 13. V předběžných studiích (Dr. Nagy, osobní sdělení) na buněčných kulturách neuronů spinálních ganglií bylo ukázáno, že NAPE zvyšuje vtok vápníku do buňky. To naznačuje, že NAPE může být přímým aktivátorem TRPV1 receptorů, tj. bez enzymatického působení PLD. V této sekci je také diskutována zásadní role NAPEPLD v produkci anandamidu a jeho následné aktivaci TRPV1 a CB1 receptorů.

Obrázek 13 Přeměna NAPE na pre- i postsynaptické membráně. NAPE je převedeno membránovým enzymem PLD na anandamid, který je uvolňován z membrány a aktivuje synaptické CB1 receptory. Tím může být aktivována či inhibována mj. adenylylcyklasa (AC), jež produkuje cAMP, významného druhého posla mnoha signálních kaskád. Anandamid je vychytáván zpět do buňky a degradován – viz modrý váleček (transportér) s enzymem FAAH – fatty amino acid hydrolase. (Felder et al., 2006)

- 67 -

Námi provedené experimenty in vitro ukázaly jednoznačné snížení frekvence mEPSC po aplikaci NAPE, i když snímané neurony měly TRPV1 pozitivní vstupy, což bylo ověřeno excitačním působením kapsaicinu na závěr pokusu. Naproti tomu v dalších pokusech naší laboratoře vedlo intrathekální podání 200 μM NAPE ke zvýšené expresi produktu raných genů c-Fos ve spinálních neuronech, což ukazuje spíše na excitační působení této látky. Jednou z možností, jak vysvětlit rozdílnost výsledků od předpokladů, je koncentrační závislost působení anandamidu na TRPV1 či CB1 (CB2) receptory. V nízké koncentraci anandamid preferenčně aktivuje CB1 a CB2 receptory. Naopak ve vyšších koncentracích aktivuje TRPV1 receptor (Zygmunt et al., 1999). Kanabioidní receptory působí v rámci nociceptivních mechanismů tlumivě, což bylo prokázáno na periferii (Elms et al., 2005; Gutierezz et al., 2007) i v míše (Tognetto et al., 2001). Je tedy možné, že při dlouhodobější aplikaci NAPE by bylo dostatečné množství této látky konvertováno na anandamid a následně vedlo k aktivaci TRPV1 receptorů.

Při

mechanismech

působení

anandamidu

závisí

nepochybně

i na farmakokinetických vlastnostech, v našem případě ovlivněných koncentrací NAPE v roztoku, dále na hloubce uložení snímaného neuronu a jeho primárních aferentů v míšním řezu a rozložením TRPV1 a CB1 receptorů. Po svém vytvoření anandamid působí ihned jako signální molekula. Následně dochází k jeho vychytávání, tzv. reuptake, do buněk a rychlé degradaci (Wang a Ueda, 2008). Rychlost degradace tak může výrazně ovlivňovat lokální koncentraci anandamidu. Při vyšší rychlosti odbourávání by nemusela být v žádném okamžiku dostupná dostatečná koncentrace anandamidu pro aktivaci TRPV1 receptorů. Vzhledem k tomu, že pozorovaný jev byl pokles frekvence mEPSC, což je presynaptický mechanismus, ovlivněné receptory nejspíše byly exprimovány na centrálním zakončení primárních aferentů. Je-li tento úkaz závislý na CB receptorech, může být provázen snížením vtoku Ca2+ do zakončení, čímž klesá množství vypouštěného glutamátu (Toth et al., 2010). Bylo již prokázáno, že CB1 receptory způsobují presynaptickou inhibici postsynaptických excitačních proudů (Morisset a Urban, 2001). Z dosud dosažených výsledků při studiu NAPE vyplývá, že jeho působení na presynaptické TRPV1 receptory je s větší pravděpodobností nepřímé. Je substrátem membránového PLD, který jej přeměňuje na agonistu TRPV1 receptorů anandamid. Dle našich výsledků získaných z akutních míšních řezů se zdá, že NAPE by mohlo mít tlumivé účinky, podobně jako anandamid v závislosti na lokální koncentraci látky. Další experimenty a testování však budou potřeba pro potvrzení současných pozorování.

- 68 -

Regulace a kooperace mezi CB1 a TRPV1 receptory na primárních aferentních vláknech může hrát klíčovou roli v modulaci míšní nociceptivní signalizace, obzvláště bereme-li v úvahu, že značná část identifikovaných endogenních agonistů aktivuje za určitých podmínek oba typy receptorů. Výzkum interakce mezi funkcí těchto receptorů tak představuje významný cíl pro farmakolgické ovlivnění bolestivých stavů.

- 69 -

ZÁVĚR Modulace synaptického přenosu v superficiální oblasti zadního rohu míšního může zásadním způsobem ovlivňovat nociceptivní signalizaci, zejména při patologických bolestivých stavech. Během nich se do přenosu signálu na míšních synapsích zapojuje řada objasněných, ale jistě také i dosud neobjevených pochodů. Výsledky této práce nastiňují některé možnosti presynaptických modulačních mechanismů nociceptivní signalizace na míšní úrovni, především v modelu neuropatické bolesti. TRPV1 receptory nacházející se na centrálním zakončení primárních aferentů byly v našich experimentech aktivovány aplikací nízké koncentrace OLDA (0,2 μM) po pěti dnech od experimentálně navozené neuropatie. Aktivace TRPV1 kanálů endogenním agonistou zvýšila výlev glutamátu do synaptické štěrbiny a v důsledku toho i frekvenci postsynaptických proudů. Reakce na nízkou koncentraci agonisty byla také pozorována u akutních řezů po pětidenní axotomii s inkubací s TNFα. V obou skupinách snímaných neuronů došlo k výraznému nárůstu frekvence AMPA mEPSC během působení OLDA. To ukazuje na vzestup citlivosti presynaptických TRPV1 receptorů v modelu neuropatie. Tato změna by mohla mít značný podíl na vzniku a rozvoji centrální senzitizace v patologických bolestivých stavech. Výsledky pravděpodobnou

spolupůsobení

TNFα

kolokalizaci

receptorů

a

TRPV1 pro

receptorů

TNFα

a

odhalují

TRPV1

také

receptorů

na presynaptických zakončeních neuronů spinálních ganglií, což je v souladu s předchozími experimenty naší laboratoře. V této práci byl však zkoumán vliv TNFα po axotomii, který ukázal zásadní vliv tohoto cytokinu a jeho receptorů TNFR1 a TNFR2 na míšní mechanismy přenosu nociceptivního signálu při neuropatii. TNFα zvýšil ve srovnání s prostou axotomií frekvenci mEPSC a, jak naznačuje působení antagonisty TRPV1 (SB 366791) receptorů, díky jeho působení byl tonicky aktivován i vaniloidní receptor 1. Pokusy na modelu neuropatické bolesti poodhalují důležitost TRPV1 receptorů při přenosu nociceptivních podnětů na míšní úrovni v této situaci. Z tohoto hlediska se jeví jako možný terč analgetik při patologických stavech bolesti, obzvláště v kombinaci se zacílením zároveň na TNFα a jeho receptory. Pro lepší pochopení mechanismů patologických bolestivých stavů je zapotřebí zkoumání obou typů patologické bolesti, neuropatické i zánětlivé, samozřejmě ve srovnání s normálními nociceptivními procesy. Nesmírně zajímavým

- 70 -

se v tomto směru jeví vytvoření komplexnějšího experimentálního modelu patologické bolesti, který by neuropatickou a zánětlivou bolest dokázal kombinovat. Složitost problematiky modulace nociceptivního míšní synaptického přenosu se ukázala v pokusech s potenciálním agonistou TRPV1 a CB1 receptorů, NAPE. Tato látka působením na akutní míšní řezy snížila frekvenci snímaných AMPA proudů.

Výsledky

z těchto

pokusů

naznačují

silný

vliv

kooperace

mezi

presynaptickými TRPV1 a kanabioidními receptory na modulaci synaptického přenosu v míše. Detailnější průzkum vztahů mezi těmito membránovými bílkovinami na primárních nociceptivních aferentech by mohl být také přínosem pro vývoj nových analgetik. Pochopení a poznání škály možností modulace synaptického míšního přenosu v rámci nociceptivního systému je nezbytným krokem ve vývoji nových terapeutických metod v léčbě bolesti vznikající z rozličných příčin.

- 71 -

LITERATURA AN, Seong; ZENISEK, David. Regulation of exocytosis in neurons and neuroendocrine cells. Current opinion in neurobiology. 2004, vol. 14, no. 5, s. 522-530. Dostupný také z WWW: . ISSN 0959-4388. APKARIAN, A. V.; SOSA, Y.; SONTY, S. ; LEVY, R. M. ; HARDEN, R. N. ; PARRISH, T. B. ; GITELMAN D. R. Chronic back pain is associated with decreased prefrontal and thalamic gray matter density. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2004, vol. 24, no. 46, s. 10410-10430. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. ARNETT, H. A.; MASON, J.; MARINO, M.; SUZUKI, K.; MATSUSHIMA, G. K.; TING, J. P. TNF alpha promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature neuroscience. 2001, vol. 4, no. 11, s. 1116-1122. Dostupný také z WWW: . ISSN 1097-6256. ASTORGA, Guadalupe; BACIGALUPO, Juan. TRP channels as Biological Sensors. Physiological Mini-Reviews [online]. 2007, vol. 3, no. 4, [cit. 2010-04-16]. Dostupný z WWW: . BAO, L.; WANG, H. F.; CAI, H. J. ; TONG, Y. G. ; JIN, S. X. ; LU, Y. J. ; GRANT, G. ; HÖKFELT, T. ; ZHANG, X. Peripheral axotomy induces only very limited sprouting of coarse myelinated afferents into inner lamina II of rat spinal cord. The European journal of neuroscience. 2002, vol. 16, no. 2, s. 175-185. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. BATTAGLIA, G.; RUSTIONI, A. Coexistence of glutamate and substance P in dorsal root ganglion neurons of rat and monkey. The Journal of comparative neurology. 1988, vol. 277, no. 2, s. 302-312. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9967. BAZAN, J. F. Emerging families of cytokines and receptors. Current biology. 1993, vol. 3, no. 9, s. 603-606. Dostupný také z WWW: . ISSN 0960-9822. BENNETT, D. L.; FRENCH, J.; PRIESTLY, J. V. ; MCMAHON, S. B. NGF but not NT-3 or BDNF prevents the Afiber sprouting into lamina II of the spinal cord that occurs following axotomy. Molecular and cellular neurosciences. 1996, vol. 8, no. 4, s. 211-220. Dostupný také z WWW: . ISSN 1044-7431. BERGER, S. W.; HÖRSTER, D.; FURUKAWA, K.; GOODMAN, Y.; KRIEGLSTEIN, J.; MATTSON, M. P. Tumor necrosis factors alpha and beta protect neurons against amyloid beta-peptide toxicity : evidence for involvement of a kappa B-binding factor and attenuation of peroxide and Ca2+ accumulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995, vol. 92, no. 20, s. 9328-9332. Dostupný také z WWW: . ISSN 0027-8424. BHAVE, Gautam ; ZHU, Weiguo ; WANG, Haibin ; BRASIER, D. J. ; OXFORD, Gerry S. ; GEREAU, Robert W. CAMP-Dependent Protein Kinase Regulates Desensitization of the Capsaicin Receptor (VR1) by Direct Phosphorylation. Neuron. 2002, vol. 35, no. 4, s. 721-731. Dostupný také z WWW: . ISSN 0896-6273. BLACK, R. A.; RAUCH, C. T.; KOZLOSKY, C. J.; PESCHON, J. J.; SLACK, J. L.; WOLFSON, M. F.; CASTNER, B. J.; STOCKING, K. L.; REDDY, P.; SRINIVASAN, S.; NELSON, N.; BOIANI, N.; SCHOOLEY, K. A.; GERHART, M.; DAVIS, R.; FITZNER, J. N.; JOHNSON, R. S.; PAXTON, R. J.; MARCH, C. J.; CERRETTI, D. P.; A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature. 1997, 385, 6618, s. 729733. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836. BRIDGES, D.; THOMPSON, S. W.; RICE, A. S. Mechanisms of neuropathic pain. British journal of anaesthesia. 2001, vol. 87, no. 1, s. 12-26. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-0912. CALIXTO, Joao B.; MEDEIROS, Rodrigo; FERNANDES, Elizabeth S ; FERREIRA, Juliano ; CABRINI, Daniela A. ; CAMPOS, Maria M . Kinin B1 receptors : Key G-protein-coupled receptors and their role in inflammatory and painful processes. British Journal of Pharmacology. 2004, vol. 143, no. 7, s. 803-818. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-1188. CAMPBELL, J. N.; MEYER, R. A. Mechanisms of Neuropathic Pain. Neuron. 2010, vol. 52, no. 1, s. 77-92. Dostupný také z WWW: . ISSN 0896-6273. CATERINA, M. J.; SCHUMACHER, M. A.; TOMINAGA, M.; ROSEN, T. A.; LEVINE, J. D.; Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 1997, vol. 389, no. 6653, s. 816-824. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836. CATERINA, Michael J.; JULIUS, David. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway. ANNUAL REVIEW OF NEUROSCIENCE. 2001, no. 24, s. 487-517. Dostupný také z WWW: . ISSN 0147-006X. CLAPHAM, D. E.; RUNNELS, L. W.; STRÜBING, C. The TRP ion channel family. Nature reviews : Neuroscience. 2001, vol. 2, no. 6, s. 387-396. Dostupný také z WWW: . ISSN 1471-003X. COULL, J. A.; BOUDREAU, D.; BACHAND, K. ; PRESCOTT, S. A. ; NAULT, F. ; SIK, A. ; DE KONINCK, P. DE KONINCK, Y. Trans-synaptic shift in anion gradient in spinal lamina I neurons as a mechanism of neuropathic pain. Nature. 2003, vol. 424, no. 6951, s. 938-942. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836.

- 72 -

CUI, M.; HONORE, P.; ZHONG, C. ; GAUVIN, D. ; MIKUSA, J. ; HERNANDEZ, G. ; CHANDRAN, P. ; GOMTSYAN, A. ; BROWN, B. ; BAYBURT, E. K. ; MARSH, K. ; BIANCHI, B. ; MCDONALD, H. ; NIFORATOS, W. ; NEELANDS, T. R. ; MORELAND, R. B. ; DECKER, M. W. ; LEE, C.-H. ; SULLIVAN, J. P. ; FALTYNEK, C. R. TRPV1 receptors in the CNS play a key role in broad-spectrum analgesia of TRPV1 antagonists. The journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006, vol. 26, no. 37, s. 9385-9393. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. DAVAR, G.; HAMA, A.; DEYKIN, A.; VOS, B.; MACIEWICZ, R. MK-801 blocks the development of thermal hyperalgesia in a rat model of experimental painful neuropathy. Bran research. 1991, vol. 553, no. 2, s. 327-330. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-8993. DECOSTERD, I.; WOOLF, C. J. Nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 2000, vol. 87, no. 2, s. 149 - 158. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. DEVOR, M.; JAENIG, W.; MICHAELIS, M. Modulation of activity in dorsal root ganglion neurons by sympathetic activation in nerve-injured rats. Journal of neurophysiology. 1994, vol. 71, no. 1, s. 38-47. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. DOLY, S.; FISCHER, J.; CONRATH, M. The vanilloid receptor-1 (TRPV1) is expressed in some rat dorsal horn NK1 cells . Brain research. 2004, vol. 1004, no. 1-2, s. 203-207. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-8993. DOLY, S.; FISCHER, J.; SALIO, Ch. ; CONRATH, M. The vanilloid receptor-1 is expressed in rat spinal dorsal horn astrocytes . Neuroscience letters. 2004, vol. 357, no. 2, s. 123-126. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3940. DOWDALL, T.; ROBINSON, I.; MEERT, T. F. Comparison of five different rat models of peripheral nerve injury. PHARMACOLOGY BIOCHEMISTRY AND BEHAVIOR. 2005, vol. 80, no. 1, s. 93-108. Dostupný také z WWW: . ISSN 0091-3057. DUNCAN, L. M.; DEEDS, J.; HUNTER, J.; SHAO, J.; HOLMGREN, L. M.; WOOLF, E. A.; TEPPER, R. I.; SHYIAN, A. W. Down-regulation of the novel gene melastatin correlates with potential for melanoma metastasis. Cancer research. 1998, vol. 58, no. 7, s. 1515-1520. Dostupný také z WWW: . ISSN 0008-5472. ELMES, S. J.; WINYARD, L. A. ; MEDHURST, S. J. ; CLAYTON, N. M. ; WILSON, A. W. ; KENDALL, D. A. ; CHAPMAN, V . Activation of CB1 and CB2 receptors attenuates the induction and maintenance of inflammatory pain in the rat. PAIN -AMSTERDAM-. 2005, vol. 118, no. 3, s. 327-335. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. EMPL, M.; RENAUD, S.; ERNE, B. ; FUHR, P. ; STRAUBE, A ; SCHAEREN-WIEMERS, A. ; STECK, A. J. TNFalpha expression in painful and nonpainful neuropathies. NEUROLOGY -MINNEAPOLIS-. 2001, vol. 56, Part 10, s. 1371-1376. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-3878. ESKE, Nathaniel A.; PATWARDHAN, Amol M.; RUPAREL, Nikita B.; AKOPIAN, A. N.; SHAPIRO, M. S.; HENRY, M. A. A-kinase anchoring protein 150 controls protein kinase C-mediated phosphorylation and sensitization of TRPV1. Pain. 2009, vol. 146, no. 3, s. 301-307. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. FACER, P.; CASULA, M. A.; SMITH, G. D. ; BENHAM, C. D. ; CHESSELL, I. P. ; BOUNTRA, C. ; SINISI, M. ; BIRCH, R. ; ANAND, P. Differential expression of the capsaicin receptor TRPV1 and related novel receptors TRPV3, TRPV4 and TRPM8 in normal human tissues and changes in traumatic and diabetic neuropathy. BMC Neurology. 2007, vol. 7, no. 11, s. 1-12. Dostupný také z WWW: . FANG, L.; WU, J.; LIN, Q. ; WILLIS, W. D. Calcium-calmodulin-dependent protein kinase II contributes to spinal cord central sensitization. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2002, vol. 22, Part 10, s. 4196-4204. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. FELDER, C. C.; DICKASON-CHESTERFIELD, A. K.; MOORE, S. A. Cannabinoids biology: the search for new therapeutic targets. Molecular interventions. 2006, vol. 6, no. 3, s. 149-161. Dostupný také z WWW: . ISSN 1534-0384. FERRIERA, Juliano; BEIRITH, Alessandra; MORI, Marcelo A. S. ; ARAUJO, Ronaldo C. ; BADER, Michael ; PESQUERO, Joao B. ; CALIXTO, Joao B . Reduced nerve injury-induced neuropathic pain in kinin B1 receptor knockout mice. The journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2005, vol. 25, no. 9, s. 24052412. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. FERRINI, F.; SALIO, C.; VERGNANO, A. M. ; MERIGHI, A. Vanilloid receptor-1 (TRPV1)-dependent activation of inhibitory neurotransmission in spinal substantia gelatinosa neurons of mouse. Pain. 2007, vol. 129, no. 1-2, s. 195-209. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. FLEETWOOD-WALKER, S. M.; QUINN, J. P.; WALLACE, C. ; BLACKBURN-MUNRO, G. ;KELLY, B. G. ; FISKERSTRAND, C. E. ; NASH, A. A. ; DALZIEL, R. G. Behavioural changes in the rat following infection with varicella-zoster virus. The Journal of general virology. 1999, vol. 90, no. 9, s. 2433-2436. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-1317. FUKUOKA, T.; KONDO, E.; DAI, Y. ; HASHIMOTO, N. ; NOGUCHI, K. Brain-derived neurotrophic factor increases in the uninjured dorsal root ganglion neurons in selective spinal nerve ligation model. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2001, vol. 21, no. 13, s. 4891-4900. Dostupný také z WWW: . ISSN 02706474.

- 73 -

GAO, Yong-Jing ; ZHANG, Ling ; SAMAD, Omar Abdel ; SUTER, Marc R. ; YASUHIKO, Kawasaki; XU, ZhenZhong ; PARK, Jong-Yeon ; LIND, Anne-Li ; QIUFU, Ma ; JI, Ru-Rong . JNK-induced MCP-1 production in spinal cord astrocytes contributes to central sensitization and neuropathic pain. The journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2009, vol. 29, no. 13, s. 4096-4108. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. GARCIA-SANZ, N.; FERNANDEZ-CARVAJAL, A.; MORENILLA-PALAO, C.; PLANELLS-CASES, Rosa; FEJARDO-SANCHEZ, E.; FERNANDEZ-BALLESTER, G.; FERRER-MONTIEL, A. Identification of a Tetramerization Domain in the C Terminus of the Vanilloid Receptor. Journal of neuroscience. 2004, 24, 23, s. 53075314. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. GAUR, U.; AGGARWAL, B. B. Regulation of proliferation, survival and apoptosis by members of the TNF superfamily. Biochemical pharmacology. 2003, vol. 66, no. 8, s. 1403-1408. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-2952. GIBSON, H. E.; EDWARDS, J. G.; PAGE, R. S. ; VAN HOOK, M. J. ; KAUER, J. A. TRPV1 channels mediate longterm depression at synapses on hippocampal interneurons. Neuron. 2008, vol. 57, no. 5, s. 746-759. Dostupný také z WWW: . ISSN 0896-6273. GU, Q.; KWONG, K.; LEE, L.-Y . Ca2+ transient evoked by chemical stimulation is enhanced by PGE2 in vagal sensory neurons: role of cAMP/PKA signaling pathway. Journal of neurophysiology. 2003, vol. 89, no. 4, s. 1985-1993. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. GUTIERREZ, T.; FARTHING, J.N. ; ZVONOK, A. M. ; MAKRIYANNIS, A. ; HOHMANN, A. G . Activation of peripheral cannabinoid CB1 and CB2 receptors suppresses the maintenance of inflammatory nociception : a comparative analysis. British journal of pharmacology. 2007, vol. 150, no. 2, s. 153-163. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-1188. HAMILL, O. P.; MARTY, A.; NEHER, E. ; SAKMANN, B. ; SIGWORTH, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 1981, vol. 391, no. 2, s. 85-100. Dostupný také z WWW: . ISSN 0031-6768. HANISCH, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 2002, vol. 40, no. 2, s. 140-155. Dostupný také z WWW: . ISSN 0894-1491. HENSELLEK, S.; BRELL, P.; SCHIABLE, H. G. ; BRÄUER, R. ; SEGOND VON BACHNET, G. The cytokine TNFalpha increases the proportion of DRG neurones expressing the TRPV1 receptor via the TNFR1 receptor and ERK activation. Molecular and cellular neurosciences. 2007, vol. 36, no. 3, s. 381-391. Dostupný také z WWW: . ISSN 1044-7431. HOLMES, G. M.; HERBERT, S. L.; ROGERS, R. C ; HERMANN, G. E. Immunocytochemical localization of TNF type 1 and type 2 receptors in the rat spinal cord. Brain research. 2004, vol. 1025, no. 1-2, s. 210-219. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-8993. HONORE, P.; ROGERS, S. D.; SCHWEI, M. J. ; SALAK-JOHNSON, J. L. ; LUGER, N. M. ; SABINO, M. C. ; CLOHISY, D. R. ; MANTYH, P. W. Murine models of inflammatory, neuropathic and cancer pain each generates a unique set of neurochemical changes in the spinal cord and sensory neurons. Neuroscience. 2000, vol. 98, no. 3, s. 585598. Dostupný také z WWW: . ISSN 0306-4522. HUANG, J.; ZHANG, X.; MCNAUGHTON, P. A. Inflammatory pain: the cellular basis of heat hyperalgesia. Current neuropharmacology. 2006, vol. 4, no. 3, s. 197-206. Dostupný také z WWW: . ISSN 1570-159X. HUDSON, L. J.; BEVAN, S.; WOTHERSPOON, G. ; GENTRY, C. ; FOX, A. ; WINTER, J. VR1 protein expression increases in undamaged DRG neurons after partial nerve injury. European Journal of Neuroscience. 2001, vol. 13, no. 11, s. 2105-2114. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. HWANG, S. J.; BURETTE, A.; RUSTIONI, A. VALTSCHANOFF, J. G. Vanilloid receptor VR1-positive primary afferents are glutamatergic and contact spinal neurons that co-express neurokinin receptor NK1 and glutamate receptors. Journal of neurocytology. 2004, vol. 33, no. 3, s. 321-329. Dostupný také z WWW: . ISSN 0300-4864. HWANG, S. J.; VALTSCHANOFF, J. G. Vanilloid receptor VR1-positive afferents are distributed differently at different levels of the rat lumbar spinal cord. Neuroscience letters. 2003, vol. 349, no. 1, s. 41-44. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3940. CHEN, Q.; GOEDDEL, D. V. TNF-R1 Signaling: A Beautiful Pathway. Science : NEW YORK THEN WASHINGTON. 2002, vol. 296, no. 5573, s. 1634-1635. Dostupný také z WWW: . ISSN 00368075. CHU, C. J.; HUANG, S. M.; DE PETROCELLIS, L. ; BISOGNO, T. ; EWING, S. A. ; MILLER, J. D. ; ZIPKIN, R. E. ; DADDARIO, N. ; APPENDINO, G. ; DI MARZO, V. ; WALKER, J. M. N-oleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces hyperalgesia. The Journal of biological chemistry. 2003, vol. 278, no. 16, s. 1363313639. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9258. IHNATKO, R.; KUBEŠ, M. . TNF signaling : early events and phosphorylation. General physiology and biophysics. 2007, vol. 26, no. 3, s. 159-167. Dostupný také z WWW: . ISSN 0231-5882.

- 74 -

JARA, J. H.; SINGH, B. B. ; FOLDEN, A. M.; COMBS, C. K. Tumor necrosis factor alpha stimulates NMDA receptor activity in mouse cortical neurons resulting in ERK-dependent death. Journal of neurochemistry. 2007, vol. 100, no. 5, s. 1407-1420. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3042. JARA-OSEGUERA, A.; SIMON, S. A. ; ROSENBAUM, T. TRPV1 : on the road to pain relief. Current molecular pharmacology. 2008, vol. 1, no.3, s. 255-269. Dostupný také z WWW: . ISSN 1874-4672. JI, R. R.; BEFORT, K.; BRENNER, G. J. ; WOOLF, C. J. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2002, vol. 22, Part 2, s. 478-485. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. JI, R. R.; KOHNO, T.; MOORE, K. A.; WOOLF, C. J. Central sensitization and LTP : do pain and memory share similar mechanisms? . Trends in neurosciences. 2003, vol. 26, no. 12, s. 696-705. Dostupný také z WWW: . ISSN 0166-2236. JIANG, Y.; WORONIZC, J. D.; LIU, W.; GOEDDEL, D. V. Prevention of Constitutive TNF Receptor 1 Signaling by Silencer of Death Domains. Science. 1999, vol. 283, no. 5401, s. 543-546. Dostupný také z WWW: . ISSN 0036-8075. JIN, X.; GEREAU, R. W. Acute p38-mediated modulation of tetrodotoxin-resistant sodium channels in mouse sensory neurons by tumor necrosis factor-alpha. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2006, vol. 26, no. 1, s. 246-255. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. KASKE, S.; KRASTEVA, G.; KÖNIG, P.; KUMMER, W.; HOFMANN, T.; GUDERMANN, T.; CHUBANOV, V. TRPM5 : a taste-signaling transient receptor potential ion-channel, is a. BMC Neuroscience [online]. 2007, vol. 49, no. 8, [cit. 2010-04-23]. Dostupný z WWW: . KHAN, A. A.; DIOGENES, A.; JESKE, N. A ; HENRY, M. A. ; AKOPAIN, A. ; HARGREAVES, K. M. Tumor necrosis factor alpha enhances the sensitivity of rat trigeminal neurons to capsaicin. Neuroscience. 2008, vol. 155, no. 2, s. 503-509. Dostupný také z WWW: . ISSN 0306-4522. KIM, K. J.; YOON, Y. W.; CHUNG, J. M. Comparison of three rodent neuropathic pain models. Experimental brain research. 1997, vol. 113, no. 2, s. 200-206. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-4819. KIM, S. H.; CHUNG, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 1992, vol. 50, no. 3, s. 355-363. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. KINGERY, W. S.; VALLIN, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 1989, vol. 38, no. 3, s. 321-332. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. KINOUCHI, K.; BROWN, G.; PASTERNAK, G.; DONNER, D. B. Identification and characterization of receptors for tumor necrosis factor-alpha in the brain. Biochemical and biophysical research communications. 1991, vol. 181, no. 3, s. 1532-1538. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-291X. KOERBER, H. R.; MIRNICS, K.; BROWN, P. B.; MENDELL, L. M. Central sprouting and functional plasticity of regenerated primary afferents. The Journal of neuroscience. 1994, vol. 14, no. 6, s. 3655-3671. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. KOHNO, T.; JI, R. R.; ITO, N. ; ALLCHOME, A. J. ; BEFORT, K. ; KARCHEWSKI, L. A. ; WOOLF, C. J. Peripheral axonal injury results in reduced mu opioid receptor pre- and post-synaptic action in the spinal cord. Pain. 2005, vol. 117, no. 1-2, s. 77-87. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. KOHNO, T.; MOORE, K. A.; BABA, H. ; WOOLF, C. J. Peripheral nerve injury alters excitatory synaptic transmission in lamina II of the rat dorsal horn. The Journal of physiology. 2003, vol. 548, no. 1, s. 131-138. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3751. KOCHUKOV, M. Y.; MCNEARNEY, T. A.; YIN, H.; ZHANG, L.; MA, F.; PONOMAREVA, L.; ABSHIRE, S.; WESTLUND, K. N. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) enhances functional thermal and chemical responses of TRP cation channels in human synoviocytes. Molecular pain. 2009, vol. 5, no. 49. Dostupný také z WWW: . KRENZ, N. R.; MEAKIN, S. O.; KRASSIOUKOV, A. V. ; WEAVER, L. C. Neutralizing intraspinal nerve growth factor blocks autonomic dysreflexia caused by spinal cord injury. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 1999, vol. 19, no. 17, s. 7405-7414. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. KUPERS, R.; YU, W.; PERSSON, J. K. ; XU, X. ; WIESENFELD-HALLIN, Z. Photochemically-induced ischemia of the rat sciatic nerve produces a dose-dependent and highly reproducible mechanical, heat and cold allodynia, and signs of spontaneous pain. Pain. 1998, vol. 76, no. 1-2, s. 45-59. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. LEUNG, L.; CAHILL, C. M. TNF-alpha and neuropathic pain - a review. Journal of neuroinflammation. 2010, vol. 7, no. 1, s. 1-27. Dostupný také z WWW: . LI, D. P.; CHEN, S. R.; PAN, H. L. VR1 receptor activation induces glutamate release and postsynaptic firing in the paraventricular nucleus. JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY. 2004, vol. 92, no. 3, s. 1807-1816. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077.

- 75 -

LI, Y.; JI, A.; WEIHE, E ; SCHAFER, M. K.-H. Cell-specific expression and lipopolysaccharide-induced regulation of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) and TNF receptors in rat dorsal root ganglion. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2004, vol. 24, Part 43, s. 9623-9637. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. LIU, Y. L.; ZHOU, L. J.; HU, N. W.; XU, J. T.; WU, C. Y.; ZHANG, T.; LI, Y. Y.; LIU, X. G. Tumor necrosis factoralpha induces long-term potentiation of C-fiber evoked field potentials in spinal dorsal horn in rats with nerve injury : the role of NF-kappa B, JNK and p38 MAPK.Neuropharmacology. 2007, vol. 52, no. 3, s. 708-715. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-3908. LOESER, John D.; TREEDE, Rolf-Detlef. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 2008, vol. 137, no. 3, s. 473-477. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. LU, C.; MATTSON, M. P. Dimethyl sulfoxide suppresses NMDA- and AMPA-induced ion currents and calcium influx and protects against excitotoxic death in hippocampal neurons. Experimental neurology. 2001, vol. 170, no. 1, s. 180185. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-4886. MÄNNEL, D. N. Biological aspects of tumor necrosis factor. Immunobiology. 1986, vol. 172, no. 3 - 5, s. 283-290. Dostupný také z WWW: . ISSN 0171-2985. MARSCH, R.; FOELLER, E.; RAMMES, G. ; BUNCK, M. ; KOSSL, M. ; HOLSBOER, F. ; ZIEGLGANSBERGER, W. ; LANDGRAF, R. ; LUTZ, B. ; WOTJAK, C. T. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2007, vol. 27, no. 4, s. 832-839. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. MATSAMUTO, Misaki; INOUE, Makoto; HALD, Andreas; XIE, W.; UEDA, H. Inhibition of paclitaxel-induced Afiber hypersensitization by gabapentin. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2006, vol. 318, no. 2, s. 735-740. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3565. MATSUMOTO, M.; RIKER, W. K.; TAKASHIMA, K. ; GOSS, J. R. ; MELA-RIKER, L. DMSO effects on synaptic facilitation and calcium dependence in bullfrog sympathetic ganglion. European journal of pharmacology. 1985, vol. 109, no. 2, s. 213-218. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-2999. MEYER, R. A.; RINGKAMP, M. A role for uninjured afferents in neuropathic pain. Sheng li xue bao : Acta Physiologica Sinica. 2008, vol. 60, no. 5, s. 605-609. Dostupný také z WWW: . ISSN 0371-0874. MEZEY, E.; TOTH, Z. E.; CORTRIGHT, D. N. ; ARZUBI, M. K. ; KRAUSE, J. E. ; ELDE, R. ; GUO, A. ; BLUMBERG, P. M. ; SZALLASI, A. Distribution of mRNA for vanilloid receptor subtype 1 (VR1), and VR1-like immunoreactivity, in the central nervous system of the rat and human. PROCEEDINGS- NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES USA. 2000, vol. 97, Part 7, s. 3655-3660. Dostupný také z WWW: . ISSN 0027-8424. MICHAEL, G. J.; PRIESTLY, J. V. Differential expression of the mRNA for the vanilloid receptor subtype 1 in cells of the adult rat dorsal root and nodose ganglia and its downregulation by axotomy. The journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 1999, vol. 19, no. 5, s. 1844-1854. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. MILLAN, MJ. The induction of pain : an integrative review. Progress in neurobiology. 1999, vol. 57, no. 1, s. 1-164. Dostupný také z WWW: . ISSN 0301-0082. MONTELL, C. The TRP superfamily of cation channels. Science's STKE : signal transduction knowledge environment [online]. 2005, vol.2005, no. 272, [cit. 2010-04-23]. Dostupný z WWW: . MORISSET, V.; URBAN, L . Cannabinoid-induced presynaptic inhibition of glutamatergic EPSCs in substantia gelatinosa neurons of the rat spinal cord. JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY. 2001, vol. 86, Part 1, s. 40-48. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. MOSAVI, Leila K.; MINOR, Daniel L.; PENG, Zheng-yu. Consensus-Derived Structural Determinants of the Ankyrin Repeat Motif . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002, vol. 99, no. 25, s. 16029-16034. Dostupný také z WWW: . ISSN 0027-8424. Mosby's medical dictionary. 8th ed. St. Louis : Mosby/Elsevier, 2009. ISBN 0-3230-529-08 MUNGLANI, R.; HUNT, S. P. Molecular biology of pain. British journal of anaesthesia. 1995, vol. 75, no. 2, s. 186192. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-0912. NAGY, B.; FEDONIDIS, C.; PHOTIOU, A. ; WAHBA, J. ; PAULE, C. C. ; MA, D. ; BULUWELA, L. ; NAGY, I. Capsaicin-sensitive primary sensory neurons in the mouse express N-Acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D. Neuroscience. 2009, vol. 161, no. 2, s. 572-577. Dostupný také z WWW: . ISSN 0306-4522. NICOL, G. D.; LOPSHIRE, J. C.; PAFFORD, C. M. Tumor necrosis factor enhances the capsaicin sensitivity of rat sensory neurons. The journal of neuroscience : e official journal of the Society for Neuroscience. 1997, vol. 17, no. 3, s. 975-982. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. OGOSHI, F.; YIN, H. Z.; KUPPUMBATTI, Y.; SONG, B.; AMINDARI, S.; WEISS, J. H. Tumor necrosis-factor-alpha (TNF-alpha) induces rapid insertion of Ca2+-permeable alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate

- 76 -

(AMPA)/kainate (Ca-A/K) channels in a subset of hippocampal pyramidal neurons. Experimental neurology. 2005, vol. 193, no. 2, s. 384-393. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-4886. OKAMOTO, Y.; MORISHITA, J.; TSUBOJ, K. ; TONAI, T. ; UEDA, N. Molecular characterization of a phospholipase D generating anandamide and its congeners. The Journal of biological chemistry. 2004, vol. 279, no. 7, s. 5298-5305. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9258. PALEČEK, J.; ABRACHMANOVA, G.; VLACHOVA, V. ; VYKLICKY, L. Properties of NMDA receptors in rat spinal cord motoneurons. EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 1999, vol. 11, no. 3, s. 827-836. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. PALEČEK, J.; PALEČKOVÁ, V.; WILLIS, W. D. . The effect of phorbol esters on spinal cord amino acid concentrations and responsiveness of rats to mechanical and thermal stimuli. Pain. 1999, vol. 80, no. 3, s. 597-606. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. PATAPOUTAIN, A.; TATE, S.; WOOLF, C. J. Transient receptor potential channels: targeting pain at the source. Nature reviews : Drug discovery. 2009, vol. 8, no. 1, s. 55-68. Dostupný také z WWW: . ISSN 1474-1776. PATESTAS, Maria Antoniou; GARTNER, Leslie P. A textbook of neuroanatomy. Oxford : Blackwell, 2006. 454 s. Dostupné z WWW: . ISBN 978-1-4051-0340-4. PEGORINI, S.; ZANI, A.; BRADA, D. ; GUERINI-ROCCO, CH. ; SALA, M. Vanilloid VR1 receptor is involved in rimonabant-induced neuroprotection. British Journal of Pharmacology. 2006, vol. 147, no. 5, s. 552-559. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-1188. POLLOCK, J.; MCFARLANE, S. M.; CONELL, M. C. ; ZEHAVI, U. ; VANDENABEELE, P. ; MACEWAN, D. J. ; SCOTT, R. H. TNF-alpha receptors simultaneously activate Ca2+ mobilisation and stress kinases in cultured sensory neurones. Neuropharmacology. 2002, vol. 42, no. 1, s. 93-106. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-3908. POSPÍŠILOVÁ, E.; PALEČEK, J. Post-operative pain behavior in rats is reduced after single high-concentration capsaicin application. Pain. 2006, vol. 125, no. 3, s. 233-243. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. RAGHAVENDRA, V.; TANGA, F. Y. ; DE LEO, J. A. Complete Freunds adjuvant-induced peripheral inflammation evokes glial activation and proinflammatory cytokine expression in the CNS. EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2004, vol. 20, no. 2, s. 467-473. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. REXED, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of comparative neurology. 1952, vol. 96, no. 3, s. 414-495. ISSN 0021-9967. SELTZER, Z.; DUBNER, R.; SHIR, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 1990, vol. 43, no. 2, s. 205-218. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. SHAULIAN, E.; KARIN, M. AP-1 as a regulator of cell life and death. Nature cell biology. 2002, vol. 4, no. 5, s. E131136. Dostupný také z WWW: . ISSN 1465-7392. SHUBAYEV, V. I.; MYERS, R. R. Axonal transport of TNF-alpha in painful neuropathy: distribution of ligand tracer and TNF receptors. Journal of neuroimmunology. 2001, vol. 114, no. 1-2, s. 48-56. Dostupný také z WWW: . ISSN 0165-5728. SCHAFERS, M.; GEIS, C.; BRORS, D. ; YAKSH, T. L. ; SOMMER, C. Anterograde transport of tumor necrosis factor-alpha in the intact and injured rat sciatic nerve. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2002, vol. 22, Part 2, s. 536545. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. SCHAFERS, M.; LEE, D. H.; BRORS, D. ; YAKSH, T. L. ; SORKIN, L. S. Increased Sensitivity of Injured and Adjacent Uninjured Rat. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2003a, vol. 23, no. 7, s. 3028-3038. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. SCHAFERS, M.; SOMMER, C.; GEIS, C. ; HAGENACKER, T. ; VANDENABEELE, P. ; SORKIN, L. S. Selective stimulation of either tumor necrosis factor receptor differentially induces pain behavior in vivo and ectopic activity in sensory neurons in vitro. Neuroscience. 2008, vol. 157, no. 2, s. 414-423. Dostupný také z WWW: . ISSN 0306-4522. SCHAFERS, M.; SVENSSON, C. I.; SOMMER, C. ; SORKIN, L. S. Tumor Necrosis Factor-alpha Induces Mechanical Allodynia after Spinal Nerve Ligation by Activation of p38 MAPK in Primary Sensory Neurons. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2003b, vol. 23, Part 7, s. 2517-2521. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. SCHAFERS, Maria; SORKIN, Linda S.; SOMMER, Claudia. Intramuscular injection of tumor necrosis factor-alpha induces muscle hyperalgesia in rats. Pain. 2003, vol. 104, no. 3, s. 579-588. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. SCHOLZ, J.; BROOM, D. C.; YOUN, D. H. ; MILLS, C. D. ; KOHNO, T. ; SUTER, M. R. ; MOORE, K. A. ; DECOSTERD, I. ; COGGESHALL, R. E. ; WOOLF, C. J. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2005, vol. 25, no. 32, s. 7317-7323. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474.

- 77 -

SCHOLZ, J.; WOOLF, C. J. Can we conquer pain?. NATURE NEUROSCIENCE. 2002, vol. 5, no. 11, s. 1062-1067. Dostupný také komerčně z WWW: . ISSN 1097-6256. SIDI, S.; FRIEDRICH, R. W.; NICOLSON, T. NompC TRP Channel Required for Vertebrate Sensory Hair Cell Mechanotransduction : A cation-conducting pore at the base of the hair cells in the vertebrate inner ear converts vibrations of their cilia into nerve signals, providing for hearing and balance control. Science. 2003, vol. 301, no. 5629, s. 96-99. Dostupný také z WWW: . ISSN 0036-8075. SMITH, G. D.; GUNTHORPE, M. J.; KELSELL, R. E.; HAYES, P. D.; REILLY, P.; WRIGHT, J. E.; JERMAN, J. C.; WALHIN, J. P.; OOI, L.; EGERTON, J.; CHARLES, K. J.; SMART, J.; RANDALL, A. D.; ANAND, P.; DAVIS, J. B. TRPV3 is a temperature-sensitive vanilloid receptor-like protein. Nature. 2002, vol. 418, no. 6894, s. 186-190. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836. SMITH, Jacqueline A. M.; DAVIS, Clare L.; BURGESS, Gillian M . Prostaglandin E2-induced sensitization of bradykinin-evoked responses in rat dorsal root ganglion neurons is mediated by cAMP-dependent protein kinase A. European Journal of Neuroscience. 2000, vol. 12, no. 9, s. 3250-3258. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. SOMMER, C.; SCHAFERS, M. Painful mononeuropathy in C57BL/Wld mice with delayed wallerian degeneration: differential effects of cytokine production and nerve regeneration on thermal and mechanical hypersensitivity. Brain research. 1998, vol. 784, no. 1-2, s. 154-162. Dostupný také z WWW: . ISSN 0006-8993. SOMMER, Claudia; MARZINIAK, Martin; MYERS, Robert R. The effect of thalidomide treatment on vascular pathology and hyperalgesia caused by chronic constriction injury of rat nerve. Pain. 1998, vol. 74, no. 1, s. 83-91. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3959. SUGIURA, T.; TOMINAGA, M.; KATSUYA, H. ; MIZUMURA, K. Bradykinin lowers the threshold temperature for heat activation of vanilloid receptor 1. JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY. 2002, vol. 88, Part 1, s. 544-548. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. SUKHATME, V. P. Early transcriptional events in cell growth: the Egr family. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 1990, vol. 1, no. 6, s. 859-866. Dostupný také z WWW: . ISSN 1046-6673. SZALLASI, A.; CORTRIGHT, D. N.; BLUM, C. A. ; EID, S. R. . The vanilloid receptor TRPV1 : 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nature reviews : Drug discovery. 2007, vol. 6, no. 5, s. 357-372. Dostupný také z WWW: . ISSN 1474-1776. SZALLASI, Arpad; BLUMBERG, Peter M. Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms. Pharmacological reviews. 1999, vol. 51, no. 2, s. 159-212. Dostupný také z WWW: . ISSN 00316997. ŠPICAROVÁ, D. ; PALEČEK, J. Tumor necrosis factor α sensitizes TRPV1 receptors to the endogenous agonist Noleoyldopamine at the spinal cord level. V recenzním řízení. 2010. ŠPICAROVÁ, D.; PALEČEK, J. The role of Spinal Cord Vanilloid (TRPV1) Receptors in Pain modulation. Physiological Research. 2008, vol. 57, Suppl. 3, s. 69-77. Dostupný také z WWW: . ISSN 0862-8408. ŠPICAROVÁ, D.; PALEČEK, J. The role of the TRPV1 endogenous agonist N-Oleoyldopamine in modulation of nociceptive signaling at the spinal cord level. JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY. 2009, vol. 102, no. 1, s. 234-243. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. TANDRUP, T.; WOOLF, C. J.; COGGESHALL, R. E. Delayed loss of small dorsal root ganglion cells after transection of the rat sciatic nerve. The Journal of comparative neurology. 2000, vol. 422, no. 2, s. 172-180. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9967. THOMPSON, S. W. N.; BENNETT, D. L. H.; KERR, B. J.; BRADBURY, E. J.; MCMAHON, S. B. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is an Endogenous Modulator of Nociceptive Responses in the Spinal Cord. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, vol. 96, no. 14, s. 7714-7718. Dostupný také z WWW: . ISSN 0027-8424. TOBIUME, K.; MATSUZAWA, A.; TAKAHASHI, T.; NISHITOH, H.; MORITA, K.; TAKEDA, K.; MINOWA, O.; MIYAZONO, K.; NODA, T.; ICHIJO, H. ASK1 is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis. EMBO reports. 2001, vol. 2, no. 3, s. 222-228. Dostupný také z WWW: . ISSN 1469-221X. TOGNETTO, M.; AMADESI, S.; HARRISON, S ; CREMINON, C. ; TREVISANI, M. ; CARRERAS, M. ; MATERA, M. ; GEPPETTI, P. ; BIANCHI, A . Anandamide excites central terminals of dorsal root ganglion neurons via vanilloid receptor-1 activation. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2001, vol. 21, Part 4, s. 1104-1109. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. TOMOKO, Moriyama ; TOMOHIRO, Higashi; KAZUYA, Togashi ; TOHKO, Ida ; ERI, Segi ; YUKIHIKO, Sugimoto ; TOMOKO, Tominaga ; SHUH, Narumiya ; MAKOTO, Tominaga . Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins. Molecular Pain. 2005, vol. 1, no. 3, s. 1-13. Dostupný také z WWW: .

- 78 -

TOTH, C. C.; JEDRZEJEWSKI, N. M.; ELLIS, C. L ; FREY, W. H. 2nd . Cannabinoid-mediated modulation of neuropathic pain and microglial accumulation in a model of murine type I diabetic peripheral neuropathic pain. Molecular Pain. 2010, vol. 6, no. 16, s. 1-22. Dostupný také z WWW: . Tumor necrosis factor-alpha In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida) : Wikipedia Foundation, 5 June 2003, 22 April 2010 [cit. 2010-04-27]. Dostupné z WWW: . UEDA, H. Peripheral mechanisms of neuropathic pain - involvement of lysophosphatidic acid receptor-mediated demyelination. Molecular pain. 2008, vol. 4, no.11, s. Dostupný také z WWW: . ISSN 1744-8069. UEDA, Hiroshi. Peripheral mechanisms of neuropathic pain : involvement of lysophosphatidic acid receptor-mediated demyelination. Molecular pain. 2008, vol. 4, no. 11. Dostupný také z WWW: . UEDA, Hiroshi; TSUDA, Makoto; INOUE, Kazuhide.; MURASE, Kazuyuki. Long-term potentiation of neuronal excitation by neuron-glia interactions in the rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 2007, vol. 25, no. 5, s. 1297-1306. Dostupný také z WWW: . ISSN 0953-816X. VALTSCHANOFF, J. G.; RUSTIONI, A.; GUO, A. ; HWANG, S. J. Vanilloid receptor VR1 is both presynaptic and postsynaptic in the superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of comparative neurology. 2001, vol. 436, no. 2, s. 225-235. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9967. VENKATACHALAM , Kartik; MONTELL, Craig. TRP channels. Annual Review of Biochemistry. 2007, vol. 76, s. 387-417. Dostupný také z WWW: . ISSN 00664154. VON ROENN, Jamie H.; PAICE, Judith A.; PREODOR, Michael E. Current diagnosis and treatment of pain. United States of America : The MacGraw-Hill Company, 2006. 349 s. Dostupný z WWW: . ISBN 0-07-144478-5. WAGNER, R.; MYERS, R. R. Endoneurial injection of TNF-alpha produces neuropathic pain behaviors.Neuroreport. 1996, vol. 7, no. 18, s. 2897-2901. Dostupný také z WWW: . ISSN 0959-4965. WAJANT, H.; PFIZENMAIER, K.; SCHEURICH, P. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death and Differentiation. 2003, vol. 10, no. 1, s. 45-65. Dostupný také z WWW: . ISSN 1350-9047. WALL, P. D. Neuropathic pain and injured nerve : central mechanisms. British medical bulletin. 1991, vol. 47, no. 3, s. 631-643. Dostupný také z WWW: . ISSN 0007-1420. WATANABE, M.; ENDO, Y.; KIMOTO, K. ; KATOH-SEMBA, R. ; ARAKAWA, Y. Inhibition of adjuvant-induced inflammatory hyperalgesia in rats by local injection of neurotrophin-3. Neuroscience letters. 2000, vol. 282, no. 1, s. 6164. Dostupný také z WWW: . ISSN 0304-3940. WATKINS, L. R.; HUTCHINSON, M. R.; MILLIGAN, E. D. ; MAIER, S. F. "Listening" and "talking" to neurons: implications of immune activation for pain control and increasing the efficacy of opioids. Brain Research Reviews. 2007, vol. 56, no. 1, s. 148-169. Dostupný také z WWW: . ISSN 0165-0173. WAXMAN, S. G.; DIB-HAJI, S.; CUMMINS, T. R.; BLACK, J. A. Sodium channels and pain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999, vol. 96, no. 14, s. 7635-7639. Dostupný také z WWW: . ISSN 0027-8424. WAXMAN, S. G.; KOCSIS, J. D.; BLACK, J. A. Type III Sodium Channel mRNA Is Expressed in Embryonic But Not Adult Spinal Sensory Neurons, and Is Reexpressed Following Axotomy. Journal of neurophysiology. 1994, vol. 72, no. 1, s. 466-470. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. WELLS, M. R.; RACIS JR., S. P.; VAIDYA, U. Changes in plasma cytokines associated with peripheral nerve injury. Journal of neuroimmunology. 1992, vol. 39, no. 3, s. 261-268. Dostupný také z WWW: . ISSN 0165-5728. Wikipedia [online]. 2010 [cit. 2010-05-03]. Rexed laminae. Dostupné .

z

WWW:

Wikipedia [online]. 2010 [cit. 2010-05-03]. Tumor necrosis .

factor-alpha.

Dostupné

z

WWW:

Wikipedia [online]. 2010 [cit. 2010-05-03]. Tumor .

factor-alpha.

Dostupné

z

WWW:

necrosis

WILSON-GERWING, T. D.; DMYTERKO, M. V.; ZOCHODNE, D. W. ; JOHNSTON, J. M. ; VERGE, V. K. M. Neurotrophin-3 suppresses thermal hyperalgesia associated with neuropathic pain and attenuates transient receptor potential vanilloid receptor-1 expression in adult sensory neurons. JOURNAL OF NEUROSCIENCE. 2005, vol. 25, no. 3, s. 758-767. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. WILSON-GERWING, T. D.; STUCKY, C. L.; MCCOMB, G. W. ; VERGE, V. K. M. . Neurotrophin-3 significantly reduces sodium channel expression linked to neuropathic pain states. EXPERIMENTAL NEUROLOGY. 2008, vol. 213, no. 2, s. 303-314. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-4886. WOOLF, C. J.; SALTER, M.W. Neuronal plasticity : increasing the gain in pain. Science. 2000, vol. 288, no. 5472, s. 1765-1769. Dostupný také z WWW: . ISSN 0036-8075.

- 79 -

WOOLF, C. J.; SHORTLAND, P.; COGGESHALL, R. E. Peripheral nerve injury triggers central sprouting of myelinated afferents. Nature. 1992, vol. 355, no. 6355, s. 75-78. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836. WOOLF, C. J.; SHORTLAND, P.; REYNOLDS, M. ; RIDINGS, J. ; DOUBELL, T. ; COGGESHALL, R. E. Reorganization of central terminals of myelinated primary afferents in the rat dorsal horn following peripheral axotomy. The Journal of comparative neurology. 1995, vol. 360, no. 1, s. 121-134. Dostupný také z WWW: . ISSN 0021-9967. YUAN, Z.; GONG, S.; LUO, J.; ZHENG, Z.; SONG, B.; MA, S.; GUO, J.; HU, C.; THIEL, G.; VINSON, C.; HU, C. D.; WANG, Y.; LI, M. Opposing roles for ATF2 and c-Fos in c-Jun-mediated neuronal apoptosis nabla. Molecular and Cellular Biology. 2009, vol. 29, no. 9, s. 2431-2442. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-7306. ZHANG, H. M.; ZHOU, L. J.; HU, X. D. ; HU, N. W. ; ZHANG, T. ; LIU, X. G. Acute nerve injury induces long-term potentiation of C-fiber evoked field potentials in spinal dorsal horn of intact rat. Sheng li xue bao : Acta physiologica Sinica. 2004, vol. 56, no. 5, s. 591-596. Dostupný také z WWW: . ISSN 0371-0874. ZHANG, X.; LI, L.; MCNAUGHTON, P. A. Proinflammatory mediators modulate the heat-activated ion channel TRPV1 via the scaffolding protein AKAP79/150. Neuron. 2008, vol. 59, no. 3, s. 450-461. Dostupný také z WWW: . ISSN 0896-6273. ZHONG, Y.; ZHOU, L. J.; REN, W. J.; XIN, W. J.; LI, Y. Y.; ZHANG, T.; LIU, X. G. The direction of synaptic plasticity mediated by C-fibers in spinal dorsal horn is decided by Src-family kinases in microglia : The role of tumor necrosis factor-alpha. Brain, behavior and immunity. 2010, Preprint. Dostupný také z WWW: . ISSN 0889-1591. ZHOU, H. Y.; CHEN, S. R.; CHEN, H. ; PAN, H. L. The glutamatergic nature of TRPV1-expressing neurons in the spinal dorsal horn. Journal of neurochemistry. 2009, vol. 108, no. 1, s. 305-318. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3042. ZHOU, H.-Y.; ZHANG, H.-M.; CHEN, S.-R. ; PAN, H.-L. Increased nociceptive input rapidly modulates spinal GABAergic transmission through endogenously released glutamate. JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY. 2007, vol. 97, no. 1, s. 871-882. Dostupný také z WWW: . ISSN 0022-3077. ZHOU, L. J.; ZHONG, Y.; REN, W. J.; LI, Y. Y.; ZHANG, T.; LIU, X. G. BDNF induces late-phase LTP of C-fiber evoked field potentials in rat spinal dorsal horn. Experimental neurology. 2008, vol. 212, no. 2, s. 507-514. Dostupný také z WWW: . ISSN 0014-4886. ZHUANG, Zhi-Ye ; WEN, Yeong-Ray; ZHANG, De-Ren ; BORSELLO, Tiziana ; BONNY, Christophe ; STRICHARTZ, Gary R. ; DECOSTERD, Isabelle ; JI, Ru-Rong . A peptide c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor blocks mechanical allodynia after spinal nerve ligation: respective roles of JNK activation in primary sensory neurons and spinal astrocytes for neuropathic pain development and maintenance. The journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006, vol. 26, no. 13, s. 3551-3560. Dostupný také z WWW: . ISSN 0270-6474. ZYGMUNT, P. M.; PETERSSON, J.; ANDERSSON, D. A. ; CHUANG, H. ; SØRGÅRD, M. ; DI MARZO, V. ; JULIUS, D. ; HÖGESTÄTT, E. D. Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature. 1999, vol. 400, no. 6743, s. 452-457. Dostupný také z WWW: . ISSN 0028-0836.

- 80 -