Sporadikus vastag- és végbéldaganatok molekuláris genetikai markerei
Készítette: Kámory Enikő
ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Klasszikus és Molekuláris Genetika Doktori Program
Témavezető: Dr. Csuka Orsolya Doktori Program vezetője: Prof. Dr. Orosz László Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Erdei Anna
Országos Onkológiai Intézet, Patogenetikai Osztály 2007
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...............................................................................................................3 1. BEVEZETÉS ......................................................................................................................................5 1.1. A SEJTCIKLUS SZABÁLYOZÁSA ÉS A RÁK ........................................................................................5 1.2. PROTOONKOGÉNEK/ONKOGÉNEK ...................................................................................................6 1.3. TUMORSZUPPRESSZORGÉNEK .........................................................................................................8 1.3.1. Mismatch repair gének .........................................................................................................10 1.3.2. APC gén................................................................................................................................13 1.4. MIKROSZATELLITA INSTABILITÁS ................................................................................................14 1.5. EPIGENETIKAI FOLYAMATOK - METILÁCIÓ ...................................................................................15 1.6. A VASTAG- ÉS VÉGBÉLDAGANATOKRÓL ......................................................................................17 1.6.1. Nemzetközi és hazai előfordulás...........................................................................................17 1.6.2. A vastagbéldaganat kialakulása ...........................................................................................19 1.6.3. Örökletes vastagbéldaganatok..............................................................................................20 1.6.4. Sporadikus vastagbéldaganatok ...........................................................................................21 1.6.5. Stádiumbeosztás ...................................................................................................................23 CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................................25 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................................27 3.1. BETEGANYAG ...............................................................................................................................27 3.2. DNS- ÉS FEHÉRJEIZOLÁLÁS .........................................................................................................29 3.3. MIKROSZATELLITA ANALÍZIS .......................................................................................................29 3.4. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR)................................................................................................30 3.4.1. hMLH1 mutációk vizsgálata .................................................................................................30 3.4.2. hMSH2 mutációk vizsgálata. ................................................................................................31 3.4.3. TP53 mutációk vizsgálata.....................................................................................................33 3.4.4. APC mutációk vizsgálata......................................................................................................33 3.4.5. MTHFR polimorfizmus vizsgálata ........................................................................................34 3.4.6. K-RAS mutáció vizsgálata ....................................................................................................34 3.4.7. SMAD4 mutációk vizsgálta...................................................................................................35 3.4.8. Ismétlődő szekvenciákat tartalmazó gének vizsgálata ..........................................................35 3.5. SZEKVENCIAVARIÁNSOK VIZSGÁLATA SSCP ÉS HETERODUPLEX (HD) ANALÍZISSEL ..................36 3.6. DNS SZEKVENÁLÁS .....................................................................................................................37 3.7. AMINOSAVAK KONZERVÁLTSÁGI FOKÁNAK VIZSGÁLATA ............................................................37 3.8. MLPA REAKCIÓ ...........................................................................................................................37 3.9. PROMÓTER METILÁCIÓ .................................................................................................................38 3.9.1. hMLH1 promóter metiláció ..................................................................................................38 3.9.2. CDKN2A promóter metiláció ...............................................................................................39 3.9.3. APC promóter metiláció .......................................................................................................39 3.9.4. hMLH1 promóter metiláció Taqman próbával.....................................................................40 3.10. WESTERN BLOT MLH1, MSH2, P16CDKN2A ÉS P53 FEHÉRJÉKRE ....................................................41 3.11. IMMUNHISZTOKÉMIA ..................................................................................................................41 3.12. STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉS...........................................................................................................41 4. EREDMÉNYEK ...............................................................................................................................43 4.1. MIKROSZATELLITA INSTABILITÁS ÉS AZ ISMÉTLŐDŐ RÉSZEKET TARTALMAZÓ GÉNEK VIZSGÁLATA ............................................................................................................................................................43 4.2. MTHFR POLIMORFIZMUS ............................................................................................................48 4.3. TP53 MUTÁCIÓK ..........................................................................................................................48 4.4. MMR GÉNEK MUTÁCIÓI ...............................................................................................................49 4.5. APC MUTÁCIÓK ...........................................................................................................................51 4.6. K-RAS ÉS SMAD4 GÉNEK MUTÁCIÓI ..........................................................................................53 4.7. AMINOSAVCSERÉK PATOGENITÁSA ..............................................................................................54 4.8. PROMÓTER RÉGIÓK METILÁCIÓJA.................................................................................................55 1
4.9. AZ MLH1, MSH2, P16CDKN2A ÉS P53 FEHÉRJÉK VIZSGÁLATA WESTERN BLOT SEGÍTSÉGÉVEL .......58 4.10. EREDMÉNYEK STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉSE ..................................................................................61 4.11. CSALÁDVIZSGÁLATOK ...............................................................................................................64 5. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE..............................................................................................68 5.1. SPORADIKUS KOLOREKTÁLIS DAGANATOKKAL KAPCSOLATOS ÁLTALÁNOS MEGÁLLAPÍTÁSOK ...68 5.2. GENETIKAI INSTABILITÁS AZ INTER- ÉS INTRAGÉNIKUS MIKROSZATELLITÁKBAN ........................69 5.3. A MISMATCH REPAIR GÉNEK INAKTIVÁCIÓJA ...............................................................................71 5.4. AZ APC GÉN INAKTIVÁCIÓJA .......................................................................................................75 5.5. AZ MTHFR GÉN ÉS A METILÁCIÓ ................................................................................................78 5.6. A SEJTCIKLUS ALAPVETŐ SZABÁLYOZÁSÁBAN BEKÖVETKEZŐ VÁLTOZÁSOK ..............................79 5.7. A CSALÁDVIZSGÁLAT KÖVETKEZTETÉSEI ....................................................................................82 5.8. INAKTIVÁCIÓS ÚTVONALAK .........................................................................................................83 5.9. A DOLGOZAT EREDMÉNYEINEK RÖVID ÖSSZEFOGLALÁSA............................................................85 6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..........................................................................................................89 7. IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................................................90 ÖSSZEFOGLALÓ .............................................................................................................................117 SUMMARY.........................................................................................................................................118
2
Rövidítések jegyzéke ACTB
aktin-β
AI
allélikus instabilitás (allelic imbalance)
APC
adenomatosis polyposis coli
BCIP
5-bromo-4-kloro-3-inidolit-foszfát
BSA
szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumine)
CIMP
CpG sziget metilációs fenotípus (CpG island methylator phenotype)
dNTP
dezoxi-nukleotid-trifoszfát
EDTA
etilén-diamin-tetraacetát
EGTA
etilén-glikol-bis(β-amino-etil-éter)- N, N, N’, N’-tetraacetát
FAP
családi adenómás polipózis (familiaris adenomatosus polyposis)
GTBP
GTP-kötő fehérje (binding protein)
HDA
heteroduplex analízis
hMLH1
humán mutL homológ 1
hMSH2
humán mutS homológ 2
HNPCC
örökletes nem polipózusos kolorektális daganat (hereditary nonpolyposis colorectal cancer)
k-ras
Kirsten patkány szarkóma virális onkogén homológ (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)
LOH
allélvesztés (loss of heterozigosity)
MLH1
mutL homológ 1
MLPA
multiplex ligáció-függő próba amplifikáció (ligation dependent probe amplification)
MMR
mismatch repair
MSH2
mutS homológ 2
MSI
mikroszatellita instabilitás
MSI-H
magas mikroszatellita instabilitás (high)
MSI-L
alacsony mikroszatellita instabilitás (low)
MSS
mikroszatellita stabil
MTHFR
metilén-tetrahidrofolát-reduktáz
NBT
nitro-blue-tetrazónium
PBS
foszfát tartalmú sóoldat (phosphate buffered saline)
PCR
polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)
3
PMSF
fenil-metil-szulfonil fluorid
RER
replikációs hiba (replication error)
RR
relatív kockázat (relative risk)
SDS
nátrium-dodecil-szulfát
siRNS
kis interferáló RNS (small interfering RNA)
SSCP
egyszálú konformációs polimorfizmus (single-strand conformation polymorphism)
TBE
tris-bórsav-EDTA
TE
tris-EDTA
Tris
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propándiol
UTR
nem transzlálódó rész (untranslated region)
4
1. Bevezetés 1.1. A sejtciklus szabályozása és a rák A normális sejtek növekedést serkentő és gátló folyamatai egyensúlyban vannak, amely csak bizonyos fiziológiás esetekben (pl. embriogenezis, szöveti sérülések gyógyulása), de még ekkor is szigorúan szabályozva tolódik el a sejtproliferáció irányába. A daganatsejtekben ezzel szemben a sejtproliferáció szabályozása zavart szenved: vagy úgy, hogy a sejtet folyamatosan éri proliferáló programot aktiváló jel, vagy a sejtproliferáció gátlása szűnik meg (Hirsch-Ginsberg 1995, Kopper 2002). A szabályozás kulcspontjai az ellenőrzési pontok (checkpoints), amelyek a sejtek sejtcikluson történő áthaladását ellenőrzik (1. ábra). Négy fő ellenőrzési pont ismert: a késői G1 fázisban a start- vagy restrikciós (R) pont, amelynek az a feladata, hogy csak génhiba nélkül engedje a sejtet S fázisba. Normál sejtben a sejtciklus során a G1 fázisban az ellenőrző elemek (pl. p53) felismerik a keletkezett hibát és a sejtet megállítják a hiba kijavítására. Ha a sejt a hibát nem tudja kijavítani, akkor aktiválódik a programozott sejthalált, az apoptózist végző program. Ha az ellenőrzés nem megfelelő, akkor a sejt továbbadja a hibát a leánysejteknek, ezzel megnő a valószínűsége a hibák felhalmozódásának, végső soron a genom instabilitásának. A második és harmadik ellenőrzési pont az S fázisban és a késői G2-ben a DNS szintézis végrehajtását és az osztódásra való felkészülést ellenőrzi. A negyedik pont a mitózis során megakadályozza a nem ép kromoszómák elválását. Előfordul, hogy a sejt G1-ben (vagy ritkábban G2-ben), átmenetileg vagy véglegesen megszakítja útját a sejtciklusban. Ha leállítása átmeneti, akkor megfelelő stimulus hatására képes visszalépni a ciklusba, ha végleges, akkor vagy véglegesen differenciálódik vagy működése elégtelenné válása miatt elpusztul. A rák kialakulása többlépcsős folyamat eredménye, melynek során a megjelenő újabb és újabb mutációk egyre növekvő proliferatív potenciállal rendelkező és/vagy az apoptózis és/vagy a sejtközötti kapcsolatok képességét elveszítő sejtek kialakulását eredményezik (Hanahan 2000). Több olyan genetikai elváltozást (pl. pontmutációt) is azonosítottak, amelyek bizonyítottan alapvető szerepet játszanak egy adott szerv bizonyos daganattípusának kialakulásában, így tumor markerként fontos diagnosztikai szerepet tölthetnek be (Sikora 1997, Knudson 2000). 5
A
sejtciklus
szabályozásában
kulcsszerepet
játszanak
a
proliferáció
elindításáért felelős jeleket szállító protoonkogének, valamint a gátló szerepet játszó szuppresszorgének.
1. ábra Sejtciklus
1.2. Protoonkogének/onkogének A proliferációt elősegítő gének a protoonkogének, amelyek a sejtosztódáshoz vezető folyamatokat pozitív módon szabályozzák, azaz a proliferáció agonistái. A protoonkogének funkcióik szerint igen változatosak lehetnek: növekedési faktorok, növekedési faktor receptorok, protein-kinázok, GTP-kötő fehérjék, transzkripciós faktorok. A protoonkogének génhibáinak kialakulásakor keletkezhetnek onkogén formáik. Az onkogének proliferációt stimuláló hatása a szabályozástól többé-kevésbé független funkciómegjelenéshez vezet (gain of function). A főbb csoportokba tartozó génekre illetve aktiválásuk módjára és a hozzájuk kapcsolódó daganattípusokra mutat néhány példát az 1. táblázat. A génhibák kialakulásának egyik következménye lehet, hogy a gén szerkezetének megváltozása miatt a gén funkciója is zavart szenved. Ennek egyik példája a növekedési faktor receptorok - amelyek rendelkeznek ligandkötő, transzmembrán és citoplazmatikus katalitikus doménnel, amely utóbbiak többnyire tirozin-kináz aktivitásúak -
már nem igénylik állandó külső jelként a 6
ligandot, hogy proliferációs szignált küldjenek a mag felé (pl. erbB2). A jelátvivők (GTP kötő fehérjék, és citoplazmatikus protein kinázok) aktiválódás után nem képesek inaktiválódni, nem képesek elengedni a GTP-t, amely így nem alakul GDPvé, és az aktivált fehérje állandó jelet küld a magba (pl. ras). Az onkogének legnagyobb csoportja, a transzkripciós faktorok esetén pedig vagy a gén hibája miatt a gén működését szabályozó tényezők nélkül is serkenti a sejtosztódást, így a sejt nem tud kilépni a proliferációból (pl. myc) és elmaradhat az apoptózis (pl. fos). A génhiba másik következménye lehet, hogy a géntermék – bár szerkezete normális – nem megfelelő mennyiségben és/vagy a sejt normális működése szempontjából rossz időben keletkezik. Az onkogének proliferációt serkentő hatása domináns módon érvényesül (Freireich 1995, Kopper 2002). 1. táblázat Onkogének.
Gének
Aktiválás módja
Jellemző daganattípus
FGF1
fokozott expresszió
fibroszarkóma
PDGF
fokozott expresszió
oszteoszarkóma, asztrocitóma
ERBB2
amplifikáció
emlőrák, petefészekrák, gyomorrák
ret
pontmutáció
endokrin daganatok
ABL
transzlokáció
leukémiák
RAF
transzlokáció
gyomorrák
pontmutáció
vastagbél daganat, pancreas daganat,
1. Növekedési faktorok
2. Növekedés faktor receptorok
3. Protein kinázok
4. GTP-kötő fehérjék K-RAS
endometriumrák, tüdőrák, egyéb H-RAS
pontmutáció
húgyhólyagrák, pajzsmirigyrák
FOS
fokozott expresszió
B-sejtes tumorok
MYC
amplifikáció
limfómák
5. Transzkripciós faktorok
7
1.3. Tumorszuppresszorgének A sejtproliferáció szabályozásának negatív ágát képviselik a szuppresszor, azaz a (szabályozatlan) proliferációt gátló gének. Normális működésük esetén megakadályozzák a kontrollálatlan sejtproliferációt és a sejtek örökítőanyagában bekövetkező károsodások felhalmozódását. A szuppresszor gének hibái legtöbbször recesszívek, azaz mindkét allélnak károsodnia kell ahhoz, hogy a gén működése zavart szenvedjen. A daganatos megbetegedések családi és sporadikus formáinak tanulmányozása alapján állította fel Knudson ezt a „kettős találat” elméletét (Knudson 1971). Elmélete szerint a familiáris daganatok esetében az egyik allél hibája örökölt, és a másik allél szomatikusan inaktivációja vezet a daganatkialakuláshoz. Sporadikus esetben általában mindkét allél szomatikus inaktivációjára szükség van. Így a familiáris esetben a betegség korábbi életkorban alakul ki, szemben a sporadikus esetekkel. Az allélek károsodása során az első hiba rendszerint pontmutáció, a második allél pedig rendszerint elvész, általában az allél környezetével együtt. Az allélvesztés tehát a heterozigótaság elvesztését jelenti, a gén az adott allélra homovagy hemizigótává válik. Allélvesztést okozhat: normál allél elvesztése után a kromoszómális non-diszjunkciót követően a mutáns allélt hordozó kromoszóma reduplikációja, a meiotikus rekombináció, a génkonverzió, a normális allél deléciója. Az onkogénekkel szemben a szuppresszorgéneknél a fő probléma a funkcióvesztés (loss of function). Az elveszett funkciók érinthetik a jelátvitelt (pl. smad), a proliferáció szabályozását (pl. p16CDKN2A), a genom épségének őrzését (pl. MMR fehérjék), a génhibák kijavítását (pl. p53), és az apoptózis indukálását (pl. p53) (Freireich 1995). A tumorszuppresszorgéneket három csoportba soroljuk: elsődleges vagy gatekeeper gének, másodlagos vagy caretaker gének, és harmadlagos vagy landscaper gének (Kinzler 1997,1998). A három csoportba tartozó génekre, a fehérjék funkcióira, illetve a hozzájuk kapcsolódó daganattípusokra mutat néhány példát a 2. táblázat. Az elsődleges tumorszuppresszorok direkt módon a proliferáció antagonistái, így működésük hiánya meghatározó lépés a kontrollálatlan sejtproliferáció beindulásához. Ennek a csoportnak a legismertebb példája az RB1 gén, amely a sejtciklus G1 fázisának végén az R ponton való áthaladást, és ezáltal az S fázisba való belépést szabályozza. A fehérje hipofoszforilált állapotban köti a dp1/e2f heterodimer transzkripciós faktort, és így gátolja az S fázishoz szükséges gének átíródását. Az R pont közelében azonban ciklinfüggő kinázok az rb1 fehérjét foszforilálják, amely így 8
már nem tudja gátolni a transzkripciós faktort és a sejt így beléphet az S fázisba (Friend 1986). A másodlagos tumorszuppresszorokhoz olyan gének tartoznak, amelyek a DNS-t ért károsodások kijavításával és a genom stabilitásának megőrzésével indirekt módon
gátolják
a
proliferációt,
mivel
működésükkel
nem
engedik
más
tumorszuppresszorgének és protoonkogének mutációinak továbbadódását. Ide tartoznak a mismatch repair (MMR) géncsalád tagjai, mint az MLH1 és az MSH2. Ezek a gének termékei más fehérjékkel (msh6, pms1, pms2) komplexet alkotva a DNS bázispárosodásában felhalmozódott hibákat javítják ki a replikációt követően. Ezen gének működésének hiánya a mikroszatellita instabilitás/replikációs error (MSI/RER) fenotípushoz vezet (Lynch 1999). A harmadlagos tumorszuppresszorgének csoportjába kevés gén tartozik. Kinzler és Vogelstein megfigyelte, hogy bizonyos gének mutációit hordozó egyénekben a másik allélt érintő szomatikus inaktiváció a tumorban nem, csak a környező szövetekben figyelhető meg. Ezek alapján a gének működésének hiánya olyan mikrokörnyezetet alakít ki, amely a daganatsejtek proliferációja szempontjából kedvező, és ilyen módon következik be a tumorprogresszió (Kinzler 1997). Mind az elsődleges, mind a másodlagos tumorszuppresszor kategóriába besorolható a TP53 gén, amely szerepe egyedülálló. A gén meghibásodásait körülbelül a daganatok 70%-ában kimutatták, ezért feltételezték, hogy a p53-nak központi szerepe van a sejtosztódási folyamatok szabályozásában. Kiderült, hogy a fehérje szenzorként működik: ha a DNS-t károsodások érik, akkor a sejtet nem engedi áthaladni a G1/S fázishatáron. Ha pedig ezen károsodások mértéke meghalad egy bizonyos szintet, akkor a fehérje, mint transzkripciós faktor, olyan gének átíródását indítja be, amelyek apoptózishoz vezetnek és elpusztítják a sejtet. A p53 normális működésének feltétele, hogy a p53 fehérjék tetramert képezzenek. Ha azonban a mutáns allélról képződött fehérje kötődik a normális fehérjetermékhez, azt inaktiválja, így a p53 hiba domináns lesz (May 1999).
9
2. táblázat Tumorszuppresszorgének.
Gének
Elsődleges funkció
Jellemző daganattípus
RB1
sejtciklus G1/S szabályozás
retinoblasztóma, oszteoszarkóma
APC
β-katenin kötés, wnt jelátvitel
vastagbéldaganatok
NF1
RAS onkogének negatív regulátora
neurofibroszarkóma
CDKN2A
CDK-gátlás
bőrrák, nyelőcsőrák, pancreas
1. Elsődleges vagy gatekeeper
rák, tüdőrák, emlőrák, egyéb 2. Másodlagos vagy caretaker MLH1
DNS hibajavítás
vastagbél- és végbélrák
MSH2
DNS hibajavítás
vastagbél- és végbélrák
TP53
DNS hibaszenzor, sejtciklus
Li-Fraumeni szindróma
szabályozás 3. Harmadlagos vagy landscaper SMAD4 (DPC4)
tgfβ jelátvitel
vastagbéldaganatok
PTEN
lipid foszfatáz
prosztatarák, emlőrák
1.3.1. Mismatch repair gének A Mut-családba tartozó mismatch repair típusú génként emberben hat gént azonosítottak, amelyek fehérjetermékei felelősek a DNS replikáció során kialakult hibák felismeréséért és javításáért. Escherichia coli-ban a mutS és a mutL fehérjék két fő hibajavítási útvonalban vesznek részt, a metil-irányított hosszú és a rövid útvonalban. A metil-irányított útvonal funkciója a DNS replikáció során keletkezett bázis-bázis nem-illeszkedés, a rövid deléciók és inszerciók kijavítása. A rövid út speciális funkciója a nem replikálódó DNS-ben előforduló G-T párosodás kijavítása, amely az 5-metilcitozinok dezaminálódásának következménye (Kopper 2002). A mutS fehérje Escherichia coli-ban a MutHLS útvonal része, amely excíziós javító mechanizmusokat indít be. Az excíziós repair célpontja az újonnan replikálódott, még nem metilált DNS szál. A mutS kötődik a hibás DNS szálhoz, a mutL összekapcsolja
10
a mutS-t a mutH endonukleázzal, amely köt a hemimetilált DNS-hez és hasítja a nem metilált DNS szálat. A javító mechanizmus humán sejtben is láncspecifikus, a replikáció során a hibás DNS-hez az MSH2-MSH6 komplex köt. Míg az MSH2 és az MLH1 egyformán fontosak az egybázisos MMR-ben, az MSH2 fontos szerepet játszik az öt vagy még több nukleotidot tartalmazó hurkok javításában. Ez a rendszer a humán sejtekben 14 bázisig képes javítani a hurkokat, ami lényeges, hiszen a humán DNS számtalan mikroszatellita régiót tartalmaz, amelyek a replikáció során bekövetkező megcsúszás miatt hurkokat tudnak képezni (Peltomaki 1993, 1997). A MMR rendszer alkiláló szerek hatására bekövetkező változásokat is felismer, és válaszul a G2-ben bekövetkező proliferációgátlásban is szerepet játszik (Hawn 1995). A MMR rendszer emellett szerepet játszik a nem homológ szekvenciák közti rekombináció szabályozásában is (Selva 1995). Az MSH2 gén a 2p16 kromoszóma lókuszon helyezkedik el, genomi DNSének mérete körülbelül 73-80 kilobázis. Kódoló szekvenciája 16 exonba tömörül. A gén egy 100 kDa-os fehérjét kódol (Peltomaki 1993). A fehérje több régióra osztható (2. ábra) (Obmolova 2000, Fishel 1993). Az hmsh2 fehérje humán ortológja a bakteriális mutS és a Saccharomyces cerevisiae-ben található MSH fehérjéknek.
11
2. ábra Az MSH2 gén doménszerkezete. A számok az exonokat jelölik. Körülbelül az első 100 kodon a DNS felismerő domén, majd körülbelül a 340. kodonig tart a fehérje dimerizációs domén, amely a DNS kötésben szintén szerepet játszik, utána a 340. és a 480. kodon között, majd a 600. és a 630. kodon között a szerkezeti sértetlenségért felelős domén, ennek két régiója között található a domének közötti kölcsönhatásért felelős rész (MSH3/MSH6 kötés), majd a fehérje C terminális végén az ATPáz aktivitásért felelős régió. Az első, a második és a negyedik domén felelős a DNS kötésért, és a stabil dimer képződés pedig az ATPáz doménben található antiparalel hélixeken keresztül történik.
Az MLH1 gén a 3p21-p23 kromoszóma lókuszon helyezkedik el, a genomi DNS mérete körülbelül 58-100 kilobázis. 19 exonja tartalmazza a kódoló szekvenciát. A gén egy 756 aminosavból álló 160 kDa-os fehérjét kódol (Lindblom 1993). A fehérje négy régióra osztható (3. ábra) (Kolodner 1995, Ellison 2001, Nyström-Lahti 2002, Ellison 2004, Park 2006). Az mlh1 fehérje Escherichia coli-ban mutL néven a korábban említett MutHLS útvonal része.
12
3. ábra Az MLH1 gén doménszerkezete. A számok az exonokat jelölik. Körülbelül a 40. aminosavtól a 150. aminosavig tart az ATPáz domén, utána következik a központi régió (ebben van az MSH2-kötő domén), majd körülbelül a 490. aminosavtól a PMS1-kötő domén, és végül a 690. aminosavtól a fehérje végéig a C terminális régió, amely a dimerizációért felelős.
A MMR gének konzervativitásának foka igen magas. A MMR gének gátlása körülbelül 90%-ban az MLH és MSH2 génekben történik. További négy MMR gén: a MutL ortológ PMS1, PMS2, és a MutS ortológ MSH3 és MSH6 (=GTBP, GTP-kötő fehérje) mutációja is előfordulhat. A MMR gének mindkét alléljének inaktiválása a genom egészében kialakuló másodlagos mutációkat nem tudja kijavítani, amelyek egy része fontos proliferációt szabályozó géneket is érinthet, így járulva hozzá a karcinogenezishez (Peltomaki 1997). Az MLH1 és az MSH2 gének mutációi a rövid ismétlődéseket,
mikroszatellitákat
tartalmazó
régiók,
illetve
további
gének
károsodását okozzák, amit replikációs hiba (replication error, RER) fenotípusnak nevezünk (Lynch 1999, Jubb 2001).
1.3.2. APC gén Az adenomatosis polyposis coli (APC) gén az 5q21 kromoszóma lókuszon helyezkedik el. A gén több, mint 300 kilobázis nagyságú, a kódoló szekvenciája 8532 13
bázispár, 15 kódoló exonba tömörül. Alternatív splicing-gal több mRNS szekvenciája létezik, a leggyakoribb formája egy 300 bázispáros exonnal hosszabb, és egy 2843 aminosav hosszú 311,8 kDa tömegű fehérjét kódol. A leggyakoribb splice variáns akkor keletkezik, ha az átíródás az 1A promóterrel szabályozódik, inaktiválódása esetén az 1B promóter lép működésbe, amely az 1. exon és bizonyos 5’UTR régiók kimaradását eredményezi (Lambertz 1993, Thliveris 1994, Esteller 2000, Xiong 2001, Jubb 2001). Az inaktiválás leggyakoribb formája rövid deléció vagy inszerció, amely a kódoló régióban a leolvasási keret eltolódását okozza, és ezáltal csonkolt fehérjetermék keletkezik (Groden 1991, Kinzler 1991, Nishisho 1991). Ritkábban előfordulnak több exont érintő nagy deléciók is (Groden 1991, Joslyn1991), amelyek azonban sporadikus esetekre nem jellemzőek. A báziscserével járó mutációk (Nagase 1993, Varesco 1993) közel kétharmada egy úgynevezett mutációs halmozódási (cluster) régióban (MCR) helyezkednek el, amely a 1285 és a 1465 kodon között található a 15. exonban (Wallis 1999, Fearnhead 2001, Segditsas 2006). Az apc fehérje a wnt-szignál rendszerben, a sejtciklus szabályozásban, a mikrotubuláris citoszkeleton stabilitásában és a sejtek közötti kölcsönhatásokban játszik szerepet. Az MCR régió a β-kateninnel alakít ki kötést, amely utóbbi köti az Ekadherint. Ez a kötés az E-kadherin funkciójához elengedhetetlen. A kadherinek sejtfelszíni
molekulák,
amelyek
szabályozzák
a
kálcium-függő
sejtközötti
kapcsolatokat, és a morfogenezisben játszanak fontos szerepet. A kadherinek az α- és β-katenint egyaránt kötik, míg az apc főként a β-kateninhez kapcsolódik. A csonkolt APC legtöbbször nem tartalmazza az egyik β-katenin kötő doménjét, így nincs affinitása többé a β-kateninhez. A sejtadhéziós tulajdonság és ezzel a sejtközötti interakciók elvesztése a proliferáció és a differenciáció feletti kontroll elvesztését eredményezi. A kontroll elvesztése adenómák kialakulását teszi lehetővé (Fearnhead 2001). 1.4. Mikroszatellita instabilitás A genom instabilitását okozhatja többek között a DNS-hibajavítás, a sejtciklus szabályozás és a DNS-replikáció zavara. A daganatok majd minden típusa lehet genetikailag instabil. Ez az instabilitás a tumor progressziójának motorja és heterogenitásának oka, emiatt nincs két teljesen megegyező daganat. A rövid szekvenciákat érintő instabilitás mindössze néhány bázispárt érint, hátterében a mismatch repair rendszer zavara áll. A mikroszatelliták egyszerű 14
szekvenciák tandem ismétlődései, amelyek igen polimorfak és véletlenszerűen helyezkednek el a genomban, főként a génmentes régiókban, intronokban, promóterekben, exon-intron határon, de néha kódoló régiókban is. A genom egészében körülbelül 100 000 mikroszatellitát írtak le (Weber 1989). Ezek egy-hat bázispárnyi
szekvenciák,
amelyek
8-50
kópiában
ismétlődnek.
Az
egyéni
változatosság ellenére a mikroszatelliták hűségesen replikálódnak, spontán mutációk kialakulása igen ritka. A mikroszatellita instabilitás (MSI) a sporadikus daganatok közül leggyakrabban a vastagbél daganatokban (10-15%) fordul elő (Konishi 1996). Ez a változás a mikroszatellitákban nem korlátozódik bizonyos lókuszokra, nem specifikus, több kromoszóma több lókuszán is megfigyelték. Érdekes, hogy a MSI jelenlétét ellentétesnek találták a LOH-val, amely egyben a daganatkialakulás alternatív útját vetette fel (Kopper 2002). A tumorokat MSI státuszuk alapján több csoportba oszthatjuk (Boland 1998): nagy instabilitási gyakoriságúak (high level instability, MSI-H), amelyeknél a vizsgált mikroszatellita markerek legalább 30%-a mutat instabilitást; alacsony instabilitási gyakoriságúak (low level instability, MSI-L), amelyeknél a vizsgált mikroszatellita markerek kevesebb, mint 30%-a mutat instabilitást, és stabil tumorok (microsatellite stable phenotype, MSS), amelyeknél egyetlen vizsgált mikroszatellita marker sem mutat instabilitást. Az MSI-H tumorok főleg a felszálló vastagbélben alakulnak ki, míg az MSI-L tumorok nem mutatnak jellegzetes lokalizációt. Természetesen az MSI nem kizárólag vastagbélrákra specifikus jelenség, előfordulhat az endometrium, a gyomor, a pancreas, a petefészek, a vékonybél és a vesemedence daganataiban is. A sok ismétlődő szakaszt tartalmazó gének érintettsége is valószínűsíthető a MMR rendszer zavara esetén, ezek közé tartozik a TGFβRII, amelynél az mRNS szint lényegesen lecsökken, ha az ismétlődő részekben instabilitás alakul ki, és így a vastagbél
hámsejtjeinek
proliferációját
gátló
mechanizmusa
nem
működik
megfelelően. Az instabilitást mutató gének közé tartozik az E2F4 és a BAX gén is. Az E2F4 gén sérülése esetén a proliferáció serkentődik és a G1 fázisban a ciklusból való kilépés gátlódik, a BAX gén hibája esetén pedig a p53 függő apoptózis sérül. 1.5. Epigenetikai folyamatok - metiláció Az allélek inaktiválódása az eddig megismert szomatikus mutáció vagy az allélvesztés jelensége mellett epigenetikai folyamatok kapcsán is végbemehet. A metiláció a kromoszómális események egyik kulcsfontosságú szabályozója. A DNS15
metiltranszferázok metilcsoporttal megjelölik a kikapcsolandó gént, erről a génről többet nem történik átíródás, és így természetesen fehérjeszintézis sem. A metiláció megváltozása azt jelenti, hogy a gének átíródásának szabályozása megváltozik. A daganatokban kétféle metilációs hiba lehet: genom szintű sok lókuszt érintő hipometiláció, ugyanakkor a CpG szigetek hipermetilációja (CIMP: CpG island methylator phenotype). A CpG szigetek általában 0,5-2 kilobázis nagyságú CGgazdag DNS régiók a gének 5’ régiójában. A CpG szigetek hipermetilációjának két típusa ismert: korfüggő, amely sok lókuszt érint, de funkcionálisan kevésbé releváns, valamint a tumorhoz kapcsolt, amely érinthet szuppresszorgéneket (pl. CDKN2A), ezen belül mismatch repair géneket (pl. MLH1) és egyéb géneket. A CpG szigetek hipermetilációja jellegzetes epigenetikai változás a sejtek öregedése (senescence) során. A kor előrehaladtával egyre több gént érint, ezzel nő a genetikai instabilitás és a daganatok kialakulásával szembeni érzékenység (Wong 2001). A metiláció, különösen a CG-gazdag promóterek hipermetilációja a transzkripció csendesítésével jár. Elsősorban MLH1 génnel kapcsolatban mutatták ki, hogy sporadikus daganatokban a gén működésének gátlásáért főként a gén promóter hipermetilációja a felelős. Az MSH2 gén promóter hipermetilációját sporadikus vastagbél daganatokban nem tudták kimutatni (Maliaka 1996, Esteller 1998, Cunningham 1998, Kondo 2000, Chan 2005). A metilén-tetrahidrofolát reduktáz (mthfr) enzim a folsav és a metionin anyagcsere fontos enzime, amelyek a DNS szintézis és metiláció alapvető faktorai (4. ábra).
16
4. ábra Az mthfr enzim működése. Az mthfr katalizálja a 5,10-metilén-tetrahidrofolát → 5-metil-tetrahidrofolát átalakulást, amelyből metionin és tetrahidrofolát keletkezik. A metioninból képződő S-adenozil-metionint használja fel a metiltranszferáz a DNS metilálásához.
Az MTHFR gén két gyakori polimorfizmusa ismert, a c.677C>T és a c.1298A>C. A c.1298A>C polimorfizmus nem mutatott összefüggést az enzimaktivitással (Larsson 2006). Az
MTHFR
gén
c.677C>T polimorfizmusa viszont
csökkenti
az
enzimaktivitást, amely az 5-metil-tetrahidrofolát szint csökkenéséhez vezet, amely hatással van a DNS metilációra és ezen keresztül a kolorektális daganatok kialakulására. A folsav és a metionin a táplálékkal is bekerülhet a szervezetbe. Normál folsav szint mellett az MTHFR gén polimorfizmusa a daganat kialakulásának csökkent kockázatát jelenti, míg az alacsony folsav szint és a polimorfizmus együttesen megnövekedett kockázatot jelent (Chen 1996, Ma 1997, Ueland 2001, Ueland 2005). 1.6. A vastag- és végbéldaganatokról 1.6.1. Nemzetközi és hazai előfordulás A világon összesen a rákhalálozás a halálokok közül 12,5%. A fejlett egészségi kultúrájú országokban ez az arány nagyobb, 21%. A kardiovaszkuláris 17
halálozás után a daganatos halálozás a második helyet foglalja el. A szív- és érrendszeri betegségek csökkenéső tendenciája miatt 10-15 éven belül a rákhalálozás az első helyre kerülhet. A kolorektális daganat az egyik legelterjedtebb daganattípus a fejlett nyugati társadalmakban, amelyet korai felismeréssel jó hatásfokkal gyógyítani lehet (Byers 1997). Nőkben és férfiakban közel azonos gyakorisággal fordul elő. Az emigráns populációk vizsgálata során kiderült, hogy a letelepedést követően egy-két generáción belül az incidencia foka eléri a befogadó országét, azt mutatva, hogy a betegség kialakulása nagymértékben függ a különböző környezeti tényezőktől. Negyven éves kor előtti kialakulása viszonylag ritka, de negyvenöt éves kor után a gyakorisága nőni kezd, és 75 és 80 év között éri el a maximumát. Ötven éves kor felett körülbelül a népesség negyedében jelentkező jóindulatú polipok kezelés nélkül körülbelül 15%-ban malignussá válhatnak. A húsban, kalóriában és zsírban gazdag, de növényi rostokban szegény táplálkozás növeli a betegség kockázatát. Bizonyos táplálkozási szokások, például füstölt, grillezett vagy nitrogéntartalmú pácokkal kezelt ételek, főként vörös húsfélék fogyasztása szintén hozzájárul a daganatok kialakulásához. Lehetséges, hogy a dohányzás és az alkoholfogyasztás is további rizikótényezőt jelent. A mozgásszegény életmód, és az ülő életforma szintén kockázati tényező a kolorektális daganatok kialakulásában. A családi kórtörténet, főként
első
és
másodfokú
vérszerinti
rokonoknál
előforduló
vastag-
és
végbéldaganatok esetén – főként ha negyven éves kor előtt jelentkezik a betegség – erősen emelkedik e ráktípus kialakulásának valószínűsége. A betegség megjelenése ez esetben szintén korábbi életkorban történik. Ha több családtagnál lépett fel daganat, akkor a kockázat sokkal jelentősebb. A személyes kórtörténet is jelentősen befolyásolhatja a rák kialakulását, például ha a betegnek korábban volt már gyulladásos bélbetegsége (Chron betegség, fekélyes bélbetegség (colitis ulcerosa)), vagy ha már korábban is volt kolorektális daganata, a betegség másodszori kialakulásának kockázata. Azoknál a nőknél, akiknek kórtörténetében emlő-, méh-, vagy petefészekrák szerepel, szintén fokozott hajlam mutatkozik a kolorektális daganatok kialakulására (Igazvölgyi 2003). A vastagbéldaganat körülbelül kétszer olyan gyakori, mint a végbéldaganat. A nyugati országokhoz hasonlóan a magyarországi halálozási statisztikában a daganatos megbetegedések miatti halálok a második helyen áll. Magyarországon évente 83 000 új daganatos beteget diagnosztizálnak. Az összesen regisztrált daganatos betegek száma 300-320 000 körül van. Ebből évente 34 000 ember hal meg 18
rákban, amely az összhalálozás körülbelül 25%-a. A daganatos megbetegedések közül – férfiaknál, illetve összesen - a kolorektális daganatok a tüdőrák utáni második helyet foglalják el. Nőknél az emlőrák után a harmadik helyet foglalják el. Magyarországon évente körülbelül 4500 férfi és 4000 női új kolorektális daganatos beteget diagnosztizálnak. Az ötéves túlélés kevesebb, mint 50% (Altman 1996, Igazvölgyi 2003).
1.6.2. A vastagbéldaganat kialakulása A vastagbéldaganat kialakulása számos genetikai változás eredménye, amely a normál vastagbél nyálkahártya tumoros progressziójával párhuzamba állítható. A genetikai változások nagy része az onkogéneket és a tumorszuppresszor géneket érinti. A vastagbéldaganatok kialakulásának modelljét elsőként Vogelstein írta le (Vogelstein 1988). Normális hám → Hiperplasztikus hám → Korai adenóma → Intermedier adenóma → Késői adenóma → Karcinóma Az
első
lépésben
a
hiperplasztikus
hám
kialakulásához
az
APC
tumorszuppresszorgén mindkét alléljének inaktiválódása következik be, mutációval, a gén promóter régiójában bekövetkező hipermetilációval, vagy allélvesztéssel. Az APC gén funkcióvesztése, tekintve, hogy elsődleges tumorszuppresszor, serkenti a proliferációt, fokozza egyes onkogének expresszióját. Az APC gén hibáinak előfordulása
fordított
a
mikroszatellita
instabilitással.
A
sporadikus
vastagbéldaganatok közel felében nem hibás az APC gén (Konishi 1996, Kim 2003). A korai adenómára a genomban globálisan előforduló DNS hipometiláció jellemző, amely a gének – köztük onkogének - túlkifejeződését (overexpresszióját) eredményezi, elősegítve ezzel a genetikai instabilitást és a mutációs gyakoriság fokozódását. A K-RAS mutációk megjelenésével intermedier adenóma képződése a jár. A k-ras egy GTP-kötő fehérje, amely aktiváló mutációja hatására nem képes a GTP-t elengedni és így állandó proliferációt serkentő jeleket küld a genom felé. A K-RAS gén hibáit elsősorban polipózusképző daganatokban találták, az ulceratív típusban nem, amely ez esetben alternatív utat feltételez. 19
A késői adenóma kialakulásához több tumorszuppresszorgén (DCC, TGFβ, SMAD4) funkcióvesztése, inaktiválódása vezet. A DCC gén hibáinak hatására a sejtadhézió szabályozása szenved csorbát, a tgfβ - smad út defektusa esetén pedig a növekedés és a differenciáció szabályozása sérül, és az apoptózis indukciója elmarad (Hahn 1998, Caligo 2000). A karcinóma kialakulásához mindezek mellett még hozzájárulnak a TP53 gén mutációi is. Ámbár úgy tűnik, hogy a genetikai események sorrendje kevésbé lényeges, mint a halmozódó genetikai változások száma, főként a korai események mutatnak jelentős változatosságot (Fearon 1990). A karcinóma kialakulásának folyamatában sem az APC inaktiváció, sem a KRAS hibájának megjelenése nem szükségszerű. Alternatív úton és a MMR gének különösen az MLH1 és az MSH2 gének – inaktiválódnak és mikroszatellita instabilitás alakul ki, és az ismétlődő szekvenciákat hordozó gének (TGFβ, BAX) is károsodnak. Ennek hatására az apoptózis indukálása és a proliferáció szabályozása is zavart szenved. Ezekben a daganatokban a TP53 gén mutációi ritkábban fordulnak elő (Cottu 1996).
1.6.3. Örökletes vastagbéldaganatok A vastagbéldaganatok mintegy 5-15%-a örökletes típusú. Ezen daganatoknak, a megjelenő klinikai tulajdonságaik alapján, két leggyakoribb fajtáját különböztetjük meg: családi adenómás polipózis (FAP), és örökletes (herediter) nem polipózusos vastagbélrák (HNPCC). Mindkettő autoszomális dominánsan öröklődő szindróma, de a penetrancia HNPCC esetében nem 100%. A FAP szindrómát az APC gén defektusa okozza. A betegség során vastagbél adenómák, úgynevezett polipok alakulnak ki, amelyek száma néhánytól a több ezerig változhat. Az APC gén az elsődleges vagy gatekeeper tumorszuppresszorgének családjába tartozik, fő funkciója a vastagbél hámsejtek épségének biztosítása. Az APC gént szomatikus mutációk és a promóter régióban bekövetkező hipermetiláció is inaktiválhatja. A HNPCC szindrómát nem olyan egyszerű felismerni (Lynch 1988), mint a FAP szindrómát. A szindróma meghatározásában az Amszterdam (Vasen 1991) és a Bethesda irányelvek alkalmazhatók (3. táblázat) (Rodriguez-Bigas 1997). Az Amszterdam irányévek közül mindegyik teljesülése feltétele a HNPCC szindrómának, míg a kevésbé szigorú Bethesda irányelvek közül legalább egynak kell teljesülnie. A HNPCC szindrómában 20
gyakori az MSI kialakulása és/vagy a MMR gének mutációi. Az örökletes daganatok megjelenése körülbelül 20 évvel korábban történik, mint a sporadikus daganatoké. 3. táblázat Amszterdam és Bethesda kritériumok.
Amszterdam kritériumok: 1. Három vastagbéldaganat a család elsőfokú rokonai között. 2. Vastagbéldaganatok a család két generációjában. 3. Ötven évnél fiatalabb családtagban előforduló vastagbéldaganat. Bethesda kritériumok: 1. Amszterdam kritériumok. 2. Betegek legalább két HNPCC-hez kapcsolódó daganattal: szinkron/metakron vastagbéldaganatok, endometrium-, petefészek-, gyomor-, máj-, epeút-, vagy vékonybéldaganat. 3. Beteg vastagbéldaganattal és egy elsőfokú rokon az alábbiak közül valamelyikkel: a, 45 évesnél fiatalabb korban kialakuló vastagbéldaganat, b, 45 évesnél fiatalabb korban kialakuló HNPCC-hez kapcsolódó daganat, c, 40 évesnél fiatalabb korban kialakuló vastagbél adenóma. 4. 45 évesnél fiatalabb korban kialakuló vastagbél- vagy endometriumdaganat. 5. Beteg differenciálatlan daganattal a vastagbél proximális szakaszán. 6. 45 évesnél fiatalabb korban kialakuló pecsétgyűrűsejtes daganat. 7. 40 évesnél fiatalabb korban kialakuló vastagbél adenóma.
1.6.4. Sporadikus vastagbéldaganatok Az örökletes és a szomatikus alapon kialakuló daganatok közti legfőbb különbség, hogy az örökletes daganatokban az első genetikai változás már eleve adott. A sporadikus daganatok megjelenése átlagosan körülbelül húsz évvel később következik be, mint az örökletes daganatok esetében. Ez azt jelenti, hogy a betegek majdnem mindegyike a tumor megjelenésekor már elmúlt ötven éves. A tumorprogresszió minden esetben egy sor genetikai változástól függ, melyek különbözhetnek a betegek között. Az adenóma-karcinóma átalakulás sebessége jelentősen változhat, az adenóma molekuláris eredetétől függően. Az örökletes daganatok esetében a HNPCC-s betegeknél az adenóma-karcinóma átalakulás meglehetősen gyors, sokkal inkább, mint a FAP-os, illetve a sporadikus betegeknél.
21
Ezzel szemben a FAP-os betegek esetében az adenóma kialakulásának sebessége gyors, sokkal inkább, mint a HNPCC-s vagy a sporadikus betegek esetében. Az APC gén allélvesztése igen gyakori lehet sporadikus daganatok esetében (Solomon 1987, Sasaki 1989), ellenben a génben több exont érintő nagy deléciók sporadikus esetekre nem jellemzőek, szemben az örökletes esetekkel. Az APC gén szomatikus
mutációit
ugyanolyan
százalékban
találták
adenómákban,
mint
karcinómákban (Powell 1992), ami azt jelenti, hogy az APC gén fontos szerepet játszik a kolorektális daganatok kialakulásában a karcinogenezis korai szakaszában. Az APC gén mutációja benignus daganathoz vezet, amely az emberek egy részében adenómák kialakulását segíti elő. Ha nem kezelik, akkor 15-20%-uk karcinómává alakulhat (Powell 1992). A sporadikus kolorektális karcinómák közel felében (a HNPCC-s esetekhez képest kisebb mértékben) a K-RAS gén 12. vagy 13. kodonján mutációt találtak (Forrester 1987). Adenómák esetében a K-RAS mutációk száma az adenómák méretével mutatott összefüggést. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy a K-RAS gén mutációja a karcinogenezis középső szakaszában, a korai és az intermedier adenóma átalakuláshoz kapcsolható. A TP53 génben allélvesztést és pontmutációkat is leírtak. Ezek rendszerint a benignus-malignus
átalakulást
kísérik,
éppen
ezért
szerepük
alapvető
a
karcinogenezisben. Inaktiválódása kontrollálatlan sejtnövekedést eredményez. A legfőbb mutációs forró pontok az evolúciósan konzervált régióban, az 5-8 exonban helyezkednek el, amelyek fontos funkcionális domének jelenlétére utalnak. A p53 fehérje a tumorokban többnyire túlkifejeződött főleg a késői G1 és S fázisban, tekintve, hogy a TP53 gén sejtciklus függő, és az osztódó sejtek száma igen magas. A p53 fehérje nagy mennyiségének ugyanakkor szintén oka a mutált p53 fehérje nagyobb stabilitása (Vogelstein 1989, Baker 1989). A mikroszatellita instabilitást mutató vastagbéldaganatok általában a proximális, jobb kolonrészben helyezkednek el, éppúgy, mint a HNPCC-s tumorok, ezzel szemben viszont a mikroszatellita instabilitást nem mutató tumoroknak csak kis része található a jobb oldalon (Aaltonen 1993) (4. táblázat). Az allélvesztéssel nem járó tumorok is főként a kolon proximális részén találhatók. Az allélvesztés gyakrabban
fordul elő mikroszatellita instabilitást nem mutató sporadikus
daganatokban, mint HNPCC esetében, ahol viszont a mikroszatellita instabilitás gyakori és allélvesztés jóval ritkábban fordul elő (Kouri 1990). A sporadikus MSI 22
pozitív tumorokban, melyek
főként a proximális kolonfélben fordulnak elő az
allélvesztés ritkább (4. táblázat). Ezek a tumorok jobb prognózisúak, szemben az MSI negatív sporadikus daganatokkal, amelyekben gyakoribb az allélvesztés és főként a disztális kolonfélben helyezkednek el. 4. táblázat A sporadikus vastagbéldaganat és a HNPCC összehasonlítása.
Sporadikus Elhelyezkedés Mikroszatellita instabilitás Allélvesztés
HNPCC
disztális
proximális
proximális
nincs
van
van
van
nincs
nincs
1.6.5. Stádiumbeosztás Az általános klinikai gyakorlatban a Dukes-féle stádiumbeosztási rendszer terjedt el, a meghatározásokat az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat Dukes klasszifikáció.
Stádium 0
Dukes
Megjelenés
karcinóma in situ a daganat csupán a bél nyálkahártyarétegében található
1
Dukes A
a daganat a nyálkahártya alá terjed a mélyebb rétegekbe, de nem éri el a bélfal külső rétegét, és nem terjed a környező szövetekbe
2
Dukes B
a daganat a bélen kívüli szövetekre is ráterjed, de nem található a nyirokcsomókban
3
Dukes C
a daganat a környékbeli nyirokcsomókban is megjelenik, de nem szóródik a szervezet más részébe
4
Dukes D
a daganat a szervezet más részében ad metasztázist (főként a májban és/vagy tüdőben)
Rekurrens
kiújuló daganat
a daganata kezelést követően visszatér az eredeti kiindulási helyén vagy a szervezet más részeiben (a kiújuló végbélrák gyakran a májban és/vagy tüdőben található meg) 23
A Dukes-féle rendszer pontosítása érdekében további részletezést vezettek be: B1: kizárólag az izomszövet területén, B2: az izomszöveten is túl, B3: invázió a közeli szervekbe. A C stádium a B-vel megegyező felosztású, eltekintve attól, hogy a regionális nyirokcsomók is érintettek.
24
Célkitűzések Az Országos Onkológiai Intézet (OOI) alapvető funkciója a hazai daganatos betegellátás, oktatás és kutatás koordinálása. Az Intézet 1985-ben alakult Patogenetikai Osztálya foglalkozik a vastagbél daganatok kialakulását kísérő molekuláris mechanizmusok vizsgálatával. Az elmúlt évek molekuláris genetikai vizsgálatai nyomán kiderült, hogy az örökletes vastagbél daganatok két alapvető formája a HNPCC és a FAP jól körülhatárolható mutációs spektrummal rendelkezik. A HNPCC kialakulásáért főként a MMR gének inaktiválódása a felelős, és ezzel együtt a mikroszatellita régiókban jelentkező instabilitás mutatható ki. A FAP kialakulásáért pedig az APC gén inaktiválódása felelős. Az inaktiválódás módja azonban úgy tűnik sok esetben eltér az örökletes és a sporadikus daganatok között. Az inaktiválódási mechanizmusok ráadásul bizonyos eltéréseket mutatnak a korábban jellemzett populációkban is. Ezek alapján a sporadikus daganatok vizsgálatainak tervezésekor a következő kérdéseket fogalmaztuk meg: 1. A mikroszatellita instabilitás milyen gyakorisággal mutatható ki sporadikus daganatokban a hazai populációban? 2. Melyek a mismatch repair gének (MLH1, MSH2) fő inaktivációs mechanizmusai sporadikus daganatokban? 3. Az APC gén szomatikus mutációi milyen mértékben járulnak hozzá a sporadikus
daganatok
kifejlődéséhez?
Megjelennek-e
esetleg
populációspecifikus mutációk? 4. A másutt leírt mikroszatellita régiókat tartalmazó gének instabilitása ebben a populációban
milyen
arányban
járul
hozzá
a
tumoros
fenotípus
kialakulásához? 5. A sejtciklus működését alapvetően befolyásoló gének (TP53, K-RAS, SMAD4) mennyire érintettek, hordoznak-e gyakori mutációkat?
25
6. A promóter hipermetilációs inaktiváláshoz mennyiben járul hozzá a metiléntetrahidrofolát-reduktáz megjelenik-e
az
gén
polimorfizmusa?
alapvető
Promóter
tumorszuppresszorgének
hipermetiláció inaktiválódási
folyamataiban? 7. Felállítható-e a daganatképződésnek több, egymástól független útja éppúgy, mint örökletes daganatok esetén, vagy a daganatképződés útja némileg eltér ettől sporadikus betegek esetében? Vizsgálatainkat műtéten átesett betegek tumoros és normál szövetmintán végeztük párhuzamosan. Munkánk során igyekeztünk minél pontosabb képet kapni a sporadikus vastagbéldaganatok kialakulásáról. Reményeink szerint kutatásaink közelebb visznek minket a vastagbél daganatok körülbelül 85%-át kitevő sporadikus daganatok kialakulásának és esetleges molekuláris típusainak megértéséhez.
26
3. Anyagok és módszerek 3.1. Beteganyag Vizsgálatainkhoz 70, az Országos Onkológiai Intézet Sebészeti Osztályán vastagés/vagy végbéldaganattal diagnosztizált beteg tumor és normál szöveti mintáit használtuk fel (6. táblázat). A tumoros és a hozzájuk tartozó normál szövetet minden esetben az Intézet Patológiai Osztályának valamely munkatársa különítette el. A betegek családi háttere minden esetben bármely tumortípusra nézve negatív volt. A betegek átlagos életkora 64 év volt, a legfiatalabb beteg 31 éves, míg a legidősebb 87 éves volt. A kolorektális betegek közül 34 férfi és 36 nő volt, a tumorok Dukes-féle besorolása alapján: 7 A, 34 B és 29 C. A daganattípusok megoszlása szerint 27 rektális és 43 vastagbéldaganat, melyek közül mindössze 6 db volt mucinózus (9, 18, 20, 44, 68, 70 számú betegek). A tumoros minták esetében kiválasztási feltétel volt, hogy a mintavétel a patológiai diagnózist ne veszélyeztesse. 6. táblázat A vizsgált betegek adatai.
Beteg azonosító 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Tumor A betegség Kiterjesztett elhelyezkedése diagnosztizálásakor a Dukes-féle beteg kora stádiumbesorolás 68 A vastagbél 70 C2 vastagbél 56 C2 rektum 50 C2 rektum 64 C2 rektum 55 B1 rektum 76 B2 vastagbél 70 C2 vastagbél 44 B1-B2 vastagbél 61 C2 vastagbél 77 A vastagbél 66 C vastagbél 72 B1 rektum 87 C rektum 67 B2 vastagbél 51 C rektum 58 B1 rektum 61 C2 vastagbél 79 B1 rektum 64 C2 vastagbél 62 B2 vastagbél 54 B vastagbél 69 C vastagbél
Beteg neme férfi nő férfi nő férfi férfi nő nő nő férfi nő nő férfi férfi férfi nő férfi nő férfi férfi nő nő nő 27
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 45 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 85
64 73 60 74 50 48 68 47 45 56 51 85 72 64 76 75 83 69 78 62 64 71 62 72 71 62 83 72 31 77 40 31 54 72 64 47 59 78 76 56 75 64 83 72 71 68 52
C A B2 B1 C2 B B1 B2 B1 C1 B C2 B A B2 B A C3 B1 C A C2 B B2 C C2 B C B2 B2 B B B2 C2 B2 B2 C1 C C B1 B1 A C C C2 B B2
vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél rektum vastagbél rektum vastagbél rektum vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél vastagbél rektum rektum rektum rektum vastagbél vastagbél rektum vastagbél vastagbél vastagbél rektum rektum vastagbél vastagbél rektum rektum vastagbél vastagbél vastagbél rektum vastagbél rektum rektum vastagbél rektum vastagbél vastagbél vastagbél rektum rektum
férfi férfi férfi férfi nő nő férfi férfi férfi nő nő férfi nő férfi nő nő nő nő férfi nő nő férfi férfi férfi férfi férfi nő nő nő férfi férfi nő férfi nő nő férfi férfi férfi férfi nő férfi nő nő nő nő nő nő
28
3.2. DNS- és fehérjeizolálás A vizsgálatok során teljes genomi DNS-t izoláltunk a betegek tumoros illetve normál szövetéből. A szöveteket folyékony nitrogénnel hűtve golyós malomban porítottuk. A mintákat 1 ml 10 mM Tris-t és 1 mM EDTA-t (pH=9) és 0,1% SDS-t tartalmazó emésztő (TE) pufferben vettük fel, majd az elegyhez 0,1 mg/ml koncentrációjú Proteinase K enzimet (Sigma) adtunk és egy éjszakán át 37ºC-on inkubáltuk. Másnap fenolos, fenol-kloroformos, kloroformos extrakció következett (Maniatis 1982), majd a DNS-t kétszeres térfogatú 4ºC-os abszolút etanollal kicsaptuk. A kicsapott DNS-t 70%-os etanollal mostuk, majd szárítás után desztillált vízben vagy TE pufferben (pH=7,4) vettük fel. A DNS koncentrációját és tisztaságát spektrofotométerrel határoztuk meg. Fehérje preparálást a betegek tumoros és normál szövetéből egyaránt végeztünk. A fehérje izolálásához adott mennyiségű szövetmintához mg-onként 10 µl homogenizáló oldatot adtunk (20 mM TrisHCl pH=7,5, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA, 250 µM PMSF (fenil-metil-szulfonil fluorid), 10 µg/ml leupeptin, 2 µg/ml aprotinin, 0,1-1% TritonX 100, 0,1% merkaptoetanol), késes homogenizálóval aprítottuk, majd 30 percig 17 000 g-vel 4ºC-on centrifugáltuk. A felülúszó összfehérje tartalmát Bradford szerint Comassie brilliant blue-val mértük (Maniatis 1982). 3.3. Mikroszatellita analízis Tumor és normál mintapárok DNS-ét használtunk a mikroszatellita instabilitás (MSI) és az allélikus instabilitás (AI) vizsgálatára. A primerek a (CA)n ismétlődésekhez (D2S118, D2S123, D3S1283, D3S1298, D3S1611, D5S346, D16S398, D17S250) és az An ismétlődésekhez (BAT25, BAT26) fluoreszcens jelöléssel rendelkeztek (Gyapay 1994). Az analízis ABI PRISM 310 genetikai analizátoron GeneScan szoftver segítségével történt (Applied Biosystems). A minták MSI státuszát a National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for Colorectal Cancer Detection konszenzus alapján állapítottuk meg (Boland 1998). Magas szintű instabilitásként (high level instability, MSI-H) diagnosztizáltuk, ha a vizsgált markerek legalább 30%-a hordozott instabilitást, alacsony szintű instabilitásként (low level instability, MSI-L) diagnosztizáltuk, ha a vizsgált markerek kevesebb, mint 30%-a hordozott instabilitást, és stabilként (microsatellite stable, MSS), ha a vizsgált markerek egyikénél sem tapasztaltunk instabilitást. Ha mikroszatellita instabilitást találtunk bármely lókuszon, akkor ezt a lókuszt az AI szempontjából nem 29
minősítettük informatívnak. Allélikus instabilitásnak neveztük, ha a tumorban a vizsgált heterozigóta markerek közül az egyik allél több mint 50 %-os csökkenését tapasztaltuk. Ha egy marker esetében allélikus instabilitást tapasztaltunk, akkor tekintve, hogy a markerek és a gének között a távolság kicsi volt, nagy valószínűséggel a gént is érintettnek tekintettük. 3.4. Polimeráz láncreakció (PCR) 3.4.1. hMLH1 mutációk vizsgálata A gén mind a 19 exonját vizsgáltuk Kolodner (1995), Beck (1997) és Yanagisawa (2000) nyomán. A PCR reakcióban 100 ng templátot hMLH1 primerekkel (7. táblázat) 100-200 mM dNTP, 1,5-2,5 mM MgCl2 segítségével 50 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 10 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük.
7. táblázat MLH1 primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) hMLH1 1 s
gacgtttccttggctcttctg
hMLH1 1 as
ccgttaagtcgtagcccttaagt
hMLH1 2 s
tattttctgtttgatttgccag
hMLH1 2 as
tgactcttccatgaagcgc
hMLH1 3 s
gagatttggaaaatgagtaaca
hMLH1 3 as
cacaggaggatattttacaca
hMLH1 4 s
cccagcagtgagtttttcttt
hMLH1 4 as
gattactctgagacctaggc
hMLH1 5 s
gattttctcttttccccttggg
hMLH1 5 as
caaacaaagcttcaacaatttac
hMLH1 6 s
ttgccaggaccatcttggg
hMLH1 6 as
actcccagattttggactgt
hMLH1 7 s
ctagtgtgtgtttttggc
hMLH1 7 as
cataaccttatctccacc
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
193
56
165
55
198
49
193
52
190
52
187
55
185
47
30
hMLH1 8 s
aaatccttgtgtcttctgctg
hMLH1 8 as
gtgatggaatgataaaccaag
hMLH1 9 s
gcttcagaatctcttttcta
hMLH1 9 as
gtggatttcccatgtggttc
hMLH1 10 s
ggacagttttgaactggttgc
186
55
169
52
198
55
216
55
418
55
292
55
201
60
178
49
212
53
171
55
158
55
240
55
hMLH1 10 as gaggagagcctgatagaacatctg hMLH1 11 s
tctaaggtaattgttctctctta
hMLH1 11 as aagtagctggatgagaagcg hMLH1 12 s
ttaatacagactttgctaccag
hMLH1 12 as cagataaagagtagctgtactt hMLH1 13 s
ggttcattcacagctctgtag
hMLH1 13 as cacagcgtttagtaccctca hMLH1 14 s
aagtggggttggtaggattc
hMLH1 14 as ctctgcttgttcacacactc hMLH1 15 s
tttgtcccaactggttgtatctc
hMLH1 15 as tcagttgaatttcagaagtg hMLH1 16 s
ttcatgttcttgcttcttcc
hMLH1 16 as gaagtataagaatggctgtc hMLH1 17 s
tgtcctttttcctgcaagc
hMLH1 17 as tttccctccagcacacatg hMLH1 18 s
gaggtattgaatttctttggac
hMLH1 18 as gtgtgcatcaccactgtacc hMLH1 19 s
caaacagggaggcttatgac
hMLH1 19 as aagaacacatcccacagtgc
3.4.2. hMSH2 mutációk vizsgálata. A gén mind a 16 exonját vizsgáltuk Beck (1997), és Yanagishawa (2000) nyomán. A PCR reakcióban 100 ng templátot hMSH2 primerekkel (8. táblázat) 200 mM dNTP, 1,5-2,5 mM MgCl2 segítségével 50 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 10 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük.
31
8. táblázat MSH2 primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) hMSH2 1 s
cttcaaccaggaggtgaggaggt
hMSH2 1 as
gaaaggagccgcgccacaag
hMSH2 2 s
atgtaatatctcaaatctgtaatgt
hMSH2 2 as
ataagtaaattaaaaaggaagataa
hMSH2 3 s
tgttcaagagtttgttaaattttt
hMSH2 3 as
tggaatctcctctatcactagact
hMSH2 4 s
tcttattccttttctcatagtag
hMSH2 4 as
tattgtaattcacatttataatcc
hMSH2 5 s
agtggtatagaaatcttc
hMSH2 5 as
accaatcaacatttttaaccc
hMSH2 6 s
tttcactaatgagcttgcc
hMSH2 6 as
caggttacataaaactaacg
hMSH2 7 s
agattgaatttagtggaagc
hMSH2 7 as
caaaatcacttgttaccttc
hMSH2 8 s
aatgagatctttttatttgtttgtt
hMSH2 8 as
actgcttaaattaaaaagtatattg
hMSH2 9 s
gtcactttgttctgtttgcag
hMSH2 9 as
attccaacctccaatgaccc
hMSH2 10 s
gtagtaggtatttatggaatac
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
301
59
227
47
359
52
224
47
240
48
225
48
218
49
182
47
174
55
217
55
169
50
251
52
272
52
288
55
254
52
hMSH2 10 as taataatgacttacaaacctg hMSH2 11 s
ttaataaaactgttatttcgatttg
hMSH2 11 as agccaggtgacattcagaacattat hMSH2 12 s
aggctatgtagaaccaatgc
hMSH2 12 as taccagtaatgatgtggaac hMSH2 13 s
aatcttgctttctgatataatttg
hMSH2 13 as catttctatcttcaagggactagga hMSH2 14 s
tcatgtaattatgtgcttcag
hMSH2 14 as gtactccaatagtacatacc hMSH2 15 s
tgtctcttctcatgctgtcc
hMSH2 15 as taagttaaactatgaaaacaaactg
32
hMSH2 16 s
gacattcacatgtgtttcagc
217
58
hMSH2 16 as taccttcattccattactggg
3.4.3. TP53 mutációk vizsgálata A gén mutációs forró pontjait (Elsaleh 2000) vizsgáltuk: 5, 7 és 8 exon lefedésével. A PCR reakcióban 100 ng templátot p53 primerekkel (Zhang 1997) (9. táblázat) 50-100 mM dNTP, 1,5-2,5 mM MgCl2 segítségével 30 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 10 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük. 9. táblázat TP53 primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) TP53 5 s
tgttcacttgtgccctgact
TP53 5 as
agcaatcagtgaggaatcag
TP53 7 s
tgttgtctcctaggttggct
TP53 7 as
caagtggctcctgacctgga
TP53 8 s
cctatcctgagtagtggtaat
TP53 8 as
tcctccaccgcttcttgt
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
310
57
140
57
181
53
3.4.4. APC mutációk vizsgálata Mutációkat a génen a mutációs cluster régióban (MCR) kerestünk, amely az 1285 és az 1465 kodon között helyezkedik el. A PCR reakcióban 100 ng templátot APC primerekkel (10. táblázat) (Groden 1991, Miyoshi 1992) 100 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2 segítségével 30 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 40 ciklus 93,5ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 5 perc. Az APC A primerek a 1257-1383 kodonokat, az APC B a 1296-1409 kodonokat, az APC C a 1477-1530 kodonokat és az APC 1450 a
1389-1498
kodonokat fogja közre. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük.
33
10. táblázat APC primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) APC A s
aagaaacaatacagacttattgtg
APC A as
atgagtggggtctcctgaac
APC B s
gcagattctgctaataccct
APC B as
atggttcactctgaacgga
APC C s
cagagggtccaggttcttcc
APC C as
tcctgaactggaggcattattc
APC 1450 s
tctgtcagttcacttgatag
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
382
55
342
54
162
56
329
54
APC 1450 as tctggagtactttccgtgg
3.4.5. MTHFR polimorfizmus vizsgálata A gén c.677C>T polimorfizmusát tumor és normál mintákon egyaránt vizsgáltuk. A PCR reakcióban 100 ng templátot MTHFR primerekkel (Frosst 1995) (11. táblázat) 100 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2 segítségével 30 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 5 perc. A PCR reakció után HinfI enzimmel (Fermentas) emésztettük, majd 2%-os agaróz gélen (Cambrex) futtattuk. A HinfI enzim felismerőhelye a GANTC, megemészti a mutáns GTC kodont és nem képes megemészteni a nem mutáns GCC kodont. 11. táblázat MTHFR primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) MTHFR s
tgaaggagaaggtgtctgcggga
MTHFR as
aggacggtgcggtgagagtg
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
198
60
3.4.6. K-RAS mutáció vizsgálata A gén mutációs forró pontját, a 12. kodont és környékét vizsgáltuk. A PCR reakcióban 100 ng templátot K-RAS primerekkel (Kopreski 1997, Mulcahy 1998) (12. táblázat) 100 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2 segítségével 30 µl-ben amplifikáltunk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs 34
hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 5 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük. 12. táblázat K-RAS primerek.
Primer
Primer szekvenciája
Amplikon
Anellációs
neve
(5’→ → 3’ irányban)
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
K-RAS s
actgaatataaacttgtggtagttgga
157
57
cct K-RAS as tcaaagaatggtcctggacc
3.4.7. SMAD4 mutációk vizsgálta A gén mutációs forró pontjait, a 2., 8. és 11. exont vizsgáltuk. A PCR reakcióban 100 ng templátot SMAD4 primerekkel (Takagi 1996, Hahn 1998, Yakicier 1999) (13. táblázat) 50-100 mM dNTP, 1,5-2,5 mM MgCl2 segítségével 30 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 40 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 5 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük. 13. táblázat SMAD4 primerek.
Primer neve
Primer szekvenciája
Amplikon
Anellációs
(5’→ → 3’ irányban)
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
175
56
264
53
296
55
SMAD4 2 s
ttctaggtggctggtcggaa
SMAD4 2 as
caggtgatacaactcgttcg
SMAD4 8 s
tttctcatgggaggatgttc
SMAD4 8 as
caattttttaaagtaactatctga
SMAD4 11 s
atgtcttccaaactcttttctg
SMAD4 11 as tgtattttgtagtccaccatc
3.4.8. Ismétlődő szekvenciákat tartalmazó gének vizsgálata Az E2F4 gén CAG ismétlődését (Souza 1997), a BAX gén G8 ismétlődését és a TGFβRII gén A8 ismétlődését (Akiyama 1997) vizsgáltuk. A PCR reakcióban 100 ng templátot primerekkel (14. táblázat) 100 mM dNTP, 0,5 mM MgCl2 segítségével 30
35
µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 5 perc, majd 35 ciklus 94ºC 1 perc, anellációs hőmérséklet 1 perc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 5 perc. A minták további vizsgálatát SSCP és heteroduplex analízissel végeztük. 14. táblázat Ismétlődő szekvenciákat tartalmazó gének primerei.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) E2F4 s
tggtcctcctgtgtctgggtt
E2F4 as
aaggaggtagaagggttgg
BAX s
atccaggatcgagcagggcg
BAX as
actcgctcagcttcttggtg
TGFβRII s
agatgctgcttctccaaagtgc
TGFβRII as
ttgcactcatcagagctacagg
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
310
57,5
94
61,5
90
59,5
3.5. Szekvenciavariánsok vizsgálata SSCP és heteroduplex (HD) analízissel A PCR termékeket kilencszeres térfogatnyi, 96% formamidot, 4% 20 mM EDTA-t és brómfenolkék és xiléncianol festékeket tartalmazó oldattal összekevertük (a HD mintafelviteli puffer 40% szaharózt is tartalmaz). A mintákat 95ºC-on 5 percig denaturáltuk, majd SSCP-hez jégen, illetve heteroduplex vizsgálathoz lassan hűtöttük vissza. A mintákat méretük szerint 7,5-10-12,5-15%-os akrilamidon illetve MDE gélen (Cambrex Bio Science Rockland Inc.) futtattuk 16 cm hosszú vertikális gélen (Hoefer SE 600, Pharmacia). Az SSCP futtatás 4-16 órán keresztül 1xTBE pufferben, a heteroduplex futtatás pedig 0,6xTBE pufferben történt (10xTBE: 0.89 M Tris, 0.89 M bórsav, 20 mM EDTA). A gélben megfelelő ideig futtatott egyszálú, illetve kétszálú DNS szálakat ezüstfestéssel tettük láthatóvá. A gélt először 3 percig fixáltuk 10% etanolt és 0.5% ecetsavat tartalmazó oldatban. Majd desztillált vizes mosások után 0.1 % ezüst-nitrát oldattal festettük 10-15 percig. Újabb desztillált vizes mosás után előhívtuk 10-15 perc alatt 1.5% NaOH-t és 0.15% formaldehidet tartalmazó oldattal. A közömbösítést 5-10 percig 0.75% nátrium-karbonát oldattal végeztük (Caetano-Anolles 1994).
36
3.6. DNS szekvenálás Az SSCP illetve heteroduplex analízissel eltérő PCR termékeket először alkalikus foszfatázzal (SAP, USB) és exonukleáz I-gyel (USB) megtisztítottuk a feleslegben megmaradt nukleotidoktól és primerektől. Ezután a mintákat BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) segítségével amplifikáltuk. A fluoreszcensen jelölt termékeket ABI PRISM 310 illetve 3130 genetikai analizátorokon futtattuk és a Sequencing Analysis (Applied Biosystems) szoftver segítségével értékeltük. 3.7. Aminosavak konzerváltsági fokának vizsgálata Az aminosavak konzerváltságát három szoftverrel vizsgáltuk. A SIFT szoftver (http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) az adott aminosav cseréjére egy tolerancia küszöböt ad meg (0,05), amely érték alatt a csere nem tolerálható és a változás káros a fehérje
szempontjából
(Ng
2003).
A
PolyPhen
szoftver
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph) egy pozícióspecifikus értéket ad meg minden aminosavcserére, amely ha kisebb mint 0,5 a változás neutrális, ha nagyobb mint 2 a változás patogén, és ha a kettő között van, akkor a patogenitás a pozíciótól, térkitöltéstől, töltéstől és egyéb dolgoktól függ (Sunyaev 2001). A PMut szoftver (http://mmb.pcb.ub.es/PMUT) egy küszöbértéket (0,5) ad meg, amely felett a változás patogén és egy megbízhatósági értéket mellékel, amely 0 és 9 között változik, ez az érték minél nagyobb, annál megbízhatóbb az eredmény (Ferrer-Costa 2004). 3.8. MLPA reakció Nagy deléciók vizsgálatához MLH1 és MSH2 gén exonjaira úgynevezett multiplex ligáció-függő próba amplifikációval (MLPA) (Schouten 2002, Gille 2002, Nakagawa 2003, Taylor 2003, Ainsworth 2004, Bunyan 2004, Castellvi-Bel 2005, Wehner 2005) vizsgálatot végeztünk. A kit a vizsgált szakaszokon kívül különböző kromoszómákon elhelyezkedő, illetve szintetikus próbákat is tartalmazott. Százötven ng DNS-t SALSA próbakeverékkel (MRC-Holland) 60ºC-on hibridizáltattunk 16 órán át, majd a próbákat 54ºC-on 15 percig ligáltuk. Az összekapcsolt szakaszokat PCR-rel felszaporítottuk. A PCR reakció a következő volt: 35 ciklus 95ºC 30 másodperc, 60ºC 30 másodperc, 72ºC 1 perc, végül 72ºC 20 perc. A fluoreszcensen jelölt termékeket ABI PRISM 3130 genetikai analizátoron futtattuk és a GeneMapper (Applied Biosystems) szoftver segítségével értékeltük. Valamely próbánál az egyik allél 37
delécióját a csúcs görbe alatti területének 35-55%-os redukciója jelenti. A mintában az amplifikált próbák mennyiségét egy egészséges kontroll mintához viszonyítottuk. 3.9. Promóter metiláció 3.9.1. hMLH1 promóter metiláció A hMLH1 gén promóter régiójának a transzlációs start kodontól proximális irányban –316 és –435 közötti részének metilációs vizsgálatát enzimes emésztéses módszerrel végeztük (Kane 1997, Kamory 2003). Elsőként elkészítettük a metilációs negatív kontrollt. Nem metilált kontrollnak PCR módszerrel felsokszorozott terméket használtunk, tekintve, hogy a PCR termék soha nem metilált semelyik régióban. Ehhez Muc I primereket használtunk (15. táblázat). Ezek után a negatív kontrollból készítettük a metilált kontrollt SssI metiláz (New Ingland BioLabs Inc.) kezeléssel. Ezután minden mintából négy különböző csövet készítünk: HS: minta + metilált kontroll HpaII (Pharmacia) emésztésre, H: minta + nem metilált kontroll HpaII emésztésre, M: minta + nem metilált kontroll MspI (Promega) emésztésre, U: minta + nem metilált kontroll. A HpaII enzim felismerőhelye a CCGG, megemészti a nem metilált CpG régiókat és nem képes megemészteni a metilált CpG régiókat. Ezzel szemben az MspI enzim felismerőhelye ugyanez, de mind a metilált, mind a nem metilált CpG szigeteket képes megemészteni. Az emésztés 20 µl-ben 37ºC-on 4 órán keresztül történt, majd az enzimeket 65ºC-on 20 perc alatt inaktiváltuk. Az emésztési termékek 10 µl-ét hMLH1 (14. táblázat) és MUC I primerek (Hardingham 2000) együttes jelenlétében 100 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2 segítségével 50 µl-ben amplifikáltuk. A PCR reakció a következő volt: 96ºC 4 perc, majd 35 ciklus 93,5ºC 45 másodperc, anellációs hőmérséklet 45 másodperc, 72ºC 45 másodperc, végül 72ºC 7 perc (15. táblázat). A termékeket 7,5 %-os akrilamid gélen futtattuk. A hMLH1 promóter hipermetilált minták a HS sávban két csíkot adtak, amely megfelelt mind a hMLH1 hipermetilációnak és a metilált kontrollnak, H sávban egy csíkot adtak, amely megfelelt a hMLH1 hipermetilációnak és a nem metilált kontroll leemésztődött, M sávban nem volt csík, mind a kontroll, mind a minta leemésztődött, U sávban két csík volt, tekintve, hogy itt emésztés nem történt. A promóter régióban hipermetilációt nem mutató minták esetében a HS sávban csak a metilált kontroll adott jelet, a H sávban nem volt jel, az M sáv és az U sáv pedig megegyezett a hMLH1 promóter hipermetilált mintákkal (16. ábra).
38
15. táblázat MUC I és MLH1 primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) MUC I s
accaagactgatgccagtagcact
MUC I as
accgttacctgcagaaaccttct
hMLH1 s
cgctcgtagtattcgtc
hMLH1 as
tcagtgcctcgtgctcac
Amplikon
Anellációs
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
684
56
606
56
3.9.2. CDKN2A promóter metiláció A CDKN2A gén promóter régiójának a transzlációs start kodontól proximális irányban –80 nukleotidtól
az első exonban tálható +71 nukleotidig a metilációs
vizsgálatot enzimes emésztéses módszerrel a hMLH1 promóter metilációs fejezetben leírtak alapján végeztük (16. táblázat) (Gonzalez-Zulueta 1995, Merlo 1995, Herman 1996, Kane 1997, Wong 1997). 16. Táblázat CDKN2A primerek.
Primer neve Primer szekvenciája (5’→ → 3’ irányban) P16 s
tcaccagagggtggggcggaccgcg
P16 as
cgaccccgggccgcggccgtgg
Amplikon
Anellációs
hossza (bp) hőmérséklet (ºC) 151
56
3.9.3. APC promóter metiláció Az APC 1A promóter metiláció vizsgálatát nátrium-biszulfitos modifikációs módszerrel végeztük (Frommer 1992). 500 ng genomiális DNS-t kiegészítettünk 11,2 µl-re és hozzáadtunk 1,2 µl 3 M NaOH-t, majd 37ºC-on 15 percet inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 105 µl 3 M NaHSO3-t, 7,5 µl 10 mM hidrokinont és 3,6 µl 3 M NaOH-t és egy éjszakán át 50ºC-on inkubáltuk. Másnap Wizard Clean Up (Pharmacia) oszlopos rendszerrel megtisztítottuk, majd hozzáadtunk 10 µl 3 M-os NAOH-t és 37ºC-on 10 percet inkubáltuk. Majd az elegyhez hozzámértünk 120 µl 5 M ammónium-acetátot és 660 µl abszolút etanolt és egy éjszakán át -20ºC-on tartottuk. Harmadnap 30 percig 20 000 g-vel centrifugáltuk, 70%-os etanollal mostuk, majd 39
felvettük 100 µl desztillált vízben. A Taqman vizsgálatot MethyLight módszerrel Eads és munkatársai (2001) alapján 25 µl-ben 3,5 mM MgCl2, 200 mM dNTP, metilált APC promóterre specifikus primerek és az 5’ végen 6-FAM és a 3’ végen TAMRA festékkel fluoreszcensen jelölt próba (17. táblázat) segítségével ABI 7900 szekvencia detektáló rendszeren (Applied Biosystems) végeztük. A módosított DNS mennyiségére az aktin-β (ACTB) specifikus (metilációtól független) primerek és próba segítségével normalizáltunk. A metiláció fokát mesterséges 0%-os és 100%-os metilált kontrollokhoz viszonyítva határoztuk meg. Metilációra pozitívnak értékeltünk egy mintát, ha értéke legalább 5%-kal nagyobb volt, mint a normál minta értéke. 17. táblázat APC és ACTB metilációs primerek.
Primer/próba Primer/próba szekvenciája
Amplikon
Anellációs
neve
(5’→ → 3’ irányban)
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
APC s
gaaccaaaacgctccccat
74
60
APC as
ttatatgtcggttacgtgcgtttatat
APC próba
cccgtcgaaaacccgccgatta
ACTB s
tggtgatggaggaggtttagtaagt
133
60
ACTB as
aaccaataaaacctactcctcccttaa
ACTB próba
accaccacccaacacacaataacaaac aca
3.9.4. hMLH1 promóter metiláció Taqman próbával Az hMLH1 promóter metiláció vizsgálatát a –662 és –575 közötti régióra biszulfitos modifikációs módszerrel végeztük az előző részben leírt szemikvantitatív MethyLight analízissel (18. táblázat) (Frommer 1992, Eads 2001). 18. táblázat MLH1 metilációs primerek.
Primer/próba Primer/próba szekvenciája
Amplikon
Anellációs
neve
(5’→ → 3’ irányban)
hossza (bp)
hőmérséklet (ºC)
hMLH1 s
cgttatatatcgttcgtagtattcg
88
60
tgttt hMLH1 as
ctatcgccgcctcatcgt
hMLH1 próba cgcgacgtcaaacgccactacg
40
3.10. Western blot mlh1, msh2, p16CDKN2A és p53 fehérjékre A fehérjéket 4:1 arányban, merkaptoetanolt, glicerint, nátrium-dodecilszulfátot (SDS), TrisHCl-t (pH=6,8) és brómfenolkék festéket tartalmazó oldattal összekevertük. A mintákat 7,5-15%-os 16 cm hosszú vertikális akrilamidgélen futtattuk (Hoefer SE 600, Pharmacia). A futtatás 2 órán keresztül 110 V-on, 1x pufferben történt (10xTrisGlicin: 0,25 M Tris-hidroximetil-amino-metán, 0,1% SDS, 2 M Glicin). A membránra az elektroblottolást BioRad készülékkel másfél órán keresztül végeztük. Az első ellenanyagot 2 órán át szobahőmérsékleten és a második ellenanyagot egy éjszakán át 4ºC-on hagytuk állni a membránon, majd a Streptavidint 1 órán át szintén szobahőmérsékleten hagytuk rajta. A festés 10% Tris-HCl-t, 10 mM MgCl2-t, nitroblue-tetrazóniumot (NBT) és 5-bromo-4-kloro-3-inidolit-fosztfátot (BCIP) tartalmazó oldattal történt. Az mlh1-re egér (Pharmingen), az msh2-re Ab-2 egér (Calbiochem), a p16CDKN2A-ra M-156 (Santa Cruz) és a p53-ra Bp53-12 (Santa Cruz) monoklonális ellenanyagot használtunk (Maniatis 1982). 3.11. Immunhisztokémia Az immunhisztokémiai vizsgálat 5 µm vastagságú paraffinos metszeten történt. A metszetet xilollal deparaffináltuk, rehidratálás után citrát pufferben (pH 6,4) 20 percig mikrohullámú sütőben inkubáltuk. A nem specifikus kötések blokkolása bovine serum albumin-nel (BSA) történt PBS pufferben. Ezután a metszeteket a következő elsődleges antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk: egér anti-humán mlh1 (G168-728, Cell Marque) és egér anti-humán msh2 (G219-1129, Cell Marque). Az elsődleges antitestek kimutatása másodlagos antitesttel biotin-sztreptavidin detektáló kittel VIP kromogén
segítségével történt. A tumor sejtekben negativitást a
magszignál hiányával határoztuk meg. A magok ellenfestése metilénzölddel történt (Plevova 2004). 3.12. Statisztikai értékelés A Taqman módszerrel történt kvantitatív metilációs eredmények értékelése Wilcoxon és páros t teszt segítségével történt. A több csoportot tartalmazó összeghasonlításokat ANOVA (one-way ordinary) analízissel, Tukey’s poszt-teszt alkalmazásával végeztük. A kontingenciatáblák vizsgálata Fisher és χ2 négyzet tesztekkel történt. Az 41
értékeléshez az InStat (Graphad) szoftvert használtuk. A p<0,05 valószínűségi értéket fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak. A Fisher próba esetén, ha a p érték magas, és a relatív kockázat (RR, relative risk) érték kisebb, mint egy, akkor az értékek között negatív korreláció áll fenn.
42
4. Eredmények 4.1. Mikroszatellita instabilitás és az ismétlődő részeket tartalmazó gének vizsgálata A mikroszatellita markerek esetében nem tekintettük informatívnak allélvesztés szempontjából azokat a markereket, ahol a normál minta is homozigótának bizonyult. Amennyiben egy mintánál az egyik markerre nézve MSI-t tapasztaltunk (5. ábra), azt a markert az allélvesztés szempontjából szintén nem tekintettük informatívnak. Allélvesztés (6. ábra) esetén a génhez legközelebb eső, vagy a génben található mikroszatellita markert vizsgáltuk: MSH2 esetén az intragénikus BAT26-t (homozigóciája, illetve instabilitása esetén a D2S123-t, amely 3,6 megabázis távolságra
található
a
géntől),
MLH1
esetén
az
intragénikus
D3S1611-t
(homozigóciája, illetve instabilitása esetén a D3S1298-t, amely 1 megabázis távolságra található a géntől) és APC esetén a D5S346-t (amely 70 kilobázisra található a géntől). Az eredményeket a 18. táblázat tartalmazza.
5. ábra MSI a D3S1283 markerben. Első ábrán a tumor a másodikon a hozzá tartozó normál minta látható. A tumorminában a nyilak az extra csúcsok megjelenését mutatják. A piros csúcsok a méret standard-et jelölik.
43
6. ábra Allélvesztés a D16S398 markerben. Első ábrán a tumor a másodikon a hozzá tartozó normál minta látható. A tumorban az első allél több, mint 50%-os csökkenése tapasztalható, amelyet a piros nyíl jelöl.
Az ismétlődő részeket tartalmazó géneket instabilnak tekintettük, ha a tumorból származó mintában a normálhoz képest eltérést tapasztaltunk (19. táblázat). A TGFβRII gén esetében A10 ismétlődést, a BAX gén esetében G8 ismétlődést (6. ábra), és az E2F4 gén esetén a (CAG)n ismétlődő szakaszt vizsgáltunk (7. ábra, 8. ábra).
7. ábra BAX és E2F4 minták SSCP képe. A géleken tumor-normál mintapárok láthatók. A tumorminták esetében a gélen extra csíkok jelentek meg, amelyek a normáltól való eltérésre utalnak.
44
8. ábra A 4. számú tumor minta E2F4 szekvenálása szensz irányban. 19. táblázat MSI, LOH és repeateket tartalmazó gének.
Betegazonosító 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Mikroszatellita Allélvesztés instabilitás alacsony stabil stabil stabil alacsony APC stabil stabil MLH1 stabil MSH2 stabil MSH2 stabil alacsony stabil MLH1 stabil alacsony APC stabil stabil MSH2 stabil alacsony MSH2, APC stabil alacsony MSH2 stabil stabil MLH1 stabil MLH1 alacsony MSH2, APC stabil stabil APC stabil stabil stabil MSH2 stabil MSH2 stabil -, APC nem informatív alacsony MSH2, APC stabil APC
E2F4 (CAG)n + + + + + + + + -
BAX G8 + + -
TGFβ β RII A10 + + + + -
-
+ -
+ 45
35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 85
stabil stabil stabil stabil stabil alacsony stabil stabil alacsony stabil stabil stabil stabil stabil alacsony alacsony stabil stabil stabil alacsony stabil stabil alacsony magas stabil stabil stabil alacsony alacsony stabil alacsony stabil stabil alacsony alacsony alacsony stabil
APC MLH1 APC MLH1 MSH2, MLH1 APC APC APC MLH1, APC APC APC MSH2 MLH1 -
+ + -
+ -
+ + + + -
Harminchat betegnél, azaz a betegek felénél az MSI stabil volt, allélvesztést a két MMR génre nézve nem tapasztaltunk és a három mikroszatellita régiót tartalmazó génből legalább kettő szintén stabil volt. Alacsony szintű mikroszatellita instabilitást találtunk 20 betegnél (29%), és magas instabilitást 1 betegnél (1,5%) (58). Allélvesztést sikerült kimutatnunk csak az APC génre 11 betegnél (16%) (5, 14, 26, 33, 35, 41, 48, 50, 53, 58, 59), az APC és az MLH1 génre együtt 1 betegnél (1,5%) (55), az MLH1 génre önmagában 7 betegnél (10%) (7, 12, 22, 23, 36, 42, 70), az 46
MSH2 génre önmagában 7 betegnél (10%) (8, 9, 16, 20, 29, 30, 65), az APC és az MSH2 génre együtt 3 betegnél (4%) (18, 24, 32) és az MLH1 és az MSH2 génre együtt 1 betegnél (1,5%) (43) (9. ábra).
9. ábra. A diagram az allélvesztések megoszlását mutatja gének szerint betegszámban kifejezve. A vízszintes tengelyeken azok a gének láthatóak, amelyekben allélvesztés fordult elő, a függőleges tengely az adott allélvesztéshez tartozó betegek számát mutatja. A gének metszéspontjában az együttesen előforduló allélvesztések száma látható, ugyanazon gén metszéspontjában (pl. APC-APC) pedig az önállóan előforduló allélvesztések betegszámát találjuk.
Alacsony MSI-t és allélvesztést valamely MMR génre 6 betegnél tapasztaltunk (9%) (18, 20, 24, 43, 65, 70), ebből három E2F4-re is pozitív volt (4%) és 1 betegnél mind a két MMR génre allélvesztést is találtunk(1,5%). Két betegnél (3%) (7, 9) MSI pozitivitást nem, azonban allélvesztést valamely MMR génre és mikroszatellita régiót tartalmazó génre is pozitivitást tapasztaltunk. Egy beteg (1,5%) (32) bizonyult mind MSI pozitívnak, mind valamely MMR génre allélvesztést hordozónak és legalább két mikroszatellita régiót tartalmazó génre is pozitívnak.
47
4.2. MTHFR polimorfizmus Az MTHFR génben a c.677C>T mutáció esetén C/C genotípust nevezzük nem mutánsnak, C/T a heterozigóta és T/T a homozigóta mutáns. Mind a tumoros mind a normál szövetmintákat megvizsgáltuk, és a várt három típuson (tumor és normál megegyező: nem mutáns (37%) vagy heterozigóta (44%) vagy homozigóta mutáns (9%)) kívül megjelent három másik csoport is: az elsőben a tumorban szomatikus mutáció alakult ki (C>T) (1%), a másik két csoportban viszont a mutáns formából lett nem mutáns forma (T>C) (7%, 1%) (20. táblázat). Lehetséges, hogy ahol a normál minta C/T genotípusából a tumoros szövetben C/C genotípust mutattunk ki, ott valójában nem a mutáció visszaalakulása, hanem a T allél elvesztése történt és a tumor minták nem C/C homozigóták, hanem C/- hemizigóták lettek. 20. táblázat MTHFR genotípusok.
Tumor szövet C/C
Normál szövet C/C
C/T
C/T
T/T C/T C/C C/T
T/T C/C C/T T/T
Betegazonosító 1, 4, 7, 10, 11, 15, 22, 26, 29, 31, 39, 44, 47, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 85 3, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 24, 25, 27, 30, 33, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 46, 49, 51, 53, 55, 64, 65, 68 2, 17, 23, 32, 45, 60 57 5, 16, 18, 48, 50 28
4.3. TP53 mutációk A TP53 génben a 7. exonban nem sikerült mutációt kimutatnuk. A másik két exonban talált misszensz mutációkat (10. ábra) a 21. táblázat tartalmazza.
48
10. ábra A TP53 gén 8. exonjában megjelenő mutációk SSCP képe, és a két, normálhoz képest eltérő tumorminta szekvenálási képe szensz irányban. 21. táblázat A TP53 génben megjelenő mutációk.
Exon Mutáció 5 8
Nukleinsav változás
Fehérje változás
Betegazonosító
c.524G>A c.796G>A c.817C>T
p.Arg175His p.Gly266Arg p.Arg273Cys
8 61 31
4.4. MMR gének mutációi A MMR génekben összesen 10 féle nukleotidcserét sikerült kimutatnunk. Ebből 3 bizonyult misszensz mutációnak, 2 az MLH1 és 1 az MSH2 génben. Emellett 7 polimorfizmust is sikerült kimutatnunk, amelyből 4 az MLH1 és 3 az MSH2 génben volt. Az MLH1 gén polimorfizmusai közül kettő intronban helyezkedett el, és egy aminosavcserével járó nem szinonim polimorfizmus volt. A másik exonikus polimorfizmus és az MSH2-ben talált 3 polimorfizmus szinonimnak bizonyult. A két vizsgált MMR gén mutációit a 22. táblázat tartalmazza. A 11-12. ábrákon egyes mutációk SSCP, illetve szekvenálási képe látható.
49
11. ábra Az MSH2 gén SSCP képe, és az extra csíkot tartalmazó tumorminták szensz szekvenálási képe.
12. ábra Az MLH1 gén SSCP képe a tumormintákban extra csíkkal, és a tumorok szensz szekvenálási képe a 19-es és a 14-es számú mintákban.
50
22. táblázat A MMR génekben megjelenő változások.
Gén Mutáció MLH1 MSH2 Polimorfizmus MLH1
MSH2
Exon
Nukleinsav változás
Fehérje változás
Betegazonosító
14 16 6
c.1564C>T c.1853A>C c.965G>A
p.Arg522Trp p.Lys618Thr p.Gly322Asp
9 53 59
8 9 15 17 5 6 13
c.655A>G c.790+10A>G c.1668-19A>G c.1959G>T c.837C>T c.984C>T c.2061C>G
p.Ile219Val Intronikus Intronikus p.Leu653Leu p.Leu279Leu p.Ala328Ala p.Leu687Leu
11, 14 19 14 70 9, 24, 49, 52 59 29
4.5. APC mutációk Az APC gén mutációs cluster régiójának vizsgálata során 18 féle változást tapasztaltunk (13. ábra, 23. táblázat). Ebből szekvenálással 6 misszensz mutációt egyegy mintában (9%), 3 nonszensz mutációt egy-kettő-négy mintában (10%), 7 kereteltolódási mutációt egy-egy mintában (10%) és két polimorfizmus tudtunk kimutatni. A hétféle kereteltolódási mutációból 6 deléciós (2 egybázisos, 1 ötbázisos és 3 féle 11 bázisos) és egy inszerciós mutáció volt. Négy mintában több mutáció is előfordult: a 3-as mintában egy misszensz és egy nonszensz mutáció, a 8-as mintában egy kereteltolódási mutáció, egy misszensz mutáció és egy polimorfizmus, a 30-as mintában két nonszensz mutáció, a 66-os mintában pedig két nonszensz és egy misszensz mutáció valamint egy polimorfizmus. A két szinonim polimorfizmusból a gyakoribb (p.Thr1493Thr) 16 mintában (23%) fordult elő.
51
13. ábra A felső ábrán a p.Thr1493Thr polimorfizmus szekvenálása látható. Az alsó ábrán a 8-as mintában található két mutáció látható antiszensz irányban szekvenálva, szensz irányban a p.Met1431Arg mutáció nem jól látható a kereteltolódási mutáció miatt. A mutációk helyét nyilak jelölik. 23. táblázat Az APC génben megjelenő változások.
Nukleinsav változás Mutáció c.3792delA c.3897del11 c.3914C>G c.3915deltgcaa c.3920T>A c.3944C>G c.3982C>G c.4037C>G c.4040C>T c.4282insccaaa c.4292T>G c.4395T>G c.4464A>T c.4464del11 c.4476delC c.4488del11 Polimorfizmus c.4350A>G c.4479G>A
Fehérje változás
Betegazonosító
Kereteltolódás Kereteltolódás p.Ala1305Gly Kereteltolódás p.Ile1307Lys p.Ser1315Stop p.Gln1328Stop p.Ser1346Stop p.Ala1347Val Kereteltolódás p.Met1431Arg p.Ser1465Arg p.Leu1488Phe Kereteltolódás Kereteltolódás Kereteltolódás
7 48 2 54 42 66 30,66 3,16,30,85 66 8 8 3 15 57 31 49
p.Arg1450Arg p.Thr1493Thr
17, 19, 25 5, 6, 8, 10, 13, 18, 20, 22, 27, 30, 38, 42, 49, 66, 68, 70
52
4.6. K-RAS és SMAD4 gének mutációi A SMAD4 gén 2. és 11. exonjában nem találtunk elváltozást, a 8. exonban szekvenálással csak az 59-es mintában tapasztaltunk változást (14. ábra, 24. táblázat). A K-RAS gén első exonjában a 12. kodonban kétféle változást tudtunk kimutatni: a p.Gly12Asp misszensz mutációt két mintában és a p.Gly12Val misszensz mutációt pedig négy mintában (15. ábra, 24. táblázat).
14. ábra Az ábrán a SMAD4 gén 8-as exonjában található in frame inszerció látható az 59-es mintában. A mutációkra utaló extra csíkokat az SSCP képen és a mutáció helyét a szekvenálási képen nyilak jelölik. 24. táblázat A SMAD4 és a K-RAS génben megjelenő mutációk.
Gén, exon SMAD4, exon 8 K-RAS, exon 1
Nukleinsav változás c.1051insctgttg c.35G>A c.35G>T
Fehérjeváltozás Betegazonosító p.351insGlyVal in frame inszerció p.Gly12Asp p.Gly12Val
59 55, 70 14, 38, 57, 85
53
15. ábra A K-RAS gén 12. kodonjában megjelenő kétféle mutáció kimutatása heteroduplex módszerrel és szekvenálással. A heteroduplex ábrán megjelenő extra csík
miatt a mintát szekvenáltuk, a baloldali
szekvenálási ábrán a p.Gly12Asp, a jobboldali ábrán a p.Gly12Val mutáció szekvenálási képe látható. Mindkét szekvenálási kép az antiszensz szekvenciából szoftveresen képzett reverz komplement képet mutatja.
4.7. Aminosavcserék patogenitása Az újonnan talált és kérdéses aminosavcserék esetén az aminosavak konzerváltságát három szoftverrel értékeltük (25. táblázat). Kérdéses aminosavcserének tekintettük az irodalomban neutrálisnak és patogénnek egyaránt jellemzett változásokat: a p.Val716Met változást az mlh1 fehérjében és a p.Gly322Asp változást az msh2 fehérjében. Patogénnek neveztünk egy változást, ha minden szoftver erre az eredményre jutott. Neutrálisnak neveztük, ha mindegyik szoftver szerint neutrális volt. Lehetséges patogénnek értékeltük a változást, ha legalább egy szoftver patogénnek minősítette. Feltehetőleg nem patogénként értékeltük, ha egyedül a PMut szoftver értékelte patogénnek, de az eredményt nem minősítette megbízhatónak.
54
25. táblázat Újonnan leírt és kérdéses mutációk patogenitásának meghatározása. A SIFT szoftverrel patogén egy aminosavcsere, ha az eredmény kisebb mint 0,05. A PolyPhen szoftver pozícióspecifikus értéke, ha kisebb mint 0,5 a változás neutrális, ha nagyobb mint 2 a változás patogén, és ha a kettő között van, akkor a szoftver ad értékelést. A PMut szoftver esetén ha az eredmény nagyobb mint 0,5 a változás patogén és akkor tekintettük elfogadhatónak, ha a megbízhatósági érték nagyobb mint 5. PMut szoftver használata esetén az eredmény/megbízhatósági értéket adtuk meg.
Gén
Aminosavcsere
SIFT
PolyPhen
PMut
Értékelés
APC
A1305G
0,01
1,137
0,1726/6
Lehetséges patogén
APC
A1347V
0,15
1,033
0,1485/7
Neutrális
APC
M1431R
0,0
2,163
0,9159/8
Patogén
APC
S1465R
0,49
1,379
0,5955/1
Feltehetőleg nem patogén
APC
L1488F
0,0
1,242
0,2641/4
Lehetséges patogén
MLH1
R522W
0,02
2,178
0,9585/9
Patogén
MLH1
V716M
0,16
0,409
0,4442/1
Neutrális
MSH2
G322D
0,08
1,457
0,3284/3
Neutrális
4.8. Promóter régiók metilációja A hMLH1 gén (16. ábra) promóterének két régióját a start kodontól –316 és –435 közötti és a –662 és –575 között részeket vizsgáltuk. A CDKN2A és az APC (17. ábra) génben csak egy-egy régiót vizsgáltuk. A vizsgálat célja az epigenetikus inaktiválás feltérképezése volt (26. táblázat).
55
16. ábra Az MLH1 gén metilációs vizsgálata látható a Muc I belső kontroll használata mellett a 11 és 12 számú mintákban. A módszer részletes leírása a 3.9.1. részben található.
17. ábra Az APC gén Taqman próbával történt vizsgálata az aktin-β β kontroll mellett. Az APC minták esetében jól látható, hogy egy bizonyos ciklusszámtól függő küszöbérték után a görbék egy része emelkedni kezd, amely a mintákban jelen lévő metilált DNS-ről keletkező PCR termék felszaporodására utal. Az aktin-β metilációtól független kontroll, minden mintában történik felszaporítás.
56
26. táblázat Promóter metilációs eredmények. Mindhárom gén együttes hipermetilációja szürkével jelölt. Taqman vizsgálat esetén pozitívnak vettük, ha a tumor minta metilációja legalább 5%-kal nagyobb a normál minta metilációs értékénél, az emésztéses vizsgálat esetén pedig ha a Hpa II emésztés után nem emésztett csíkot kapunk a gélen.
Beteg-
MLH1
MLH1
CDKN2A
APC
+ + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + +
azonosító -662 és –575 között –316 és –435 között 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 36 37 38 39 40
+ + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + -
57
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 85
+ + + + + + + -
+ + + + -
+ + + + + + + + + + +
+ + + + + + + -
Mindhárom gén együttes hipermetilációja 7 esetben (10%), az MLH1 gén és a CDKN2A gén együttes inaktiválódása 2 esetben, a CDKN2A gén és az APC gén inaktiválódása szintén 2 esetben és az MLH1 gén és az APC gén együttes hipermetilációja szintén 2 esetben fordult elő. Egyáltalán nem történt metilációs inaktiválódás 25 esetben (36%). Az MLH1 gén start kodontól távolabb eső régiójának kizárólagos hipermetilációja 10 esetben fordult elő. 4.9. Az mlh1, msh2, p16CDKN2A és p53 fehérjék vizsgálata Western blot segítségével A fehérjeexpresszió megváltozását mindig a saját, azonos tömegű normál mintájának expressziójához viszonyítottuk (18. ábra, 27. táblázat). Változást a legalább kétszeres csökkenés vagy növekedés esetén vettünk valósnak. Az mlh1 58
fehérje mennyisége 13-13 mintában nőtt illetve csökkent, az msh2 fehérje mennyisége 16 mintában csökkent és 12 mintában nőtt. A p16CDKN2A fehérje mennyisége 11 mintában csökkent és 7 mintában nőtt, a p53 fehérje mennyisége pedig 7 mintában csökkent és 11 mintában nőtt. A többi esetben a fehérjék mennyisége nem változott (ezt a táblázatban 0-val jelöltük).
18. ábra A felső Western blot az MLH1, az alsó a p16CDKN2A fehérjeexpresszióját mutatja. Az ábrán tumor-normál párok láthatók. 27. táblázat Az mlh1, az msh2, a p16CDKN2A és a p53 fehérjeexpresszió változása. A 0-val jelölt esetekben az expresszió nem változott.
Betegazonosító 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
mlh1 fehérje 0 0 csökken 0 0 csökken 0 0 nő 0 0 nő 0 csökken 0 0 0 csökken 0
msh2 fehérje csökken 0 0 0 csökken 0 0 0 0 0 0 0 csökken nő csökken 0 0 0 0
p16 fehérje p53 fehérje 0 0 0 0 0 0 0 0 csökken 0 csökken nő 0 0 0 nő 0 0 0 0 0 nő 0 nő csökken nő nő 0 0 0 0 0 0 0 0 nő 0 0 59
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
0 0 0 0 0 0 nő 0 0 0 0 0 csökken csökken nő 0 0 0 csökken 0 0 0 nő 0 nő csökken 0 nő 0 0 0 csökken nő nő nő 0 nő 0 0 0 0 csökken nő 0 csökken 0 0 csökken 0
csökken nő nő 0 0 0 nő 0 0 nő csökken 0 csökken csökken 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 csökken 0 csökken nő 0 nő 0 0 nő nő 0 0 0 csökken nő csökken 0 0 nő csökken 0 0 0 csökken csökken
nő nő csökken 0 nő 0 csökken csökken 0 0 0 0 0 0 0 0 nő csökken 0 csökken csökken 0 nő 0 csökken 0 0 0 0 0 0 0 csökken 0 0 0 nő csökken 0 0 0 0 nő nő 0 0 0 0 0
0 0 0 nő csökken 0 0 0 0 0 nő 0 0 0 0 0 csökken nő 0 0 0 0 0 0 csökken 0 0 csökken 0 0 0 0 csökken 0 0 0 0 csökken 0 csökken nő 0 0 0 0 0 0 0 nő 60
70 85
nő csökken
nő csökken
0 0
0 0
4.10. Eredmények statisztikai értékelése A relatív kvantifikálással történt APC Taqman vizsgálattal a normál és tumoros minták metilációs értékeinek összehasonlítása statisztikailag szignifikánsnak bizonyult (Wilcoxon teszttel a p=0,0034, és páros t teszttel p=0,011). Azaz a tumorban emelkedett metiláció mutatható ki a normál mintákhoz képest. A genetikai vizsgálatok eredményeit kontingencia táblába rendezve Fisher teszttel (28. táblázat), majd ellenőrzésképpen Khi-négyzet teszttel is elvégeztük. Szignifikánsnak mindössze az MLH1 promóter régiójának disztális részének metilációja és az MLH1 gén allélvesztése közötti kapcsolat bizonyult (p=0,007). Negatív korrelációt tapasztaltunk az APC inaktiváció és a MMR gének inaktivációja, ezen belül is az MLH1 gén inaktivációja között; a TP53 gén és a MMR gének inaktivációja, ezen belül is az MLH1 gén inaktivációja között; a TP53 gén mutációja és az MSI megjelenése között; az allélvesztés és a mutációs inaktiválás között mind az APC mind az MLH1 gén esetében (MLH1 estében az allélvesztés és a promóter régió proximális részének metilációja között is); és meglepő módon negatív korrelációt tapasztaltunk az MSI megjelenése és az ismétlődő szakaszokat tartalmazó gének instabilitása között. 28. táblázat Fisher teszt a genetikai vizsgálatok eredményeire.
1. változó MSI MSI MSI MSI MSI APC inaktiválás APC inaktiválás LOH nélkül APC LOH APC LOH APC metiláció MLH1 metiláció MLH1 promóter proximális régió
2. változó APC inaktiválás TP53 mutáció LOH MMR inaktiválás repeat gének változása MMR inaktiválás MMR inaktiválás LOH nélkül APC metiláció APC mutáció APC mutáció MLH1 LOH
p 0,7926 0,5488 0,3071 0,5994
relatív kockázat (RR) >1 <1 >1 >1
1 0,8133
<1 >1
0,4576 0,7583 0,1631 1 0,0604
<1 >1 <1 >1 >1
MLH1 LOH
0,6755
<1
61
MLH1 promóter disztális régió MMR inaktiválás MLH1 LOH MSH2 inaktiválás TP53 mutáció MSH2 inaktiválás MLH1 inaktiválás MLH1 inaktiválás MSH2 inaktiválás MSI MSI
MLH1 LOH TP53 mutáció MLH1 mutáció
0,0070 1 1
>1 <1 <1
MLH1 inaktiválás APC inaktiválás
0,5357 1
>1 >1
APC inaktiválás
0,5360
>1
APC inaktiválás
0,2299
<1
TP53 mutáció
0,2615
<1
TP53 mutáció MLH1 inaktiválás MSH2 inaktiválás
0,4363 0,5986 0,1630
>1 >1 >1
A Dukes-féle stádiumok és a betegek életkorának összefüggése ANOVA teszttel nem bizonyult szignifikánsnak (p=0,058), akkor sem, ha a betegeket nemek szerint is bontottuk (p=0,1808). Egyes stádiumokon belül a férfiak és nők életkor megoszlása közötti különbség sem bizonyult nem-páros t teszttel szignifikánsnak (C stádium p=0,2124, B stádium p=0,4523, az A stádiumú betegek száma alacsony volt a próba elvégzéséhez). A genetikai vizsgálatok eredményeit összehasonlítottuk a Dukes-féle stádiummal, a nemmel és az előfordulással (29. táblázat). A vizsgálatoknál az A és B stádiumú betegek hasonlónak bizonyultak, ezért több esetben összevontan is elvégeztük a számolásokat. A B (illetve az A+B) stádium a rektumdaganatok, míg a C stádium a vastagbéldaganatok között gyakoribb. A B (illetve az A+B) stádium negatívan korrelál az APC és MMR génekben előforduló (összeadott) mutációkkal (külön-külön egyik génben előforduló mutációval sem), és a promóter régiókban (minimum két gén) bekövetkező hipermetilációval. A vastagbéldaganatokban kialakuló tumorokban szignifikánsan gyakrabban (p=0,012) fordult elő a promóter régiókban (minimum két gén) bekövetkező hipermetiláció, a végbéldaganatokban kialakuló tumorokra a metiláció nem volt jellemző. Emellett szintén szignifikáns összefüggést (p=0,0339) találtunk a tumor MSI státusza és a stádium között: C stádiumra volt jellemzőbb az instabilitás.
62
29. táblázat Fisher teszt a stádium, nem, elhelyezkedés és a genetikai eredmények összehasonlítására. (Nem értelmezhető a relatív kockázati eredmény, ha valamely csoportba tartozó személyek száma nulla.) A-B stádium: A kontra B stádium, A+B – C stádium: A és B stádium kontra C stádium.
1. változó A-B stádium B-C stádium A+B - C stádium A-C stádium nem nem B stádiumban nem C stádiumban A-B stádium B-C stádium A-C stádium A+B - C stádium A - B+C stádium A-B stádium B-C stádium A-C stádium A+B - C stádium A - B+C stádium
2. változó elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés minimum két helyen metiláció minimum két helyen metiláció minimum két helyen metiláció minimum két helyen metiláció minimum két helyen metiláció minimum egy helyen metiláció minimum egy helyen metiláció minimum egy helyen metiláció minimum egy helyen metiláció minimum egy helyen metiláció
A-B stádium B-C stádium A+B - C stádium
mutáció a MMR génekben mutáció a MMR génekben mutáció a MMR génekben
A-C stádium A-B stádium B-C stádium A+B - C stádium A-C stádium
mutáció a MMR génekben mutáció az APC génben mutáció az APC génben mutáció az APC génben mutáció az APC génben mutáció a MMR és az APC génekben mutáció a MMR és az APC génekben mutáció a MMR és az APC génekben mutáció a MMR és az APC génekben elhelyezkedés MSI elhelyezkedés elhelyezkedés elhelyezkedés
A-B stádium B-C stádium A+B - C stádium A-C stádium minimum két helyen metiláció minimum két helyen metiláció mutáció a MMR génekben mutáció az APC génben mutáció a MMR és az APC génekben
p 0,6849 1 1 1 0,8065 0,3151 1 0,5800 0,7400 0,6309 1 0,6065 1 1 1 1 1
RR >1 <1 <1 >1 >1 >1 >1 >1 <1 >1 <1 >1 >1 >1 >1 >1 >1 nem 1 értelmezhető 0,6176 <1 0,6369 <1 nem 1 értelmezhető 1 >1 1 >1 1 >1 1 >1 0,6514
>1
0,7858
<1
1
<1
0,6218 0,0120 0,5107 0,6366 0,1437
>1 >1 >1 <1 <1
0,1037
<1
63
A-B stádium B-C stádium A+B - C stádium A-C stádium A+B – C stádium LOH
LOH LOH LOH LOH MSI elhelyezkedés
0,2151 0,8031 0,4717 0,2003 0,0339 0,4677
>1 >1 >1 >1 >1 >1
A Western blot vizsgálattal mért fehérjeexpresszió változása az MLH1 gén inaktiválódásával Fisher teszttel szignifikáns kapcsolatot mutatott (p=0,0122). Az MSH2 gén esetén az expresszió és az inaktiválás nem mutatott szignifikáns kapcsolatot (p=0,07447). A TP53 gén mutációja és a p53 fehérjeexpresszió növekedése sem mutatott szignifikáns kapcsolatot (p=0,0623), de ennek oka lehet a mutációs minták alacsony száma. 4.11. Családvizsgálatok A klasszikus Amszterdam irányelvek (Vasen 1991) alapján sporadikusnak tartott betegek közül egy 25 éves szinkron kolorektális daganatos beteg került kiválasztásra, mivel a daganat korai megjelenése és több daganat együttes előfordulása örökletes daganatra utalt. A beteg egyik tumora a vastagbélben (G3, stage: T3, N0, M0, Dukes’ B2) a másik a végbélben (G3, stage: T2, N1, M0, Dukes’ C1) helyezkedett el. Minden elérhető családtagtól is kaptunk vérmintát (18. ábra). Sem a 28 éves testvérének, sem a szüleinek és azok testvéreinek (50-60 éves korosztály) nem szerepelt az anamnézisében
semmiféle
daganat,
kivéve
az
apai
nagyapát,
akinél
vastagbéldaganatot diagnosztizáltak, de már 80 éves kora fölött. A betegnél elvégeztük az MSI vizsgálatot (19. ábra) és immunhisztokémiát mindkét MMR génjére. MSI-H-nak bizonyult mindkét daganata, és sem aktív MLH1-t sem aktív MSH2-t nem tudtunk fehérje szinten immunhisztokémiával kimutatni (20. ábra).
64
19. ábra A Dukes’ C1 tumor és a vérminta MSI vizsgálata a D2S123 marker esetén. Az extra csúcsok megjelenése nyilakkal jelölt.
20. ábra A Dukes B2 tumor immunhisztokémiai képe. Az A ábrán az mlh1, a B ábrán pedig az msh2 fehérjeexpresszió hiánya látható.
Majd a beteg két tumorából és a véréből származó DNS mintákból MLPA reakciót végeztünk. A vérmintánál és egyik tumoránál sem találtunk nagy deléciót (21. ábra).
65
21. ábra A beteg vérének MLPA képe összehasonlítva egy normál kontrollal. A piros csúcsok a méret standardot jelölik. Eltérés nem tapasztalható.
Ezután meghatároztuk az MLH1 és az MSH2 gén összes exonjában előforduló mutációkat. A betegben két csíravonalas mutációt mutattunk ki: a hMLH1 gén 19-es exonjában egy valin → metionin aminosavcserét a 716. kodonon (p.Val716Met), és a hMSH2 gén 13-as intronjában, egy G>C cserét a 2210+1. nukleotidon (c.2210+1G>C). Ezután a család vérmintáinak vizsgálata következett az adott mutációkra (22. ábra). Az anyánál és egyik testvérénél az MLH1 p.Val716Met mutációt homozigóta formában, míg további három testvérénél és az anyai nagyszülőknél
heterozigóta formában
mutattuk
ki. Az MSH2 splice site
c.2210+1G>C mutációt az apánál, az apa egyik testvérénél és az apai nagymamánál találtuk. Az index személy testvére ugyanazokat a mutációkat hordozta, mint az index személy. A vastgbéldaganatos apai nagyapában ez a mutáció nem volt kimutatható.
66
22. ábra A vizsgált család családfája az örökletes mutációk feltüntetésével. Az index személy két szinkron kialakult kolorektális daganatot hordoz, az index személy testvérénél adenómát mutattak ki. Az apai nagyapa nem hordoz mutációt, ennek ellenére kolorektális daganata van.
67
5. Eredmények megbeszélése 5.1. Sporadikus kolorektális daganatokkal kapcsolatos általános megállapítások A mutáció megléte örökletes daganatok esetén önmagában nem feltétlenül jelenti a tumor kialakulását. Minden mutációnak penetranciája van, azaz a patogén mutáció jelenléte nagyban megnöveli a daganat kialakulásának esélyét a normál populációs kockázathoz képest, de csak bizonyos százalékban hajlamosít a daganat kialakulására. A MMR gének mutációi csak 40-80%-os penetranciával rendelkeznek, azaz a hordozók 40-80%-a válik daganatossá élete során. A férfiak és a nők kockázata eltérő, a férfiakban a mutáció magasabb penetranciával rendelkezik (Mitchell 2002). Ezzel szemben az APC gén penetranciája közel 100%, tehát a hordozó élete során majdnem biztos, hogy daganatossá válik. Örökletes daganat kimutatása esetén a családtagok adott mutációra történő szűrése elvégezhető, és a hordozók folyamatosan nyomonkövethetőek. A szomatikus alapon kialakuló daganatok megjelenése átlagosan 20 évvel később következik be, mint az örökletes daganatok kialakulása és ekkor a betegek életkora többnyire 45-50 év felett van. Minden esetben elsőként diagnosztizálják a daganatot és utána történik a mutációkeresés. A talált mutációra azonban a családtagokat nem érdemes szűrni, hiszen a mutáció feltehetően teljesen egyéni. A vastagbél daganatok a kolorektális daganatok körülbelül kétharmad része. A vizsgálati minták lokalizáció szerint megoszlása: 61% vastagbél- és 39% végbéldaganat. A vizsgálatoknál molekuláris szempontból az A és a B stádiumú betegek hasonlónak bizonyultak, ezért több esetben összevontan kezeltük őket. A rektumdaganatok jellemzően inkább alacsonyabb B (illetve az A+B) stádiumúak voltak, szemben a vastagbéldaganatokkal. Ez az eredmény arra utalhat, hogy a rektumdaganatok kivizsgálása egyszerűbb az elhelyezkedése miatt, ezért hamarabb, korábbi stádiumban kerül a betegség felismerésre, mint a vastagbéldaganatok. A Dukes-féle stádiumok és a betegek életkorának összefüggése nem bizonyult szignifikánsnak (p=0,058), még nemek szerinti bontásban sem (p=0,1808). Egyes stádiumokon belül a férfiak és nők életkor megoszlása sem bizonyult szignifikánsnak (Buyse 2000, Azzoni 2007). Az APC és a MMR gének inaktiválódási mechanizmusa eltér az örökletes és a sporadikus daganatok esetén. Sporadikus daganatokban a nagy, néhány exont érintő deléciók nem fordulnak elő, ehelyett a promóter régióban bekövetkező hipermetiláció 68
jelentős szerepet tölt be a gének inaktiválódása során. A B (illetve az A+B) stádium negatívan korrelál az APC és MMR génekben előforduló (összeadott) mutációkkal, és a promóter régiókban (minimum két gén) bekövetkező hipermetilációval. Ezek alapján azt gondoljuk, hogy ezen gének inaktiválódása korai esemény, később már nem jellemző, hogy újabb inaktiválódási lépés következne be ezekben a génekben. Szignifikáns eltérést (p=0,012) találtunk a tumor elhelyezkedése és a legalább két gén promóterében bekövetkező hipermetiláció között: a vastagbéldaganatokban fordult elő alapvetően a hipermetiláció, a végbéldaganatokra nem volt jellemző (27. táblázat). Tumormintáink közül mindössze hat (9%) bizonyult mucinózusnak (9, 18, 20, 44, 68, 70), ebből öt a vastagbélben és egy a rektumban helyezkedett el. Li és munkatársai (2005) szerint az MSI pozitív proximális daganatok jellemzően mucinózusak, feltehetőleg mintáink szegényes patológiai leírása okozta mucinózus intáink alacsony számát. A tumorok közül négy MSI pozitív volt, amely ugyan nem szignifikáns (p=0,0617), de a mucinózus daganatokban magas százalékban (67%) előforduló instabilitásra utal, az egyik MSS tumor pedig instabilitást mutatott az E2F4 és a BAX génben, összhangban a korábban leírtakkal (Deng 2002). A mucinózus daganatok négy esetben C és két esetben B stádiumúak voltak, amely azt mutatja, hogy a dedifferenciálódás igen előrehaladott ebben a daganattípusban (Yagi 1997, Greenson 2003, Li 2005). Emellett valamely MMR gén allélvesztése is nagyon gyakori volt, négy esetben fordult elő, illetve a metiláció valamely promóter régióban is három tumorban előfordult.
A vastagbél szakaszban előforduló mucinózus
daganatok tehát igen egységes képet mutattak. A rektumban elhelyezkedő tumorban azonban ezeket az eltéréseket nem lehetett megfigyelni. 5.2. Genetikai instabilitás az inter- és intragénikus mikroszatellitákban A
mikroszatellita
instabilitás
igen
gyakori
jelenség
az
örökletes
vastagbéldaganatok bizonyos típusánál. A mikroszatellita instabilitás gyakorisága (30%) a sporadikus daganatok esetében alacsonyabb volt, mint a HNPCC esetén leírt: Johnson és munkatársai szerint HNPCC esetén az MSI 100% (Johnson 2006), Hoedema és munkatársai pedig 75% MSI-t írtak le (Hoedema 2003). A vizsgált 70 sporadikus daganat közül 21 (30%) betegnél találtunk instabilitást (20 alacsony és 1 magas), ellentétben a korábban sporadikus daganatokban leírt 10-20%-kal (Aaltonen 1994, Konishi 1996, Grady 2004, Chaksangchaichot 2007), illetve hasonlóan Halford és munkatársaihoz, akik szintén MSI-L kolorektális betegeket mutattak ki 35%-ban 69
(Halford 2003) (19. táblázat). Valószínűleg az MSI-H daganatok alacsony száma a betegek kiválogatásának szigorú követelményeinek következménye: nem engedtünk meg semmiféle pozitív családi hátteret. Az MSI pozitivitás összefüggést mutatott a Dukes’ stádiummal: a C stádiumban szignifikánsan gyakoribb volt (p=0,0339), mint az A és/vagy B stádiumban. Az MSI pozitivitás nem mutatott semmilyen összefüggést az allélvesztéssel, ellentétben a korábban leírtakkal (Kopper 2002, Li 2003, Trautmann 2006), hasonlóan Camps és munkatársai által leírthoz (Camps 2006), melynek oka lehet, hogy az MSI pozitív csoportok közül főként az MSI-H fenotípus korrellál negatívan az allélvesztéssel, de nálunk MSI-H típusú beteg mindössze egy volt. Az ismétlődő régiókat tartalmazó gének (E2F4 - CAG repeat, TGFβRII – A10 repeat, BAX – G8 repeat) mindössze 19 esetben (27%) mutattak instabilitást, sokkal alacsonyabb százalékban, mint az irodalomban (Boland 2000): 2 esetben a BAX gén, 6 esetben a TGFβRII, 7 esetben az E2F4 gén, és négy esetben (7, 9, 25, 32) kettő együtt (1 esetben az E2F4 és a BAX, egy esetben a BAX és a TGFβRII és két esetben az E2F4 és a TGFβRII) (19. táblázat). A mikroszatellita instabilitás és a ismétlődést hordozó génekben bekövetkező instabilitás eredményeink alapján úgy tűnik, hogy inkább egymást kizáró események, függetlenül attól, hogy a gének esetében a minimum egy vagy a minimum két instabilitást hordozó gént vettük pozitívnak, hasonlatosan Simms és munkatársaihoz (Wicking 1998). Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a kódoló részben bekövetkező változások javítására a sejt nagyobb energiát fordít, mint a nem kódoló részben bekövetkező változásokra. Jass és munkatársai hozzánk hasonlóan az MSS és az MSI-L daganatokban nem találtak TGFβRII és BAX instabilitást, vizsgálataik alapján ezen gének instabilitása az MSI-H fenotípusú dagatokra jellemző (Jass 1999). Öt olyan mintát találtunk, amely legalább az egyik ismétlődést hordozó génre nézve instabil volt és MSI pozitívnak is bizonyult. Ebből három esetben (20, 24, 65) ezek mellett találtunk még MSH2 allélvesztést és MLH1 promóter hipermetilációt is. A másik két mintában vagy csak MLH1 promóter hipermetilációt (69) vagy csak MSH2 allélvesztést (32) találtunk, utóbbi mintában a BAX és a TGFβRII gén is instabil volt. A MMR génekben bekövetkező inaktiválódás oka lehet az instabil fenotípus megjelenésének. Ha a TGFβRII expresszió csökken, a vastagbél
hámsejtjeinek
proliferációját
gátló
mechanizmusa
nem
működik
megfelelően. Az E2F4 sérülése esetén a proliferáció serkentődik és a G1 fázisban a ciklusból való kilépés gátlódik, a BAX gén hibája esetén pedig a p53-függő apoptózis 70
sérül. Lehetséges, hogy sporadikus esetben nem ezek a főbb célgénjei az instabilitásnak, illetve a magas instabilitású csoport eleve ritkább a sporadikus minták között. A kimutatott mutációk mellett minden egyes génben egyéb génvariációk is megjelentek. Három olyan mintát (19, 49, 70) találtunk, amelyekben legalább két neutrális genetikai változás is megjelent, ez szintén jele lehet a genetikai instabilitásnak. A minták közül kettő MSI-L fenotípusú volt, a harmadik pedig az E2F4 génben hordozott instabilitást. Azoknak a betegeknek, akik MSI-H pozitív fenotípust mutattak hosszabb túlélésre van esélyük, mint az MSS vagy az MSI-L fenotípusúaknak, ha nem kapnak 5-fluorouracil vagy egyéb adjuváns kemoterápiát, mivel a kezelés a DNS károsodást tovább növeli (Elsaleh 2000, Watanabe 2001, Ribic 2003). Lamberti és munkatársai (2007) szerint azonban a két dolog között nincs világos összefüggés. Az MSI pozitív tumorok közül a TGFβRII instabil tumorok túlélése a legjobb 5-fluorouracil kezelés esetén (Watanabe 2001), ezzel szemben az MSI pozitív és a BAX génben instabilitást hordozó betegek irinotecan kezelésre adott válasza bizonyult messze a legjobbnak (Fallik 2003). Ezeket az eredményeket megkérdőjelezik Samowitz és munkatársai, akik szerint a TGFβRII vagy a BAX génben instabilitást hordozó tumorok között nincs lényegi különbség (Samowitz 2002), viszont alátámasztják Jung és munkatársai, akik szerint a TGFβRII és a BAX gén instabilitása együttes előfordulásuk esetén MSI pozitív esetekben javítja a túlélést (Jung 2006). Hazánkban ennek vizsgálata és az eredmény felhasználása a kezeléshez még nem épült be a klinikai gyakorlatba. 5.3. A mismatch repair gének inaktivációja A DNS replikáció hűségének megőrzése nagyon fontos, hogy elkerülhessük a gének mutációinak halmozódását. Az MLH1 és az MSH2 poszt-replikációs MMR gének. Funkcióvesztésük megnöveli a spontán mutációk gyakoriságát, amely mutátor fenotípust eredményez. Mivel a MMR gének recesszív típusúak, mindkét allél inaktivációja szükséges a tumorképződéshez. Az inaktivációs esemény lehet allélvesztés, promóter hipermetiláció, vagy mutáció. Legalább az egyik allél szomatikus inaktivációja 35 (50%) esetben következett be (23. ábra). Huszonöt esetben figyeltünk meg az MLH1 génben promóter hipermetilációt (legalább az egyik módszerrel), 3 esetben mutációt és 19 esetben allélvesztést valamely MMR génben. Az MLH1 génben promóter hipermetilációt a betegek 36%71
ban találtunk (26. táblázat), hasonlóan az irodalomhoz (Noda 2005). Hipermetilációt mindkét promóter régióban összesen 7 betegnél tapasztaltunk, a proximális részben 14 (20%) és a disztális részben 18 (26%) minta bizonyult hipermetiláltnak. Különbséget jelenthet, hogy a proximális részben csak a CCGG régiókat tudtuk vizsgálni, és pozitív csak az a minta lett, ahol mind a négy vizsgált CpG sziget metilált volt. A disztális részben a CpG régiók mindegyikét vizsgáltuk, pozitívnak azok a minták bizonyultak, ahol legalább a primer és a próba régióba eső CpG szigetek metiláltak voltak. Mindkét módszer alulbecsülheti azon betegek számát, ahol a gén metilációval inaktiválódik (Kuismanen 2000). Noha Furukawa és munkatársai leírják, hogy a promóter régiónak csak a denz metilációja jelent mRNS expresszió csökkenést (Furukawa 2002). Allélvesztést valamely MMR génben 27%-ban találtunk (19. táblázat), egy esetben mindkét génben előfordult allélvesztés (43. minta). Allélvesztés az MSH2 és a MLH1 génben közel azonos frekvenciában jelentkezett (16% és 13%). Ez az frekvencia az MSI megjelenése miatt alatta maradhat a valós értéknek. Az allélvesztés feltehetőleg egy második lépcső az inaktiválódási mechanizmusban (Tomlinson 2002). Vizsgálataink alapján azt mondhatjuk, hogy az MLH1 promóter hipermetilált mintákban, főként a disztális régióban hipermetilált mintákban, az MLH1 gén allélvesztése szignifikánsan gyakoribb (p=0,007), mint a metiláció negatív mintákban. A proximális régió metiláltságával fordított korrelációt kaptunk. A mutációs esemény kevéssé volt gyakori a mi betegeink között (4%) (22. táblázat). Három szomatikus patogén mutációt sikerült kimutatnunk, hármat az MLH1 és egyet az MSH2 génben. A mutációs esemény a Dukes’ B stádiumban gyakoribb volt, habár ilyen alacsony számnál a statisztikai teszt bizonytalan. Az új mutáció (a p.Arg522Trp (Kamory 2003)) patogenitását valószínűsíti az a tény, hogy a Drosophila-tól kezdve erősen konzervált régióban helyezkedik el, emellett mindhárom konzervitásvizsgálatra használt szoftver patogénnek minősítette (25. táblázat). A p.Lys618Thr (Han 1995) az MLH1 és a p.Gly322Asp (Maliaka 1996, Kurzawski 2002) mutáció az MSH2 génben helyezkedett el. A mutációk mellett kimutattunk hét polimorfizmust is, amelyből négy az MLH1 és három az MSH2 génben helyezkedik el. A polimorfizmusok közül kettő intronikus, igen messze helyezkednek el az exon-intron határtól, ezért feltehetőleg semmiféle hatásuk sincs az expresszióra. A négy exonikus polimorfizmusból három szinonim és egy nem szinonim polimorfizmus volt. A 10 genetikai változat közül három eddig még le nem 72
írt variációt találtunk: egy misszensz mutációt az MLH1 génben, és két szinonim génváltozatot, feltehetőleg polimorfizmust az MSH2 génben (p.Leu279Leu, p.Leu687Leu) (Kamory 2003), hármat a közép-kelet európai régióban írtak le korábban: a p.Gly322Asp mutációt Lengyelországban (Kurzawski 2002) illetve Oroszországban (Maliaka 1996), a c.790+10A>G intronikus polimorfizmust Oroszországban
(Krepelova),
a
c.1668-19A>G
intronikus
polimorfizmust
Lengyelországban (Kurzawski 2002) és a p.Leu653Leu polimorfizmust pedig Szlovákiában (Liu 1998, Bartosova 2003). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a variációk nagy része erre a populációra jellemző. A p.Gly322Asp mutációt más szerzők nem sorolják a patogén mutációk közé, sőt 2%-os populációs gyakoriságát is leírták, így polimorfizmusnak minősítették (Liu 1995). Ezt támasztja alá az aminosav konzervitásának vizsgálata is (24. táblázat), mely szerint az aminosavcsere neutrális. Az MLH1 mutációk mindegyike a PMS1-kötő doménben következett be, az MSH2 mutáció pedig a strukturális integritásért felelős domént érinti. A p.Ile219Val (Liu 1995, Tannergard 1995) és a p.Ala328Ala (Liu 1999) polimorfizmust Svédországban írták le. Mindkét allél inaktivációja csak az MLH1 génben volt megfigyelhető 7 (10%) betegben. Ebből hat esetben a promóter régió hipermetilációja együtt jelentkezett az MLH1 gén allélvesztésével. Egy minta esetében emellett még az MSH2 gén allélvesztése is megfigyelhető volt. Egy esetben pedig az MLH1 gén promóter hipermetilációja mutációval együtt fordul elő. Emellett öt esetben előfordult, hogy a vizsgált két MMR gén egy-egy allélja inaktiválódott. Mind az öt esetben az MSH2 génben
allélvesztés
történt,
négy
esetben
ez
az
MLH1
gén
promóter
hipermetilációjával, egy esetben pedig az MLH1 gén szomatikus patogén mutációjával járt együtt.
73
23. ábra. A MMR gének inaktiválódási mechanizmusai. A kockás szeletek biallélikus inaktiválást jelentenek az MLH1 génben, a csíkos szeletek pedig az MLH1 és az MSH2 gén egy-egy alléljének együttes inaktiválódását jelentik.
Az MLH1 gén inaktivációja esetén a fehérjeexpresszió szintje megváltozik (p=0,0122). Az mlh1 fehérjeexpresszió ugyanannyi esetben nőtt, mint csökkent. Az expressziócsökkenés okának a promóter hipermetiláció tűnik, mivel csendesíti a transzkripciót, míg az expresszió megemelkedésének hátterében az allélvesztés és a mutáció áll. Ennek egyik oka lehet, hogy a fehérjefunkció elvesztése a sejtet további fehérje termelésére serkenti, de hiába nő az expresszió, a mutáns fehérje nem működőképes. Az MSH2 gén esetén az expressziós szint megváltozása nem szignifikáns (p=0,7447). A MMR gének inaktiválása nem mutatott szignifikáns kapcsolatot a tumor MSI státuszával. Ennek egyik oka lehet, hogy más MMR gének, mint a PMS1, a PMS2, az MSH3 és az MSH6 is szerepet játszhat. Egyes szerzők szerint az MSH6 inaktiválódás összefüggést mutat az MSI pozitív fenotípussal (Parc 2000). Az MLH1 gén promóter régiójában bekövetkező hipermetiláció befolyással van a kemoterápiás szerekkel szembeni érzékenységre. A hipermetilált sejtek rezisztensekké válnak az 5-fluorouracil kezelésre, amelyet a vastagbéldaganatok rutinszerű kezelésekor alkalmaznak (Carethers 1999, Arnold 2003). Az 5-fluorouracil 74
kezelés nem javít a beteg állapotán, ellenkezőleg: a DNS károsodást – a MMR rendszer inaktiválódása mellett – tovább növeli. A MMR deficiens sejtek nem érzékenyek a metilációs kemoterápiás szerekre, mint a streptozocin és a temozolomid, vagy a buszulfán, etopozid és doxorubicin, ezzel ellentétben a normális sejtek citotoxicitását okozza (Fink 1998, Claij 1999). A promóter hipermetiláció vizsgálata hazánkban még nem rutinszerűen történik, pozitív eredmény esetén az 5-fluorouracil kezelés ellenjavalt lenne, amely még nem épült be a klinikai gyakorlatba. MLH1 indukció 5-aza-dC-vel egy lehetséges kezelési módja lehet az aberráns metilációt mutató kolorektális daganatoknak. 5.4. Az APC gén inaktivációja Az apc fehérje többek között a sejtek közötti interakciókban játszik szerepet. A sejtadhéziós tulajdonság és ezzel a sejtközötti interakciók elvesztése a sejtnövekedés és a differenciáció feletti kontroll elvesztését eredményezi. A kontroll elvesztése adenómák kialakulását teszi lehetővé. Az inaktivációs esemény hasonlatosan az MLH1 génhez lehet allélvesztés, promóter hipermetiláció, vagy mutáció. Legalább az egyik allél szomatikus inaktivációja 40 esetben (57%) következett be (24. ábra). Huszonegy esetben (30%) figyeltünk meg az APC gén 1A promóterében (amelyről a fő termék átíródása szabályozódik (Jubb 2001)) hipermetilációt (26. táblázat), 15 esetben mutációt és 15 esetben (21%) allélvesztést, Arnold és munkatársai (2004) promóter hipermetilációt hasonló arányban tapasztaltak (28%), allélvesztést pedig kisebb mértékben (10%). A vizsgált promóter régióban a CpG párok mindegyikét vizsgáltuk: pozitívnak azok a minták bizonyultak, ahol legalább a primer és a próba régióba eső CpG párok mindegyike metilált volt. A promóter hipermetilációt a betegek 30%-ban találtunk (24. táblázat), hasonló százalékban, mint MLH1 promóter hipermetilációt. Allélvesztést az APC génben 21%-ban találtunk (19. táblázat). Az allélvesztés feltehetőleg egy második lépcső az inaktiválódási mechanizmusban (Tomlinson 2002). Vizsgálataink alapján azt mondhatjuk, hogy a promóter hipermetiláció és az allélvesztés között nincs statisztikai összefüggés (p=0,7583, RR>1), noha Arnold és munkatársai (2004) szerint az LOH-t mutató minták esetében másfélszer gyakoribb volt a promóter hipermetiláció, mint az LOH-t nem mutató minták esetében.
75
A minták 21%-ban találtunk feltehetőleg patogén APC mutációt (23. táblázat). tekintettel arra, hogy csak az MCR régiót vizsgáltuk, további mutációk is előfordulhatnak más régiókban. Az APC gén mutációs cluster régiójának (Wallis 1999, Fearnhead 2001) vizsgálata során 18 féle változást tapasztaltunk. Ebből szekvenálással 6 misszensz, 3 nonszensz, 7 kereteltolódási mutációt és két polimorfizmus tudtunk kimutatni. A hétféle kereteltolódási mutációból 6 deléciós (2 egybázisos, 1 ötbázisos és 3 féle 11 bázisos) és egy inszerciós mutáció volt. A misszensz mutációk közül a p.Ala1305Gly, a p.Ala1347Val, a p.Met1431Arg, a p.Ser1465Arg vagy a p.Leu1488Phe mutációkat korábban nem írták le. A misszensz mutációk patogenitása a régió konzerváltsága miatt valószínűsíthető, azonban az aminosavcsere
nem
minden
esetben
jelent
patogenitást.
Az
aminosavak
konzervitásának bioinformatikai vizsgálata során ezek közül patogénnek bizonyult a p.Met1431Arg, feltehetőleg patogén a p.Ala1305Gly és a p.Leu1488Phe, feltehetőleg nem patogén a p.Ser1465Arg, és neutrálisnak találtuk a p.Ala1347Val aminosavcserét (24. táblázat). Ezek, valamint a kereteltolódási mutációk (c.3792delA, c.3897del11, c.3915del5, c.4282ins5, c.4464del11, c.4476delC, c.4488del11) lehetséges, hogy erre a populációra jellemzők. Három nonszensz (p.Ser1346Stop, p.Ser1315Stop, p.Gln1328Stop) és egy misszensz (p.Ile1307Lys) mutációt már korábban is leírták (Paul 1993, Laken 1997, Lamlum 1999, Gavert 2002, Sieber 2003, Chen-Shtoyerman 2003, Mihalatos 2005). A p.Gln1328Stop mutáció két mintában fordult elő. A mutációk főként a β-katenin kötő régiót érintik, amely oka a sejtközötti kapcsolatok elvesztésének. A két szinonim polimorfizmusból a gyakoribb (p.Thr1493Thr (Hadjisavvas 2006)) 16 mintában fordult elő, a ritkább (p.Arg1450Arg) pedig 3 mintában. A p.Thr1493Thr polimorfizmus a 27-es mintában homozigóta formában jelentkezett. Mindkét allél inaktivációja 15 esetben (21%) fordult elő, kisebb százalékban az irodalmi értékek (adenóma: 30%, karcinóma: 54%) (Kim 2003). Négy mintában több mutáció is előfordult: a 3-as mintában egy misszensz (p.Ser1465Argpatogenitása bizonytalan) és egy nonszensz mutáció (p.Ser1346Stop), a 8-as mintában egy frameshift (c.4282insccaaa), egy misszensz mutáció (p.Met1431Arg) és egy polimorfizmus
(p.Thr1493Thr),
a
30-as
mintában
két
nonszensz
mutáció
(p.Gln1328Stop, p.Ser1346Stop), a 66-os mintában pedig két nonszensz mutáció (p.Ser1315Stop, p.Gln1328Stop), egy nem szinonim (p.Ala1347Val) és egy szinonim polimorfizmus (p.Thr1493Thr). Promóter hipermetiláció és mutáció 5 esetben (7%) 76
fordult együttesen elő, három esetben delécióval és két esetben misszensz mutációval. Promóter hipermetiláció és allélvesztés öt mintában (7%) jelentkezett, allélvesztés és mutáció pedig egy mintában (1,5%) volt együtt kimutatható.
24. ábra. Az APC gén inaktiválódási mechanizmusai. A csíkos szeletek biallélikus inaktiválást jelentenek az APC génben.
A korábbiakkal (Konishi 1996, Deuter 1996, Thorstensen 2005) ellentétben nem sikerült semmilyen összefüggést kimutatnunk az APC inaktiválás és az MSI státusz között (p=0,7926, RR>1). Az APC inaktiválás és a MMR gén inaktiválás, ezen belül is az MLH1 gén inaktivációja negatív korrelációt mutatott. Az APC mutáció szintén negatívan korrelál az APC allélvesztéssel, együttes előfordulásuk a minták között igen ritka. Ez hasonlóképpen alakult az MLH1 gén esetében is, ahol nem vontunk le messzemenő következtetést, tekintettel az alacsony mutációs mintaszámra. Vizsgálataink alapján az APC mutáció előfordulása 1,2x gyakoribb esemény a rektumdaganatok között, mint a vastagbéldaganatoknál (p=0,1437), hasonlóan a korábban leírtakhoz (1,4x, p=0,148) (De Filippo 2002). A MMR és az APC mutációk együttesen gyakoribbak az A+B stádiumban, mint a C stádiumban, utalva arra, hogy ezen mutációk bekövetkezte korai esemény a daganatok kialakulásában (De Filippo 2002).
77
5.5. Az MTHFR gén és a metiláció Három különböző funkciót ellátó tumorszuppresszorgén promóter régiójának hipermetilációját vizsgáltuk (MLH1, CDKN2A, APC) (26. táblázat). Vizsgálatainkkal leginkább denz metilációt tudtunk kimutatni, amely kissé alulbecsülheti a valódi értéket, noha valószínűleg csak a promóter régió denz metilációja jelent mRNS expresszió csökkenést (Furukawa 2002). A DNS hibajavítást ellátó MLH1 gén promóterének legalább egyik régiójának hipermetilációja összesen 25 (36%), a sejtciklus szabályozó CDKN2A gén promóter hipermetilációja összesen 19 (27%) és az APC tumorszuppresszorgén promóter hipermetilációja összesen 21 (30%) esetben fordult elő, hasonlóan ahhoz, ahogy a gasztrointesztinális daganatoknál korábban leírták (Esteller 2001, Xiong 2001, Esteller 2002). A gének promóter hipermetilációja negatív korrelációt mutatott a tumorok Dukes’ stádiumával, ami arra utal, hogy a hipermetiláció
korai
esemény
a
tumorok
kialakulásában.
Mindhárom
gén
hipermetilációjának együttes előfordulását 7 (10%) mintában tapasztaltuk. Két-két gén hipermetilációja további hat esetben fordult elő. Huszonöt esetben egyáltalán nem történt ilyen módon inaktiválódás. Az MTHFR gén c.677C>T polimorfizmusának tumor és normál mintákon történő vizsgálata során a betegeket hat csoportba soroltuk (20. táblázat). Abban a hét mintában,
ahol
mindhárom
gén
hipermetilációja
együtt
fordult
elő
a
heterozigóta/heterozigóta genotípus 5 mintában a normál/normál genotípus pedig két mintában volt kimutatható. A hat kétszeresen hipermetilált mintában pedig a heterozigóta/heterozigóta genotípus 3 mintában a normál/normál genotípus pedig szintén 3 mintában jelentkezett. Tehát a homozigóta mutáns mintákban a DNS metiláció alacsonyabb volt, amely alacsonyabb rákkockázattal jár. Valószínűleg ezekben az esetekben az enzim alacsonyabb expressziós szintjének megfelelően a metionin koncentráció is alacsonyabb volt, amit a sejt a metiláláshoz fel tudna használni (Stern 2000). A heterozigóta/heterozigóta genotípus nem szignifikánsan (p=0,22), de gyakoribb volt a metilált, mint a nem metilált mintákban (Clarizia 2006). Feltehetőleg az MTHFR gén heterozigóciája nem az egyetlen esemény, amely a hipermetilált genotípus kialakításáért felelőssé tehető, de mindenképpen kapcsolható a hipermetilációhoz. Egy összehasonlító tanulmány szerint a vizsgálatok fele szerint az MTHFR gén heterozigóciája befolyásolja a rákkockázatot, ahogy a mi vizsgálataink is mutatják, míg más tanulmányok szerint nem (Hubner 2007). A hipermetiláció ugyanakkor az elérhető metilcsoport forrásoktól is függ (pl. táplálékkal bevitt 78
metionin), és a sejtek folsav koncentrációja is befolyásolja az MTHFR működését (Stern 2000, de Vogel 2006). Alacsony folsav koncentráció és az MTHFR polimorfizmus jelenléte egyes szerzők szerint magas rákkockázatot jelent, míg magas folsavszinttel ugyanez a genotípus nem jelent emelkedett kockázatot (Ueland 2001), tehát
a
genotípusvizsgálat
után
a
folsavszint
szabályozása
hatékony
kockázatcsökkentő lépés lehet. A hagyományos (homozigóta normál, heterozigóta és homozigóta mutáns) csoportok mellett megfigyelhettük, hogy hét betegben a normálhoz képest a tumor genotípusa megváltozott. Lehetséges, hogy abban az öt mintában (7%), ahol a normál minta C/T genotípusából a tumoros szövetben C/C genotípust mutattunk ki, ott valójában nem a mutáció visszaalakulása, hanem a T allél elvesztése történt és a tumor minták nem C/C homozigóták, hanem C/- hemizigóták lettek. Az allélvesztés jelenségét MTHFR génben mások is leírták: a T allél elvesztését 16 illetve 12%-ban (Pereira 1999, Ryan 2001). Ebben a csoportban az MSI pozitív minták száma magas (négy, és egy minta pedig TGFβRII instabil), emellett az APC gén valamely inaktiválása is jellemző: 2 mintában APC LOH, 1 mintában APC metiláció, 1 mintában APC mutáció, 1 mintában APC LOH és APC mutáció, 1 mintában APC LOH és APC metiláció és 1 mintában APC metiláció és APC mutáció. A hét mintából öt Dukes’ C stádiumú. A csoport kialakulása feltehetőleg a genom általános instabilitásának tulajdonítható, amelyre utal a késői stádium is. Egyes szerzők szerint (Iacopetta 2006, Goel 2007) a promóter régiók hipermetilációja és az MSI pozitivitás negatívan korrelál, mi azonban, hasonlóan más szerzőkhöz (Yamashita 2003, Anacleto 2005) nem találtunk a két esemény között semmilyen összefüggést sem az egyszeresen (p=1, RR>1), sem a kétszeresen (p=0,5107, RR>1), sem a háromszorosan (p=0,421, RR>1) hipermetilált minták esetén. 5.6. A sejtciklus alapvető szabályozásában bekövetkező változások A protoonkogének közül a K-RAS mutációja állandó proliferációs jelet aktivál, mivel a fehérje aktiválódás után többé nem képes inaktiválódni, nem képes elengedni a GTP-t és így állandó proliferációs jelet küld a magba. Az onkogén proliferációt serkentő hatása domináns módon érvényesül. K-RAS mutációt a 12-es kodonban hat betegnél (9%) sikerült kimutatnunk, amely alacsonyabb az irodalomban eddig leírtnál (Bos 1987, Caligo 2000, Oliveira 2004, Calistri 2006, Chang 2006, 79
Oliveira 2007). Ennek oka feltehetőleg az, hogy mi kizárólag az 1. exont vizsgáltuk. Kétféle misszensz mutációt sikerült kimutatnunk, amely mindkettő igen gyakori: a p.Gly12Val mutációt négy betegben és a p.Gly12Asp mutációt két betegben (Kopreski 1997, Andreyev 1998, Kampman 2000) (24. táblázat). A 13-as kodonban nem találtunk mutációt. A K-RAS mutációt hordozó tumorok közül négy a rektumban helyezkedett el, amely kapcsoltság erős, de nem szignifikáns (az alacsony mintaszám miatt nem is várható szignifikancia), ellentétben Frattini eredményeivel (Frattini 2004). A hat beteg közül egy Dukes’ A, négy Dukes’ B és egy Dukes’ C stádiumú volt, amely arra utal, hogy a K-RAS mutáció a tumorprogresszió igen korai eseménye, megelőzve ezzel az APC vagy a MMR gének inaktiválódását. Erre utal tovább az is, hogy mind a hat betegben további mutációkat sikerült kimutatni: három beteg MSI pozitív volt, ebből egynél az APC gén allélvesztését és az MLH1 gén mutációját és promóter hipermetilációját, egynél az APC gén mutációját és promóter hipermetilációját, és egynél az MLH1 gén allélvesztését sikerült kimutatni; a további betegek közül egynél mindhárom gén promóter régiója hipermetilált volt, egynél az APC gén promóter hipermetilációja mellett az MLH1 és az APC gén allélvesztése volt megfigyelhető, egynél pedig a CDKN2A gén promóter hipermetilációja mellett az APC gén mutációját találtuk. Látható tehát, hogy a K-RAS mutáció mind az APC mind az MLH1 gén inaktiválódásával együtt fordul elő, egyikkel sem függ össze szignifikánsan (p=0,2278, p=0,4221) és a társuló inaktiválódási lehetőségek közül is főként a promóter régió hipermetiláció jellemző. A k-ras útvonal gátlása egyes szerzők szerint vastagbéldaganatok hatékony terápiája lehetne, az inaktiválás egyik lehetséges módja pedig az antisense oligonukleotidok (siRNS) használata (Adjei 2001). A tumorszuppresszorok közül a legsokoldalúbb szerepet betöltő a TP53 gén, egyben sejtproliferáció gátló és szükség esetén apoptózis indukáló is. Mi a gén mutációs forró pontjait vizsgáltuk és mindössze három misszensz mutációt sikerült kimutatnunk egy-egy betegben a szekvenciaspecifikus DNS kötő doménben, amelyek igen gyakoriak más populációkban is (21. táblázat): p.Arg175His (McIntyre 1994, Makino 2000, Dong 2001, Colomer 2003), p.Gly266Arg (Heide 1997, Rosty 2003) és p.Arg273Cys (Eeles 1993, Hamelin 1994, Rosty 2001). Más szerzők ennél magasabb arányban írtak le mutációkat (Calistri 2006, Chang 2006), noha nem vizsgáltak nagyobb régiót. Az inaktiváció által érintett három beteg közül egy B és kettő C stádiumú, amely azt mutatja, hogy a K-RAS mutációhoz képest későbbi esemény a 80
TP53 inaktiválódás. Mindegyik beteg hordozott további mutációt is: két betegben (8, 31) APC mutációt sikerült kimutatnunk, és emellett a 8-as betegben még MSH2 allélvesztést, a 31-es betegben pedig APC promóter régió hipermetilációt; a 61-es betegben pedig CDKN2A promóter hipermetilációt. Eredményeink alapján azt feltételezzük, hogy a TP53 inaktiváció megelőzi az APC és a MMR gének inaktivációját, és jellemzően az APC inaktiválódással van összefüggésben, noha ez az összefüggés nem szignifikáns. A MMR gének közül az MSH2 allélvesztés nagyobb számban fordul elő TP53 inaktivációval, ellenben az MLH1 inaktiválódással a TP53 inaktiválódás fordítottan korrelál. A TP53 mutáció betegeink között soha nem fordult elő együtt K-RAS mutációval, de ez az esetek alacsony számának is tulajdonítható. Eredményeink szerint a TP53 inaktiválás fordítottan korrelál az MSI-vel, hasonlóan más szerzők eredményeihez (Cottu 1996, Deuter 1996), amely azt mutatja, hogy feltételezhetően külön inaktivációs útvonalon helyezkednek el. Az elsődleges vagy gatekeeper tumorszuppresszorok közül a proliferáció szabályozásáért felelős CDKN2A gén promóter hipermetilációját vizsgáltuk. Tizenkilenc esetben (27%) figyeltünk meg a promóter hipermetilációt (26. táblázat), hasonló százalékban, mint MLH1 vagy APC promóter hipermetilációt, amely kissé alatta marad az irodalmi értékeknek (Wong 1997, Esteller 2001b, Esteller 2001c). A vizsgált promóter régióban a CCGG régiók mindegyikét vizsgáltuk, pozitívnak azok a minták bizonyultak, ahol mindegyik ilyen CpG sziget metilált volt. A p16CDKN2A fehérje az Rb-E2F útvonalon direkt módon a sejtproliferáció antagonistája, expressziójának hiánya kontrollálatlan sejtnövekedéshez vezet. Vizsgálataink alapján a CDKN2A és a K-RAS inaktiválás független események (p=0,6596), és mindkettő rövidebb túlélést eredményez (Esteller 2001b). A harmadlagos vagy landscaper tumorszuppresszorok családjába tartozó SMAD4 (vagy DPC4) inaktivációja esetén a TGFβ szignalizáció, amely a sejtnövekedést és a differenciációt szabályozza zavart szenved. A gén mutációs forró pontjait, a 2., 8. és 11. exont vizsgáltuk (Takagi 1996, Schutte 1996, Hahn 1998, Yakicier 1999), amely alulbecsülheti a valós mutációs mintaszámot. A 70 mintában összesen egy mutációt találtunk a 8-as exonban: p.351insGlyVal, amely egy in frame inszerció (24. táblázat). Ugyanebben a mintában a TGFβRII instabil volt, ami feltehetőleg még inkább hozzájárult a sejtproliferáció korlátlan beindításához. Ebben a mintában az MSH2 gén mutációja és az APC gén allélvesztése is megfigyelhető
81
volt, amely utóbbi esemény az irodalom szerint gyakran kapcsolt a SMAD4 mutációhoz (Takaku 1998). 5.7. A családvizsgálat következtetései A
vizsgálataink
során
Amszterdam
vagy
kiterjesztett
Amszterdam
kritériumoknak nem megfelelő, de a Bethesda kritériumoknak megfelelő beteget sikerült kiszűrnünk. A Bethesda kritériumok a legkevésbé szigorú irányelvek, és sok, változatos klinikai háttérrel rendelkező betegre ráillenek. Ezeket a HNPCC-s betegeket csak ezekkel a kritériumokkal lehet kiszűrni. Elsőként ezeknél a betegeknél az MSI analízist kell elvégezni, majd ha indokolt, következhet a MMR gének vizsgálata (Raedle 2001). Betegünkben mindkét tumor MSI-H státuszú volt, az öt vizsgált markerből négy instabilitást mutatott. A két tumornál megjelenő extra allélek különböző méretei két függetlenül kialakuló szinkron fejlődő elsődleges tumort mutatnak. Az immunhisztokémiai vizsgálat nem helyettesítheti az MSI analízist (Wahlberg 2002), de megmutathatja, hogy mely MMR gén hordoz várhatóan mutációt (Hendriks 2003). Az immunhisztokémia eredményei egybevágtak az MSI eredménnyel: mindkét tumorban mindkét génnek abnormális volt a fehérjeexpressziója. Ez a két vizsgálat azt mutatta, hogy feltehetőleg mindkét MMR gén hordoz valamiféle genetikai változást, és a betegnek valóban HNPCC szindrómája van. MLH1 promóter hipermetilációt nem sikerült kimutatnunk, noha bizonyos szerzők szerint nincs összefüggés MSI-H HNPCC tumorok klinikai tulajdonságai és a metilációs státusz között (Raedle 2001, Raut 2004). A beteg két örökletes genetikai eltérést hordozott: p.Val716Met a hMLH1 génben és c.2210+1G>C a hMSH2 génben. A 716-os aminosav evolúciósan konzervált, noha vizsgálataink alapján mindegyik szoftver neutrálisnak minősítette az aminosavcserét (25. táblázat). A p.Val716Met mutációt egyes szerzők lehetséges betegség okozó patogén mutációként azonosították (Hutter 1998), mások pedig polimorfizmusnak, vagy patogenitás szempontjából nem besorolható mutációnak minősítették (Cederquist 2004). Betegünk családjában a beteg édesanyja és egyik testvére homozigóta formában, míg másik három testvére és az anyai nagyszülők heterozigóta formában hordozzák ezt a mutációt, és a mai napig nem rákosak. A Myriad Genetics laboratóriuma ezt a génváltozatot 1%-ban a normál kontrol személyekben is megtalálta (A.M. Deffenbaugh és L.A. Burbidge, személyes kommunikáció), ahogy Cederquis és 82
munkatársai is leírták (Cederquist 2004). Ezek alapján ritka polimorfizmusnak gondoljuk, amely esetleg hozzájárulhat más mutációk negatív hatásához. Jelenléte önmagában nem elégséges a tumor kialakulásához. A polimorfizmus gyanúját megerősíti az is, hogy a homozigóta személyek hatvan éves korukig nem lettek rákosak. A másik mutáció a c.2210+1G>C az MSH2 génben, amit korábban egy lengyel HNPCC-s családnál már leírtak (Kurzawski 2002). Ez a mutáció a 13-as exon delécióját okozza, amely az olvasási keret eltolódását eredményezi, mivel a mutáció az exon-intron határon lévő hasítási helyet érinti. Ezt a mutációt heterozigóta formában megtaláltuk az apában, az apa egyik testvérében és az apai nagymamában, akik mindmáig nem betegedtek meg. Még közepes penetrancia mellett is ezen személyek közül statisztikailag kell lennie még megbetegedésnek, vagy a mutáció önmagában nem elégséges feltétele a daganat kialakulásának. Úgy véljük, hogy a c.2210+1G>C patogén mutáció a p.Val716Met polimorfizmussal együttesen okozhatták a tumor korai kialakulását. Az apai nagyapa kolorektális daganata 80 éves kora felett alakult ki, noha ő nem hordozta a c.2210+1G>C mutációt. A késői életkor és a nem hordozó státusz azt mutatja, hogy az ő daganata szomatikus mutációk következménye volt. A beteg 28 éves testvére ugyanazokat a genetikai változásokat hordozta, ezért klinikai vizsgálatot javasoltunk. Ennek eredményeképpen a vastagbelében adenómát találtak, ami a tumorprogresszió egy korai lépése lehet, és mindenképpen követést igényel. Vizsgálataink azt mutatták, hogy az Amszterdam kritériumok kizárnak családi háttérrel nem rendelkező betegeket (Kim 2004), noha bizonyos klinikai tulajdonságok jelenléte elégséges ahhoz, hogy MSI-H státuszú betegeket azonosítsunk, akikről további vizsgálatokkal belátható, hogy HNPCC szindrómát hordoznak (Kamory 2006). 5.8. Inaktivációs útvonalak Vizsgálataink alapján a sporadikus kolorektális daganatokban kétféle alapvető inaktivációs útvonalat különítettünk el (25. ábra). Véleményünk szerint az első esemény a korábban leírtakkal szemben (Söreide 2006), még mielőtt a két útvonal szétválik, a K-RAS onkogénben előforduló mutáció, amely már korai (akár Dukes’ A) stádiumban is kimutatható. Ezt támasztja alá az a tény, hogy minden K-RAS mutációt hordozó betegben más génben is sikerült mutációt vagy egyéb géninaktivációt kimutatnunk, amelyek az APC és a MMR géneket is érintették. Ezt követi a promóter 83
régiókban bekövetkező hipermetiláció. Hét betegben mind a három vizsgált gén promóterében sikerült hipermetilációt kimutatni. Ekkor válik el a két inaktivációs útvonal, attól függően, hogy csak az APC vagy csak az MLH1 gén promóterében következik be hipermetiláció. A CDKN2A inaktiváció véleményünk szerint független esemény, mindkét útvonalba tartozhat ilyen minta. Az első, vagy szuppresszor útvonalban tehát az APC promóter hipermetiláció a kezdő esemény, majd párhuzamosan történik az APC gén allélvesztése és/vagy mutációja, és a TP53 gén mutációja. Feltehetően ez utóbbi közvetlenül a promóter régió hipermetilációja után következik. Ez után a korábban leírtakkal összhangban (Ilyas 2000) következik a SMAD4 gén inaktivációja, amelyet további gének (TGFβRII, MTHFR) mutációja követi. Az MTHFR gén c.677C>T heterozigóta állapota elősegíti a metilációt, de a tumorban bekövetkező mutáció már későbbi esemény. Mindegyik általunk vizsgált mintában előfordult APC inaktiváció, ezért erre az útvonalra helyeztük, de feltehetően ez az esemény már a genom általános instabilitásának magas fokával magyarázható, ezért mindkét útvonal késői lépése is lehet. A mutátor útvonal kezdő lépése az MLH1 gén promóter régiójának hipermetilációja. Erre az útvonalra nem jellemző a TP53 gén inaktivációja. Feltehetően a promóter hipermetilációt követő esemény a MMR gének allélvesztése, mivel vizsgálataink alapján azt találtuk, hogy a promóter régió disztális részében hipermetilált mintákban
az allélvesztés szignifikánsan gyakoribb, tehát ez a két
esemény feltehetőleg időben nem egyszerre játszódik le. Ezzel egyidőben bekövetkező esemény a MMR génekben bekövetkező mutáció. A biallélikus vagy mindkét (MLH1, MSH2) génben bekövetkező inaktiválás után, tekintve, hogy a javító rendszer károsodott, az inter- és intragénikus
mikroszatellita ismétlődésekben
következik be változás, a genomi instabilitás megnő. Ez bizonyos mikroszatellitákat tartalmazó gének károsodását okozza (pl. TGFβRII, BAX, E2F4). Végezetül a genom egész területén károsodások lépnek fel, és a géneken belül is megnő a génváltozatok száma. Mindkét útvonal egy onkogén aktiválódásával indul, majd az első- és másodlagos szuppresszorgének inaktiválódnak, és a sejtciklus kontrollálatlanná válik, tumoros sejtnövekedés indul be. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy tumormintáink közül 16 (23%) a szuppresszor útvonalon (másnéven kromoszóma instabilitás útvonalon (Haydon 2002)) alakult ki és 24 (34%) a mutátor útvonalat követte (másnéven hipermutabilitási útvonalat vagy mikroszatellita instabilitás 84
útvonalat (Boland 2000, Yamada 2003, Li 2005, Yu 2006)). Tizennyolc (26%) mintáról már nem lehet eldönteni melyik útvonalon haladt, az inaktiválódási események nagy száma miatt, és 4 minta, mindegyik A vagy B stádiumú, a metilációs inaktiválódást követte, amely még lehetséges, hogy később valamelyik útvonalon halad tovább. Nyolc tumormintánál (11%) nem sikerült semmilyen genetikai változást kimutatnunk, ennek oka feltételezhetően egyéb, általunk nem vizsgált gének (akár egyéb MMR gének, vagy más tumorszuppresszorgének) érintettsége. Eredményeink alapján a szuppresszor és a mutátor útvonal jelentősen, közel szignifikánsan (p=0,0771, RR<1) elkülönül.
25. ábra A szuppresszor és mutátor útvonalak.
5.9. A dolgozat eredményeinek rövid összefoglalása A sporadikus daganatok kiválasztásához az örökletes szempontból kevésbé szigorú Bethesda kritériumokat javasoljuk, így a sporadikus esetek szigorúbban elkülönülnek. Eddig fel nem ismert örökletes esetekre is fény derülhet, noha az örökletes daganatok kiválasztására inkább az Amszterdam kritériumokat javasoljuk tekintve, hogy a Bethesda kritériumokra alapozva nagy költséggel és munkával
85
nagyszámú negatív esetet is meg kellene vizsgálnunk. Sporadikus daganataink vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a Dukes’ A és B stádiumú minták hasonlóak, ezért sok esetben összevontan kezeltük őket. A célkitűzésekben megfogalmazott kutatási program során nyert eredményeink a következőkben foglalhatók össze: 1.
Mikroszatellita instabilitást 21 betegnél (30%) sikerült kimutatnunk, de ebből 20 beteg az MSI-L fenotípusba tartozott. Az MSI-H betegek alacsony száma a betegszelekció nagyon szigorú követelményeinek következménye: nem engedtünk meg semmiféle pozitív családi hátteret. Szignifikáns
összefüggést
találtunk
az
MSI
megjelenése
és
a
stádiumbesorolás között, mely alapján elmondhatjuk, hogy az MSI késői esemény a tumorprogresszió során. 2.
Kimutattuk, hogy sporadikus kolorektális daganatok esetén az MLH1 gén legfőbb inkativálási mechanizmusa a promóter hipermetiláció (36%). A promóter disztális régiójában hipermetilált mintákban az allélvesztés szignifikánsan gyakoribb. A hazai populációban a sporadikus mintákban a MMR gének szomatikus mutációja viszonylag ritka (4%), és nem fordul elő allélvesztéssel együtt. Hét betegben (10%) találtunk biallélikus inaktiválást az MLH1 génben, és további öt betegben (7%) pedig MLH1 és MSH2 együttes inkativálódást. Az MLH1 gén inaktivációjával az expressziós
szint
is
változik:
metilációs
inaktiválással
csökken,
allélvesztés és mutáció esetén pedig nő. Az msh2 expresszióváltozás nem szignifikáns. 3. Vizsgálataink alapján az APC gén inaktiválódása negatívan korrelál a MMR gének (főként az MLH1 gén) inaktiválódásával. Az inaktiválódási mechanizmusok közül, csakúgy mint az MLH1 gén esetében, a leggyakoribb a promóter hipermetiláció (30%), az allélvesztés és a mutáció előfordulási gyakorisága megegyezik (21%). Az APC promóter hipermetiláció korai esemény, és az allélvesztéssel valamint a mutációs inaktiválással negatívan korrelál csakúgy, mint az MLH1 gén esetén. Az APC misszensz, deléciós és inszerciós mutációk igen gyakoriak, és a
86
rektumdaganatokra jellemzőbbek. Tizenöt esetben (21%) találtunk biallélikus inaktiválást az APC génben. 4. A mikroszatellita régiókat tartalmazó génekben (TGFβRII, BAX, E2F4) megjelenő instabilitás negatív korrelációt mutatott az MSI fenotípussal, amelyből arra következtettünk, hogy a sejt még az intergénikus instabilitás megjelenésének esetén is energiát fektet az intragénikus hibák kijavításába, ezáltal az ismétlődéseket hordozó gének instabilitását későbbi eseménynek feltételezzük. Emellett feltételezhető, hogy inkább az MSI-H fenotípussal mutat összefüggést, kellően sok intergénikus hiba után már megjelennek az intragénikus hibák is. 5.
Eredményeink alapján a K-RAS onkogén 12. kodonon bekövetkező mutációjával járó aktivációja a tumorprogresszió korai eseménye, és mind az APC, mind a MMR gének inaktiválódásával együtt fordul elő. A TP53 gén inaktivációja negatívan korrelál a MMR gének inaktivációjával és pozitívan az APC gén inaktivációval.
6.
Eredményeink alapján a promóter régió hipermetilációja korai esemény a tumorprogresszióban, amely szignifikánsan gyakoribb a vastagbélben, mint a rektumban. Hét betegnél (10%) mindhárom vizsgált génben (MLH1, CDKN2A, APC), további hat betegnél (9%) pedig két génben promóter hipermetilációt találtunk. Az MTHFR homozigóta mutáns mintákban nem fordult elő hipermetiláció, a heterozigóta mintákban a normálhoz képest gyakoribb volt a promóter hipermetiláció, de ez az összefüggés nem bizonyult szignifikánsnak, így feltételezzük, hogy egyéb gének is részt vesznek a metilációban. Az MTHFR gén hét tumorban mutálódott, ezek a betegek erősen instabil genotípust és APC inaktiválódást hordoztak.
7.
Vizsgálataink alapján úgy gondoljuk, hogy a K-RAS onkogén aktiválódása korai esemény a sporadikus kolorektális daganatok kialakulásában.
Ezt
követi
a
promóter
génekben
bekövetkező
hipermetiláció, melynek során a szuppresszor és a mutátor útvonal 87
szétválik. A szuppresszor útvonal kezdő eseményét, az APC promóter hipermetilációt a TP53 gén inaktiválódása, majd az APC génben bekövetkező allélvesztés vagy mutáció követi. Ezután történik a SMAD4 gén inaktiválódása, majd késői eseményként egyéb gének (TGFβRII, MTHFR) mutációja következik. A mutátor útvonalon a kezdő eseményt, az MLH1 promóter hipermetilációját a MMR génekben bekövetkező allélvesztés vagy mutáció követi. Ennek eredményeképpen elsőként az intergénikus majd az intragénikus mikroszatellita régiókban keletkezik instabilitás. Késői eseményként a legkülönfélébb génekben a génvariációk felhalmozódnak.
Mindkét
útvonal
végül
a
genom
általános
instabilitásához vezet. Eredményeink alapján a két útvonal közel szignifikánsan (p=0,0771) elkülönül. Vizsgálataink során sikerült közelebbről megismerni a hazai populációban a sporadikus kolorektális daganatokban bekövetkező inaktiválódási mechanizmusokat és a daganatok kialakulásának eltérő útvonalait. Eredményeink jó alapot adnak az ezirányú kutatások folytatására, melynek során közelebb juthatunk a kolorektális daganatok különbségeinek megértéséhez, és talán a hatékonyabb kezeléséhez is, mivel a mutátor útvonalon haladó tumoros betegeknek nagyobb esélyük van a túlélésre a másik csoporthoz képest, ha nem kapnak kemoterápiát (főként 5fluorouracil kezelést).
88
6. Köszönetnyilvánítás Köszönettel
tartozom
témavezetőmnek,
Dr.
Csuka
Orsolyának,
aki
kiválasztotta számomra ezt az izgalmas témát, és lehetővé tette számomra, hogy modern módszerekkel kutathassak. Köszönet illeti a munkatársaimat, Olasz Juditot, Kolacsek Orsolyát és Dr. Papp Jánost, amiért szakmai megbeszélések során hasznos tanácsokkal és ötletekkel láttak el. Köszönet illeti Farkas Szilvia, Papp Gabriella és Szőke Gabriella asszisztenseket pótolhatatlan segítségükért. Köszönetet szeretnék mondani az Országos Onkológiai Intézet Sebészeti valamint Patológiai Osztályán dolgozóknak, akik a minták gyűjtésében voltak a segítségemre. Köszönettel tartozom Dr. Tóth Lászlónak a Debreceni Egyetem Patológiai Osztályáról, aki az immunhisztokémiai vizsgálatot elvégezte számomra. Végül, de nem utolsó sorban ez a munka soha nem jött volna létre férjem és szüleim biztatása és szeretetteljes támogatása nélkül.
89
7. Irodalomjegyzék 1. Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin JP, Jarvinen H, Powell SM, Jen J, Hamilton SR, Petersen GM, Kinzler KW, Vogelstein B.
Clues
to
the
pathogenesis
of
familial
colorectal
cancer.
Science.
1993;260(5109):812-816. 2. Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP, Jarvinen H, Jass JR, Green JS, Lynch HT, Watson P, Tallqvist G, Juhola M, Sistonen P, Hamilton SR, Kinzler KW, Vogelstein B, de la Chapelle A. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients.Cancer Res. 1994;54(7):16451648. 3. Adjei AA. Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J Natl Cancer Inst. 2001;93(14):1062-1074. 4. Ainsworth PJ, Koscinski D, Fraser BP, Stuart JA. Family cancer histories predictive of a high risk of hereditary non-polyposis colorectal cancer associate significantly with a genomic rearrangement in hMSH2 or hMLH1. Clin Genet. 2004;66(3):183-188. 5. Akiyama Y, Iwanaga R, Saitoh K, Shiba K, Ushio K, Ikeda E, Iwama T, Nomizu T, Yuasa Y. Transforming growth factor beta type II receptor gene mutations in adenomas from hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology. 1997;112(1):33-39. 6. Altman R, Sarg MJ: A rákbetegségek lexikona, Corvina Kiadó, 1996. 7. Anacleto C, Leopoldino AM, Rossi B, Soares FA, Lopes A, Rocha JC, Caballero O, Camargo AA, Simpson AJ, Pena SD. Colorectal cancer "methylator phenotype": fact or artifact? Neoplasia. 2005;7(4):331-335.
90
8. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, Oates JR, Clarke PA. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the multicenter "RASCAL" study. J Natl Cancer Inst. 1998;90(9):675-684. 9. Arnold CN, Goel A, Boland CR. Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5-fluorouracil in colorectal cancer cell lines. Int J Cancer. 2003;106(1):66-73. 10. Arnold CN, Goel A, Niedzwiecki D, Dowell JM, Wasserman L, Compton C, Mayer RJ, Bertagnolli MM, Boland CR. APC promoter hypermethylation contributes to the loss of APC expression in colorectal cancers with allelic loss on 5q. Cancer Biol Ther. 2004;3(10):960-964. 11. Azzoni C, Bottarelli L, Campanini N, Di Cola G, Bader G, Mazzeo A, Salvemini C, Morari S, Di Mauro D, Donadei E, Roncoroni L, Bordi C, Sarli L. Distinct molecular patterns based on proximal and distal sporadic colorectal cancer: arguments for different mechanisms in the tumorigenesis. Int J Colorectal Dis. 2007;22(2):115126. 12. Baker SJ, Fearon ER, Nigro JM, Hamilton SR, Preisinger AC, Jessup JM, vanTuinen P, Ledbetter DH, Barker DF, Nakamura Y, White R, Vogelstein B. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science. 1989;244(4901):217-221. 13. Bartosova Z, Fridrichova I, Bujalkova M, Wolf B, Ilencikova D, Krizan P, Hlavcak P, Palaj J, Lukac L, Lukacova M, Boor A, Haider R, Jiricny J, NystromLahti M, Marra G. Novel MLH1 and MSH2 germline mutations in the first HNPCC families identified in Slovakia. Hum Mutat. 2003;21(4):449. 14. Beck NE, Tomlinson IP, Homfray T, Frayling I, Hodgson SV, Harocopos C, Bodmer WF. Use of SSCP analysis to identify germline mutations in HNPCC families fulfilling the Amsterdam criteria. Hum Genet. 1997;99(2):219-224.
91
15. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998;58(22):5248-5257. 16. Boland CR. Molecular genetics of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Ann N Y Acad Sci. 2000;910:50-59; discussion 59-61. 17. Bos JL, Fearon ER, Hamilton SR, Verlaan-de Vries M, van Boom JH, van der Eb AJ, Vogelstein B. Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature. 1987;327(6120):293-297. 18. Bunyan DJ, Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, Duncan PJ, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cross NC. Dosage analysis of cancer predisposition genes by multiplex ligation-dependent probe amplification. Br J Cancer. 2004;91(6):1155-1159. 19. Byers T, Levin B, Rothenberger D, Dodd GD, Smith RA. American Cancer Society guidelines for screening and surveillance for early detection of colorectal polyps and cancer: update 1997. American Cancer Society Detection and Treatment Advisory Group on Colorectal Cancer. CA Cancer J Clin. 1997;47(3):154-160. 20. Caetano-Anolles G, Gresshoff PM. Staining nucleid acids with silver: An alternative to radioisotopic and fluorescent labeling. Promega Notes Magazine. 1994;45:13. 21. Caligo MA, Ghimenti C, Sensi E, Marchetti A, Bertacca G, Giulianotti PG, Fornaciari G, Bevilacqua G. Microsatellite alterations and K-ras, TGFbetaRII, IGFRII and bax mutations in sporadic cancers of the gastrointestinal tract. Oncol Rep. 2000;7(6):1371-1375.
92
22. Calistri D, Rengucci C, Seymour I, Leonardi E, Truini M, Malacarne D, Castagnola P, Giaretti W. KRAS, p53 and BRAF gene mutations and aneuploidy in sporadic colorectal cancer progression. Cell Oncol. 2006;28(4):161-166. 23. Camps J, Armengol G, del Rey J, Lozano JJ, Vauhkonen H, Prat E, Egozcue J, Sumoy L, Knuutila S, Miro R. Genome-wide differences between microsatellite stable and unstable colorectal tumors. Carcinogenesis. 2006;27(3):419-428. 24. Carethers JM, Chauhan DP, Fink D, Nebel S, Bresalier RS, Howell SB, Boland CR. Mismatch repair proficiency and in vitro response to 5-fluorouracil. Gastroenterology. 1999;117(1):123-131. 25. Castellvi-Bel S, Castells A, Strunk M, Ferrandez A, Piazuelo E, Mila M, Pinol V, Rodriguez-Moranta F, Andreu M, Lanas A, Pique JM; Gastrointestinal Oncology Group of the Spanish Gastroenterological Association. Genomic rearrangements in MSH2 and MLH1 are rare mutational events in Spanish patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cancer Lett. 2005;225(1):93-98. 26. Cederquist K, Emanuelsson M, Goransson I, Holinski-Feder E, Muller-Koch Y, Golovleva I, Gronberg H. Mutation analysis of the MLH1, MSH2 and MSH6 genes in patients with double primary cancers of the colorectum and the endometrium: a population-based study in northern Sweden. Int J Cancer. 2004;109(3):370-376. 27. Chaksangchaichot P, Punyarit P, Petmitr S. Novel hMSH2, hMSH6 and hMLH1 gene mutations and microsatellite instability in sporadic colorectal cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 2007;133(1):65-70. 28. Chan TL, Yuen ST, Kong CK, Chan YW, Chan AS, Ng WF, Tsui WY, Lo MW, Tam WY, Li VS, Leung SY. Heritable germline epimutation of MSH2 in a family with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 2006;38(10):1178-1183. 29. Chang SC, Lin JK, Yang SH, Wang HS, Li AF, Chi CW. Relationship between genetic alterations and prognosis in sporadic colorectal cancer. Int J Cancer. 2006;118(7):1721-1727. 93
30. Chen J, Giovannucci E, Kelsey K, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA, Spiegelman D, Willett WC, Hunter DJ. A methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and the risk of colorectal cancer. Cancer Res. 1996;56(21):4862-4864. 31. Chen-Shtoyerman R, Theodor L, Harmati E, Friedman E, Dacka S, Kopelman Y, Sternberg A, Zarivach R, Bar-Meir S, Fireman Z. Genetic analysis of familial colorectal cancer in Israeli Arabs. Hum Mutat. 2003;21(4):446-447. 32. Claij N, te Riele H. Microsatellite instability in human cancer: a prognostic marker for chemotherapy? Exp Cell Res. 1999;246(1):1-10. 33. Clarizia AD, Bastos-Rodrigues L, Pena HB, Anacleto C, Rossi B, Soares FA, Lopes A, Rocha JC, Caballero O, Camargo A, Simpson AJ, Pena SD. Relationship of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism with microsatellite instability and promoter hypermethylation in sporadic colorectal cancer. Genet Mol Res. 2006;5(2):315-322. 34. Colomer A, Erill N, Verdu M, Roman R, Vidal A, Cordon-Cardo C, Puig X. Lack of p53 nuclear immunostaining is not indicative of absence of TP53 gene mutations in colorectal adenocarcinomas. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003;11(2):130137. 35. Cottu PH, Muzeau F, Estreicher A, Flejou JF, Iggo R, Thomas G, Hamelin R. Inverse correlation between RER+ status and p53 mutation in colorectal cancer cell lines. Oncogene. 1996;13(12):2727-2730. 36. Cunningham JM, Christensen ER, Tester DJ, Kim CY, Roche PC, Burgart LJ, Thibodeau SN. Hypermethylation of the hMLH1 promoter in colon cancer with microsatellite instability. Cancer Res. 1998;58(15):3455-3460. 37. De Filippo C, Luceri C, Caderni G, Pacini M, Messerini L, Biggeri A, Mini E, Tonelli F, Cianchi F, Dolara P. Mutations of the APC gene in human sporadic colorectal cancers. Scand J Gastroenterol. 2002;37(9):1048-1053. 94
38. Deng G, Peng E, Gum J, Terdiman J, Sleisenger M, Kim YS. Methylation of hMLH1 promoter correlates with the gene silencing with a region-specific manner in colorectal cancer.Br J Cancer. 2002;86(4):574-579. 39. Deuter R, Linz J, Pietsch S, Winde G, Hentsch S, Muller O. DNA alterations in sporadic colorectal tumors do not correlate with tumor staging diagnosed by the TNM system. Cancer Lett. 1996;109(1-2):161-169. 40. de Vogel S, van Engeland M, Luchtenborg M, de Bruine AP, Roemen GM, Lentjes MH, Goldbohm RA, van den Brandt PA, de Goeij AF, Weijenberg MP. Dietary folate and APC mutations in sporadic colorectal cancer. J Nutr. 2006;136(12):3015-3021. 41. Dong SM, Traverso G, Johnson C, Geng L, Favis R, Boynton K, Hibi K, Goodman SN, D'Allessio M, Paty P, Hamilton SR, Sidransky D, Barany F, Levin B, Shuber A, Kinzler KW, Vogelstein B, Jen J. Detecting colorectal cancer in stool with the use of multiple genetic targets. J Natl Cancer Inst. 2001;93(11):858-865. 42. Eads CA, Lord RV, Wickramasinghe K, Long TI, Kurumboor SK, Bernstein L, Peters JH, DeMeester SR, DeMeester TR, Skinner KA, Laird PW. Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res. 2001;61(8):34103418. 43. Eeles RA, Warren W, Knee G, Bartek J, Averill D, Stratton MR, Blake PR, Tait DM, Lane DP, Easton DF, Yarnold JR, Cooper CS, Sloane JP. Constitutional mutation in exon 8 of the p53 gene in a patient with multiple primary tumours: molecular and immunohistochemical findings. Oncogene. 1993;8(5):1269-1276. 44. Ellison AR, Lofing J, Bitter GA. Functional analysis of human MLH1 and MSH2 missense variants and hybrid human-yeast MLH1 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Hum Mol Genet. 2001;10(18):1889-1900.
95
45. Ellison AR, Lofing J, Bitter GA. Human MutL homolog (MLH1) function in DNA mismatch repair: a prospective screen for missense mutations in the ATPase domain. Nucleic Acids Res. 2004;32(18):5321-5338. 46. Elsaleh H, Powell B, Soontrapornchai P, Joseph D, Goria F, Spry N, Iacopetta B. p53 gene mutation, microsatellite instability and adjuvant chemotherapy: impact on survival of 388 patients with Dukes' C colon carcinoma. Oncology. 2000;58(1):52-59. 47. Esteller M, Levine R, Baylin SB, Ellenson LH, Herman JG. MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene. 1998;17(18):2413-2417. 48. Esteller M, Sparks A, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Gonzalez S, Tarafa G, Sidransky D, Meltzer SJ, Baylin SB, Herman JG. Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer. Cancer Res. 2000;60(16):4366-4371. 49. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res. 2001;61(8):3225-3229. 50. Esteller M, Gonzalez S, Risques RA, Marcuello E, Mangues R, Germa JR, Herman JG, Capella G, Peinado MA. K-ras and p16 aberrations confer poor prognosis in human colorectal cancer. J Clin Oncol. 2001b;19(2):299-304. 51. Esteller M, Fraga MF, Guo M, Garcia-Foncillas J, Hedenfalk I, Godwin AK, Trojan J, Vaurs-Barriere C, Bignon YJ, Ramus S, Benitez J, Caldes T, Akiyama Y, Yuasa Y, Launonen V, Canal MJ, Rodriguez R, Capella G, Peinado MA, Borg A, Aaltonen LA, Ponder BA, Baylin SB, Herman JG. DNA methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis. Hum Mol Genet. 2001c;10(26):3001-3007. 52. Esteller M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene. 2002;21(35):5427-5440.
96
53. Fallik D, Borrini F, Boige V, Viguier J, Jacob S, Miquel C, Sabourin JC, Ducreux M, Praz F. Microsatellite instability is a predictive factor of the tumor response to irinotecan
in
patients
with
advanced
colorectal
cancer.
Cancer
Res.
2003;63(18):5738-5744. 54. Fearnhead NS, Britton MP, Bodmer WF. The ABC of APC. Hum Mol Genet. 2001;10(7):721-733. 55. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990;61(5):759-767. 56. Ferrer-Costa C, Orozco M, de la Cruz X. Sequence-based prediction of pathological mutations. Proteins. 2004;57(4):811-819. 57. Fink D, Aebi S, Howell SB. The role of DNA mismatch repair in drug resistance. Clin Cancer Res. 1998;4(1):1-6. 58. Fishel R, Lescoe MK, Rao MR, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, Kane M, Kolodner R. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell. 1993;75(5):1027-1038. 59. Forrester K, Almoguera C, Han K, Grizzle WE, Perucho M. Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis. Nature. 1987;327(6120):298-303. 60. Frattini M, Balestra D, Suardi S, Oggionni M, Alberici P, Radice P, Costa A, Daidone MG, Leo E, Pilotti S, Bertario L, Pierotti MA. Different genetic features associated with colon and rectal carcinogenesis. Clin Cancer Res. 2004;10(12 Pt 1):4015-4021. 61. Freireich EJ, Stass SA. Molecular Basis of Oncology, Blackwell Science Inc., 1995.
97
62. Friend SH, Bernards R, Rogelj S, Weinberg RA, Rapaport JM, Albert DM, Dryja TP. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature. 1986;323:643-646. 63. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL, Paul CL. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(5):1827-1831. 64. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, Rozen R. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995;10(1):111-113. 65. Furukawa T, Konishi F, Masubuchi S, Shitoh K, Nagai H, Tsukamoto T. Densely methylated MLH1 promoter correlates with decreased mRNA expression in sporadic colorectal cancers. Genes Chromosomes Cancer. 2002;35(1):1-10. 66. Gavert N, Yaron Y, Naiman T, Bercovich D, Rozen P, Shomrat R, Legum C, OrrUrtreger A Molecular analysis of the APC gene in 71 Israeli families: 17 novel mutations. Hum Mutat. 2002;19(6):664. 67. Gille JJ, Hogervorst FB, Pals G, Wijnen JT, van Schooten RJ, Dommering CJ, Meijer GA, Craanen ME, Nederlof PM, de Jong D, McElgunn CJ, Schouten JP, Menko FH. Genomic deletions of MSH2 and MLH1 in colorectal cancer families detected by a novel mutation detection approach. Br J Cancer. 2002;87(8):892-897. 68. Goel A, Nagasaka T, Arnold CN, Inoue T, Hamilton C, Niedzwiecki D, Compton C, Mayer RJ, Goldberg R, Bertagnolli MM, Boland CR. The CpG Island Methylator Phenotype and Chromosomal Instability Are Inversely Correlated in Sporadic Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2007;132(1):127-138. 69. Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS, Nguyen T, Beart RW, Van Tornout JM, Jones PA. Methylation of the 5' CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor 98
gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res. 1995;55(20):4531-4535. 70. Grady WM. Genomic instability and colon cancer. Cancer Metastasis Rev. 2004;23(1-2):11-27. 71. Greenson JK, Bonner JD, Ben-Yzhak O, Cohen HI, Miselevich I, Resnick MB, Trougouboff P, Tomsho LD, Kim E, Low M, Almog R, Rennert G, Gruber SB. Phenotype of microsatellite unstable colorectal carcinomas: Well-differentiated and focally mucinous tumors and the absence of dirty necrosis correlate with microsatellite instability. Am J Surg Pathol. 2003;27(5):563-570. 72. Groden J, Thliveris A, Samowitz W, Carlson M, Gelbert L, Albertsen H, Joslyn G, Stevens J, Spirio L, Robertson M, Sargeant L, Krapcho K, Wolff E, Burt R, Hughes JP, Wanington J, McPherson J, Washmth J, LePaslier D, Abderrahim H, Cohen D, Leppert M, White R. Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell. 1991;66(3):589-600. 73. Gyapay G, Morissette J, Vignal A, Dib C, Fizames C, Millasseau P, Marc S, Bernardi G, Lathrop M, Weissenbach J. The 1993-94 Genethon human genetic linkage map. Nat Genet. 1994;7(2 Spec No):246-339. 74. Hadjisavvas A, Papasavva T, Loizidou M, Malas S, Potamitis G, Christodoulou C, Pavlides G, Papamichael D, Klonis C, Nasioulas G, Anastasiadou V, Kyriacou K. Novel germline mutations in the APC gene of Cypriot patients with familial and sporadic adenomatous polyposis. Clin Genet. 2006;69(5):404-409. 75. Hahn SA, Bartsch D, Schroers A, Galehdari H, Becker M, Ramaswamy A, Schwarte-Waldhoff I, Maschek H, Schmiegel W. Mutations of the DPC4/Smad4 gene in biliary tract carcinoma. Cancer Res. 1998;58(6):1124-1126. 76. Halford SE, Sawyer EJ, Lambros MB, Gorman P, Macdonald ND, Talbot IC, Foulkes WD, Gillett CE, Barnes DM, Akslen LA, Lee K, Jacobs IJ, Hanby AM, Ganesan TS, Salvesen HB, Bodmer WF, Tomlinson IP, Roylance RR. MSI-low, a 99
real phenomenon which varies in frequency among cancer types. J Pathol. 2003;201(3):389-394. 77. Hamelin R, Flejou JF, Muzeau F, Potet F, Laurent-Puig P, Fekete F, Thomas G. TP53 gene mutations and p53 protein immunoreactivity in malignant and premalignant Barrett's esophagus. Gastroenterology. 1994;107(4):1012-1018. 78. Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y. Genomic structure of human mismatch repair gene, hMLH1, and its mutation analysis in patients with hereditary
non-polyposis
colorectal
cancer
(HNPCC).
Hum
Mol
Genet.
1995;4(2):237-242. 79. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100(1):57-70. 80. Hardingham JE, Hewett PJ, Sage RE, Finch JL, Nuttall JD, Kotasek D, Dobrovic A. Molecular detection of blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease. Int J Cancer. 2000;89(1):8-13. 81. Hawn MT, Umar A, Carethers JM, Marra G, Kunkel TA, Boland CR, Koi M. Evidence for a connection between the mismatch repair system and the G2 cell cycle checkpoint. Cancer Res. 1995;55(17):3721-3725. 82. Haydon AM, Jass JR. Emerging pathways in colorectal-cancer development. Lancet Oncol. 2002;3(2):83-88. 83. Heide I, Thiede C, Sonntag T, de Kant E, Neubauer A, Jonas S, Peter FJ, Neuhaus P, Herrmann R, Huhn D, Rochlitz CF. The status of p53 in the metastatic progression of colorectal cancer. Eur J Cancer. 1997;33(8):1314-1322. 84. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(18):9821-9826.
100
85. Hirsch-Ginsberg CF, Stass SA, Freireich EJ. Principles of molecular oncology. Molecular basis of oncology. 1995;1-20. 86. Hoedema R, Monroe T, Bos C, Palmer S, Kim D, Marvin M, Luchtefeld M. Genetic testing for hereditary nonpolyposis
colorectal cancer. Am Surg.
2003;69(5):387-391; discussion 391-392. 87. Hubner RA, Houlston RS. MTHFR C677T and colorectal cancer risk: A metaanalysis of 25 populations. Int J Cancer. 2007;120(5):1027-1035. 88. Hutter P, Couturier A, Membrez V, Joris F, Sappino AP, Chappuis PO. Excess of hMLH1 germline mutations in Swiss families with hereditary non-polyposis colorectal cancer. Int J Cancer. 1998;78(6):680-684. 89. Iacopetta B, Grieu F, Li W, Ruszkiewicz A, Caruso M, Moore J, Watanabe G, Kawakami K. APC gene methylation is inversely correlated with features of the CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.Int J Cancer. 2006;119(10):22722278. 90. Igazvölgyi K: National Cancer Institute: Amit a vastag- és végbélrákról tudni kell – SpringMed Betegtájékoztató füzetek, SpringMed Kiadó, 2003. 91. Ilyas M, Straub J, Tomlinson IP, Bodmer WF. Genetic pathways in colorectal and other cancers. Eur J Cancer. 1999;35(14):1986-2002. 92. Jass JR, Biden KG, Cummings MC, Simms LA, Walsh M, Schoch E, Meltzer SJ, Wright C, Searle J, Young J, Leggett BA. Characterisation of a subtype of colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways. J Clin Pathol. 1999;52(6):455-460. 93. Johnson V, Lipton LR, Cummings C, Eftekhar Sadat AT, Izatt L, Hodgson SV, Talbot IC, Thomas HJ, Silver AJ, Tomlinson IP. Analysis of somatic molecular changes, clinicopathological features, family history, and germline mutations in colorectal cancer families: evidence for efficient diagnosis of HNPCC and for the 101
existence of distinct groups of non-HNPCC families. J Med Genet. 2005;42(10):756762. 94. Joslyn G, Carlson M, Thliveris A, Albertsen H, Gelbert L, Samowitz W, Groden J, Stevens J, Spirio L, Robertson M, Sargeant L, Krapcho K, Wolff E, Burt R, Hughes JP, Warrington J, McPherson J, Wasmuth J, LePaslier D, Abderrahim H, Cohen D, Leppert M, White R. Identification of deletion mutations and three new genes at the familial polyposis locus. Cell. 1991;66(3):601-613. 95. Jubb AM, Bell SM, Quirke P. Methylation and colorectal cancer. J Pathol. 2001;195(1):111-134. 96. Jung B, Smith EJ, Doctolero RT, Gervaz P, Alonso JC, Miyai K, Keku T, Sandler RS, Carethers JM. Influence of target gene mutations on survival, stage and histology in sporadic microsatellite unstable colon cancers. Int J Cancer. 2006;118(10):25092513. 97. Kamory E, Kolacsek O, Otto S, Csuka O. hMLH1 and hMSH2 somatic inactivation mechanisms in sporadic colorectal cancer patients. Pathol Oncol Res. 2003;9(4):236-241. 98. Kamory E, Tanyi M, Kolacsek O, Olasz L, Toth L, Damjanovich L, Csuka O. Two Germline Alterations in Mismatch Repair Genes Found in a HNPCC Patient with Poor Family History. Pathol Oncol Res. 2006;12(4):228-233. 99. Kampman E, Voskuil DW, van Kraats AA, Balder HF, van Muijen GN, Goldbohm RA, van't Veer P. Animal products and K-ras codon 12 and 13 mutations in colon carcinomas. Carcinogenesis. 2000;21(2):307-309. 100. Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup JM, Kolodner R. Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res. 1997;57(5):808-811.
102
101. Kim JC, Koo KH, Roh SA, Cho YK, Kim HC, Yu CS, Kim HJ, Kim JS, Cho MK. Genetic and epigenetic changes in the APC gene in sporadic colorectal carcinoma with synchronous adenoma. Int J Colorectal Dis. 2003;18(3):203-209. 102. Kim JC, Lee KH, Ka IH, Koo KH, Roh SA, Kim HC, Yu CS, Kim TW, Chang HM, Gong GY, Kim JS. Characterization of mutator phenotype in familial colorectal cancer patients not fulfilling Amsterdam criteria. Clin Cancer Res. 2004;10(18 Pt 1):6159-6168. 103. Kinzler KW, Nilbert MC, Vogelstein B, Bryan TM, Levy DB, Smith KJ, Preisinger AC, Hamilton SR, Hedge P, Markham A, Carlson M, Joslyn G, Groden J, White R, Miki Y, Miyoshi Y, Nishisho I, Nakamura Y. Identification of a gene located at chromosome 5q21 that is mutated in colorectal cancers. Science. 1991;251(4999):1366-1370. 104. Kinzler KW, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature. 1997;386(6627):761-763. 105. Kinzler KW, Vogelstein B. Landscaping the cancer terrain. Science. 1998;280(5366):1036-1037. 106. Knudson AG. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1971;68(4):820-823. 107. Knudson AG. Chasing the cancer demon. Annu Rev Genet. 2000;34:1-19. 108. Kolodner RD, Hall NR, Lipford J, Kane MF, Morrison PT, Finan PJ, Burn J, Chapman P, Earabino C, Merchant E, Bishop DT. Structure of the human MLH1 locus and analysis of a large hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma kindred for mlh1 mutations. Cancer Res. 1995;55(2):242-248. 109. Kondo E, Furukawa T, Yoshinaga K, Kijima H, Semba S, Yatsuoka T, Yokoyama T, Fukushige S, Horii A. Not hMSH2 but hMLH1 is frequently silenced
103
by hypermethylation in endometrial cancer but rarely silenced in pancreatic cancer with microsatellite instability. Int J Oncol. 2000;17(3):535-541. 110. Konishi M, Kikuchi-Yanoshita R, Tanaka K, Muraoka M, Onda A, Okumura Y, Kishi N, Iwama T, Mori T, Koike M, Ushio K, Chiba M, Nomizu S, Konishi F, Utsunomiya J, Miyaki M. Molecular nature of colon tumors in hereditary nonpolyposis colon cancer, familial polyposis, and sporadic colon cancer. Gastroenterology. 1996;111(2):307-317. 111. Kopper L. A sejtproliferáció és a sejthalál szabályozásának zavarai. Onkológia, a géntől a betegágyig. Medicina Könyvkiadó. 2002;25-48. 112. Kopreski MS, Benko FA, Kwee C, Leitzel KE, Eskander E, Lipton A, Gocke CD. Detection of mutant K-ras DNA in plasma or serum of patients with colorectal cancer. Br J Cancer. 1997;76(10):1293-1299. 113. Kouri M, Laasonen A, Mecklin JP, Jarvinen H, Franssila K, Pyrhonen S. Diploid predominance in hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma evaluated by flow cytometry. Cancer. 1990;65(8):1825-1829. 114. Kuismanen SA, Holmberg MT, Salovaara R, de la Chapelle A, Peltomaki P. Genetic and epigenetic modification of MLH1 accounts for a major share of microsatellite-unstable colorectal cancers. Am J Pathol. 2000;156(5):1773-1779. 115. Kurzawski G, Suchy J, Kladny J, Safranow K, Jakubowska A, Elsakov P, Kucinskas V, Gardovski J, Irmejs A, Sibul H, Huzarski T, Byrski T, Debniak T, Cybulski C, Gronwald J, Oszurek O, Clark J, Gozdz S, Niepsuj S, Slomski R, Plawski A, Lacka-Wojciechowska A, Rozmiarek A, Fiszer-Maliszewska L, Bebenek M, Sorokin D, Stawicka M, Godlewski D, Richter P, Brozek I, Wysocka B, Jawien A, Banaszkiewicz Z, Kowalczyk J, Czudowska D, Goretzki PE, Moeslein G, Lubinski J. Germline MSH2 and MLH1 mutational spectrum in HNPCC families from Poland and the Baltic States. J Med Genet. 2002;39(10):E65.
104
116. Laken SJ, Petersen GM, Gruber SB, Oddoux C, Ostrer H, Giardiello FM, Hamilton SR, Hampel H, Markowitz A, Klimstra D, Jhanwar S, Winawer S, Offit K, Luce MC, Kinzler KW, Vogelstein B. Familial colorectal cancer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APC. Nat Genet. 1997;17(1):79-83. 117. Lamberti C, Lundin S, Bogdanow M, Pagenstecher C, Friedrichs N, Buttner R, Sauerbruch T. Microsatellite instability did not predict individual survival of unselected patients with colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2007;22(2):145-152. 118. Lambertz S, Ballhausen WG. Identification of an alternative 5' untranslated region of the adenomatous polyposis coli gene. Hum Genet. 1993;90(6):650-652. 119. Lamlum H, Ilyas M, Rowan A, Clark S, Johnson V, Bell J, Frayling I, Efstathiou J, Pack K, Payne S, Roylance R, Gorman P, Sheer D, Neale K, Phillips R, Talbot I, Bodmer W, Tomlinson I. The type of somatic mutation at APC in familial adenomatous polyposis is determined by the site of the germline mutation: a new facet to Knudson's 'two-hit' hypothesis. Nat Med. 1999;5(9):1071-1075. 120. Larsson SC, Giovannucci E, Wolk A. Folate intake, MTHFR polymorphisms, and risk of esophageal, gastric, and pancreatic cancer: a meta-analysis. Gastroenterology. 2006;131(4):1271-1283. 121. Li D, Semba S, Wu M, Yokozaki H. Molecular pathological subclassification of mucinous adenocarcinoma of the colorectum. Pathol Int. 2005;55(12):766-774. 122. Li LS, Kim NG, Kim SH, Park C, Kim H, Kang HJ, Koh KH, Kim SN, Kim WH, Kim NK, Kim H. Chromosomal imbalances in the colorectal carcinomas with microsatellite instability. Am J Pathol. 2003;163(4):1429-1436. 123. Lindblom A, Tannergard P, Werelius B, Nordenskjold M. Genetic mapping of a second locus predisposing to hereditary non-polyposis colon cancer. Nat Genet. 1993;5(3):279-282.
105
124. Liu B, Nicolaides NC, Markowitz S, Willson JK, Parsons RE, Jen J, Papadopolous N, Peltomaki P, de la Chapelle A, Hamilton SR, et al. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet. 1995;9(1):48-55. 125. Liu T, Wahlberg S, Rubio C, Holmberg E, Gronberg H, Lindblom A. DGGE screening of mutations in mismatch repair genes (hMSH2 and hMLH1) in 34 Swedish families with colorectal cancer. Clin Genet. 1998;53(2):131-135. 126. Liu T, Tannergard P, Hackman P, Rubio C, Kressner U, Lindmark G, Hellgren D, Lambert B, Lindblom A. Missense mutations in hMLH1 associated with colorectal cancer. Hum Genet. 1999;105(5):437-441. 127. Lynch HT, Watson P, Kriegler M, Lynch JF, Lanspa SJ, Marcus J, Smyrk T, Fitzgibbons RJ Jr, Cristofaro G. Differential diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome I and Lynch syndrome II). Dis Colon Rectum. 1988;31(5):372-377. 128. Lynch HT, de la Chapelle A. Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet. 1999;36(11):801-818. 129. Ma J, Stampfer MJ, Giovannucci E, Artigas C, Hunter DJ, Fuchs C, Willett WC, Selhub
J,
Hennekens
CH,
Rozen
R.
Methylenetetrahydrofolate
reductase
polymorphism, dietary interactions, and risk of colorectal cancer. Cancer Res. 1997;57(6):1098-1102. 130. Makino R, Kaneko K, Kurahashi T, Matsumura T, Mitamura K. Detection of mutation of the p53 gene with high sensitivity by fluorescence-based PCR-SSCP analysis using low-pH buffer and an automated DNA sequencer in a large number of DNA samples. Mutat Res. 2000;452(1):83-90. 131. Maliaka YK, Chudina AP, Belev NF, Alday P, Bochkov NP, Buerstedde JM. CpG dinucleotides in the hMSH2 and hMLH1 genes are hotspots for HNPCC mutations. Hum Genet. 1996;97(2):251-255. 106
132. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA. 1982. 133. May P, May E. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene. 1999;18(53):7621-7636. 134. McIntyre JF, Smith-Sorensen B, Friend SH, Kassell J, Borresen AL, Yan YX, Russo C, Sato J, Barbier N, Miser J. Germline mutations of the p53 tumor suppressor gene in children with osteosarcoma. J Clin Oncol. 1994;12(5):925-930. 135. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB, Sidransky D. 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the
tumour
suppressor
p16/CDKN2/MTS1
in
human
cancers. Nat
Med.
1995;1(7):686-692. 136. Mihalatos M, Apessos A, Dauwerse H, Velissariou V, Psychias A, Koliopanos A, Petropoulos K, Triantafillidis JK, Danielidis I, Fountzilas G, Agnantis NJ, Nasioulas G. Rare mutations predisposing to familial adenomatous polyposis in Greek FAP patients. BMC Cancer. 2005;5(1):40-47. 137. Mitchell RJ, Farrington SM, Dunlop MG, Campbell H. Mismatch repair genes hMLH1 and hMSH2 and colorectal cancer: a HuGE review. Am J Epidemiol. 2002;156(10):885-902. 138. Miyoshi Y, Ando H, Nagase H, Nishisho I, Horii A, Miki Y, Mori T, Utsunomiya J, Baba S, Petersen G, Hamilton SR, Kinzler KW, Vogelstein B, Nakamura Y. Germ-line mutations of the APC gene in 53 familial adenomatous polyposis patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(10):4452-4456. 139. Mulcahy HE, Lyautey J, Lederrey C, qi Chen X, Anker P, Alstead EM, Ballinger A, Farthing MJ, Stroun M. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. Clin Cancer Res. 1998;4(2):271-275.
107
140. Nagase H, Nakamura Y. Mutations of the APC (adenomatous polyposis coli) gene. Hum Mutat. 1993;2(6):425-434. 141. Nakagawa H, Hampel H, de la Chapelle A. Identification and characterization of genomic rearrangements of MSH2 and MLH1 in Lynch syndrome (HNPCC) by novel techniques. Hum Mutat. 2003;22(3):258. 142. Ng PC, Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 2003;31(13):3812-3814. 143. Nishisho I, Nakamura Y, Miyoshi Y, Miki Y, Ando H, Horii A, Koyama K, Utsunomiya J, Baba S, Hedge P. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science. 1991;253(5020):665-669. 144. Noda H, Kato Y, Yoshikawa H, Arai M, Togashi K, Nagai H, Konishi F, Miki Y. Microsatellite instability caused by hMLH1 promoter methylation increases with tumor
progression
in
right-sided
sporadic
colorectal
cancer.
Oncology.
2005;69(4):354-362. 145. Nystrom-Lahti M, Perrera C, Raschle M, Panyushkina-Seiler E, Marra G, Curci A, Quaresima B, Costanzo F, D'Urso M, Venuta S, Jiricny J. Functional analysis of MLH1 mutations linked to hereditary nonpolyposis colon cancer. Genes Chromosomes Cancer. 2002;33(2):160-167. 146. Obmolova G, Ban C, Hsieh P, Yang W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 2000;407(6805):703710. 147. Oliveira C, Westra JL, Arango D, Ollikainen M, Domingo E, Ferreira A, Velho S, Niessen R, Lagerstedt K, Alhopuro P, Laiho P, Veiga I, Teixeira MR, Ligtenberg M, Kleibeuker JH, Sijmons RH, Plukker JT, Imai K, Lage P, Hamelin R, Albuquerque C, Schwartz S Jr, Lindblom A, Peltomaki P, Yamamoto H, Aaltonen LA, Seruca R, Hofstra RM. Distinct patterns of KRAS mutations in colorectal
108
carcinomas according to germline mismatch repair defects and hMLH1 methylation status. Hum Mol Genet. 2004;13(19):2303-2311. 148. Oliveira C, Velho S, Moutinho C, Ferreira A, Preto A, Domingo E, Capelinha AF, Duval A, Hamelin R, Machado JC, Schwartz S Jr, Carneiro F, Seruca R. KRAS and BRAF oncogenic mutations in MSS colorectal carcinoma progression. Oncogene. 2007;26(1):158-163. 149. Parc YR, Halling KC, Wang L, Christensen ER, Cunningham JM, French AJ, Burgart LJ, Price-Troska TL, Roche PC, Thibodeau SN. HMSH6 alterations in patients
with
microsatellite
instability-low
colorectal
cancer.
Cancer
Res.
2000;60(8):2225-2231. 150. Park JG, Kim DW, Hong CW, Nam BH, Shin YK, Hong SH, Kim IJ, Lim SB, Aronson M, Bisgaard ML, Brown GJ, Burn J, Chow E, Conrad P, Douglas F, Dunlop M, Ford J, Greenblatt MS, Heikki J, Heinimann K, Lynch EL, Macrae F, McKinnon WC, Moeslein G, Rossi BM, Rozen P, Schofield L, Vaccaro C, Vasen H, Velthuizen M, Viel A, Wijnen J; International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours. Germ line mutations of mismatch repair genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients with small bowel cancer: International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumours Collaborative Study. Clin Cancer Res. 2006;12(11 Pt 1):33893393. 151. Paul P, Letteboer T, Gelbert L, Groden J, White R, Coppes MJ. Identical APC exon 15 mutations result in a variable phenotype in familial adenomatous polyposis. Hum Mol Genet. 1993;2(7):925-931. 152. Peltomaki P, Aaltonen LA, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin JP, Jarvinen H, Green JS, Jass JR, Weber JL, Leach FS, Petersen GM, Hamilton SR, de la Chapelle A, Vogelstein B. Genetic mapping of a locus predisposing to human colorectal cancer. Science. 1993;260(5109):810-812. 153. Peltomaki P, de la Chapelle A. Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Adv Cancer Res. 1997;71:93-119. 109
154. Pereira P, Stanton V, Jothy S, Tomlinson IP, Foulkes WD, Rozen R. Loss of heterozygosity of methylenetetrahydrofolate reductase in colon carcinomas. Oncol Rep. 1999;6(3):597-599. 155. Plevova P, Krepelova A, Papezova M, Sedlakova E, Curik R, Foretova L, Navratilova M, Novotny J, Zapletalova J, Palas J, Nieslanik J, Horacek J, Dvorackova J, Kolar Z. Immunohistochemical detection of the hMLH1 and hMSH2 proteins in hereditary non-polyposis colon cancer and sporadic colon cancer. Neoplasma. 2004;51(4):275-284. 156. Powell SM, Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature. 1992;359(6392):235-237. 157. Raedle J, Trojan J, Brieger A, Weber N, Schafer D, Plotz G, Staib-Sebler E, Kriener S, Lorenz M, Zeuzem S. Bethesda guidelines: relation to microsatellite instability and MLH1 promoter methylation in patients with colorectal cancer. Ann Intern Med. 2001;135(8 Pt 1):566-576. 158. Raut CP, Pawlik TM, Rodriguez-Bigas MA. Clinicopathologic features in colorectal cancer patients with microsatellite instability. Mutat Res. 2004;568(2):275282. 159. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM, Hamilton SR, Laurent-Puig P, Gryfe R, Shepherd LE, Tu D, Redston M, Gallinger S. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracilbased adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2003;349(3):247-257. 160. Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass JR, Khan PM, Lynch H, Perucho M, Smyrk T, Sobin L, Srivastava S. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst. 1997;89(23):1758-1762.
110
161. Rosty C, Chazal M, Etienne MC, Letoublon C, Bourgeon A, Delpero JR, Pezet D, Beaune P, Laurent-Puig P, Milano G. Determination of microsatellite instability, p53 and K-RAS mutations in hepatic metastases from patients with colorectal cancer: relationship with response to 5-fluorouracil and survival. Int J Cancer. 2001;95(3):162-167. 162. Ryan BM, Molloy AM, McManus R, Arfin Q, Kelleher D, Scott JM, Weir DG. The methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in colorectal cancer: role in tumor development and significance of allelic loss in tumor progression. Int J Gastrointest Cancer. 2001;30(3):105-111. 163. Samowitz WS, Curtin K, Neuhausen S, Schaffer D, Slattery ML. Prognostic implications of BAX and TGFBRII mutations in colon cancers with microsatellite instability. Genes Chromosomes Cancer. 2002;35(4):368-371. 164. Sasaki M, Okamoto M, Sato C, Sugio K, Soejima J, Iwama T, Ikeuchi T, Tonomura A, Miyaki M, Sasazuki T. Loss of constitutional heterozygosity in colorectal tumors from patients with familial polyposis coli and those with nonpolyposis colorectal carcinoma. Cancer Res. 1989;49(16):4402-4406. 165. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002;30(12):e57. 166. Schutte M, Hruban RH, Hedrick L, Cho KR, Nadasdy GM, Weinstein CL, Bova GS, Isaacs WB, Cairns P, Nawroz H, Sidransky D, Casero RA Jr, Meltzer PS, Hahn SA, Kern SE. DPC4 gene in various tumor types. Cancer Res. 1996;56(11):25272530. 167. Segditsas S, Tomlinson I. Colorectal cancer and genetic alterations in the Wnt pathway. Oncogene. 2006;25(57):7531-7537.
111
168. Selva EM, New L, Crouse GF, Lahue RS. Mismatch correction acts as a barrier to
homeologous
recombination
in
Saccharomyces
cerevisiae.
Genetics.
1995;139(3):1175-1188. 169. Sieber OM, Lipton L, Crabtree M, Heinimann K, Fidalgo P, Phillips RK, Bisgaard ML, Orntoft TF, Aaltonen LA, Hodgson SV, Thomas HJ, Tomlinson IP. Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations in MYH. N Engl J Med. 2003;348(9):791-799. 170. Sikora K, Pandha H. Clinical relevance of oncogenes. Oncogenes and tumor suppressors, Frontiers in Molecular Biology. 1997;19:315-328. 171. Solomon E, Voss R, Hall V, Bodmer WF, Jass JR, Jeffreys AJ, Lucibello FC, Patel I, Rider SH. Chromosome 5 allele loss in human colorectal carcinomas. Nature. 1987;328(6131):616-619. 172. Souza RF, Yin J, Smolinski KN, Zou TT, Wang S, Shi YQ, Rhyu MG, Cottrell J, Abraham JM, Biden K, Simms L, Leggett B, Bova GS, Frank T, Powell SM, Sugimura H, Young J, Harpaz N, Shimizu K, Matsubara N, Meltzer SJ. Frequent mutation of the E2F-4 cell cycle gene in primary human gastrointestinal tumors. Cancer Res. 1997;57(12):2350-2353. 173. Söreide K, Janssen EA, Soiland H, Korner H, Baak JP. Microsatellite instability in colorectal cancer. Br J Surg. 2006;93(4):395-406. 174. Stern LL, Mason JB, Selhub J, Choi SW. Genomic DNA hypomethylation, a characteristic of most cancers, is present in peripheral leukocytes of individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000;9(8):849-853. 175. Sunyaev S, Ramensky V, Koch I, Lathe W 3rd, Kondrashov AS, Bork P. Prediction of deleterious human alleles. Hum Mol Genet. 2001;10(6):591-597.
112
176. Takagi Y, Kohmura H, Futamura M, Kida H, Tanemura H, Shimokawa K, Saji S. Somatic alterations of the DPC4 gene in human colorectal cancers in vivo. Gastroenterology. 1996;111(5):1369-1372. 177. Takaku K, Oshima M, Miyoshi H, Matsui M, Seldin MF, Taketo MM. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 1998;92(5):645-656. 178. Tannergard P, Lipford JR, Kolodner R, Frodin JE, Nordenskjold M, Lindblom A. Mutation screening in the hMLH1 gene in Swedish hereditary nonpolyposis colon cancer families. Cancer Res. 1995;55(24):6092-6096. 179. Taylor CF, Charlton RS, Burn J, Sheridan E, Taylor GR. Genomic deletions in MSH2 or MLH1 are a frequent cause of hereditary non-polyposis colorectal cancer: identification
of novel
and
recurrent
deletions
by MLPA. Hum Mutat.
2003;22(6):428-433. 180. Thliveris A, Samowitz W, Matsunami N, Groden J, White R. Demonstration of promoter activity and alternative splicing in the region 5' to exon 1 of the APC gene. Cancer Res. 1994;54(11):2991-2995. 181. Thorstensen L, Lind GE, Lovig T, Diep CB, Meling GI, Rognum TO, Lothe RA. Genetic and epigenetic changes of components affecting the WNT pathway in colorectal carcinomas stratified by microsatellite instability. Neoplasia. 2005;7(2):99108. 182. Tomlinson IP, Lambros MB, Roylance RR. Loss of heterozygosity analysis: practically and conceptually flawed? Genes Chromosomes Cancer. 2002;34(4):349353. 183. Trautmann K, Terdiman JP, French AJ, Roydasgupta R, Sein N, Kakar S, Fridlyand J, Snijders AM, Albertson DG, Thibodeau SN, Waldman FM. Chromosomal instability in microsatellite-unstable and stable colon cancer. Clin Cancer Res. 2006;12(21):6379-6385. 113
184. Ueland PM, Hustad S, Schneede J, Refsum H, Vollset SE. Biological and clinical implications of the MTHFR C677T polymorphism. Trends Pharmacol Sci. 2001;22(4):195-201. 185. Uleand PM, Rozen R. MTHFR polymorphisms and disease. Landes Bioscience, USA. 2005. 186. Varesco L, Gismondi V, James R, Robertson M, Grammatico P, Groden J, Casarino L, De Benedetti L, Bafico A, Bertario L, Sala P, Sassatelli R, Ponz de Leon M, Biasco G, Allegretti A, Aste H, De Sanctis S, Rossetti C, Illeni MT, Sciarra A, Del Porto G, White R, Ferrara GB. Identification of APC gene mutations in Italian adenomatous polyposis coli patients by PCR-SSCP analysis. Am J Hum Genet. 1993;52(2):280-285. 187. Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT. The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC). Dis Colon Rectum. 1991;34(5):424-425. 188. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, Nakamura Y, White R, Smits AM, Bos JL. Genetic alterations during colorectaltumor development. N Engl J Med. 1988;319(9):525-532. 189. Vogelstein B, Fearon ER, Kern SE, Hamilton SR, Preisinger AC, Nakamura Y, White R. Allelotype of colorectal carcinomas. Science. 1989;244(4901):207-211. 190. Wahlberg SS, Schmeits J, Thomas G, Loda M, Garber J, Syngal S, Kolodner RD, Fox E. Evaluation of microsatellite instability and immunohistochemistry for the prediction of germ-line MSH2 and MLH1 mutations in hereditary nonpolyposis colon cancer families. Cancer Res. 2002;62(12):3485-3492. 191. Wallis YL, Morton DG, McKeown CM, Macdonald F. Molecular analysis of the APC gene in 205 families: extended genotype-phenotype correlations in FAP and
114
evidence for the role of APC amino acid changes in colorectal cancer predisposition.J Med Genet. 1999;36(1):14-20. 192. Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, Ueki T, Satriano R, Haller DG, Benson AB 3rd, Hamilton SR. Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2001;344(16):1196-1206. 193. Weber JL, May PE. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet. 1989;44(3):388-396. 194. Wehner M, Mangold E, Sengteller M, Friedrichs N, Aretz S, Friedl W, Propping P, Pagenstecher C. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: pitfalls in deletion screening in MSH2 and MLH1 genes. Eur J Hum Genet. 2005;13(8):983-986. 195. Wicking C, Simms LA, Evans T, Walsh M, Chawengsaksophak K, Beck F, Chenevix-Trench G, Young J, Jass J, Leggett B, Wainwright B. CDX2, a human homologue of Drosophila caudal, is mutated in both alleles in a replication error positive colorectal cancer. Oncogene. 1998;17(5):657-659. 196. Wong DJ, Barrett MT, Stoger R, Emond MJ, Reid BJ. p16INK4a promoter is hypermethylated at a high frequency in esophageal adenocarcinomas. Cancer Res. 1997;57(13):2619-2622. 197. Wong IHN. Methylation profiling of human cancers in blood: Molecular monitoring and prognostication. Int J Oncol. 2001;19:1319-1324. 198. Xiong Z, Wu AH, Bender CM, Tsao JL, Blake C, Shibata D, Jones PA, Yu MC, Ross RK, Laird PW. Mismatch repair deficiency and CpG island hypermethylation in sporadic
colon
adenocarcinomas.
Cancer
Epidemiol
Biomarkers
Prev.
2001;10(7):799-803. 199. Yagi OK, Akiyama Y, Ohkura Y, Ban S, Endo M, Saitoh K, Yuasa Y. Analyses of the APC and TGF-beta type II receptor genes, and microsatellite instability in mucosal colorectal carcinomas. Jpn J Cancer Res. 1997;88(8):718-724. 115
200. Yakicier MC, Irmak MB, Romano A, Kew M, Ozturk M. Smad2 and Smad4 gene mutations in hepatocellular carcinoma. Oncogene. 1999;18(34):4879-4883. 201. Yamada K, Zhong X, Kanazawa S, Koike J, Tsujita K, Hemmi H. Oncogenic pathway of sporadic colorectal cancer with novel germline missense mutations in the hMSH2 gene. Oncol Rep. 2003;10(4):859-866. 202. Yamashita K, Dai T, Dai Y, Yamamoto F, Perucho M. Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype. Cancer Cell. 2003;4(2):121-131. 203. Yanagisawa Y, Akiyama Y, Iida S, Ito E, Nomizu T, Sugihara K, Yuasa Y, Maruyama K. Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability. Int J Cancer. 2000;85(1):50-53. 204. Yu J, Mallon MA, Zhang W, Freimuth RR, Marsh S, Watson MA, Goodfellow PJ, McLeod HL. DNA repair pathway profiling and microsatellite instability in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2006;12(17):5104-5111. 205. Zhang JS, Caplin S, Bosman FT, Benhattar J. Genetic diversity at the p53 locus between primary human colorectal adenocarcinomas and their lymph-node metastases. Int J Cancer. 1997;70(6):674-678. Felhasznált szoftverek: http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html http://genetics.bwh.harvard.edu/pph http://mmb.pcb.ub.es/PMUT
116
Összefoglaló A magyarországi halálozási statisztikában a daganatos megbetegedések miatti halálok a kardiovaszkuláris halálozás után a második helyet foglalja el. A daganatos megbetegedések közül a kolorektális daganatok a tüdőrák utáni második helyen állnak. Az örökletes kolorektális daganatok kialakulásának genetikai háttere jórészt ismert. A kolorektális daganatok közel 90%-a ellenben sporadikus eredetű. A sporadikus daganatok elkülönítéséhez az örökletes daganatok szempontjából kevésbé szigorú Bethesda kritériumokat választottuk. Munkánk során 70, kolorektális műtéten átesett beteg normál és tumoros szövetmintáját analizáltuk. Vizsgáltuk a proliferációt elősegítő onkogének közül a K-RAS aktiválódását; az elsődleges tumorszuppresszorgének közül a proliferáció szabályozásáért felelős CDKN2A, a sejtközötti
interakciókban
tumorszuppresszorgének
szerepet
közül
a
játszó
mismatch
APC, repair
a
(MLH1,
másodlagos MSH2),
a
sejtciklusszabályozásért és az apoptózis indukálásáért felelős TP53, és a harmadlagos tumorszuppresszorgének közül a sejtnövekedésben és differenciációban szerepet játszó SMAD4 gének inaktiválódását. A MMR génekhez kapcsolódva megvizsgáltuk az intergénikus mikroszatellita régiók stabilitását és a repeat régiókat hordozó gének a smad4 útvonalon elhelyezkedő hámsejtek proliferációjában résztvevő TGFβRII gén, a sejtproliferáció szabályozásában résztvevő E2F4 gén, és a p53 függő apoptózisban szerepet játszó BAX gén - mikroszatellitáinak stabilitását. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az örökletes daganatokkal ellentétben az inaktivációs mechanizmusok közül bizonyos gének (APC, MLH1, CDKN2A) promóter hipermetilációja igen gyakori és korai esemény, míg a MMR génekben a szomatikus mutációk előfordulása alacsony. A mikroszatellita instabilitás megjelenése 30%-ban fordult elő, de - szemben az örökletes daganatokkal - a minták túlnyomó többsége az MSI-L csoportba sorolódott, amely a szigorú betegszelekciónak köszönhető.
Eredményeink
alapján
a
sporadikus
kolorektális
daganatok
kialakulásának két, egymástól jól elkülöníthető, az irodalmi adatoktól kissé eltérő útját vázoltuk fel. Betegeink kolorektális tumorainak kialakulása 89%-ban besorolható a szuppresszor vagy a mutátor utak valamelyikébe. Ennek ismerete hozzájárulhat a hatékonyabb kezeléshez, mivel a mutátor útvonalon haladó tumoros betegeknek nagyobb esélyük van a túlélésre a másik csoporthoz képest, ha nem kapnak hagyományos kemoterápiát. A fennmaradó esetek hátterében feltételezhetően valamely általunk nem vizsgált gén inaktiválódása vagy aktiválódása állhat. 117
Summary In Hungarian mortality staistics death from cancer ranks second after cardiovascular diseases. Of the various tumour types, colorectal cancer is the second cause of death after lung cancer. The genetic background of the development of familial colorectal cancer is mostly known. However, nearly 90% of colorectal cancer cases are sporadic. For the selection of tumours to be studied the Bethesda guidelines were used, which are less strict criteria for hereditary tumours. Seventy tumourous and corresponding normal tissue samples were analysed from patients after colorectal surgery. The following genetic properties were studied: the activation of the proliferation-stimulating K-RAS oncogene; the inactivation of the primary tumour suppressor genes CDKN2A (a proliferation regulator) and APC (plays a role in cellcell interactions), the secondary tumor suppressor MLH1 and MSH2 mismatch repair genes, TP53, which belongs to both tumour suppressor groups and is responsible for cell cycle regulation and induction of apoptosis, and finally, the tertiary tumour suppressor gene SMAD4, which plays a role in cell proliferation and differentiation. To study the MMR genes, the stability of intergenic microsatellite regions, as well as of genes containing microsatellite repeats were analysed, namely TGFβRII, which takes part in cell proliferation in the smad4 pathway, E2F4, which regulates the cell proliferation, and the BAX gene, which plays a role in p53 dependent apoptosis. We conclude that in contrast to hereditary cancers, gene inactivation in certain genes (APC, MLH1, CDKN2A) by promoter hypermethylation is a common and early event, whereas somatic mutations in MMR genes has less importance in sporadic cancers. We observed microsatellite instability in 30% of the cases, although, in contrast to familial cancers, the majority of the samples was classified as MSI-L, which is the result of strict patient selection criteria. Based on the results, two distinct tumour progression types for sporadic colorectal cancers can be outlined, which differ slightly from published data. Eighty-nine percent of our patients belong to either the suppressor or the mutator type. The knowledge of this may contribute to a more effective therapy, since patients belonging to the mutator type have a greater chance of survival than the other group without conventional chemotherapy. The remaining cases may be due to the activation or inactivation of some other genes not examined in the present study.
118
