A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei

Doktori (Ph.D.) értekezés

A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei

Dr. Végh György

Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika

Budapest 2001

Tartalomjegyzék

1. Bevezetés ...………………………………………………………………………….1 2. Irodalmi áttekintés ...………………………………………………………………4 2.1. Terhességi trofoblaszt betegségek ...……………………………………………4 2.1.1. A terhességi trofoblaszt betegségek definiciója és klasszifikációja ……...4 2.1.2. A terhességi trofoblaszt betegségek előfordulási gyakorisága és etiológiája …………………….………………………………………….6 2.1.3. A terhességi trofoblaszt betegségek tünetei és diagnosztikája …………...7 2.1.4. A terhességi trofoblaszt betegségek kezelése és utánkövetése ………….10 2.2. A terhességi trofoblaszt betegségek kialakulásában és progressziójában szerepet játszó biológiai tényezők …………………………………………..11 2.2.1. A terhességi trofoblaszt betegségek citogenetikai jellemzői ……………12 2.2.2. A protonkogének és tumorszupresszor gének, illetve fehérjetermékeik szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben..…….14 2.2.2.1.Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbB onkogének és termékeik ………………………..17 2.2.3. A normál és daganatos trofoblaszt sejtek beágyazódását és invazivitását befolyásoló sejtadhéziós molekulák és az azokat bontó proteolitikus enzimek ……………………………………19 3. Célkitűzések ………………………………………………………………………23 4. Vizsgálati módszerek ……………………………………………………………..26 4.1. Sejtvonalak tenyésztése ……………………………………………………….26 4.2. Klinikai adatok és szövettani minták ………………………………………….26 4.3. Teljes RNS izolálás …………………………………………………………...27 4.4. mRNS izolálás ………………………………………………………………...28 4.5. Fehérje izolálás ………………………………………………………………..28

ii

4.5.1. Sejtmag fehérje izolálás …………………………………………………28 4.5.2. Citoplazmatikus fehérje izolálás ………………………………………...29 4.6. Az "Atlas human cDNA expression array" membránhibridizációs technika …29 4.7. RT-PCR ……………………………………………………………………….31 4.8. Western-blot …………………………………………………………………..32 4.9. Immunhisztokémiai analízis …………………………………………………..33 4.9.1. Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből készült szövettani metszeteken végzett immunhisztokémiai analízis …………...33 4.9.1.1. A Hsp-27 immunhisztokémiai vizsgálata ………………………...34 4.9.1.2. A c-erbB fehérjék családjának immunhisztokémiai vizsgálata …………………………………………………………34 4.9.1.3. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk immunhisztokémiai vizsgálata ……………………………………34 4.9.2. Sejtvonalakon végzett immunhisztokémiai vizsgálat …………………...35 4.10. In situ mRNS hibridizáció …………………………………………………...35 4.11. Statisztikai analízis …………………………………………………………..36 5. Eredmények ………………………………………………………………………37 5.1. Gének kifejeződése a normál humán trofofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakban ……………………………………………...37 5.2. A Hsp-27 megjelenése a normál humán trofoblasztban és choriocarcinomában in vitro és in vivo ……………………………………….39 5.3. A c-erbB fehérjék kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben ……………………………………….…42 5.4. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben ..…………...45 6. Megbeszélés ……………………………………………………………………….50 6.1. A normál humán trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak közötti eltérő génkifejeződés …………………………………...……………………..50 6.2. A Hsp-27 lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a choriocarcinomában …………………………………………………….……..52

iii

6.3. A c-erbB onkogének és fehérjetermékeiknek lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben .……………………54 6.4. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben …………………….56 7. Köszönetnyilvánítás ………………………………………………………………59 8. Irodalomjegyzék ……………………………………………………………………I 9. Függelék ………………………………………………………………………..XVII

iv

A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei Szerző: Dr. Végh György Témavezető: Dr. Fülöp Vilmos és Dr. Kopper László Semmelweis Egyetem, Egészségtudományi Kar, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika A terhességi trofoblaszt betegségek csoportját a terhességgel kapcsolatos invazív és noninvazív proliferatív trofoblaszt elváltozások képezik, melyek magukba foglalják a részleges és teljes molaterhességet, valamint a terhességi choriocarcinomát. A betegség diagnosztikájában és terápiájában elért fontos eredmények ellenére a patogenezisben szereplő molekuláris tényezők nagyrészt ismeretlenek maradtak. Kísérleteink célja az volt, hogy potenciális génkifejeződési különbségeket találjunk a normál méhlepény és a terhességi trofoblaszt tumorok között. Az „Atlas human cDNA expression array” membránhibridizációs módszer alkalmazásával a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtek génkifejeződési mintázatát hasonlítottuk össze. A normál trofoblaszt sejtekhez képest 6 gén fokozott, 3 gén pedig csökkent expressziót mutatott a choriocarcinoma sejtekben. A Hsp-27 csökkent kifejeződését choriocarcinomában RT-PCR, Western-blot és immunhisztokémiai módszerekkel erősítettük meg in vitro sejtvonalakon és in vivo paraffinos szövettani metszeteken. Továbbá a c-erbB fehérjék, valamint a mátrix metalloproteinázok és inhibitorai megjelenését

vizsgáltuk

immunhisztokémiai

módszerrel

paraffinos

szövettani

metszeteken. Az értekezésben bemutatott kísérletek eredményei az alábbiakban foglalhatóak össze: 1. Az Atlas cDNS membránhibridizációs eljárás hasznos módszernek bizonyult a normál és tumoros sejtek, illetve szövetek eltérő génkifejeződésének meghatározására, valamint alkalmas új biológiai markerek keresésére. 2. A Hsp-27 fontos szerepet játszhat a korai méhlepény kialakulásában, fejlődésében és a trofoblasztok differenciálódásában. Továbbá a Hsp-27 choriocarcinomában való csökkent expressziója a rosszindulatú trofoblaszt tumorok egyedülálló kemoterápia érzékenységének magyarázata lehet. 3. Feltételezhető, hogy a c-erbB fehérjék szerepet játszanak a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisében és a perzisztens posztmoláris tumorok kialakulásában. 4. A mátrix metalloproteinázok és szöveti inhibitoraik kifejeződése összefüggésben lehet a terhességi trofoblaszt betegségek kifejlődésével.

v

Potential biological markers of the gestational trophoblastic diseases Author: György Végh, M.D. Tutor: Vilmos Fülöp, M.D. and László Kopper, M.D. Department of Obstetrics and Gynecology, Semmelweis University, Faculty of Health Sciences Gestational trophoblastic diseases are a spectrum of pregnancy related, invasive and noninvasive proliferative trophoblastic disorders, which include partial mole, complete mole and gestational choriocarcinoma. Despite important advances in the diagnosis and therapy of these diseases, molecular pathogenesis has remained largely unknown. Our purpose was to identify potential differences in gene expression between normal placenta and gestational trophoblastic tumors. „Atlas human cDNA expression array” membrane hybridization technique was used to study the gene expression pattern in normal trophoblast and choriocarcinoma cell lines. As compared to normal trophoblast cells, 6 genes were upregulated and 3 genes were downregulated in choriocarcinoma cells. The downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma cells was confirmed both in vitro with cell lines and in vivo with paraffin sections using RT-PCR, Western-blot and immunohistochemical methods. Furthermore the expression of c-erbB proteins, and matrix metalloproteinases and their inhibitors were invastigated with paraffin sections by immunohistochemistry. Our findings summerized in this thesis are the following: 1. Atlas cDNA array is a useful and suitable technique to identify differentially expressed genes in normal and malignant cells or tissues, and suitable for search after new biological markers as well. 2. Hsp-27 may play an important role in the genesis and the development of early placenta and the differentiation of trophoblasts. Furthermore, the downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma may contribute to the extreme sensitivity of malignant trophoblastic tumors to chemotherapy. 3. Supposingly c-erbB protein family may be important in the pathogenesis of gestational trophoblastic diseases and in the progression to persistent postmolar tumors. 4. The expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors may be related to the development of gestational trophoblastic diseases.

vi

Rövidítések

ABC AEBSF cad CAM Cx DAB dATP DNáz dNTP DTT ECM EGF EGFR FCS FR-b GAPDH hCG HIP-116 hNGF hPL Hsp IGF IL INF LH MAP-kináz MMP mRNS NP-40 PA PAI PAR PBS PCNA PCR PMSF PVDF RFLP Rnáz RP-L6 RT-PCR SDS SDS-PAGE

amino-benzperidol-klorid aminoetil-benzénszulfonil-fluorid cadhedrin sejtadhéziós molekula connexin 3,3-diaminobenzidin-tetrahidroklorid dezoxi-adenozin-trifoszfát dezoxiribonukleáz dezoxi-nukleotid-trifoszfát D,L-ditiotreitol extracelluláris mátrix epidermális növekedési faktor epidermális növekedési faktor receptor magzati borjúszérum fibronektin receptor-béta alegység glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz humán choriogonadotropin DNS repair fehérje humán ideg növekedési faktor humán placentáris laktogén hő shock fehérje inzuliszerű növekedési faktor interleukin interferon luteinizáló hormon mitogén aktivált fehérje kináz mátrix metalloproteináz messzendzser ribonukleinsav nonidét-foszfát-40 plazminogén aktivátor plazminogén aktivátor inhibitor plazminogén aktivátor receptor foszfát pufferos sóoldat proliferáló sejt nukleáris antigén polimeráz lánc reakció fenil-metil-szulfonil-fluorid polivinilidén-difluorid restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus ribonukleáz 60S riboszomális fehérje L6 reverz transzkripciós polimeráz lánc reakció nátrium-dodecil-szulfát SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis

vii

TBS TGF TIMP TNF TSH

Tris puffer sóoldat transzformáló növekedési faktor metalloproteinázok szöveti gátlója tumornekrózis faktor pajzsmirigy stimuláló hormon

viii

1. BEVEZETÉS

A terhességi trofoblaszt betegségek olyan egymással kapcsolatban lévő kóros elváltozások, amelyek a chorionszövetek kóros növekedésével jellemezhetőek és magukban foglalják a változékony helyi invazív és távolra metasztatizálódó hajlammal rendelkező molaterhességet, invazív molát és choriocarcinomát [1]. A teljes mola egy egyedülálló megtermékenyülés abban a tekintetben, hogy az összes mag-DNS apai eredetű és az összes sejtplazma-DNS pedig anyai eredetű [2]. A mola hydatidosa megelőzheti a perzisztáló trofoblaszt tumor, köztük az invazív mola és a choriocarcinoma kifejlődését [3]. Bár a choriocarcinoma kialakulásának kockázata fokozott teljes molaterhesség után, a marker tanulmányok nem minden esetben igazolják, hogy maga a choriocarcinoma ugyanabból a sejtvonalból ered, mint a komplett mola [4,5]. Mivel a morfológia sem önmagában, sem a klinikai jellemzőkkel együtt nem tudja pontosan előre jelezni, hogy mely molák fognak progrediálni, a daganat viselkedésének más jelzőit keresik. Több daganatféleség esetében kimutatták, hogy

a

protoonkogének

és

tumorszupresszor

gének

sejtproliferációra

és

differenciálódásra való hatása összefüggésben van a daganatos átalakulás és daganatfejlődés többlépcsős folyamatával [6]. A trofoblaszt tumorok hatékony kemoterápiás kezelése az emberi rosszindulatú daganatok kezelésében elért legszembetűnőbb sikert mutatja. Az Egyesült Államok Rákkutató Központjában Li és munkatársai alkalmaztak először metotrexátot choriocarcinomák gyógykezelésében, amikor három, már daganat áttétellel rendelkező nőbetegük sikeres terápiájáról számoltak be. Ezzel új korszakot nyitottak egy nagyon rossz prognózisú, általában halálos kimenetelű betegség történetében [7]. A citosztatikus kezelés bevezetésében és elterjesztésében néhány amerikai munkacsoport kivételesen nagy érdemeket szerzett azáltal, hogy körülöttük a betegséggel kiemelten foglalkozó centrumok alakultak ki és nagyszámú beteganyagon értékelték ki tapasztalataikat. Ezekben a központokban a teljes gyógyulási arány már a hetvenes évek elején 80%-on felüli volt [8,9]. Azóta a terhességi trofoblaszt daganatok klinikai

1

megítélése és terápiája jelentős fejlődésen ment keresztül a betegség patológiájában, endokrinológiájában, immunológiájában és molekuláris biológiájában állandóan bővülő ismeretanyag segítségével. Ennek következtében általánosan elismert az a tény, hogy a terhességi trofoblaszt daganatok még gyors, lokális invázió és távolra szóródó, kiterjedt metasztázisok jelenléte mellett is hatékonyan és sikeresen kezelhetőek kemoterápiával [10]. Magyarországon elsőként és Európában az elsők között a Pécsi Orvostudományi Egyetem Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján Lajos professzor a hatvanas évek közepétől alkalmazott nagy dózisú metotrexát kezelést choriocarcinomás betegeken. A kis esetszám és a korlátozott feltételek, azonban a betegség átfogó vizsgálatát nem tették lehetővé és a megjelent néhány közlemény esetismertetésre szorítkozott, vagy a betegség csak egy-egy aspektusával foglalkozott [11,12]. Hazánkban nemzetközileg is elismert, hatékonynak bizonyuló trofoblaszt központot a hetvenes évek végén Gáti professzor hozott létre az Orvos Továbbképző Intézet (Jelenleg: Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar) Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján. A betegség ritka előfordulása ellenére a viszonylag nagyszámú beteganyagon szerzett tapasztalatok, valamint a több mint 20 éves kutatómunka eredménye révén (kandidátusi értekezések: 1983, 1989, 1993, doktori értekezés: 1992) a munkacsoport korszerű diagnosztikus és kezelési eljárások egész során vezette be és alkalmazta eredményesen. Témavezetőm Dr. Fülöp Vilmos és amerikai partnere, Berkowitz professzor által alapított, tíz éves gyümölcsöző

tudományos

kapcsolat

működik

a

Semmelweis

Egyetem

Egészségtudományi Kara (SEEK) és a Harvard Egyetem között. Ennek a kutató csoportnak a munkájába volt lehetőségem 1998 januárjától aktívan bekapcsolódni. Klinikai munkám mellett tudományos kísérleteimet az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet (OHII) Molekuláris Genetikai Laboratóriumában és Bostonban a Harvard Egyetem Brigham and Women’s Kórházának Szülészeti, Nőgyógyászati és Reproduktív

Biológiai

Klinikáján

működő

Nőgyógyászati

Onkológiai

Laboratóriumában végeztem. Általánosan elmondható, hogy a terhességi trofoblaszt betegségek kutatása rendkívüli klinikai eredményeket hozott a betegség diagnosztikájában és kezelésében. A napról-napra bővülő ismeretanyag ellenére a trofoblaszt betegségek viselkedésének számos pontját még homály fedi, amit a klinikumban a minden erőfeszítés ellenére is

2

bekövetkező, ritkán előforduló kudarcok szemléltetnek a legjobban. A viharosan fejlődő molekuláris biológiának köszönhetően egyre többet tudhatunk meg a betegség molekuláris alapjairól. Azonban legnagyobb hiányosságaink is éppen ezen a területen, az intracellulárisan és extracellulárisan zajló biológiai folyamatok szerepének megértésében vannak.

Budapest, 2001. Május

3

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. Terhességi trofoblaszt betegségek A mola hydatidosát már 1500 évvel ezelőtt is ismerték. Az amidai Aetius (502575) a bolyhok hydatid elfajulásáról ír az „uteri hydropii” elnevezésű betegség kapcsán. Megállapítása szerint üszögterhességről van szó, ha a vérzés kimarad, de a nő nem terhes, a méh pedig folyadékkal és apró hólyagszerű képletekkel telődik fel [13]. A későbbiekben is a méhre lokalizálódó esetekben az ötéves túlélés 30% alatt volt, és ha a diagnózis felállítása idején már áttétet találtak, a betegek kivétel nélkül rövid időn belül meghaltak [14]. Az 1961 után bevezetett eredményes kemoterápiás kezelésekkel a betegség, sokszor a reprodukciós képesség megőrzésével gyógyíthatóvá vált [15].

2.1.1. A terhességi trofoblaszt betegségek definiciója és klasszifikációja Hertz 1971-ben kidolgozta a terhességi trofoblaszt betegségek terminológiáját. Felfogása értelmében a gesztációs trofoblaszt betegségek spektruma a hidropikus boholydegenerációtól a mola hydatidosán keresztül a choriocarcinomáig terjed [16]. A WHO 1983-ban ezt az állásfoglalást elfogadta és a következők szerint, csoportosította: Terhességi trofoblaszt betegségek: a trofoblaszt sejtekből kiinduló benignus és malignus folyamatok ·

Mola hydatidosa: a chorionbolyhok hólyagos elfajulása (részleges és teljes)

·

Invazív mola: a molaterhesség infiltrálja a miometriumot és áttétet is adhat

·

Terhességi choriocarcinoma: cito- és szinciciotrofoblaszt sejtek malignus daganata, bolyhok nincsenek

·

Placentahely trofoblaszt tumor (PSTT): a méhlepény beágyazódási helyéről kiinduló, főként intermedier trofoblaszt sejtekből álló daganat

4

·

Terhességi trofoblaszt tumorok: azok a trofoblaszt betegségek, amelyek környezetükbe törnek, progrediálnak, áttétet adnak és kezelés nélkül a beteg halálát okozzák [17].

A rosszindulatú trofoblaszt tumorok több mint a fele molaterhesség talaján alakul ki, ezért a mola hydatidosát malignus potenciállal rendelkező benignus trofoblaszt tumorként értelmezik [18]. A molás szövet progrediálhat és az anyai erekbe törve más szervekbe, főleg tüdő áttétet képezhet és az esetek 20%-ában malignus daganat fejlődik ki. A részleges molaterhesség is lehet invazív és metasztatikus, kb. 5%ban choriocarcinoma alakulhat ki belőle [19]. A kezelés megválasztását és sikerességét a betegség elsősorban anatómiai kiterjedésén alapuló stádiumbeosztása határozza meg (2.1.1. táblázat). Stádiumbeosztás I. A daganat a méhre lokalizálódik II. A daganat a genitális szerveken okoz áttétet III. Metasztázis a tüdőben, genitális áttéttel vagy anélkül IV. Távoli szerveken való áttét (agy, vese, máj, bél, stb.) Alcsoportok A Rizikófaktor nincs B Egy rizikófaktor C Két rizikófaktor Rizikófaktorok 1. hCG > 100.000 NE/l 2. A betegség fennállása az utolsó terhesség után>6 hónap

2.1.1. táblázat A terhességi trofoblaszt tumorok stádiumbeosztása (FIGO 1992) (Goldstein és mtsai: Revised FIGO staging system for gestational trophoblastic tumors. J Reprod Med 43: 37-43, 1998)

Tovább kategorizálva a betegséget – amely ugyancsak a kezelés megválasztását befolyásolja, főleg ha nem áll rendelkezésre definitív szövettani diagnózis – alacsony kockázatú (low-risk) és magas kockázatú (high-risk) csoportokra osztották. A New England Trophoblastic Disease Center (Boston) ajánlása szerint high-risk kategóriába kerül az a trofoblaszt beteg, akinél: ·

a kezdeti hCG-titer > 100 000 NE/l

·

a tünetek kezdete óta > 4 hónap telt el

·

agy és/vagy májáttéte van

5

·

előzetes sikertelen kemoterápiát kapott

·

a beteg életkora > 40 év

·

"large-for-date" uterus

·

theca-lutein ciszta átmérője > 6 cm

·

előzetes molaterhesség, vagy trofoblaszt tumor

·

egyéb: toxémia, hipertireózis, trofoblaszt embolizáció, DIC [20].

Ennek alapján számos prognosztikai pontrendszer létezik, abban azonban mindegyik megegyezik, hogy a rossz prognózisú, magas kockázatú esetekben profilaktikus kemoterápia szükséges a beteg gyógyulásához [21].

2.1.2. A terhességi trofoblaszt betegségek előfordulási gyakorisága és etiológiája A molaterhesség incidenciája geográfiai megoszlást mutat. Európában és ÉszakAmerikában

terhességre

vonatkoztatott

előfordulási

aránya

1/2000,

endémiás

területeken, főleg Délkelet-Ázsiában 1/200. Choriocarcinomára vonatkoztatva ezek az adatok 1/20000 és 1/2000. Magyarországon 1800 terhességre esik egy mola hydatidosa és 15800 terhességre egy invazív mola, vagy choriocarcinoma, ami azt jelenti, hogy évente körülbelül 160 új molás és 20 új malignus trofoblaszt tumoros megbetegedést diagnosztizálnak [22]. A trofoblaszt betegségek etiológiája még ma sem pontosan ismert. A betegség kórokát kutatva felmerülnek anyai, magzati, fetomaternális, genetikai, immunológiai tényezők és a vírusfertőzés lehetősége sem zárható ki [23]. Az etnikai és földrajzi okok mellett az előzetes spontán vetélések, valamint az anamnézisben már korábban szereplő trofoblaszt betegség fokozott rizikótényezőt jelent. Epidemiológiai tanulmányok kimutatták, hogy bizonyos táplálkozási szokások (csökkent karotin és állati eredetű zsírok bevitele) mellett, illetve 40 év feletti és 18 év alatti anyai életkor esetében a teljes mola előfordulási gyakorisága emelkedett [24]. Továbbá Berkowitz és munkatársai összefüggést találtak a rendszertelen menstruációs ciklus, a két évnél hosszabb ideig tartó orális fogamzásgátlók szedése, az előzményben fiúgyermek szülése és a részleges molaterhesség gyakoribb kialakulása között [25].

6

2.1.3. A terhességi trofoblaszt betegségek tünetei és diagnosztikája A molaterhesség kórismézése tünetei alapján és korszerű morfológiai, laboratóriumi és radiológiai módszerek birtokában általában nem nehéz. A gondos anamnézis felvétel és a fizikális vizsgálati lelet a tünetek helyes értékelésével együtt már önmagukban felvethetik a trofoblaszt tumorok lehetőségét. Elősegítheti a rosszindulatú elfajulás korai felismerését, illetve megelőzését a high-risk faktorok ismerete [26]. A leggyakoribb tünet az egy-két menstruáció kimaradása után fellépő hüvelyi vérzés (97%), amely során borsó nagyságú hólyagok is ürülhetnek, miközben a terhességi gyanújelek fennállnak. Fizikális vizsgálattal a számított terhességi hétnél nagyobb méhet, esetleg egy vagy kétoldali theca-lutein tömlőt lehet tapintani. Az igen magas hCG szinttel magyarázható az esetek 20-25%-ában előforduló hiperemezis és toxémia. Az első trimeszterben fellépő preeklampszia a molaterhesség patognomikus jele [27]. A hCG mind szerkezetileg, mind pedig biológiailag hasonlít az LH-hoz és a TSH-hoz. A mola hydatidosa nagy mennyiségü hCG-t választ ki, ami a petefészkek hiperstimulációját és theca-lutein ciszták kialakulását idézi elő. A pajzsmirigyben a nagyobb hCG koncentráció a pajzsmirigy hormonok kiválasztódását serkenti és ezáltal kb. 7%-ban hipertireózis alakul ki [28,29]. Ritkán (2%) előforduló, néha a beteg halálát okozó súlyos szövődménye a trofoblaszt betegségeknek a trofoblaszt embolizáció, következményes légzési elégtelenséggel, amely megfelelő kardiopulmonális támogatás és ellátás mellett általában 72 órán belül megszűnik [30]. Az előzőekben felsorolt tünetek karakterisztikusan csak a komplett molában jellemzőek. A részleges molaterhesség tünetei sokkal szegényesebb formában jelentkeznek, általában a missed abortion vagy spontán vetélés tüneteivel megegyezők. Sokszor csak a szövettani vizsgálat deríti ki és állítja fel a pontos diagnózist [24]. A malignus troblaszt tumorok tünetei a molaterhesség tüneteihez hasonlóak, valamint az áttétek jelenlétét szervspecifikus panaszok jellemzik. A profúz hüvelyi folyás - hüvelyi metasztázis, mellkasi fájdalom és véres köpet – tüdő, fejfájás - agyi, vesetáji fájdalom és véres vizelet - vese, véres széklet és hasmenés – gasztrointesztinális áttét lehetőségére utal [27,31].

7

Az 1970-es évekig a terhességi trofoblaszt betegségek diagnózisa általában a második trimeszterre esett. Azóta a korszerű diagnosztikus módszerek birtokában, elsősorban az ultrahang (UH) vizsgálatok lehetősége miatt a kórismézés az első trimeszterre esik, ezért a klasszikus tünetek lényegesen ritkábban és szegényesebben fejlődnek ki. Berkowitz és munkatársainak anyagában az utóbbi évtizedekben preeklampszia és hiperemezis csak néhány esetben, hipertireózis és trofoblaszt embolizáció pedig nem fordult elő [24]. Egyéb adatok szerint a 10. terhességi hétig történt felismerés esetén a rosszindulatú kimenetel frekvenciája 10% alá csökken. A 1015. gesztációs hét között 9-14%, a 16 gesztációs hét után már 15-41% a malignizálódás aránya [13]. Ezért a molaterhesség gyanúja esetén az első választandó lépés az UH vizsgálat. UH vizsgálattal már a 10. terhességi hét előtt biztonsággal felismerhető a betegség. Teljes mola esetében a tágult méhüreget hóesésszerű echorajzolatot adó képlet tölti ki. Parciális molában a magzat jelenléte mellett észlelhető a lepény részleges elfajulása. Ezen kívül, a méh környezetében lévő theca-lutein tömlők pontos mérete is megállapítható [31,32]. A vizelet hCG és szérum hCG-b-alegység koncentrációja magas. A hCG szint ellenőrzése a diagnózis felállításában való segítségén kívül, a kezelés alatti és utáni nyomon követésben is fontos szerepet kap [1,29]. A szövettani vizsgálat a terhességi trofoblaszt betegségek alapvető kórismézési módszere. A pontos, mindenre kiterjedő vizsgálatnak nemcsak a korrekt diagnózis felállításában van jelentős szerepe, hanem a helyes kezelési mód megválasztásában is. A molaterhességnek morfológiailag három fő jellemzője van: 1) a bolyhok vizenyős duzzanata, 2) a bolyhok vérellátásának zavara, vagy hiánya, 3) a boholyhám különböző mérvű burjánzása. Részleges molában ezek a morfológiai jellemzők a méhlepénynek csak egy részét, teljes molában pedig a méhlepény egészét érintik [33]. Mivel a betegség felismerése egyre korábbi gesztációs korra tolódik, a szövettani vizsgálat a patológus számára, a hidropikus abortusztól való elkülönítése differenciál diagnosztikai nehézséget okozhat [34,35]. Ober és munkatársai szerint, ha a trofoblaszt sejtek beszűrik a boholystromát, illetve a cito- és szinciciotrofoblaszt sejtek keverednek egymással a rosszindulatú elfajulás veszélye 50% felett van [36]. A nem invazív és invazív formák elkülönítése

8

kórszövettanilag is nehéz lehet. Eltérés a bolyhok elhelyezkedése, méhállományba történő

betörésében

van,

amely sokszor

csak

mikroszkópikus

mértékű.

A

choriocarcinomában a cito- és szinciciotrofoblasztok nagyfokú polimorfiát mutatnak és boholystruktúra nem látható benne [37]. A szövettani vizsgálatok mellett a citogenetikai megfigyelések is megerősítették, hogy a mola hydatidosa két csoportra - teljes és részleges molaterhességre – osztható. A DNS állomány ploiditása ugyanis használható paraméternek tűnik a részleges mola egyéb terhességektől való elkülönítésében. Kevés

kivétellel

a molaszövetek

citogenetikai elemzése azt mutatta, hogy teljes mola hydatidosa esetén a sejtek diploid génállománnyal (46,XX, 46,XY) bírnak, míg a részleges molában triploid génállomány (69,XXX, 69,XXY, 69,XYY) található [24,38]. A teljes és részleges molaterhesség szövettani és citogenetikai jellemzőit a 2.1.2. táblázat foglalja össze. Teljes mola hydatidosa

Részleges mola hydatidosa

Embrionalis vagy magzati szövet

nincs

van

A chorionbolyhok vizenyős duzzanata Trofoblasztsejtek burjánzása

diffúz

gócos

diffúz

gócos

A chorionbolyhok szélének szabálytalansága Stromális trofoblaszt zárványok

nincs

van

nincsenek

vannak

diffúz, jelentős atípiával

gócos, gyenge atípiával

diploid

triploid (90-93%)

Trofoblaszt beágyazódási hely Kariotípus

2.1.2. táblázat A Teljes és részleges mola hydatidosa hisztopatológiai és citogenetikai jellemzői (Berkowitz és mtsai: Chorionic tumors. N Engl J Med 335: 1740-1748, 1996)

A citogenetika rutinszerű klinikai alkalmazását sok technikai nehézség akadályozza: friss szövetre van szükség, a tenyésztés során fennáll a mintavételi hiba lehetősége, speciális laboratóriumot igényel és magasak a költségei. Ezen kívül, több tanulmány alapján bebizonyosodott, hogy a diploid génállomány segíthet kizárni a részleges mola lehetőségét, a triploidia viszont nem specifikus a parciális molaterhességre nézve [39,40]. Így a hisztopatológia maradt a meghatározó módszer a betegség diagnosztikájában.

9

A trofoblaszt tumorok rendszeresen és gyorsan adhatnak lokális és távoli metasztázisokat, elsősorban a tüdőbe. A daganat kiterjedése és az áttétek elhelyezkedése megfelelő képalkotó eljárásokkal (UH, natív és kontrasztanyagos röntgen, CT, MRI) mutatható ki [41].

2.1.4. A terhességi trofoblaszt betegségek kezelése és utánkövetése A mola terhesség evakuációját követően 80%-ban várható spontán remisszió, 15%-ban invazív mola és 5%-ban choriocarcinoma kialakulása. A kemoterápia bevezetésével szinte egyedülálló eredmények születtek a malignus trofoblaszt tumorok kezelésében. Az azelőtt egyedüli beavatkozásként szóba jövő méheltávolítás fokozatosan háttérbe szorult és csak indokolt esetekben másodlagos szerepet játszik a kezelésben. Így a betegek reproduktív képessége sokszor megőrizhető [31]. Mivel a dolgozat kereteit jelentősen meghaladja a részletekbe menő terápiás lehetőségek teljes felsorolása, ezért a vezető trofoblaszt centrumok által elfogadott és Intézetünkben is alkalmazott a betegség stádiumára és rizikótényezőire alapozott kezelési protokollt foglalom össze. ·

Profilaktikus kemoterápia molaterhességben

Középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia ·

Alacsony kockázatú trofoblaszt tumor

Lokális tumor: középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia, rezisztencia esetén: MAC (Metotrexát, Aktinomicin-D, Ciclofoszfamid), vagy CVB (Ciszplatin, Vepezid, Bleomicin) kezelés, szükség esetén citosztatikus perfúzió, vagy méheltávolítás Metasztatikus tumor: középdózisú Metotrexát, vagy Aktinomicin-D terápia, rezisztencia esetén: MAC, vagy CVB kezelés, szükség esetén méheltávolítás és az áttét sebészi eltávolítása ·

Magas kockázatú trofoblaszt tumor

Lokális tumor: MAC kezelés, rezisztencia esetén: citosztatikus perfúzió és CVB, vagy EMA-CO (Etopozid, Metotrexát, Aktinomicin-D, Ciklofoszfamid, Onkovin) kezelés; méheltávolítás és CVB, vagy EMA-CO terápia

10

Metasztatikus tumor: MAC, vagy CVB terápia, rezisztencia esetén: EMA-CO és szükség esetén méh és az áttétek eltávolítása [41]. Ennek alapján az alacsony kockázatú lokális és metasztatikus, valamint a magas kockázatú lokális trofoblaszt tumorokban a várható gyógyulási arány 100%, a magas rizikójú áttétes esetekben kb. 80%-ban érhető el teljes remisszió. A betegség utánkövetésére, illetve a kezelés hatékonyságának ellenőrzésére a hCG-b-alegység negatívvá válásig való vizsgálata a legértékesebb módszer. A folyamatosan csökkenő hCG-titer a betegség remissziójára utal, a stagnáló, vagy emelkedő hCG-szint invazív folyamatra, vagy malignus átalakulásra és progresszióra hívja fel a figyelmet. Ez utóbbi esetben kemoterápia megkezdése, vagy esetleges kombinációban való kiegészítésére van szükség. A tapasztalatok szerint egy évig folyamatosan negatív hCG-b-alegység esetén relapszus egészen ritkán fordul elő, a beteg gyógyultnak tekinthető. A magas kockázatú eseteket azonban életük végéig célszerű követni, mert a megfigyelések szerint a betegség évek, vagy évtizedek múlva is kiújulhat [42]. A nyomonkövetés alatt a beteg fogamzásgátlásáról gondoskodni kell. A hCG-balegység negatívvá válása előtt barrier módszer, utána orális fogamzásgátlók szedése javasolt. Egy éves teljes remisszió után újabb terhesség vállalása megengedett. Irodalmi adatok megerősítik, amennyiben a beteg a nyomonkövetési időszakban a javaslatok ellenére terhes lesz, sem a szülészeti, sem a magzati szövődmények jelentős fokozódásától nem kell tartani [43]. Meg kell említeni a trofoblaszt tumorok centralizált ellátásának jelentőségét. Ahol nagyszámú beteganyagon nyert tapasztalatok alapján szerzett rutin és megfelelő interdiszciplináris háttér áll rendelkezésre, ott a betegek gyógyulási esélyei jobbak [13,41].

2.2. A terhességi trofoblaszt betegségek kialakulásában és progressziójában szerepet játszó biológiai tényezők Mola terhességet követően a terhességi trofoblaszt betegség ismétlődésének esélye 1%, ez a kockázat két trofoblaszt megbetegedési epizódot követően 20-25%-ra

11

emelkedik [44]. Mindez azt sugallja, hogy egyes betegeknél öröklötten magas a betegség ismétlődésének kockázata az eredeti lézió teljes kiirtásának ellenére. Így egyes nők predisponáltak lehetnek a kóros fertilizációra. Tuncer és munkatársai azt feltételezik, hogy ennek elsődlegesen anyai okai vannak, az oociták fejlődésének genetikai eredetű zavara áll a háttérben. Igazolódni látszik ez a feltételezés anyagukban, ahol egy asszony előzetes három különböző partnerektől származó molaterhessége után ovum donációval és in vitro fertilizációval élő, egészséges gyermeket szült zavartalan terhességet követően, terminusban [45]. A choriocarcinomák patogenezise igen összetett, megjelenhetnek terhességtől függetlenül, normál szülést, vagy spontán vetélést követően is. Az esetek legnagyobb részében, azonban mola hydatidosa után alakulnak ki [46]. Bár a choriocarcinoma kialakulásának veszélye megnövekszik teljes molát követően a marker és az RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) vizsgálatok nem mindig igazolják, hogy a choriocarcinoma ugyanahhoz a sejtvonalhoz tartozna, mint a komplett mola. Ennek alapján feltételezhető, hogy az egyes choriocarcinomák patogenezise különböző és néhány esetben teljesen eltér a teljes mola hydatidosa patogenezisétől [47,48]. Részleges molaterhességet követően ritkán regisztrálták choriocarcinoma kifejlődését [49]. Eddig kevés olyan tényezőt sikerült találni, amelyek előre jelzik a mola hydatidosa

progresszióját,

vagy

malignus

átalakulását

perzisztáló

trofoblaszt

tumorokká. A rendszeres hCG-titer kvantitatív monitorizálása érzékeny módszere a perzisztencia és/vagy progresszió megítéléséhez. Azonban a morfológiai elemzés mellett nyilvánvalóvá váltak korlátai is a betegség viselkedésének előrejelzésében [50]. Ezért a jelenlegi kutatások új biológia faktorok és módszerek lehetőségét keresi a betegség jobb megismerésének érdekében.

2.2.1. A terhességi trofoblaszt betegségek citogenetikai jellemzői A szövettani vizsgálatok mellett a citogenetikai megfigyelések erősítették meg, hogy a mola hydatidosa két csoportra (teljes és részleges mola) osztható [51].

12

A teljes mola génállománya kizárólag apai DNS-ből áll, amint a kromoszómális sáv heteromorfizmus és a hipervariábilis DNS szekvenciák analízise kimutatta [52]. A teljes molaterhesség sejtjeiben az összes nukleáris DNS apai eredetű, a citoplazma DNS állománya pedig anyai eredetű. Ebből következően a teljes molában minden kromoszóma apai eredetű, azonban a betegség kifejlődéséhez az anya is hozzájárul azáltal, hogy a mitokondriális DNS anyai eredetű [53]. Megállapítást nyert, hogy komplett molaterhességben a kromoszómaállomány csaknem mindig diploid: az esetek 90%-ában 46, XX, 10%-ban 46, XY. Egy-egy esetben triploidia, tetraploidia, sőt 45, X kariotípus is található [54]. 46, XX kariotípus esetén egy haploid spermium egy üres petesejtet termékenyít meg, amelynek genetikai állománya

megkétszereződik.

Az

anyai

kromoszómák

felszívódásának,

vagy

inaktiválódásának folyamata ismeretlen [55]. A 46, XY kariotípus dispermia következménye, az üres petesejt megtermékenyítése két hímivarsejttel (23, X és 23, Y) történik és ezek kromoszóma készlete egyesül [56]. A teljes mola androgenezis elméletét Suráni egér-modell kísérletei támasztják alá. Gynogenetikus embriók esetében csökevényes méhlepényt és következményes magzati retardációt találtak. Androgenetikus fejlődés esetében viszont az embriók elmaradt növekedését tapasztalták, míg a placenta hipertrofiás burjánzást mutatott. A normális egyedfejlődéshez tehát szükség van mindkét szülő génállományára. Az anyai DNS elengedhetetlen az embrionális részek fejlődéséhez, az apai DNS pedig az extraembrionális részek differenciálódásához. Ennek alapján az androgenetikus fejlődés a teljes mola hydatidosa analógiájának tekinthető [57]. A kóros embriogenezis és tumorgenezis közötti határok összemosódnak, a paternális genom megváltozása ezért kapcsolatba hozható a malignus átalakulással. Ezt a tényt támasztja alá a teljes mola gyakori neopláziás elfajulásának aránya [58]. Egyes közlemények szerint a choriocarcinomába progrediáló teljes molák leggyakrabban 46, XY genotípusúak, ami arra utal, hogy inkább dispermikus molából származnak, mint monospermikus lézióból [59]. A teljes mola hydatidosában és choriocarcinomában végzett genetikai tanulmányok azt is megerősítették, hogy a heterozigóta teljes mola malignusabb potenciállal rendelkezik, mint homozigóta megfelelője. Véleményük szerint a mola trofoblasztsejtekben talált genetikai instabilitás lehet a felelős a progresszióra és a rosszindulatú átalakulásra való hajlamért [60]. 13

A részleges molaterhességek mintegy 90%-ában triploid kariotípus (69, XXX, 69, XXY, 69, XYY) található, leggyakrabban 69, XXY [61]. A triploid megtermékenyítés kétféle fenotípust eredményezhet. Amennyiben egy normális petesejtet két spermium termékenyít meg (diandrikus triploidia) a részleges mola tünetei korábban és intenzívebben fejlődnek ki. Ha a három haploid készletből kettő anyai eredetű (digynikus triploidia), a részleges mola jellemzői enyhébbek (kisebb fokú trofoblaszt hiperplazia hidropikus degeneráció nélkül), a magzati elemek viszont jóval fejlettebbek, mint a diandrikus triploid parciális molában. A ritkán előforduló trofoblaszt tumorokká progrediáló részleges molaterhességek diandrikus triploid genotípusúak [62]. A maradék 10%-a a részleges mola hydatidosáknak diploid, ritkábban tetraploid kromoszóma készlettel rendelkezik. Érdekes megfigyelés, hogy a tetraploid molás betegek panaszai közül a molaterhességre jellemző karakterisztikus tünetek hiányoznak, ami a korai diagnózist megnehezíti. A szövettani vizsgálatok eredménye csak enyhe, nem proliferatív képet igazol [63].

2.2.2. A protonkogének és tumorszupresszor gének, illetve fehérjetermékeik szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben Bár a részleges és teljes molaterhesség genetikai jellemzői jól ismertek, a kulcsszereplő faktorok a betegség patogenezisének és progressziójának megértésében mindeddig ismeretlenek maradtak. A trofoblaszt sejtek szaporodásában feltételezhetően a protoonkogének és szupresszor gének közötti egyensúly lényeges szerepet játszik. A trofoblaszt fejlődése, szöveti egysége a sejtszaporodás, a sejtérés és a sejthalál folyamatának egyensúlyától függ. Ha ezen, funkcionálisan fontos gének, illetve fehérjetermékeik következtében

közötti

harmónia

megbomlik,

az

valamilyen a

sejtek

exogén,

vagy

kontrolálatlan

endogén

hatás

proliferációjával,

differenciálatlanságával, vagy pusztulásával jár, ami malignus transzformációhoz vezet [64]. Normál körülmények között a protoonkogének és a szupresszor gének ellentétes hatással bírnak, azonban a karcinogenezis során kóros formáik, az onkogének és tumor szupresszor gének hatása egyirányba, a fokozott sejtszaporodás irányába tolódhat el. Így

14

a protoonkogének aktiválódása, míg a szupresszor gének inaktiválódása szerepet játszik a

különféle

humán

daganatok

kialakulásában

és

progressziójában

[65].

A

protoonkogének aktiválódása, illetve a szupresszor gének inaktiválódása általában mutáció következménye, mely lehet pontmutáció, deléció, vagy transzlokáció, stb. Leggyakrabban kromoszómális transzlokáció révén indul el a folyamat. A szerkezeti mutáció azonban csak egyike annak a számos lehetséges folyamatnak, ami kiválthatja a normál gének megváltozását [66,67]. Ismert, hogy ugyanazon gén aktivációja, vagy elvesztése több különböző humán daganat kifejlődésében is szerepet játszhat. Ezen túlmenően ahhoz, hogy a tumor elérhesse teljes malignus potenciálját, számos különböző lókusz mutációjára van szükség [68]. Ezekről a molekuláris szintű, genetikai változásokról és az egymással való kölcsönhatásaik mechanizmusáról azonban még keveset tudunk, ezért intenzív kutatások tárgyát képezi a malignus átalakulást jelző tumormarkerek keresése, valamint azok a funkcionális in vitro és in vivo kísérletek, amelyek közelebb vezethetnek a folyamat mechanizmusának megértéséhez [69]. Az eddigi tanulmányok néhány onkogén aktivációját és a növekedési faktorok megváltozott kifejeződését mutatták ki a trofoblaszt daganatokban. A kóros trofoblasztnál fellépő, az expresszióban bekövetkező mennyiségi változások jelentősége néhány esetben nehezen értékelhető, mivel számos protoonkogén és tumorszupresszor gén nagy mennyiségben fejeződik ki a normál méhlepény esetében is [70]. Sok szabályozó molekuláról kiderült, hogy hatással vannak a trofoblasztok biológiájának és környezetükhöz való viszonyának területére. A legtöbb tanulmány individuális mediátorok hatását vizsgálta in vitro körülmények között a trofoblaszt sejtek szaporodására és működési differenciálódására vonatkozólag. Mivel a lepényi trofoblaszt olyan környezetben fejlődik, amely egyedülállóan gazdag hormonokban és növekedési faktorokban, a számos regulátor közötti kölcsönhatás, így nagyon valószínű [71]. Az előzőekben leírtakat témavezetőm, Dr. Fülöp Vilmos eredményei alapján próbálom meg alátámasztani. A c-myc gátolja a differenciálódást és proapoptotikus hatású. A c-myc fehérjék kifejeződését a növekedési faktorok és azok receptorai idézhetik elő [72]. A bcl-2 csökkenti a kórosan szabályozott c-myc expresszió apoptózist serkentő hatását, anélkül, hogy a folyamatos sejtnövekedést befolyásoló képességére hatna. Ezáltal onkogenetikai szinergizmust biztosít a két protoonkogén

15

között [73]. A bcl-2 fokozott expressziója, amely gátolja az apoptózist, a neopláziák számos típusában lehet gyakori rendellenesség [74,75]. Fülöp és munkatársai immunhisztokémiai módszerrel a c-myc és bcl-2 fehérjék erős kifejeződését találták teljes

molaterhességekben

és

choriocarcinomákban,

amelyek

egymással

szinergizmusban fontosak lehetnek a betegség patogenezisében [69,76]. A p53, a p21waf/cip1 és a Rb fehérjék tumorszupresszor gének termékei, amelyek a sejtekben a sejtproliferáció gátlását segítik elő. A p21 génjét a p53 fehérje szabályozza, bár ettől függetlenül több növekedési faktor is indukálhatja kifejeződését [77]. Az mdm2-nek más onkogénekkel együtt transzformáló működése van, amelyet fokozott expressziója indíthat el. A vizsgálatok szerint az mdm2 gén több humán malignus tumorban

felerősítve

van

jelen,

ami

arra

utal,

hogy jelentősége

lehet

a

daganatképződésben [78]. Úgy vélik, hogy az mdm2 géntermék a p53 fehérje egyik sejtes szabályozójaként működik, mivel az a vad típusú p53 fehérjéhez kötődhet. Ez az önszabályozó, visszajelentő mechanizmus fontos szerepet játszik a sejtosztódásban. Ezért az mdm2 túlzott expressziója elfojthatja a p53 fehérje növekedés szupresszáló hatását, aminek köszönhetően bizonyos daganatok „megmenekülhetnek” a szabályozott növekedési kontroll alól. Ennek alapján több rosszindulatú daganatban sikerült kimutatni az mdm2 felerősítés mellett, paradox módon a p53 fokozott expresszióját is [79]. Az mdm2 közvetetten a p53 fehérjén keresztül blokkolja a p21 működését, valamint közvetlenül gátolja az Rb géntermékét azáltal, hogy komplexet képez vele. Ezen a mechanizmuson keresztül a p21 és Rb fehérjék túlzott kifejeződését eredményezheti egyes tumorokban [80]. Fülöp és munkatársai az előzőekben leírtakhoz hasonlóan, az mdm2, p53, p21 és Rb fehérjék fokozott expresszióját mutatták ki teljes molában és choriocarcinomában, ami összefüggésben lehet a terhességi trofoblaszt tumorok patogenezisével [81]. A choriocarcinomák több mint 50%-a molaterhesség talaján jön létre, ezért kialakulásának kockázata teljes mola hydatidosa után fokozott. Ennek ellenére nem áll rendelkezésre olyan paraméter, amely előre jelezné a molás megbetegedés progresszióját. Több rosszindulatú daganatféleség és a trofoblaszt tumorok esetében is kimutatták, hogy a protoonkogének és tumorszuppresszor gének összefüggésben lehetnek a malignus transzformáció folyamatával [82]. Meghatározásuk reverz transzkripciós polimeráz lánc reakcióval (RT-PCR), vagy Northern-blot analízissel

16

történhet, ezek a metodikák azonban csak egy génre összpontosítanak egy időben. Sokkal ígéretesebbnek tűnik egy olyan cDNS könyvtár – egy nukleinsav panel – használata, amelyek segítségével a normál és tumoros sejtvonalak, illetve szövetek génállományának aktivitása hasonlítható össze [83,84].

2.2.2.1. Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbB onkogének és termékeik Az első trimeszterbeli méhlepényben a trofoblaszt sejtek növekedésében és érésében az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) elengedhetetlenül fontos szereppel bír [85]. Az EGFR és az azzal rokon c-erbB I. típusú onkogén család fehérje termékei: az EGFR (c-erbB-1), a c-erbB-2, a c-erbB-3, a c-erbB-4, közeli szerkezeti homológiát mutatnak a tirozin-kináz aktivitással rendelkező szignál transzdukciós transzmembrán fehérjékkel. Mind a négy c-erbB onkogén által kódolt sejtfelszíni molekula, hasonló szerkezetű: egy ciszteinben gazdag extracelluláris doménből, egy hidrofób transzmembrán régióból és egy intracelluláris tirozin-kináz doménből állnak [86] (2.2.1. ábra).

2.2.1. ábra Az EGFR, c-erbB-2, c-erbB-3 sematikus ábrája és a hasonlóságok a receptorok között (a c-erbB-4-ről nincs elérhető adat) (Prigent SA, Lemoine NR: The Type I (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Prog Growth Factor Res 4: 1-24, 1992.)

17

Az EGFR ligandjait, az EGF-t és a lepényi transzformáló növekedési faktortalfát (TGF-a) megköti, ezáltal a tirozin-kinázt aktiválja és a célsejt fehérjék foszforilálásával számos sejtfolyamatot képes aktiválni [86,87]. Kimutatták, hogy egyes choriocarcinoma sejtvonalak (BeWo, JEG-3, Jar) nagy mennyiségű EGF-t és TGF-a messzendzser RNS-t (mRNS) szintetizálnak [88]. Az EGF az EGFR kifejeződésén keresztül összefüggésben van a méhlepény által termelt hCG, humán placentáris laktogén (hPL) és progeszteron szekrécióval. Kemoterápiát követően a csökkenő hCG szinttel párhuzamosan a choriocarcinoma sejtek felszínén az EGFR-ok száma is jelentősen redukálódik [89,90]. Az EGF egy potenciális mitogén, ami a normál és tumoros sejtek széles skálájában, köztük a choriocarcinoma sejtekben képes aktiválni az EGFR-okat, ami fokozza a sejtnövekedést. A sejtek proliferációs aktivitása és kapacitása a sejtfelszínen kifejezett növekedési faktor receptorok számától függ [91,92]. A normál placenta és a terhességi choriocarcinomák beágyazódási helye limfocitákkal

és

makrofágokkal

infiltrált

terület

[93].

Miután

a

terhességi

choriocarcinomát infiltráló immunsejtek nagy valószínűséggel apai eredetű antigének és onkoproteinek hatásának vannak kitéve, ezért ezek a sejtek aktivált állapotba kerülnek. Az aktivált limfociták és makrofágok citokineket termelnek, amelyek parakrin módon hatással vannak környezetükre és befolyásolják a helyi folyamatokat [94]. Steller és munkatársai kimutatták, hogy interleukin-1 (IL-1) és tumor nekrózis faktor (TNF-a) citokinek hatására az EGFR expresszió fokozódik a choriocarcinoma sejtek felszínén in vitro [95]. Aboagye-Mathiesen és munkatársai interferon-gamma (INF-g) hatására az invazív trofoblaszt sejtek c-erbB-2 fehérje kifejeződés csökkenését figyelték meg [96]. Igazolódni látszik tehát az a feltételezés, hogy a citokinek az autokrin növekedést szabályozó folyamatok parakrin mediátoraiként működhetnek és befolyásolják a choriocarcinoma sejtek proliferációját. Az EGFR-t és a többi c-erbB onkogéneket és fehérje-receptor termékeiket számos rosszindulatú tumorban vizsgálták, mint patogenetikai és prognosztikai tényezőket, összefüggéseket találva a betegség és a kifejeződés erőssége között [97-99].

18

2.2.3. A normál és daganatos trofoblaszt sejtek beágyazódását és invazivitását befolyásoló sejtadhéziós molekulák és az azokat bontó proteolitikus enzimek A

lepényszövet

trofoblaszt

sejtjei

heterogén

populációt

képeznek:

szinciciotrofoblasztokból, citotrofoblasztokból és extravillozus trofoblasztokból állnak. Míg a boholytrofoblaszt sejtek nem mutatnak invazív viselkedést, addig az extravillozus trofoblasztok a malignus tumorok sejtjeihez hasonlóan invazív tulajdonságokkal rendelkeznek [100]. Az endometriumba történő trofoblaszt betörés a placentáció során szigorúan szabályozott folyamat. Az extravillozus trofoblaszt sejtek a lepény rögzítő bolyhainak bazális membránjától migrálnak, és a mélybe törve elérik a miometriumot [101]. A folyamat az anyai szövetek extracelluláris mátrixának (ECM) enzimatikus bontásával történik, melyben különböző proteáz enzimek, mint szerin proteázok, katepszinek és mátrix metalloproteinázok (MMP-k, mátrixinek) játszanak szerepet [102,103]. Az MMP-k a cink-atomot tartalmazó endopeptidázok családjába tartozó enzimek, melyek az ECM alkotóelemeinek széles spektrumát képesek bontani. Az irodalomban eddig közel 20 féle MMP-t mutattak ki. Szubsztrát specificitásuk alapján 4 fő csoportba sorolják őket: kollagenázok, zselatinázok, stromelizinek és membrántípusú MMP-k (2.2.1. táblázat). Az MMP-17 és az MMP-18 szubsztrátját ez idáig még nem sikerült tisztázni [104,105]. Az MMP-k inaktív pro-enzimek formájában szekretálódnak. Aktiválódásuk és aktivitásuk számos biológiai modulátortól (hormonok, citokinek, szöveti glikoproteinek, növekedési faktorok) függ, leginkább a szöveti inhibitoraik (Tissue inhibitor of metalloproteinase - TIMP) befolyásolják működésüket. Ezek az inhibitor molekulák kötődnek az MMP-k aktív formáihoz és gátolják a proteolitikus aktivitásukat a szövetekben [106,107]. Szerkezetileg négy TIMP molekulát különítettek el, amelyekből a TIMP-1 és a TIMP-2 játsszák a fő szerepet az MMP-k gátlásában. A TIMP-1 az összes típusú MMP-t, a TIMP-2 pedig a zselatinázokat, főleg az MMP-2-t inaktiválja [101,105].

19

Alcsoport

MMP

Egyéb elnevezés

Molekulatömeg

Szusztrát

Zsetatinázok

MMP-2

Zselatináz A 72 kDa zselatináz Zselatináz B 92 kDa zselatináz

73882

kollagén IV, V, VII, X zselatin,fibronektin, elasztin kollagén IV, V, zselatin

MMP-9 Kollagenázok

MMP-1 MMP-8 MMP-13

Stromelizinek

Fibroblaszt kollagenáz Insterticiális kollagenáz Neutrofil kollagenáz PMNL kollagenáz Kollagenáz-3

54007 53412

kollagén I, II, II, X MMP-5, enaktin kollagén I, III

53819

kollagén I kollagén III, IV, IX, X zselatin,laminin,kazein fibronektin,elasztin kazein, fibronektin, zselatin

MMP-3

Stromelizin-1 Tranzin-1

53977

MMP-7

PUMP-1 Mátrilizin Stromelizin-2 Tranzin-2 Stromelizin-3 Metalloelasztáz

29677

MMP-10 MMP-11 MMP-12 Membrán-típusú MMP-k

78427

MMP-14

54151

MT1-MMP MMP-X1 MT2-MMP MT3-MMP MT4-MMP

54595 54000

kollagén II, IV, V fibronektin, zselatin kollagén IV, szerpin elasztin, fibronektin

65883

pro-MMP-2

MMP-15 75807 MMP-16 69158 MMP-17 nem ismert MMP-18 nem ismert PMNL: polimorfonukleáris leukociták; PUMP-1: putatív metalloproteináz-1

pro-MMP-2 pro-MMP-2 nem identifikált nem identifikált

2.2.1. táblázat A metalloproteinázok osztályozása és szubsztrátjai (Bischof és mtsai: Paracrin and autocrine regulators of trophoblast invasion (review) 14: 55-60, 2000)

Az implantáció folyamata membrán közvetítette események pontos sorozatától függ, amely komplex sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásokat foglal magába. A trofoblaszt invázió folyamatát térben és időben részben a trofoblaszt sejtek által termelt faktorok autokrin módon, részben pedig az anyai, deciduális faktorok parakrin úton szabályozzák. Ennek következtében az extravillozus trofoblaszt sejtek inváziója normálisan csak az endometriumra és a miometrium proximális harmadára korlátózódik [108]. Hormonálisan az első trimeszterben fokozatosan emelkedő progeszteron és hCG szintek gátolják az MMP-k proteolitikus aktivitását. A progeszteron elsősorban a zselatinázok, a hCG pedig a kollagenázok termelődését csökkenti [109,110]. A sejtadhéziós molekulák (CAM-ok) közül a kollagének és a laminin fokozzák a sejtek zselatináz szekrécióját, ezzel a trofoblaszt inváziót elősegítik [111]. A cadherinek (cad) családjából az E-cad, az N-cad, a cad-6 és a cad-11 glikoproteinek koordinált

20

expressziója az extravillozus trofoblasztok invazív migrációját gátolják. Kimutatták, hogy az E-cad, amely egy tumorszupresszor gén terméke, a gyengén differenciálódott, nagy

metasztatikus

aktivitású

tumorokban

alacsony,

vagy

nem

kimutatható

mennyiségben termelődik, míg a jól differenciált, gyengén metasztatikus aktivitású ráksejtek

magas

koncentrációban

expresszálják

[112].

A

közvetlen

sejt-sejt

kontaktusban működő réskapcsolat (gap-junction) fehérjék, a connexinek (Cx-ek) közül a Cx40 az invazív extravillozus trofoblasztok felszínén nagy mennyiségben termelődik a terhesség első harmadában, majd fokozatosan eltűnik és az érett méhlepényben már nem mutatható ki. Winterhager és munkatársai ezért a Cx40 fehérje kifejeződését összefüggésbe hozzák a placentáció folyamatával [113,114]. Feltételezésüket igazolják Helmann és munkatársai megfigyelései, miszerint in vitro a choriocarcinoma sejtek (BeWo, Jar) erősen kifejezik a Cx40-t [115]. A trofoblaszt sejtek és az anyai decidua által termelt citokinek és növekedési faktorok is hatással vannak a trofoblaszt invázió folyamatára. Az extravillozus trofoblasztok IL-eket szekretálnak. Az IL-1, IL-6 és IL-15 fokozzák, míg az IL-10 gátolja az MMP-k proteolitikus aktivitását. A deciduális TNF, az EGF és a TGF-a aktiválják az MMP-ket a TIMP-ek egyidejű gyengítésével [105]. Unemori és munkatársai az első trimeszterbeli méhlepényben az IL-1 és az EGF faktorok szinergista hatását figyelték meg [116]. A deciduális IGF-I parakrin és a trofoblaszt IGF-II autokrin módon erősítik az endometrium trofoblaszt invázió folyamatát [117,118]. Ugyancsak kimutatták, hogy a trofoblaszt sejtek által termelt plazminogén aktivátor (PA - szerin proteáz) a plazminogén - plazmin rendszeren keresztül az összes MMP expresszióját és szekrécióját fokozza. A TGF-b ezt a hatást két mechanizmuson keresztül ellensúlyozza. Részben a TIMP aktivitást erősíti, részben pedig közvetlenül a PA gátlásán keresztül fejti ki anti-invazív hatását. Érdekesség, hogy a plazmin az MMPk mellett a TGF-b aktivitását is fokozza, egy önregulációs kört képezve a trofoblaszt invázió szabályozásának folyamatában [119] (2.2.2. ábra). Általánosságban elmondható, hogy a proinflammációs citokinek fokozzák, az anti-inflammációs citokinek pedig gátolják az MMP-k aktivitását és ezzel elősegítik, vagy gyengítik a trofoblaszt invázió folyamatát a placentáció során. Ezek a folyamatok transzkripciós szinten zajlanak [105].

21

2.2.2. ábra A trofoblaszt invázió folyamatának szabályozása. PA: plazminogén aktivátor, PAI: PA inhibitor, PAR: PA receptor, TGF: transzformáló növekedési faktor, TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase, hCG: humán choriogonadotropin. (Lala PK, Graham CH: Mechanism of trophoblast invasiveness and their control: the role of proteases and protease inhibitors. Cancer Metast Rev 9: 369-379, 1994.)

Amennyiben a szabályozó folyamatok szigorú egyensúlya megbomlik, a trofoblaszt invázió kontrollálatlanná válik, és lokális, valamint távoli áttétet képezve rosszindulatú trofoblaszt tumor alakulhat ki. *** Az előzőekben leírtak bemutatják a trofoblaszt betegségek általános és klinikai jellemzőit, valamint az etiológiai kérdések eddig feltárt, feltételezett, vagy bizonyított aspektusait. Természetesen az értekezés keretei nem engedik meg, hogy a teljesség igényével a legapróbb részletekig minden szempont elemzése szerepeljen (pl: immunológiai vonatkozások), az azonban nyilvánvalóvá válhatott, hogy az utóbbi években felhalmozott tekintélyes ismeretanyag ellenére még sok a megválaszolatlan kérdés a betegség pontos patogenezisével kapcsolatban. Ezt az ismeretanyagot próbáltam meg munkám során kisérleteimmel bővíteni, amit a következő fejezetekben ismertetek részletesen.

22

3. CÉLKITŰZÉSEK

Munkám célja az volt, hogy a normál lepényi és kóros trofoblaszt sejtek, illetve szövetek proliferációját és invázióját befolyásoló funkcionálisan fontos gének és fehérjetermékeik eltérő kifejeződését és viselkedését, valamint azok lehetséges patogenetikai szerepét vizsgáljuk normál terhességekben és a terhességi trofoblaszt betegségekben, az alábbi megközelítésekből. 3.1. A terhességi trofoblaszt tumorok kezelésében és diagnosztikájában bekövetkezett óriás előrehaladás ellenére a betegség molekuláris patogenezise nagyrészt ismeretlen maradt. A sejtszaporodás egy bonyolult szabályozási folyamat, amelyet meghatározott protoonkogének és tumorszupresszor gének koordinált kölcsönhatása irányít. A korai méhlepényben a fiziológiás onkogén kifejeződés és a terhességi trofoblaszt betegségekben a megváltozott onkogén expresszió közötti határok elmosódhatnak, a különbségek magyarázata pedig nem teljesen ismert [120]. Néhány protoonkogén aktivációját, valamint tumorszupresszor gén megváltozott kifejeződését már kimutatták terhességi trofoblaszt daganatokban is. Azok a gének, amelyek eltérő kifejeződést mutatnak a normál és daganatos sejtek, szövetek között nagy valószínűséggel

közvetlen,

vagy

közvetett

szerepet

játszanak

a

növekedés

szabályozásában, illetve a sejtdifferenciálódás átalakult folyamatában [76,81]. Ezért a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt tumorokban túlzottan, vagy csökkent mértékben kifejeződő protoonkogének, tumor szupresszor gének, valamint egyéb funkcionálisan fontos gének kutatása és további elemzése mélyebb betekintést nyújthat a betegség patogenezisébe. Az „Atlas human cDNA expression array” membránhibridizációs módszer segítségével a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak génkifejeződésének mintázatát hasonlítjuk össze 588 ismert funkcionális fehérje génjeinek expressziója közötti potenciális különbségeket keresve.

23

3.2. Ismert tény, hogy a terhességi trofoblaszt daganatok gyors lokális inváziója és a távolra szóródó metasztázisok jelenléte mellett is kifejezett kemoterápia érzékenységet mutatnak, ezért hatékonyan és sikeresen kezelhetők [18,24]. A citosztatikus kezelés eredményessége a csökkenő hCG szint ellenőrzésével jól monitorizálható [19]. Nincs azonban ismeretünk arról, hogy mely gén jelenléte, vagy hiánya, illetve milyen molekuláris szintű mechanizmusok okozzák a kemoterápia érzékenységet, vagy éppen a trofoblaszt tumorok esetében a ritkán előforduló kemoterápia rezisztenciát. Erre a kérdésre adhat magyarázatot a napjainkban sokat vizsgált Hő shock fehérje – 27 (Hsp-27). Ez a fehérje molekula több tanulmány által igazoltan szerepet játszik a kemoterápia rezisztencia kialakulásában [122,123]. Ebből a megközelítésből kiindulva vizsgáljuk a Hsp-27 kifejeződését normál placentában és choriocarcinomában in vitro és in vivo körülmények között. 3.3. Az EGFR fehérje erős kifejeződését már több malignus tumorban kimutatták és a trofoblaszt sejteken is megtalálható, ezért feltételezhető, hogy szerepet játszik a terhességi trofoblaszt betegségek kialakulásában is. Míg az EGFR kifejeződését fehérje és DNS szinten többen vizsgálták placentában és terhességi trofoblaszt tumorokban in vitro és in vivo, a kifejeződés intenzításában és annak klinikai jelentőségében a különböző tanulmányok adatai ellentétesek [123,124]. Az utóbbi időkben kimutatott c-erbB-2, c-erbB-3 és c-erbB-4 fehérjék szerepét is számos rosszindulatú folyamatban vizsgálták [125,126]. Ezért a c-erbB fehérjék expresszióját elemeztük normál méhlepényben és terhességi trofoblaszt betegségekben. A kérdés megválaszolására részben témavezetőm eredményeit használom fel. Tanulmányoztuk továbbá ezeknek a proteineknek a lehetséges szerepét a posztmoláris gesztációs trofoblaszt tumorok kialakulásában és klinikai kimenetelében. 3.4. Az extracelluláris mátrixot szétbontó proteázok különböző családjairól, köztük az MMP-kről kimutatták, hogy közreműködnek az anyai szövetekbe történő trofoblaszt invázió folyamatában [119,127]. Feltételezik, hogy ezzel a mechanizmussal az MMP-k bizonyos rosszindulatú daganatok progressziójában és a metasztázis képzésében is fontos szerepet játszanak [128]. Ennek alapján megvizsgáljuk a jó és

24

rosszindulatú trofoblaszt sejtek anyai szövetekbe történő inváziójában szerepet játszó MMP-k és gátlóik jelenlétét a normál placentában és a terhességi trofoblaszt betegségekben. Kiértékeljük, vajon ezeknek a fehérje enzimek kifejeződésében tapasztalható különbségek kapcsolatba hozhatóak-e posztmoláris trofoblaszt tumorok kialakulásában és prognózisában.

25

4. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

4.1. Sejtvonalak tenyésztése A humán normál trofoblaszt (3A-Sub-E) és a choriocarcinoma (Jar, JEG-3) sejtvonalakat az American Type Culture Collection (ATCC) cégtől szereztük be. A sejteket hővel inaktivált magzati borjúszérummal (10% FCS), L-glutaminnal (2 mM/ml), Penicillinnel (100 U/ml) és Streptomycinnel (100 mg/ml) kezelt Eagle-féle minimális esszenciális médiumot tartalmazó táptalajban (MEM - Sigma) tenyésztettük. A sejteket 37 °C-on 5% CO2-t és 95% levegőt tartalmazó nedves atmoszférában tartottuk egyrétegű (monolayer) sejtkultúrában tenyésztve. A sejtek mennyiségét hetente kétszer vagy háromszor, mosást követően médiumcserével feleztük.

4.2. Klinikai adatok és szövettani minták Ötvenegy terhességi trofoblaszt betegségben szenvedő nőtől származó szövetmintát és 11 normál, első trimeszteri terhességmegszakításból származó lepényszövetet dolgoztunk fel. Az összes beteget a Harvard Egyetem Brigham and Women’s Kórházának Szülészeti, Nőgyógyászati és Reproduktív Biológiai Klinikáján diagnosztizálták és kezelték 1993 és 1997 között. A szövettani minták gyűjtésére vonatkozó írásos beleegyező nyilatkozatot az Intézet (Brigham and Women’s Kórház) humán anyagok bizottsága által jóváhagyott protokollja szerint szereztük be. A terhességi trofoblaszt betegségben szenvedő betegek közül 16 esetben részleges molát igazolt a szövettani vizsgálat, míg 25 nőnél teljes molát és 10 esetben choriocarcinomát diagnosztizált a patológus (Dr. David R. Genest). Az átlagos gesztációs kor a terhességmegszakítások esetében 9.5 terhességi hét (8-12 hét), a részleges és teljes moláknál 8.4, illetve 9.9 terhességi hét volt. A 25 szövettanilag teljes mola hydatidosa közül 8 esetben (32.0%) alakult ki perzisztens posztmoláris terhességi trofoblaszt tumor. Amíg a perzisztens betegségben

26

szenvedő nőknek a gyógyuláshoz összesen 11 kemoterápiás ciklus adására volt szükségük, addig a többi komplett mola a méhkiürítés után spontán remisszióba került. A 10 choriocarcinomás esetből 8 (80.0%) I. stádiumú, 2 (20.0%) III. stádiumú volt és a betegek összesen 28 ciklus kemoterápiát kaptak. A terhességi trofoblaszt betegek kezelési és utánkövetési protokollja egységes volt és minden esetben megegyezett [20]. Röviden a nem metasztatizáló trofoblaszt tumoros betegeknek (I. stádium) és az alacsony kockázatú III. stádiumú betegeknek Metotrexátot és citrovorum faktort adtak. A magas kockázatú III. stádiumú trofoblaszt betegségben szenvedők pedig elsődlegesen EMA-CO kemoterápiás kezelést kaptak. Minden beteg él, panasz és tünetmentes, tartós hCG remisszióban van.

4.3. Teljes RNS izolálás A normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejteket kétszeri PBS (foszfát pufferos sóoldat) mosást követően denaturáló oldatban (4 M guanidinium-isotiocianát, 25 mM nátrium-citrát pH 7.0, 0.5% szarkozil, 0.1 M b-merkaptoetanol) lizáltuk. A teljes RNSeket cézium-klorid gradiensen (5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA pH 7.0) keresztül történő 24 órás ultracentrifugálással (35.000/min) nyertük ki [129]. Többszöri RNase mentes vízben való átmosás után az RNS-eket -80 °C-on 3 M nátrium-acetátban és tiszta etanol oldatokban precipitáltuk. Beszárítás után az RNS üledéket RNáz mentes vízben reszuszpendáltuk és megmértük a koncentrációját. Tiszta teljes RNS mintának azt tekintettük, ha a 260/280 nm-es abszorbciós arány 1.8-2.0 között volt. A teljes RNS mintákat DNáz I. enzimmel (Atlasä pure RNA isolation kit – Clontech) kezeltünk (100 mg RNS/1 mg DNáz I.), hogy a genomikus DNS teljes emésztésével a későbbiekben zavart okozó hátteret csökkentsük. Ezt követően a próbákat többszöri fenol-kloroform-isoamil alkohol 25:24:1 arányú keverékével tisztítottuk.

27

4.4. mRNS izolálás A mRNS-eket (mRNS) a PolyA Tractâ mRNA isolation system (Promega) segítségével izoláltuk [130]. Kellő mennyiségű, tiszta RNS mintákból a biotinilált oligo(dT) primer hibridizációjával jelöltük ki a 3’polyA mRNS szakaszokat, amelyeket háromszori 0.1X SSC mosással, valamint a SA-PMPs (Streptavidin – Paramagnetic Particles) mágneses állvány felhasználásával választottuk el, tisztítottuk, majd eluáltuk. A tiszta formában kinyert mRNS próbákat egy éjszakán (16 órán) keresztül -80 °C-on 3 M nátrium-acetátban és tiszta etanol oldatokban precipitáltuk. Beszárítás után az üledéket RNáz mentes vízben reszuszpendáltuk a végső 1 mg/ml-es koncentrációra.

4.5. Fehérje izolálás A Western-blot vizsgálathoz sejtmag és citoplazmatikus fehérje kivonást is végeztünk.

4.5.1. Sejtmag fehérje izolálás A sejtmag fehérjék kivonásához a sejteket először PBS oldatban háromszor mostuk, majd az előre elkészített lízis pufferban (0.5 mg/ml Leupeptin, 200 mM AEBSF /aminoetil-benzénszulfonil-fluorid/, 1 mM PMSF /fenil-metil-szulfonil-fluorid/, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT /D,L-ditiotreitol/, 10 mM Hepes pH 7.9) oldottuk. Jégben való hűtés és centrifugálás után az üledéket egy újabb puffer oldatban (1 M ZnCl2, 1 M nátrium-fluorid, 0.5 mg/ml Leupeptin, 200 mM AEBSF, 1 mM PMSF, 1% NP-40 /nonidét-foszfát-40/, 1 mM Vanadát, 0.1% TritonX-100 /alkilfenil-polietilénglikol/, 100 mM NaCl, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 10% Glicerol, 20 mM Tris pH 7.5, 20% SDS /nátrium-dodecil-szulfát/) reszuszpendáltuk, majd 80 °C-ra melegítettük és szonikáltuk. Ultracentrifugálás (55.000/min) után a felülúszóban található fehérje mennyiségének meghatározására a Micro BCA protein assay kitet (Pierce) használtuk.

28

4.5.2. Citoplazmatikus fehérje izolálás A citoplazmatikus fehérje lizátumok készítéséhez a sejteket először PBS oldatban háromszor mostuk, majd az előre elkészített lízis pufferban (1 M ZnCl2, 1 M nátrium-fluorid, 1 M b-glicerol-foszfát, 150 mM nátrium-pirofoszfát, 0.5 mg/ml Leupeptin, 200 mM AEBSF, 1 mM PMSF, 20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM Vanadát) oldottuk. Centrifugálás után a felülúszóban található citoplazmatikus fehérje mennyiségének meghatározására a Micro BCA protein assay kitet (Pierce) használtuk.

4.6. Az "Atlas human cDNA expression array" membránhibridizációs technika Egy nagyméretű nukleinsav panel - gyári nevén a Clontech cég „Atlas human cDNA expression array”-e - segítségével a normál trofoblaszt (3A-Sub-E) és choriocarcinoma (Jar) sejtvonalak génkifejeződésének mintázatát membránhibridizációs módszerrel hasonlítottuk össze. Minden egyes panel 588 emberi génből származó, 200500 bázis-pár hosszúságú cDNS-t tartalmaz, amelyeket gén-specifikus primerekkel PCR (polimeráz lánc reakció) felerősítést követően 100 ng mennyiségben, dupla pont-folt formájában helyezték el egy pozitív töltésű nylon membránon. A cDNS-eket 6 csoportra osztották fel és funkcionális csoportosításban vitték fel őket: A) onkogének, tumor szupresszor gének, sejtciklus szabályozók; B) stresszfehérjék, ioncsatorna és transzport szabályozók, intracelluláris szignál transzdukciós folyamatokat szabályozók; C) apoptózis faktorok, DNS szintézis, repair enzimek; D) transzkripciós faktorok, általános DNS-kötő fehérjék; E) receptorok, sejtfelszíni antigének, sejtadhéziós gének; F) sejt-sejt kontaktusért felelős faktorok (4.6.1. ábra). A plazmid és bakteriofág DNS-ek negatív kontrollként kerültek elhelyezésre, hogy így igazolják a hibridizáció specificitását. Pozitív kontrollként a minden sejtféleségben kifejeződő ún. háztartás gének szolgáltak. Egy kithez két membrán tartozik, így két mRNS populáció hasonlítható össze [131].

29

4.6.1. ábra Az „AtlasTM human cDNA expression array” sematikus képe. A pozitív kontrollok az ábra jobb oldalán vannak elhelyezve. (Atlasä cDNA Expression arrays User Manual, Clontech Laboratories, 1997.)

Egyenlő mennyiségű (1-1 mg) mRNS mintákhoz 1 ml 10X CDS Primer keveréket (Clontech) adtunk és 70 °C-on, majd 50 °C-on 2-2 percig inkubáltuk. A próbákat jégbe helyezve Mester keveréket (Clontech) adtunk hozzá, amely 5X Reakció puffert, 10X dNTP keveréket, 100 mM DTT-t, 50 U/ml MMLV (Moloney murine leukemia virus) reverz transkriptázt tartalmazott és 50 °C-on, 20 percig inkubálva cDNS mintákká írtuk át. A cDNS mintákat [a-32P]dATP (3000 Ci/mmol; New England Nuclear) beépítésével jelöltük. Miután a reakciót 10X Termináló keverékkel (Clontech) leállítottuk, a rádióaktívan jelölt próbákat a szabad

32

P jelölt nukleotidoktól a

CHROMA SPINä-200 DEPC-H2O oszlopokon (Clontech) keresztül választottuk el. Ezeket a mintákat az ExpressHyb hibridizáló oldattal (Clontech) külön zsákban hibridizáltuk az Atlas membránokhoz (Atlasä human cDNA expression array – Clontech) egy éjszakán keresztül, 68 °C-on. A membránokat először négyszer mostuk 2X SSC-t és 1% SDS-t tartalmazó oldatban 68 °C-on, 20 percig, majd kétszer 0.1X SSC-t és 0.5% SDS-t tartalmazó oldatban

68 °C-on, 20 percig. A hibridizációs

mintázatot autoradiográfiával analizáltuk, a legjobban értékelhető felvételt 24 órás

30

expozíció után kaptuk (4.6.2. ábra) [131]. Kifejeződésbeli különbségnek a legalább háromszoros erősségű génexpressziót tekintettük, amelyet a blottok denzitásának mérésével határoztunk meg ChemiImager technikával (Alpha Inotech Corporation).

4.6.2. ábra Az „AtlasTM human cDNA expression array” membránhibiridizációs technika sematikus képe. (Atlasä cDNA Expression arrays User Manual, Clontech Laboratories, 1997.)

4.7. RT-PCR A reverz transzkripciós polimeráz láncreakciós (RT-PCR) metodikát az előzőekben leírt módszerrel (4.3. fejezet) izolált teljes RNS-ekkel a GeneAmpâ kit (Perkin Elmer) és a GeneAmpâ PCR system 9700 (Perkin Elmer) segítségével végeztük. Első lépésben az 5-5 mg mennyiségű totál RNS mintákat egy Mester keverékkel (25 mM MgCl2, 10X PCR puffer II, 20 mM dNTP, 20 U/ml RNáz inhibitor, 50 mM Random hexamer, 250 U/ml Reverz transzkriptáz) egy cikluson keresztül cDNS próbákká írtuk át (20 °C – 10 perc, 42 °C – 30 perc, 99 °C – 5 perc). Ezután egy 31

második lépésben egy újabb Mester keveréket (25 mM MgCl2, 10X PCR puffer II, 20 mM dNTP, 5 U/ml AmpliTaq Goldä DNS polimeráz) adtunk a mintákhoz és a felfelé (upstream)

és

lefelé

(downstream)

megtervezett

Hsp-27

(5’-

GCATGACCGAGCGCCGCGTCC-3’, 5’-TTACTTGGCGGCAGTCTCATCGG-3’ Genosys),

RP-L6

(5'-GCAAGATGGCGGGTGAAAAAG-3',

CAGGAAAACCACCCTCTTGCC-3' GCGCCATGTCCTGGATGTTCA-3',

-

Genosys)

és

HIP-116

5'-TGCACCAAAAGGAACTACCCC-3'

5'(5'-

Genosys) primer párokat felhasználva a cDNS mintákat 35 cikluson keresztül felszaporítottuk (94 °C – 30 másodperc, 70 °C – 1 perc, 72 °C – 3 perc). A kapott PCR termékeket 1%-os agaróz gélen elektroforézissel szétválasztottuk és GelDoc (BioRad) készülék segítségével tettük láthatóvá. Standardizáláshoz a minden sejtféleségben kifejeződő GAPDH (gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) primer párt (Operon Technologies) használtuk és alkalmaztuk a Hsp-27-nél leírt feltételek mellett.

4.8. Western-blot A normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakból kivont sejtmag és citoplazmatikus fehérje mintákból 20-20 mg-ot futtatunk meg 10%-os SDS-PAGE (SDS-poliakrilamid gélelektroforézis) minigélen és vittük át Polyscreen PVDF (polivinilidén-difluorid) membránra (New England Nuclear) [129]. Miután a membránt egy éjszakán át 5%-os tejporban blokkoltuk, egy órán keresztül inkubáltuk a Hsp-27 egér, monoklonális elsődleges ellenanyaggal (Neomarker) 1:200 hígításban, majd 0.1%os TBS-Tween-20-al négyszer mostuk. Ezután a membránt egy újabb egy órán keresztül inkubáltuk az egérellenes, monoklonális másodlagos ellenanyaggal (Pierce) 1:2500 hígításban, majd ismételt négyszeri 0.1%-os TBS-Tween-20 mosás után a protein termék jeleit a Supersignal chemoluminescent substrate detection (Pierce) eljárás segítségével tettük láthatóvá. Pozitív kontrollnak PCNA (proliferáló sejtmag antigén) és b-aktin egér, monoklonális ellenanyagot (Oncogene Research Products) használtunk.

32

4.9. Immunhisztokémiai analízis Immunhisztokémiai

vizsgálatot

formalinban

fixált,

paraffinba

ágyazott

szövetekből készült szövettani metszeteken és in vitro körülmények között tenyésztett normál trofoblaszt (3A-Sub-E) és choriocarcinoma (Jar, JEG-3) sejtvonalakon végeztük.

4.9.1. Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből készült szövettani metszeteken végzett immunhisztokémiai analízis Az avidin-biotin immunperoxidáz eljárást alkalmaztuk formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből készült 5 mm vastagságú metszeteken. A metszeteket xilénben deparaffinizáltuk, majd csökkenő koncentrációjú alkohol sorozatban és desztillált vízben hidráltuk, végül az endogén peroxidáz aktivitást 0,3%-os hidrogénperoxiddal metanolban blokkoltuk. Miután a nem specifikus antigéneket normál ló szérummal blokkoltuk, a metszeteket nedves kamrában az elsődleges antitesttel 16 órán át, 4° C-on inkubáltuk. A festék jelöléséhez az elsődleges ellenanyagtól függően egér, vagy nyúl ellenes biotinilált másodlagos ellenanyagot, majd az ABC (aminobenzperidol-klorid) torma-peroxidázt (Vectastain Elite ABC Kit - Vector Labs) használtuk.

A

reakció

termékeket

DAB

(3,3-diaminobenzidin-tetrahidroklorid)

kromogénnel (Vector Labs) tettük láthatóvá. Végül a metszeteket növekvő koncentrációjú alkohol sorozatban dehidráltuk, xilénben tisztítottuk és montíroztuk. Negatív kontroll esetében az elsődleges antitestet normál szérummal helyettesítettük. A hematoxilinnal és eozinnal történő festést minden mintával elvégeztük. A metszeteket egyenként Dr. David R. Genest nőgyógyászati patológus segítségével elemeztük ki. A membrán, citoplazmatikus és magfestődést a normál lepény, a részleges és teljes

mola

szincicio-,

cito-

és

extravillozus

trofoblasztjaiban,

valamint

a

choriocarcinoma esetek tumorsejtjeiben szeparáltan vizsgáltuk. Az immunreakciókat negatívként, gyengén pozitívként és erősen pozitívként értékeltük. Erősen pozitívnak fogadtuk el, ha a sejtek több mint 50%-a mutatott erős, intenzív festődést, gyengén pozitívnak értékeltük, ha a sejtek több mint 50%-a gyengén, kevésbé intenzíven festődött, illetve negatívként, ha a sejtek több mint 50%-a nem mutatott immunreakciót.

33

4.9.1.1. A Hsp-27 immunhisztokémiai vizsgálata A Hsp-27 kifejeződését immunhisztokémiai módszerrel szövettani anyagunkból véletlenszerűen kiválasztott 24 terhességi trofoblaszt tumorban (8 részleges mola, 8 teljes mola, 8 choriocarcinoma) és 8 első trimeszterbeli egészséges méhlepény esetében vizsgáltuk. A metszeteket deparaffinizálás és hidrálás után forrásban lévő 0.01 M citrát pufferben (pH 6.0) 15 percig előkezeltük és a Hsp-27 egér, monoklonális elsődleges antitesttel (Neomarker) 1:100 hígításban inkubáltuk. Pozitív kontrollnak ismerten Hsp27 pozitív tüdő rákos esetet használtunk.

4.9.1.2. A c-erbB fehérjék családjának immunhisztokémiai vizsgálata A c-erbB fehérjéket (EGFR, c-erbB-2, c-erbB-3, c-erbB-4) kifejeződését 51 terhességi trofoblaszt betegség (16 részleges mola, 25 teljes mola, 10 choriocarcinoma) és 11 normál első trimeszteri terhességmegszakítás szövettani anyagában vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel. Az EGFR (nyúl, poliklonális), c-erbB-3 (egér, monoklonális), c-erbB-4 (nyúl, poliklonális) elsődleges antitesteket 1:400 hígításban (Oncogene Research Products) és a c-erbB-2 (egér, monoklonális) elsődleges ellenanyagot 1:100 hígításban (Novocastra) alkalmaztuk. Pozitív kontrolként az alkalmazott fehérjékre ismerten pozitív petefészek rákos eseteket használtunk.

4.9.1.3. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk immunhisztokémiai vizsgálata Ötvenegy terhességi trofoblaszt betegség (16 részleges mola, 25 teljes mola, 10 choriocarcinoma) esetében és 11 normál első trimeszteri méhlepényben vizsgáltuk az MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13 és inhibitoruk, a TIMP-1 expresszióját immunhisztokémiai módszerrel. Az MMP-1 és MMP-3 fehérjék esetében a metszeteket deparaffinizálás és hidrálás után forrásban lévő 0.01 M citrát pufferben (pH 6.0) 15 percig előkezeltük. Az MMP-2, MMP-3 és MMP-13 elsődleges antitesteket 1:800 és az MMP-1, MMP-9 és TIMP-1 elsődleges antitesteket 1:400 hígításban alkalmaztuk. Az

34

elsődleges antitestek valamennyien egér, monoklonális ellenanyagok voltak (Oncogene Research Products). Pozitív kontrollként az MMP-1 és MMP-13 esetében ismerten pozitív emlő rákos, az MMP-2 és MMP-3 esetében ismerten pozitív petefészek rákos, az MMP-9 esetében ismerten pozitív végbélrákos és a TIMP-1 esetében pedig ismerten pozitív normál petefészek eseteket használtunk.

4.9.2. Sejtvonalakon végzett immunhisztokémiai vizsgálat A Hsp-27 kifejeződését immunhisztokémiai módszerrel a normál trofoblaszt és a két choriocarcinoma sejtvonalon is megvizsgáltuk. A sejteket egyrétegben tenyésztettük speciális sejttenyésztő kamrás tárgylemezen (Becton Dickinson Labware) míg konfluensen benőtték a rendelkezésre álló teret, majd 4%-os paraformaldehid, 50 mM glicin (pH 8.0) és 0.2%-os TritonX-100 PBS (pH 7.5) oldatban fixáltuk. Fixálást követően a továbbiakban a már előzőekben leírt avidin-biotin komplex immunperoxidáz módszert alkalmaztuk. A sejteket az elsődleges Hsp-27 antitesttel (Neomarker) szobahőmérsékleten 45 percig inkubáltuk 1:200 hígításban.

4.10. In situ mRNS hibridizáció Az EGFR mRNS jelenlétét in situ hibridizációs módszerrel is tanulmányoztuk normál első trimeszteri lepényben, részleges és teljes molaterhességben és choriocarcinomában. Szövettani anyagunk mindegyik típusából véletlenszerűen 5-5 esetet választottunk ki és használtunk fel a vizsgálathoz. Az eredményeket összehasonlítottuk az immunhisztokémiai reakciókkal. Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből 4 mm vastagságú metszeteket RNáz mentes környezetben speciális ProbeOn Plus tárgylemezekre (Fisher Scientific) vittünk fel. Az egyes lépéseket a protokollt követve előregyártott oldatokkal a kapilláris elven működő Microprobe Manual Staining System (Fisher Scientific) segítségével végeztük [132]. A metszeteket deparaffinizálás, hidrálás és az endogén peroxidáz aktivitás blokkolása után 105 °C-on pepszinnel emésztettük. Ezután

35

hibridizáltunk a specifikus EGFR mRNS polyd(T)20 oligonukleotid próbát (Research Genetics) 1:100 hígításban, 45 °C-on, egy órán keresztül a szövetmintákhoz. A nem specifikusan kötődött próbák mosással való eltávolítása után a reakcióterméket DAB-al tettük láthatóvá. Hematoxilines ellenfestést követően a metszeteket kiértékelve az eredményeket az immunhisztokémiához hasonlóan negatívként, gyengén és erősen pozitívként kategorizáltunk.

4.11. Statisztikai analízis Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeinek adatait a c2 és a Fisher-féle c2

teszt használatával a StatView 4.5 statisztikai szoftver csomag segítségével

elemeztük. Statisztikailag szignifikáns különbségnek a 0.05 határértéket fogadtuk el.

36

5. EREDMÉNYEK

5.1. Gének kifejeződése a normál humán trofofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakban Az „Atlas human cDNA expression array” membránhibridizációs technikát használva 588 ismert génből a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak közötti különbségeket kerestük. Kilenc gén expressziója mutatott erős különbséget a két sejtvonal között. Ebből 3 gén esetében: a Hsp-86, a Hsp-27 és a Fibronektin receptor balegység (FR-b) gének fokozottan fejeződnek ki a normál lepény trofoblaszt sejtekben a choriocarcinoma sejtekhez képest. Hat gén: a Protoonkogén c-myc, NF-kB transzkripciós faktor p65, GATA-2 transzkripciós faktor, 60S Riboszomális fehérje L6 (RP-L6), DNS repair fehérje (HIP-116), és a humán ideg növekedési faktor (hNGF), pedig a choriocarcinomában expresszálódik erősebben a normál placentához képest [133]. A többi gén megjelenése mindkét sejtvonalban hasonló volt, vagy minimális különbséget mutatott (5.1.1. ábra és 5.1.1. táblázat). Csökkent expressziójú gének a choriocarcinomában

Fokozott expressziójú gének a choriocarcinomában

1 ➪ Hő shock fehérje – 86 (Hsp-86)

1 ➨ Protoonkogén c-myc

2 ➪ Hő shock fehérje – 27 (Hsp-27)

2 ➨ NF-kB transzkripciós faktor p65

3 ➪ Fibronektin receptor b-alegység (FR-b)

3 ➨ GATA-2 transzkripciós faktor 4 ➨ 60S Riboszomális fehérje L6 (RP-L6) 5 ➨ DNS repair fehérje (HIP-116) 6 ➨ Humán ideg növekedési faktor (hNGF)

5.1.1. táblázat Az Atlas membránon a normál trofoblaszt és a choriocarcinoma sejtvonalak között eltérő kifejeződést mutató gének A 9 erősen különböző génből három, random módon kiválasztott esetben RTPCR analízissel igazoltuk a membránon kapott eredményeket [134]. Míg a Hsp-27 PCR terméke csak a normál placenta sejtekben figyelhető meg, addig a RP–L6 és a HIP-116

37

DNS-repair enzimfehérje PCR termékei csak a choriocarcinomában fejeződnek ki (5.1.2. ábra).

5.1.1. ábra A normál humán trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak génkifejeződésének mintázata az Atlas membránhibridizációs módszerrel. A nyilak a kifejeződésbeli eltéréseket jelölik.

38

5.1.2. ábra RT-PCR analízis a normál humán trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakban Hsp-27, HIP-116 és RP-L6 primereket használva.

5.2. A Hsp-27 megjelenése a normál humán trofoblasztban és choriocarcinomában in vitro és in vivo RT-PCR analízissel a Hsp-27 cDNS-e 617 bázispár hosszúságú sávként expresszálódik az 1%-os agaróz gélen történő elektroforézist követően, amely csak a normál trofoblaszt sejtekben látható, a két choriocarcinoma sejtvonalban (JEG-3, Jar) nem mutatható ki (5.2.1. ábra).

5.2.1. ábra A Hsp-27 expressziója egy normál humán trofoblaszt és két choriocarcinoma sejtvonalon RT-PCR analízissel. Standardizáláshoz GAPDH primer párt használtunk. Mind a sejtmag, mind pedig a citoplazmatikus fehérjével végzett Western-blot technikával ezt az eredményt megerősítettük. A Hsp-27 egér monoklonális ellenanyag egy 27 kDa molekulasúlyú fehérjecsík formájában csak a normál trofoblaszt sejtvonalon jelenik meg (5.2.2. ábra).

5.2.2. ábra A Hsp-27 expressziója egy normál humán trofoblaszt és két choriocarcinoma sejtvonalon Western-blot technika alkalmazásával. Standardizáláshoz PCNA-t és b-aktint használtunk.

39

A sejtvonalak immunhisztokémiai vizsgálatának eredménye megegyezett az RTPCR és Western-blot analízisekkel kapott eredményekkel. Míg a normál trofoblaszt sejtekben erős mag és valamivel gyengébb citoplazmatikus festődés figyelhető meg, addig a két choriocarcinoma sejtvonal negatív nukleáris és citoplazmatikus Hsp-27 immunreakciót mutatott (5.2.3. ábra A, B). Az paraffinos metszeteken elvégzett immunhisztokémiai analízis azt mutatta, hogy a Hsp-27 megjelenhet a sejtmagban és a citoplazmában is. A Hsp-27 kifejeződik a szinciciotrofoblaszt sejtek magjában és citoplazmájában is, a többi sejttípusban csak citoplazmatikus festődés figyelhető meg (5.2.4. ábra A-D). A Hsp-27 nukleáris expressziója minden esetben erős pozitivitást mutatott a normál lepény, a részleges és teljes molák szinciciotrofoblaszt sejtjeiben, míg a choriocarcinomában csak 2 (25.0%) esetben volt erősen pozitív immunreakció a sejtmagokban (p<0.01, p<0.01, p<0.01, külön-külön), (5.2.1. táblázat). Szövettípus és az immunreakció lokalizációja

negatív

gyengén +

erősen +

Placenta (n=8) ST – N ST – C CT – C EVT – C

8(100.0%) 6(75.0)

2(25.0%) 1(12.5%)

8(100.0%) 6(75.0%) 1(12.5%)

Részleges mola (n=8) ST – N ST – C CT – C EVT – C

1(12.5%) 8(100.0%) 6(75.0%)

2(25.0%) -

8(100.0%) 5(62.5%) 2(25.0%)

Teljes mola (n=8) ST – N ST – C CT – C EVT – C

8(100.0%) 7(87.5%)

5(62.5%) 1(12.5%)

8(100.0%) 3(37.5%) -

Choriocarcinoma (n=8) TS – N 6(75.0%) 2(25.0%) TS – C 4(50.0%) 4(50.0%) ST: szinciciotrofoblaszt, CT: citotrofoblaszt, EVT: extravillozus trofoblaszt, TS: tumorsejt, N: magfestődés, C: citoplazmatikus festődés

5.2.1. táblázat A Hsp-27 immunhisztokémiai reakciók a vizsgált szövetek esetében

40

B

A

5.2.3. ábra A Hsp-27 kifejeződése (A) a normál trofoblaszt és (B) a choriocarcinoma (Jar) sejtvonalakon immunhisztokémiai módszerrel (nagyítás: 200x).

A

B

C

D

5.2.4. ábra A Hsp-27 kifejeződése (A) a normál méhlepényben, (B) részleges molában , (C) teljes molában és (D) choriocarcinomában immunhisztokémiai módszerrel (nagyítás: 100x).

41

A szinciciotrofoblasztok citoplazmatikus festődésében csökkenő intenzitás figyelhető meg a négy csoportban a choriocarcinomák felé haladva, és a choriocarcinoma esetekben már nem találtunk erős Hsp-27 kifejeződést. A különbség statisztikailag szignifikáns a normál placenta és a choriocarcinoma között (p<0.01), valamint a részleges mola és a choriocarcinoma között (p=0.02). Az extravillozus trofoblaszt sejtek főleg negatívak voltak, csak néhány esetben volt megfigyelhető enyhe Hsp-27 pozitív immunreakció, a citotrofoblaszt sejtek pedig egyáltalában nem festődtek. Az anyai decidua sejtek minden esetben erős citoplazmatikus festődést mutattak [133,135].

5.3. A c-erbB fehérjék kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben Az EGFR fehérjét immunhisztokémiai eljárással a normál lepény és a terhességi trofoblaszt betegségek összes sejttípusában kimutattuk (5.3.1. táblázat, 5.3.1. ábra A,B). A 20 eset kapcsán végzett EGFR mRNS kimutatása in situ hibridizációval az immunhisztokémiával kapott eredményeinket alátámasztotta (5.3.1. ábra C). Mind a 10 choriocarcinomában erős EGFR immunfestődés figyelhető meg. A reakció intenzitása choriocarcinomában és a teljes mola szinciciotrofoblasztjában szignifikánsan erősebb, mint a részleges mola és a normál méhlepény szinciciotrofoblaszt sejtekben (p<0.01, p<0.01, külön-külön). Az EGFR ugyancsak szignifikánsan erősebben fejeződik ki a teljes mola

citotrofoblaszt sejtekben, mint a részleges molában és a normál

méhlepényben (p<0.01, p=0.05, külön-külön). Statisztikailag szignifikáns különbség van a choriocarcinoma és a teljes mola

citotrofoblaszt (p=0.03), valamint a

choriocarcinoma és a teljes mola extravillozus trofoblaszt (p<0.04) EGFR festődése között. A c-erbB-2 fehérje kizárólagosan az extravillozus trofoblaszt sejtekben fejeződik ki, a boholytrofoblaszt mindkét sejttípusa festetlenül maradt (5.3.1. ábra D). Erős pozitív festődést találtunk 1 placentában (9.0%), 2 részleges molában (12.5%), 20 teljes molában (80.0%) és 7 choriocarcinomában (70.0%). A normál méhlepényhez, vagy a részleges molához hasonlítva a pozitív festődési reakció szignifikánsan erősebb a teljes

42

molában (p<0.01, p<0.01, külön-külön) és a choriocarcinomában (p<0.02, p<0.02, külön-külön). A c-erbB-3 protein 1 normál lepény kivételével valamennyi esetben és az összes vizsgált sejttípusban jelen van (5.3.1. ábra E). Míg 6 choriocarcinoma (60.0%) mutatott erős immunreaktivitást c-erbB-3-ra, addig a normál placenta, részleges és teljes mola szövetek kevesebb, mint 50.0%-a festődött erősen. A c-erbB-3 szignifikánsan erősebb immunreakciót mutatott a choriocarcinoma tumorsejtjeiben, mint a részleges mola citotrofoblaszt sejtekben (p=0.02). Egyébként a csoportok között nem találtunk összefüggést mutató statisztikailag szignifikáns különbséget. Pozitív c-erbB-4 immunfestődés volt megfigyelhető minden esetben. A normál lepényben, részleges és teljes molákban, valamint choriocarcinomában hasonló a cerbB-4 fehérje immunreakciója, nincs szignifikáns különbség a csoportok között.

5.3.1. táblázat A c-erbB onkofehérjék immunhisztokémiai reakciói a vizsgált szövetek esetében A posztmoláris terhességi trofoblaszt tumorok kialakulását vizsgálva azokban a teljes mola hydatidosákban, amelyekből perzistens betegség fejlődött ki az EGFR és a c-erbB-3 fehérje szignifikánsan erősebben festődött az extravillozus trofoblaszt sejtekben (5.3.2. táblázat). Míg erős immunreaktivitás figyelhető meg EGFR-ra azon teljes mola extravillozus trofoblaszt sejtek 100.0%-ában (8/8), amelyekből perzisztens trofoblaszt tumor alakult ki, addig a később spontán remisszióba került teljes moláknak csak 47.0%-a (8/17) mutat erős pozitivitást (p=0.02). A c-erbB-3 esetében ez az arány 75.0% (6/8) és 17.6% (3/17) a két csoportban (p<0.01) [136,137].

43

A

B

C

D

E 5.3.1. ábra Az EGFR, c-erbB-2, c-erbB-3 onkoproteinek kifejeződése terhességi trofoblaszt tumorokban. (A) EGFR choriocarcinomában (nagyítás: 100x), (B) EGFR teljes molában (nagyítás: 100x), (C) EGFR choriocarcinomában (in situ hibridizáció, nagyítás: 200x-a nyilak a tumorsejtekre mutatnak), (D) c-erbB-2 teljes molában (nagyítás: 100x), (E) c-erbB-3 teljes molában (nagyítás: 100x)

44

5.3.2. táblázat A perzisztens posztmolaris trofoblaszt tumorok kialakulásának kockázata a c-erbB onkoproteinek esetében

5.4. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoruk kifejeződése a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben A normál lepényben, részleges és teljes molában az MMP-1 elsősorban a citotrofoblaszt

és

az

extravillozus

trofoblaszt

sejtekben

fejeződik

ki.

A

choriocarcinomák közül 9 (90.0%) eset mutatott erősen pozitív immunreakciót (5.4.1./A táblázat). Az MMP-1 szignifikánsan erősebben festődik a choriocarcinoma sejtekben, mint a normál lepény, részleges mola és teljes mola szinciciotrofoblaszt sejtjeiben (p<0.01, p<0.01, p<0.01, külön-külön). Összehasonlítva a normál lepény extravillozus trofoblaszt sejtjeivel a choriocarcinoma sejtek ugyancsak szignifikánsan erősebb pozitivitást mutatnak (p=0.02). A citotrofoblaszt sejtek erősen pozitív festődést mutatnak 9 (82.0%) placentában, 15 (93.8%) részleges molában és 16 (56.2%) komplett molában (5.4.1. ábra A). Az MMP-2 a normál lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben szenvedő nők közül, pedig a részleges és teljes molákban kizárólag csak a szinciciotrofoblaszt és az extravillozus trofoblaszt sejtekben fejeződik ki. Az MMP-2 szignifikánsan erősebben festődik a choriocarcinoma sejtekben és a részleges és teljes molák extravillozus trofoblasztjaiban, mint a placenta extravillozus trofoblaszt sejtekben (p=0.04, p<0.01, p<0.01, külön-külön). A choriocarcinoma sejtek szignifikánsan erősebb pozitivitást mutatnak a normál lepény, a részleges és a teljes

45

molaszövet szinciciotrofoblaszt sejtjeihez képest (p<0.01, p=0.05, p<0.01, külön-külön), (5.4.1. ábra B, C) Erősen

pozitív

MMP-3

immunreaktivitást

csaknem

kizárólag

a

szinciciotrofoblaszt sejtekben találtunk: 4 (36.0%) normál lepény, 12 (75.0%) részleges mola, 10 (40.0%) teljes mola esetében. A citotrofoblaszt, az extravillozus trofoblaszt és a choriocarcinoma sejtek többségében gyengén pozitív, vagy negatív festődést kaptunk. Az egyes sejttípusokra vonatkoztatva a szövettani csoportok között nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget.

5.4.1./A táblázat Az MMP-1, MMP-2, és MMP-3 immunhisztokémiai reakciói a vizsgált szövetek esetében Az MMP-9 kifejeződés mind a három trofoblaszt sejttípusban és a tumorsejtekben is kimutatható. Az MMP-9 a teljes mola szinciciotrofoblaszt sejtjeiben szignifikánsan erősebb festődést mutatott, mint a placenta szinciciotrofoblaszt sejtekben (p=0.03). Egyébként a normál lepényben, részleges és teljes molákban, valamint a choriocarcinomában az MMP-9 immunreakciója hasonló volt, nincs szignifikáns különbség a csoportok között (5.4.1./B táblázat). Az MMP-13 kifejeződés mind a három trofoblaszt sejttípusban és a tumor sejtekben is kimutatható és az immunreakciók pozitivitása a vizsgált szövetekben hasonló, nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között. A citotrofoblaszt sejtek többségében negatív, a szinciciotrofoblasztok, az extravillozus trofoblasztok és a choriocarcinoma sejtek pedig többségében gyengén pozitív festődést mutattak.

46

A

B

C

D

E 5.4.1. ábra Az MMP-1, MMP-2 és TIMP-1 kifejeződése a terhességi trofoblaszt betegségekben. (A) MMP-1 choriocarcinomában (nagyítás: 100x), (B) MMP-2 choriocarcinomában (nagyítás: 100x), (C) MMP-2 teljes molában (nagyítás: 100x), (D) TIMP-1 részleges molában (nagyítás: 100x), (E) TIMP-1 choriocarcinomában (nagyítás: 200x). 47

Erősen pozitív TIMP-1 immunreaktivitást főleg a szinciciotrofoblaszt sejtekben találtunk, a citotrofoblasztok és az extravillozus trofoblasztok majdnem minden esetben gyengén festődtek. A szinciciotrofoblaszt sejtek erősen pozitív TIMP-1 kifejeződést mutattak 8 (73.0%) normál lepényben, 14 (87.5%) részleges molában és 19 (76.0%) teljes molában. A choriocarcinoma sejtekben erős festődési reakciót nem észletünk, ezért a különbség szignifikáns (p<0.01, p<0.01, p<0.01, külön-külön), (5.4.1. ábra D, E).

5.4.1./B táblázat Az MMP-9, MMP-13, és TIMP-1 immunhisztokémiai reakciói a vizsgált szövetek esetében Végül a posztmoláris terhességi trofoblaszt tumorok kialakulásának kockázatát vizsgálva ezeknek a proteáz enzimeknek a kifejeződése a perzisztens betegséggé átalakuló teljes mola hydatidosákban nem különbözik szignifikánsan a méhkiürítést követően spontán remisszióba került teljes mola esetekben tapasztaltaktól (5.4.2. táblázat) [138]

48

gyengén +

MMP-1 erősen +

p

gyengén +

MMP-2 erősen +

p

gyengén +

MMP-3 erősen +

p

Szinciciotrofoblaszt sr 14 pttt 7

3 1

NS

15 7

2 1

NS

12 3

5 5

NS

Citotrofoblaszt sr 5 pttt 4

12 4

NS

-

-

-

17 8

-

-

Extravillozus trofoblaszt sr 5 12 1 16 17 pttt 5 3 NS 1 7 NS 8 sr: spontán remisszió (n=17), pttt: perzisztens terhességi trofoblaszt tumor (n=8), NS: nem szignifikáns

5.4.2./A táblázat A perzisztens posztmolaris trofoblaszt tumorok kialakulásának kockázata az MMP-1, MMP-2 és MMP-3 esetében

gyengén +

MMP-9 erősen +

p

gyengén +

MMP-13 erősen +

p

gyengén +

TIMP-1 erősen +

p

Szinciciotrofoblaszt sr 7 pttt 3

10 5

NS

11 3

6 5

NS

4 2

13 6

NS

Citotrofoblaszt sr 11 pttt 3

6 5

NS

17 8

-

-

17 8

-

-

Extravillozus trofoblaszt sr 14 3 16 1 17 pttt 7 1 NS 7 1 NS 8 sr: spontán remisszió (n=17), pttt: perzisztens terhességi trofoblaszt tumor (n=8), NS: nem szignifikáns

5.4.2./B táblázat A perzisztens posztmolaris trofoblaszt tumorok kialakulásának kockázata az MMP-9, MMP-13 és a TIMP-1 esetében

49

6. MEGBESZÉLÉS

6.1. A normál humán trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak közötti eltérő génkifejeződés A terhességi choriocarcinomák patogenezisében szerepet játszó molekuláris szintű mechanizmusok nem teljesen tisztázottak. Mind a mai napig ismereteink hiányosak maradtak a molaterhesség kiürítése után kifejlődő terhességi trofoblaszt tumorok korai molekulár-biológiai előrejelzőiről. Jelen pillanatban, tehát nincs olyan biológiai marker, amelynek jelenléte mellett a trofoblaszt sejtek malignus elfajulása bizonyítottan bekövetkezne [139]. Számos citogenetikai és molekuláris biológiai laboratóriumi módszert használnak ezeknek a molekuláris változásoknak a felderítésére. A legtöbb probléma azonban az ismert fehérje szintű (Western-blot, immunhisztokémia) és nukleinsav szintű (RT-PCR, Northern-blot) metodikákkal, hogy ezek egy molekulára, vagy génre fókuszálnak egy időben. Mivel a trofoblaszt sejtek proliferációjának és differenciálódásának autokrin és parakrin szabályozása, valamint a trofoblaszt invázió folyamatának koordinációja transzkripciós szinten zajlik, ezért hasznosabbnak tűnik egy cDNS könyvtár használata, amellyel a normál és tumoros sejtvonalak, illetve szövetek génállománya hasonlítható össze [84,140]. A nukleinsav panelek használatával a sejtek genomikus szerkezetét és akár több ezernyi részleges, vagy teljes génszekvencia kifejeződését lehet tanulmányozni [141]. A különböző üveg, gél és nylon nukleinsav panelek a kereskedelemben megvásárolhatóak, azonban előállítási költségeik és drága kiegészítő felszerelések szükségessége miatt a kutatók számára a mai napig nem könnyen elérhetőek. A nylon membrán előnye a többivel szemben

hogy,

mind

kvalitatív,

mind

pedig kvantitatív

analízise egyszerű

autoradiográfiával megoldható [140]. Tanulmányunkban in vitro normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak génexpresszióját hasonlítottuk össze az „Atlan human cDNA expression array” membránhibridizációs módszerrel. Az Atlas membránokon 9 gén kifejeződése különbözött jelentős mértékben: 6 fokozott expressziót, 3 pedig csökkent expressziót

50

mutatott a choriocarcinoma sejtekben (5.1.1. táblázat) [133]. Ezek közül három esetben RT-PCR eljárással is igazoltuk a hibridizációval kapott eredményeket [134]. A daganatokban a c-myc kifejeződés szabályozási zavara általános, ami arra utal, hogy aktivációja lényeges lehet a különböző tumorok karcinogenezise során. A cmyc-nek nyilvánvaló jelentősége van a sejtproliferáció indukciójában, valamint a sejthalál (apoptózis) beindításában. Ezért fokozott expresszióját összefüggésbe hozzák az igen agresszív rákok kialakulásával [65]. Fülöp és munkatársai a c-myc onkogén erős kifejeződését találták choriocarcinomában [76]. Az NF-kB transzkripciós faktor a Rel onkogén család terméke és számos fontos sejtműködést befolyásoló gén indukciójában játszik szerepet [142]. Az NF-kB egy olyan heterodimer molekula, amely két alegységből, a p50-ből (NFKB1) és a P65-ből (RelA) áll és a citoplazmában inhibitor molekulájával, az IkB-vel komplexet alkotva inaktív formában foglal helyet. Ha a sejt valamilyen külső ingerre aktiválódik, az NFkB gátló fehérjéjétől elválik és a p65 alegység a sejtmagba transzlokálódik, ahol számos DNS szakasz promoter régiójához kötődve a transzkripciót serkenti [143]. Néhány onkogén, köztük a c-myc aktivációját fokozza, amivel a malignus átalakulást segíti elő. Szerepet

játszik

számos

sejtadhéziós

molekula

és

citokin

termelődésének

szabályozásában, amelyek az invázióban és a metasztázis képzésben lehetnek fontosak [144]. Elsősorban szolid tumorokban (petefészek rák, hasnyálmirigy rák) mutatták ki fokozott kifejeződését in vitro és in vivo [145,146]. Az NF-kB p65, tehát jelentős szerepet kap a rosszindulatú daganatok kialakulásában és progressziójában. Higgins és munkatársai egérmodellen az NF-kB p65 gátlásával a tumor fejlődést megállították és a daganat regresszióját érték el. Ennek alapján az NF-kB blokkolása egy új terápiás lehetőség lehet a carcinomák kezelésében [147]. A méhlepényben nagy mennyiségben termelődő

szteroid

hormonok

az

NF-kB

transzkripciós

faktor

termelődését

szupresszálják [148]. Az Atlas membránon tapasztalt fokozott NF-kB p65 expressziót choriocarcinomában Western-blot technikával is megerősítettük (nem közölt adat). Piao és munkatársai kimutatták, hogy a GATA-2 erősen kifejeződik a JEG-3 és Jar choriocarcinoma sejtvonalakban; azonban a GATA-2 a lepényi trofoblaszt differenciálódásában is döntő szerepet játszik [149].

51

A RP-L6, a HIP-116, a hNGF, a Hsp-86 és a FR-b potenciális működését és expresszióját

a

terhességi

trofoblaszt

betegségekben

korábban

még

nem

tanulmányozták. A hNGF bizonyos idegrendszeri daganatokban erősebben fejeződik ki, míg a FR-b száma a sejtek felszínén egyes kötőszöveti tumorokban felszaporodik [150,151]. A Hsp-86 stresszfehérje a nagy molekulasúlyú Hsp-90 családjába tartozik, és fontos szerepe van több jelátvivő folyamat beindításában [152]. Az irodalomban eddig nem szerepel a Hsp-86 kifejeződése és malignus folyamat közötti összefüggés lehetősége. A Hsp-27 további elemzését és szerepének megbeszélését a következő alfejezetben tárgyalom. Jelenleg a laboratóriumunkban folyó tanulmányok során, a Hsp86, a FR-b, a c-myc, az NF-kB p65, a GATA-2, az RP-L6, a HIP-116 és a hNGF faktorok kifejeződését és potenciális szerepét vizsgáljuk tovább a terhességi trofoblaszt tumorokban. Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy az „Atlas human cDNA expression array” membránhibridizációs technika hasznos és alkalmas módszer a normál és tumoros sejtek génkifejeződési különbségeinek meghatározásra. Alkalmas továbbá olyan biológiai markerek keresésére is, amelyek a későbbiekben diagnosztikus és prognosztikus értékűek lehetnek a malignus betegségek előrejelzésében. Összefoglalva, adataink arra utalnak, hogy a különböző mértékben expresszálódó gének meghatározása fontos betekintést adhat a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisébe és további kutatást érdemelhet.

6.2. A Hsp-27 lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a choriocarcinomában A Hsp-27 a kis molekulasúlyú stressz fehérjék csoportjába tartozik (27 kDa). Biológiai

funkcióját

tekintve

dajkafehérje

(chaperon-molekula),

több

szignál

transzdukciós folyamatban játszik szerepet (pl.: MAP-kinázok, MAPKAP kinázok) más fehérjék stabilizációjával [153]. Az exponált hidrofób felszínek blokkolásával a fehérjeaggregációt megakadályozza, és izolált környezetet biztosít a fehérjék korrekt tekeredéséhez, amik a sejtek biológiai funkciójának megtartásához szükségesek [154]. Mikroszkópikusan

a

Hsp-27

molekula

a

legtöbb

sejtben,

a

citoplazmában

perinukleárisan, közel a Golgi komplexhez helyezkedik el. Azonban ha stressz éri a

52

sejtet, foszforiláció útján aktiválódik és a sejtmagba traszportálódik, ahol funkcionális hatását kifejti. Aktiválhatja az egyes onkogéneket (c-myc), növekedési faktorokat (EGF) és citokineket (IL-1) [153]. Ösztrogén szenzitív szövetekben nagyobb mennyiségben expresszálódik. Például az ösztrogén fázisú endometrium proliferációját elősegíti, annak biológiai markerének is tekintik [153]. Padwich és munkatársai, valamint Morrish és munkatársai magas Hsp-27 kifejeződést találtak az anyai decidua és a boholy trofoblaszt sejtekben. Ezt az eredményt saját immunhisztokémiai vizsgálatainkkal is alátámasztottuk és feltételezhető, hogy a Hsp-27-nek funkciónális szerepe van a korai placenta fejlődésében és differenciálódásában [155,156]. Az eddigi adatok szerint a Hsp-27 éppúgy erősen kifejeződik az ösztrogén érzékeny emlőrákban, mint az ösztrogén-receptor pozitív méhnyak-, méhtest- és prosztatarákokban, megjelenését prognosztikai faktornak is tekintik [157-160]. Továbbá megfigyelték, hogy a Hsp-27 nagy koncentrációban expresszálódik az egyes gyomor és agy rosszindulatú daganataiban, valamint az akut limfoblasztos leukémiában [153,161163]. Ennek alapján feltételezhető, hogy a Hsp-27 szerepet játszik számos humán malignus tumor patogenezisében. Az talán kevésbé ismert, azonban feltétlenül említést érdemel, hogy a Hsp-27 a kemoterápia rezisztencia kialakulásában is fontos lehet. A Hsp-27 foszforilációjával a molekula konformáció változáson megy keresztül, amely olyan intracelluláris folyamatokat indít el, melynek következtében az aktin filamentumok átrendeződnek és a citoszkeleton stabilizálódik, ami a fokozott termotolerancián kívül, gyógyszer rezisztenciát is okoz a malignus sejtekben [121,122,164]. A Hsp-27 kemoterápia érzékenységet befolyásoló hatása eddig a doxorubicin, amfotericin-B, ciszplatin, vinblasztin és az aktinomicin-D rezisztencia kialakulásában igazolt [165]. Több tanulmány kísérletei bizonyítják ezt a szerepét, amikor is a Hsp-27 pozitív citosztatikumra rezisztens sejtvonalból a létrehozott Hsp-27 gént tartalmazó plazmidot citosztatikumra

érzékeny sejtvonalba

(emlő-, vastagbél-, hererák sejtvonalak)

transzfektálják és az elszaporodó sejtek citosztatikumra rezisztennsé váltak [153,166]. A choriocarcinoma még kiterjedt metasztázisok jelenlétében is kivételesen jól gyógyítható kemoterápiával. A Hsp-27 lecsökkent expressziója choriocarcinomában, hozzájárulhat a betegség kifejezett kemoterápia érzékenységéhez.

53

Jelen tanulmányunkban a Hsp-27 eltérő megjelenését, nevezetesen csak a normál trofoblaszt sejtekben való kifejeződését igazoltuk RT-PCR, Western-blot és immunhisztokémiai

módszerekkel

nukleinsav

és

fehérje

szinteken

in

vitro

sejtvonalakon. Mivel az in vitro körülmények között tenyésztett sejtvonalak teljes mértékben elveszíthetik eredeti tulajdonságaikat, ezért az immunhisztokémiai vizsgálatot formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövettani metszeteken is elvégeztük. Az eredmény, hasonló volt, a choriocarcinomában csökkent, a placentában fokozott expressziót találtunk [133,135]. Összefoglalva a leírtakat feltételezhető, hogy a Hsp-27 szerepet játszik a korai lepény kialakulásában, fejlődésében és a trofoblasztok differenciálódásában. A Hsp-27 szerepet játszik egyes rosszindulatú daganatok, főleg az ösztrogén szenzitív tumorok kialakulásában, illetve a tapasztalatok szerint erős expressziója rossz prognózist jelent. Ezen kívül a Hsp-27-nek a kemoterápia rezisztencia kialakításában játszott szerepéből, valamint a choriocarcinomában való hiányos kifejeződéséből kiindulva magyarázatot találhatunk a trofoblaszt tumorok egyedülálló kemoterápia érzékenységére. Ennek a bizonyítására

természetesen

laboratóriumunkban.

még

Amennyiben

további azonban

funkcionális

kísérletek

feltételezésünk

igaz,

szükségesek a

betegség

felismerésekor kiszűrhetőek lennének a kemoterápiára rezisztens esetek, és ezeknél a betegeknél erősebb citosztatikus szerek kombinációja, vagy a megszokott protokolloktól elérően, új és eredeti kezelési lehetőségek jönnének szóba.

6.3. A c-erbB onkogének és fehérjetermékeiknek lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben A malignus betegségek egyik karakterisztikus jellemzője a kontrollálatlan sejtproliferáció, ezért a növekedési faktorok és azok receptorai a rákkutatás központi témái közé tartoznak [86,161]. Az EGFR és a c-erbB-2 fehérjékről több tanulmányban leírták, hogy szerepet játszanak számos human rosszindulatú daganat patogenezisében és klinikai viselkedésében, köztük a gyomor-, vastagbél-, emlőrákokéban [167-169]. Továbbá kimutatták, hogy a c-erbB-2 fehérje erős kifejeződése a malignus betegség rossz prognózisának előrejelzője lehet [76,169]. A c-erbB-3 és c-erbB-4 az utolsó

54

évtizedben kimutatott proteinek, amelyek szintén az c-erbB onkogén család fehérjetermékei. Ezen, két fehérje erős pozitív kifejeződését találták gyomor, kolorektális, pajzsmirigy és méhnyak carcinomákban [99,125,170-173]. Az irodalomban az EGFR kifejeződésére vonatkozóan, a terhességi trofoblaszt tumorokkal kapcsolatosan fellelhető adatok meglehetősen ellentmondóak. LadinesLlave és munkatársai immunperoxidáz eljárást használva csökkent EGFR expressziót találtak choriocarcinoma esetek 78%-ában [124]. Szemben ezzel az eredménnyel Filla és munkatársai ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) módszer alkalmazásával tízszer nagyobb koncentrációban mutatták ki az EGFR fehérjét tenyésztett choriocarcinoma sejtekben, mint normál, jóindulatú citotrofoblaszt sejtvonalban [88]. Hasolóan Chen és munkatársai, valamint Steller és munkatársai erős EGFR kifejeződést

találtak

RRA

(Radioreceptor

assay)

módszerrel

különböző

choriocarcinoma sejtkultúrákban [90,95]. Ebben a tanulmányban azt figyeltük meg, hogy az EGFR kifejeződése choriocarcinomában és a teljes mola szincicio- és citotrofoblaszt sejtjeiben szignifikánsan erősebb, mint a részleges mola és a placenta szincicio- és citotrofoblasztjaiban. Ez a megfigyelés az immunhisztokémiai és az in situ mRNS hibridizációs módszerrel végzett kísérletekben egyaránt összhangban volt. Ugyancsak szignifikánsan nagyobb a c-erbB-2 protein koncentrációja a choriocarcinoma tumorsejtjeiben és a teljes mola extravillozus trofoblaszt sejtjeiben, mint a részleges molában és a normál méhlepényben. Általánosságban a c-erbB-3 és c-erbB-4 fehérjék megjelenése azonban nem különbözött a normál lepény és a terhességi trofoblaszt betegségek csoportjai között. Végül kimutattuk, hogy az EGFR és a c-erbB-3 fehérjék erős kifejeződése a teljes mola hydatidosák extravillozus trofoblaszt sejtjeiben szignifikáns összefüggésben van a posztmoláris perzisztens trofoblaszt tumorok kialakulásával [136,137]. Ehhez hasonlóan, Balaram és munkatársai közleménye szerint szoros kapcsolat figyelhető meg az EGFR expressziója és a posztmoláris trofoblaszt daganatok, illetve a choriocarcinomák között [174]. Összefoglalva, az eredményeinkből arra következtethetünk, hogy az EGFR és a vele rokon c-erbB onkogén család kifejeződése kulcsszerepet játszhat a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisében és megjelenésében. Ugyanakkor az EGFR és cerbB-3 proteinek emelkedett koncentrációja teljes molákban korai markerként jelezheti

55

a perzisztens posztmoláris terhességi trofoblaszt tumorok kifejlődését a méhkiürítést követően. Azonban a c-erbB onkogén család és fehérje termékeinek pontos biológiai szerepe, kapcsolatuk a különböző szövettani és prognosztikus paraméterekhez még további kutatómunkát igényel a terhességi trofoblaszt betegségek és egyéb malignus daganatok patogenezisének és viselkedésének megértésében.

6.4. A mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik lehetséges szerepe a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben Az MMP-ket saját inhibitorain kívül több szöveti faktor (citokinek, növekedési faktorok, stb.) is szabályozza és a szövetekre kifejtett hatásuk az aktív és inaktív formáiknak az arányától függenek [175]. Mivel az MMP-k az ECM komponenseinek széles spektrumát képesek proteolízis révén bontani, felvetődik a kérdés, hogy szerepet játszanak a rosszindulatú daganatok lokális inváziójában, illetve távoli metasztázis képzésében [176]. Az MMP-k aktivitásának kifejeződését számos humán malignus tumorban vizsgálták in vivo és in vitro tanulmányokban [175-189]. Irodalmi adatok szerint az MMP-1 és az MMP-2 a gasztrointesztinális daganatféleségek többségében erősen kifejeződik [177-179]. Továbbá, Murray és munkatársai kimutatták, hogy az MMP-1 kifejeződés erőssége összefüggésben van a nyelőcső és a kolorektális rákok rossz prognózisával [178,179]. Ezen kívül, az MMP-2 szerepet játszhat a prosztata, a méhnyak és a méhtest rákok kialakulásában is [180-185]. Davidson és munkatársai kimutatták, hogy az MMP-2 és az MMP-9 felerősödése szerepet játszik a méhnyak laphám és adenocarcinomájának kialakulásában és az immunreakció utal a betegség várható kimenetelére [183,185]. Az MMP-3 és az MMP-13 aktivitásának növekedését figyelték meg emlő rákokban [105,186]. A szájüregi daganatok esetében az MMP-3 a stromasejt eredetű tumorokban, míg az MMP-13 a laphám carcinomákban fejeződik ki fokozottan [187,188]. Az MMP-k általános inhibitorának, a TIMP-1-nek gyenge expresszióját mutatták ki gyomorrák és méhnyakrák esetén [182,189]. Ezek alapján érthető, hogy napjainkban az MMP-k családja lehetséges célponttá vált azon intenzív kutatások számára, amelyek egy új anti-neoplasztikus terápia kifejlesztésére irányulnak.

56

Ebben a tanulmányban az MMP-k kifejeződését és lehetséges szerepét vizsgáltuk a terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál méhlepényben. Az régóta ismert,

hogy

a

terhességi

trofoblaszt

tumorok

gyors

lokális

invázióra

és

metasztatizálódásra hajlamos tulajdonságokkal rendelkeznek [24]. Az utóbbi években az is nyilvánvalóvá vált, hogy a normál lepényben az extravillozus trofoblaszt sejtek az ECM enzimatikus bontásával betörnek az endometriumba, mely folyamatban - az anyai szervezet által szabályozottan - az MMP-k más proteolitikus enzimekkel együtt szerepet játszanak [100,119]. Vizsgálataink során megfigyeltük, hogy az MMP-1 és az MMP-2 kifejeződése choriocarcinomában szignifikánsan erősebb, mint a normál méhlepény, részleges és teljes molák szinciciotrofoblaszt sejtjeiben, valamint a normál méhlepény extravillozus trofoblaszt sejtekben. Ugyancsak szignifikánsan erősebb MMP-2 immunreaktivitást találtunk a részleges és a teljes molák extravillozus trofoblaszt sejtjeiben, mint a normál lepény extravillozus trofoblasztjaiban. Az MMP-3, az MMP-9 és az MMP-13 megjelenése nem különbözött a placenta és a terhességi trofoblaszt betegségek csoportjai között. A TIMP-1 szignifikánsan alacsonyabb koncentrációban fejeződött ki a choriocarcinomában, mint a normál lepényben, a részleges molában és a teljes molában. Végül nem találtunk összefüggést a vizsgált enzimek és a posztmoláris perzisztens trofoblaszt tumorok kialakulása között [138]. Eredményeinkből arra következtethetünk, hogy az MMP-k és szöveti inhibitoraik

fontos

szerepet

játszhatnak

a

terhességi

trofoblaszt

betegségek

patogenezisében és progressziójában. A terhességi trofoblaszt tumorok általában kifejezetten érzékenyek a kemoterápiára és jelen tanulmányunkban is valamennyi beteg teljes remissziót ért el. Azonban néhány alkalommal gyógyszerrezisztens esetek is előfordulnak, ezért folyamatosan szükség van új hatásmechanizmusú és támadáspontú kemoterápiás szerek kifejlesztésére, valamint értékelésére. A jelenleg kísérletes stádiumban lévő MMP-k aktivitását gátló molekulák (batimastat, marimastat, stb.) új terápiás lehetőséget kínálnak fel a terhességi trofoblaszt tumorok, illetve egyéb malignus

daganatok

kezelésében

[190,191].

A

batimastat

és

a

marimastat

állatmodelleken az MMP-1, az MMP-2, az MMP-3, az MMP-7, az MMP-9 és az MMP14 hatását gátolja, ami a TIMP-1 hatásspektrumának felel meg [191]. Az MMP család tagjainak aktivitása és a terhességi trofoblaszt betegségek közötti kapcsolat még sok

57

eddig ismeretlen kérdést vet fel és pontos tisztázásához még további kutatómunka szükséges. *** Munkám során olyan onkogéneket és tumorszupresszor géneket, illetve azok fehérjetermékeit kerestem, amelyek a későbbiekben biológiai markerként szolgálhatnak a klinikai gyakorlatban a terhességi trofoblaszt tumorok esetében. Mivel a placentáció során olyan sejtek találhatóak a korai méhlepényben, amelyek a malignus daganat sejtekhez hasonló invazív tulajdonságokkal rendelkeznek, ezért az invazív trofoblaszt sejtek, a tumorsejtek analógjaként, a tumorkutatásban széleskörűen használatosak. Azonban a placentáció folyamata az anyai és embrionális szövetek által termelt növekedési faktorok, citokinek, stb. hatására parakrin és autokrin módon, szigorúan szabályozott. Amennyiben ez a koordinált önregulációs folyamat valamilyen endogén, vagy exogén hatás következtében zavart szenved, az a sejtek kontrollálatlan növekedéséhez, proliferációjához, azaz malignus transzformációjához vezethet. Ennek a beindításához egy-egy gén, illetve fehérjetermékének mutációja, valamint csökkent, illetve fokozott expressziója elegendő lehet. In vitro sejtvonalakon és szövettani metszeteken végzett kísérleteinkben sikerült találni ilyen géneket, növekedési faktor receptorokat és proteolitikus enzimeket, amelyek összefüggésbe hozhatóak a terhességi trofoblaszt tumorok patogenezisével. Mivel az egyes intra- és extracellulárisan zajló folyamatokat szabályozó egymással kapcsolatban lévő biológiai tényezők aktivitása egymástól nagymértékben függ, ezeknek a feltételezéseknek a bizonyításához és megértéséhez még további, elsősorban funkcionális kísérletek szükségesek. Remélem, hogy a kutatómunkám során tapasztalt eredmények az állandóan bővűlő ismeretanyag részeként további tudományos kisérletek kiindulópontját és alapját képezhetik.

58

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

E helyen szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik közvetve, vagy közvetlenül támogatták kutatómunkámat és segítségemre voltak abban, hogy ez a dolgozat elkészülhessen, kiemelten: ·

Dr. Doszpod József professzor úrnak, klinikaigazgatómnak, aki lehetőséget adott számomra, hogy tudományos kutatómunkát végezhessek, támogatott külföldi tanulmányutamon, emellett szakmai fejlődésem mellett tanácsaival, útmutatásaival és bizalmával lehetővé tette, hogy ebbe a Ph.D. programmba bekacsolódhattam;

·

Dr. Fülöp Vilmosnak, témavezetőmnek, a tőle kapott szakmai tanácsokért, emberi értékekért és az együtt dolgozás élményéért. Számos elfoglaltsága mellett, azokat félredobva, sokszor szakított időt rám, hazai és külföldi munkám során;

·

Dr. Kopper László professzor úrnak, témavezetőmnek, aki értékes tanácsaival hozzájárult értekezésem végső formájának elkészüléséhez;

·

Dr. Földi Jánosnak és Páldi-Haris Piroskának az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet vezető munkatársainak, akik a kísérleti munka örömeibe bevezettek és szakmai irányításukkal, önzetlenül támogatták munkám sikerességét;

·

Dr. Ross S. Berkowitz és Samuel C. Mok harvardi professzoroknak, akik elméleti és gyakorlati tanácsaikkal hozzásegítettek és garanciát szolgáltattak Egyesült Államokbeli eredményeim eléréséhez;

·

Dr. Selcuk Z. Tuncer kollégának, akivel a Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológia Laboratóriumában ösztöndíjasokként közös kutatási témában együtt dolgoztam;

·

Minden kollégámnak és laboratóriumi munkatársamnak;

·

Végül családomnak, akik minden nehézségben végig mellettem álltak. Külön kifejezem hálámat feleségemnek, Ramonának, aki a szakmai munka békés, nyugodt és szeretetteljes magánéleti hátterét, sokszor nem kis lemondással, biztosította számomra, amely nélkül ez a disszertáció nem készülhetett volna el.

59

8. IRODALOMJEGYZÉK

1. Paulin F: A trofoblaszt betegségei (Kóros terhesség). In: Papp Z: A szülészetnőgyógyászat tankönyve. Semmelweis, Budapest, 334-339, 1999. 2. Lawler S, Fisher R, Dent J: A prospective genetic study of complete and partial hydatidiform moles. Am J Obstet Gynecol 164: 1270, 1991. 3. Goldstein DP, Berkowitz RS: Gestational trophoblastic neoplasms: clinical principles of diagnoses and management. WB Saunders, Philadelphia, PE, 143-175, 1982. 4. Genest DR, Laborde O, Berkowitz RS, et al: A clinicopathologic study of 153 cases of complete hydatidiform mole (1980-1990): Histologic grade lacks prognostic significance. Obstet Gynecol 78: 402, 1991. 5. Azuma C, Saji F, Nobunaga T, et al: Studies on the pathogenesis of choriocarcinoma by analysis of restriction fragment lenght polymorphisms. Cancer Res 50: 488, 1990. 6. Bishop JM: Molecular themes in oncogenesis. Cell 64: 235, 1991. 7. Li MC, Hertz R, Spencer DB: Effect of methotrexate therapy on choriocarcinoma and chorioadenoma. Proc Soc Exp Biol 93: 361, 1956. 8. Hammond CB, Borchert LG, Tyrey L, Creasman WT, Parker RT: Treatment of metastatic trophoblastic disease: Good and poor prognosis. Am J Obstet Gynecol 115: 451, 1973. 9. Goldstein DP, Goldstein PR, Bottomley P, Osathanondh R, Marea AR: Methotrexate with citrovorum factor rescue for nonmetastatic gestational trophoblastic neoplasms. Obstet Gynecol 48: 321, 1976. 10. Berkowitz RS, Goldstein DP, Bernstein MR: Ten years’ experience with methotrexate and folinic acid as primary therapy for gestational trophoblastic disease. Gynecol Oncol 23: 111, 1986. 11. Ágoston J, Káplár Z: Fogamzóképes kor után manifesztálodó chorioepithelioma eseteink. Magy Nőorv L 5: 294, 1960. 12. Csömör S, Dömötöri J: Észrevételek a chorioepithelioma kapcsolatban. Magy Nőorv L 31, 246, 1968.

I

malignummal

13. Szigetvári I: A mola hydatidosa. In: Doszpod J: Az intrauterin magzat. Medicina, Budapest, 262-290, 2000. 14. Brewer JI, Rinehart JJ, Dunbar RW: Choriocarcinoma – a report of the 5 or more years’ survival from the Albert Mathieu Chorioepithelioma registry. Am J Obstet Gynecol 81: 574, 1961. 15. Hertz R, Lewis Jr. JL, Lipsett MB: Five years experience with chemotherapy of metastatic choriocarcinoma and related trophoblastic tumors in women. Am J Obstet Gynecol 82: 631, 1961. 16. Hertz R: Biological aspects of gestational neoplasms derived from trophoblast. Ann NY Acad Sci 172: 279, 1971. 17. World Health Organization Group on Gestational Trophoblastic Diseases: Gestational Trophoblastic Diseases. Technical Report Series N°692, Genova, WHO, 1983. 18. Tidy JA, Rustin GJS, Newlands ES, Foskett, Fuller S, Short D, Rowden P: Presentation and management of choriocarcinoma after nonmolar pregnancy. Br J Obstet Gynecol 102: 1740-1748, 1995 19. Soper JT, Evans AC, Conaway MR, Clarke-Pearson DL, Berchuk A, Hammond CB: Evaluation of prognostic factors and staging in gestational trophoblastic tumor. Obstet Gynecol 84: 969-973, 1994. 20. Goldstein DP, Zanten-Przybysz IV, Berstein MR, Berkowitz RS: Revised FIGO staging system for gestational trophoblastic tumors. Recommendations regarding therapy. J Reprod Med 43: 37-43, 1998. 21. Lewis Jr. JL: Diagnosis and management of trophoblastic disease. Cancer 71: 16391647, 1993. 22. Szigetvári I: A trofoblaszt megbetegedések biológiai sajátosságai és korszerű kezelése. Doktori értekezés, Budapest, 1991. 23. Käser O: Epidemiological aspects of choriocarcinoma. Br Med J 3: 606, 1975. 24. Berkowitz RS, Goldstein DP: Chorionic tumor. N Eng J Med 335: 1740-1748, 1996. 25. Berkowitz RS, Bernstein MR, Harlow BL, Rice LW, Lage JM, Goldstein DP, Cramer DW: Case-control study of risk factors for partial molar pregnancy. Am J Obstet Gynecol 173: 788-794, 1995. 26. Szigetvári I: A rosszindulatú trofoblasztmegbetegedések korszerű diagnosztikája. Stádiumbeosztás és prognosztikai tényezők. Magy Nőorv L 45: 167, 1982.

II

27. Szepesi J, Szigetvári I, Fülöp V: A molaterhesség és a terhességi trofoblaszt daganatok korszerű diagnózisa és kezelése. Magy Nőorv L 59: 171, 1996. 28. Harada A, Hershman JM, Reed AW: Comparison of thyroid stimulators and thyroid hormones concentrations in the sera of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 48: 793, 1979. 29. Cole LA: hCG, its free subunits and its metabolites. Roles in pregnancy and trophoblastic disease. J Reprod Med 43: 3-10, 1998. 30. O’Quinn AG, Barnard DE: Gestational trophoblastic diseases. In: DeCherney AH, Pernoll ML: Current Obstetrics and Gynecology. Diagnosis and Treatment. Appleton and Lange, Norwalk, CT, 967-976, 1994. 31. Berkowitz RS, Goldstein DP: The management of molar pregnancy and gestational trophoblastic tumors. In: Knapp RC, Berkowitz RS: Gynecologic Oncology. 2nd ed. McGraw-Hill, New York, NY, 328-338, 1993. 32. Mangili G, Spagnolo D, Valsecchi L, Maggi R: Transvaginal ultrasonography in persistent trophoblastic tumor. Am J Obstet Gynecol 169: 1218-1223, 1993. 33. Lage JM, Sheikh SS: Early complete hydatidiform mole. Pathology Case Reviews 2: 278-283, 1997. 34. Keep D, Zaragoza MV, Hassold T, Redline RW: Very early complete hydatidiform mole. Hum Pathol 27: 708-713, 1996. 35. Paradinas FJ, Browne O, Fisher RA, Foskett M, Bagshawe KD, Newlands E: A clinikal and histopathological and flow cytometric study of 149 complete moles, 146 partial moles and 107 non-molar hydropic abortions. Histopathology 28: 101109, 1996. 36. Ober WB, Edgomb JH, Price EB: The pathology of choriocarcinoma. Ann NY Acad Sci 172: 299, 1971. 37. Berkowitz RS, Goldstein DP: Presentation and management of molar pregnancy. In: Hancock BW, Newlands ES, Berkowitz RS: Gestational trophoblastic disease. Chapman and Hall, London, 127-142, 1997. 38. Vassilakos P, Riotton G, Kajii T: Hydatidiform mole: Two entities: A morphologic and cytogenetic study with some clinical considerations Am J Obstet Gynecol 127: 167-170, 1977. 39. Lage J, Driscoll S, Yavner D, et al: Hydatidiform moles: Application of flow cytometry in diagnosis. Am J Clin Pathol 89: 419, 1988.

III

40. McFadden DE, Kalousek DK: Two different phenotypes of fetuses with chromosomal triploidy: Correlation with parental origin of the extra haploid set. Am J Med Genet 38: 535, 1991. 41. Szigetvári I, Szepesi J: Trofoblaszttumorok. In: Doszpod J, Cseh I: A szülészet és nőgyógyászat aktuális kérdései. Medicina, Budapest, 351-366, 1999. 42. Tuncer ZS, Bernstein MR, Goldstein DP, Lu KH, Berkowitz RS: Outcome of pregnancies occuring within 1 year of hydatidiform mole. Obstet Gynecol 94: 588590, 1999. 43. Tuncer ZS, Bernstein MR, Goldstein DP, Berkowitz RS: Outcome of pregnancies occuring before completion of human chorionic gonadotropin follow-up in patients with persistent gestational trophoblastic tumor. Gynecol Oncol 73: 345-347, 1999. 44. Sand P, Lurain J, Brewer J: Repeat gestational trophoblastic disease. Obstet Gynecol 142: 140, 1984. 45. Tuncer ZS, Bernstein MR, Wang J, Goldstein DP, Berkowitz RS: Repetitive hydatidiform mole with different male partners. Gynecol Oncol 75: 224-226, 1999. 46. Jones WB: Gestational trophoblastic disease: what have we learned in the past decade? Am J Obstet Gynecol 162: 1286-1295, 1990. 47. Osada H, Kawata M, Yamada M, et al: Genetic identification of pregnancies responsible for choriocarcinomas after multiple pregnancies by restriction fragment length polymorphism analysis. Am J Obstet Gynecol 165: 682, 1991. 48. Ko TM, Hsieh CY, Ho NH, et al: Restriction fragment length polymorphism analysis to study the genetic origin of complete hydatidiform mole. Am J Obstet Gynecol 164: 901, 1991. 49. Vejerslev L, Larsen G, Jacosen M: Partial hydatidiform mole with subsequent trophoblastic tumor: A case report. Eur J Obstet Gynecol 40: 73, 1991. 50. Fisher RA, Newlands ES: Gestational trophoblastic disease. Molecular and genetic studies. J Reprod Med 43: 87-97, 1998. 51. Vejerslev LO, Fisher RA, Surti U, et al: Hydatidiform mole: Cytogenetically unusual cases and their implications for the present classification. Am J obstet Gynecol 157: 180, 1987. 52. Kajii T, Ohama K: Androgenetic origin of hydatidiform mole. Nature 268: 633-634, 1977. 53. Azuma C, Saji F, Tokugawa Y, et al: Application of gene amplification by polymerase chain reaction to genetic analysis of mitochondrial DNA: The detection

IV

of anuclear empty ovum as the cause of complete mole. Gynecol Oncol 40: 29, 1991. 54. Lawler SD, Fisher RA, Pickthall VJ, et al: Genetic studies on hydatidiform moles: The origin of partial moles. Cancer Genet Cytogenet 5: 309, 1982. 55. Yamashita K, Wake N, Araki T, et al: Human lymphocyte antigen expression in hydatidiform mole: Androgenesis following fertilization with haploid sperm. Am J Obstet Gynecol 135: 597, 1979. 56. Jacobs PA, Wilson CM, Sprenkle AJ, Rosenheim NB, Midgeon BR: Mechanism of origin of complete moles. Nature 286: 714, 1980. 57. Surani MAH, Barton SC, Norris ML: Nucler transplantation in the mouse: Heritable differences between parental genomes after activation of embryonic genome. Cell 45: 127-136, 1986. 58. Habibian R, Surti S: Cytogenetics of trophoblasts from complete hydatidiform moles. Cancer Genet Cytogenet 29: 271, 1987. 59. Davis JR, Surwit EA, Garay JP, et al: Sex assignment in gestational trophoblastic neoplasia. Am J obstet Gynecol 148: 722, 1984. 60. Fisher RA, Lawler SD, Povey S, Bagshawe KD: Genetically homozygous choriocarcinoma following pregnancy with hydatidiform mole. Br J Cancer 58: 788, 1988. 61. Fisher RA, Lawler SD, Omerod MG: Flow cytometry used to distinguish between complete and partial hydatidiform moles. Placenta 8: 249-256, 1987. 62. Redline RW, Hassold T, Zaragoza MV: Prevalence of the partial molar phenotype in triploidy of maternal and paternal origin. Hum Pathol 28: 505-511, 1998. 63. Lage JM, Weinberg DS, Yavner DL, Bieber FR: The biology of tetraploid hydatidiform moles: Histopathology, cytogenetics, and flow cytometry. WB Saunders, 1989. 64. Williams GT, Smith CA: Molecular regulation of apoptosis: Genetic controls on cell death. Cell 74: 77, 1993. 65. Cheung ANY, Srivastava G, Pittaluga S, Man TK, Ngan H, Collins RJ: Expression of c-myc and c-fms oncogenes in trophoblastic cells in hydatidiform mole and normal human placenta. J Clin Pathol 46: 204-207, 1993. 66. Adamson ED: Expression of proto-oncogenes in the placenta. Placenta 8: 449, 1987. 67. Ohlsson R: Growth factors, protooncogenes and placental development. Cell Growth Differ 28: 1, 1989.

V

68. Diebold J, Arnholdt H, Lai MD, et al: C-myc expression in early human placenta: A critical evaluation of its localization. Virchows Arch (B) 61: 65, 1991. 69. Fülöp V, Cseh I, Szigetvári I, Mok SC, Szepesi J, Gáti I, Berkowitz RS, Doszpod J: A K-ras gén mutáció szerepe és a bcl-2 valamint a c-myc onkofehérjék kifejeződése terhességi trofoblaszt betegségekben. Magy Nőorv L 62: 289-295, 1999. 70. Fülöp V, Cseh I, Mok SC, Szigetvári I, Szepesi J, Dancsó J, Végh Gy, Berkowitz RS: A c-erbB-2 és a c-fms onkogének kifejeződése a normál lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben. Magy Nőorv L 62: 39-43, 1999. 71. Nelson MD: Apoptotic changes occur in syncytiotrophoblast of human placental villi where fibrin type fibrinoid isdeposited at discontinuities in the villuos trophoblast. Placenta 17: 387-391, 1996. 72. Sach L, Lotem J: Control of programmed cell death in normal and leucemic cells: New implications for therapy. Blood 82: 15-21, 1993. 73. Wang DG, Johnston CF, Atkinson AB, et al: Expression of bcl-2 oncoprotein in pituitary tumors: comparison with c-myc. J Clin Pathol 49: 795-797, 1996. 74. Fanidi A, Harrington EA, Evan GI: Cooperative interaction between c-myc and bcl2 protooncogenes. Nature 359: 554-556, 1992. 75. Pezzela F, Gatter K: What is the value of bcl-2 protein detection for histopathologists? Histopathol 26: 89, 1995. 76. Fülöp V, Mok S, Genest DR, Szigetvári I, Cseh I, Berkowitz RS: c-myc, c-erbB-2, c-fms and bcl-2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complet mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 43: 101-110, 1998. 77. Shimizu T, Miwa W, nakarmori S, et al: Absence of a miuation of the p21/WAF1 gene in human lung and pancreatic cancers. Jpn J Cancer Res 87: 275, 1996. 78. Haines DS, Landers JE, Engle LJ: Physical and functional interaction between wildtype p53 and mdm2 proteins. Mol Cell Biol 14: 1171, 1994. 79. Cordon-Cargo C, Latres E, Drobnjak M, et al: Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res 54: 794, 1994. 80. Xiao ZX, Chen J, Levine AJ, et al: Interaction between the retinoblastoma protein and the oncoprotein mdm2. Nature 375: 694, 1995. 81. Fulop V, Mok SC, Genest DR, Gati I, Doszpod J, Berkowitz RS: p53, p21, Rb and mdm oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 43: 119-127, 1998. 82. Hunter T: Oncoprotein networks. Cell 88: 333-346, 1997.

VI

83. Diatchenko L, Lau Y-FC, Campbell AP: Suppression substractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA 93: 6025-6030, 1996. 84. DeRisi J, Penland L, Brown PO: Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer. Nature Genet 14: 457-460, 1996. 85. Knöfler M, Kalionis B, Huelseweh, Bilban M, Morrish DW: Novel genes and transcription factors in placental development. Troph Res 14: 71-73, 2000. 86. Prigent SA, Lemoine NR: The Type I (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Prog Growth Factor Res 4: 1-24, 1992. 87. Cao H, Lei ZM, Bian L, Rao ChV: Functional nuclear epidermal growth factor receptors in human choriocarcinoma JEG-3 cells and normal human placenta. Endocrinology 136: 3163-3172, 1995. 88. Filla MS, Kaul KL: Relative expression of epidermal growth factor receptor in placental cytotrophoblasts and choriocarcinoma cell lines. Placenta 18: 17-27, 1997. 89. Hofmann GE, Horowitz GM, Scott RT, Navot D: Transforming growth factor-a in human implantation trophoblast: Immunohistochemical evidence for autocrine/paracrine function. J Clin Endocrinol Metab 76: 781-785, 1993. 90. Chen F, Goto S, Nawa A, Okamata T, Tomoda Y: Receptor binding of epidermal growth factor in cultured human choriocarcinoma cell lines: effects of actinomycinD and methotrexate. Nagoya J Med Sci 52: 5-11, 1990. 91. Miyachi Y, Terazono T, Nagao N, et al: Epidermal growth factor (EGF) receptors in human chorionic gonadotropin-producing tumor; Transplantation in nude mice and effect of EGF on tumor growth. J Clin Endocrinol Metab 71: 329-334, 1990. 92. Kawamoto T, Mendelsohn J, Le A, et al: Relation of epidermal growth factor receptor concentration to growth of human epidermoid carcinoma A431 cells. J Biol Chem 259: 7761-7766, 1984. 93. Downward J, Yarden Y, Mayes E, Scrace G, Totty N, Stockwell P, Waterfield MD: Close similarity of epidermal growth factor receptor and v-erbB oncogene protein sequences. Nature 307: 521-527, 1994. 94. Bulmer JN, Johnson PM: Immunohistochemical characterization of the decidual leukocyte infiltrate related to endometrial gland epithelium in early human pregnancy. Immunology 49: 35, 1985. 95. Steller MA, Mok SC, Yeh J, Fulop V, Anderson DJ, Berkowitz RS: Effects of cytokines on epidermal growth factor receptor expression by malignant trophoblast cells in vitro. J Reprod Med 39: 209-215, 1994.

VII

96. Aboagye-Mathiesen G, Zdravkovic M, Toth FD, Ebbesen P: Effects of human trophoblast-induced interferons on the expression of proto-oncogenes c-fms/CSF1R, EGF-R and c-erbB2 in invasive and non-invasive trophoblast. Placenta 18: 155161, 1997. 97. Lelle RJ, Talavera F, Gretz H, Roberts JA, Menon KM: Epidermal growth factor receptor expression in three different human endometrial cancer cell lines. Cancer 72: 519-525, 1993. 98. Kraus MH, Issing W, Miki T, Popescu NC, Aaranson SA: Isolation and characterization of erbB-3, a third member of ERB/epidermal growth factor receptor family: evidence for overexpression in a subset of human mammary tumors. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9193-9197, 1989. 99. Haugen DR, Akslen LA, Varhaug JE, Lillehaug JR: Expression of c-erbB-3 and cerbB-4 proteins in papillary thyroid carcinomas. Cancer Res 56: 1184-1188, 1996. 100. Crescimanno C, Foidart JM, Noel A, Polette M, Maquoi E, Birembaut P, Baramova E, Kaufmann P, Castellucci M: Cloning of choriocarcinoma cells shows that invasion correlates with expression and activation of gelatinase A. Exp Cell Res 227: 240-251, 1996. 101. Huppertz B, Kerschanska S, Demir AY, Frank HG, Kaufmann P: Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases (MMP), their substrates, and their inhibitors (TIMP) during trophoblast invasion in the human placenta. Cell Tissue Res 291: 133-148, 1998. 102. Bischof P, Haenggeli L, Campana A: Gelatinase and oncofetal fibronectin expression is dependent on integrin expression on human cytotrophoblasts. Hum Reprod 10: 734-742, 1995. 103. Sato H, Takino T, Okada Y: A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature 370: 61-65, 1994 104. Leber T, Boyd R, Balkwill F: Tumour Cell-stromal Cell Interactions: Proteases and Protease Inhibitors, in: Sharp F, Blackett T, Berek J, Bast R: Ovarian Cancer 5. Isis Medical Media Ltd, Oxford, 121-129, 1998. 105. Bischof P, Meisser A, Campana A: Paracrine and autocrine regulators of trophoblast incasion – A review. Troph Res 14: 55-60, 2000. 106. Castellucci M, Theelen T, Pompili E, Fumagalli L, De Renzis G, Muhlhauser J: Immunohistochemical localization of serine-protease inhibitors in the human placenta. Cell Tissue Res 278: 283-289, 1994. 107. Denhardt DT, Feng B, Edwards DR: Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP, akaEPA): structure, control of expression and biological functions. Pharmacol Ther 59: 329-341, 1993.

VIII

108. Pijnenborg R, Dixon G, robertson WB, Brosens I: Trophoblastic invasion of human decidua from 8 to 18 weeks of pregnancy. Placenta 1: 3-19, 1980. 109. Shimonovitz S, Hurwitz A, Hochner-Celnikier D, Dushnik M, Anteby E, Yagel S: expression of gelatinase B by trophoblast cells: Down-regulation by progesteron. Am J Obstet Gynecol, 178: 457-461, 1998. 110. Yagel S, Geva TE, Solomon H, Shimonovitz S, Reich R, Finci-Yeheskel Z, Mayer M, Milwidsky A: High level of hCG retard first trimester trophoblast invasion in vitro by decreasing urokinase plasminogen activator and collagenase activities. J Clin Endocrinol Metab 77: 1506-1511, 1993. 111. Emonard H, Christiane Y, Smet M, Grimaud JA, Foidart JM: Type IV and interstitial collagenolytic activities in normal and malignant trophoblast cells are specifically regulated by extracellular matrix. Invasion Metastasis 10: 170-177, 1990. 112. Damsky CH, Sutherland A, Fisher SJ: Extracellular matrix 5: adhesive interactions in early mammalian embryogenesis, implantation, and placentation. FASEB J 7: 1320-1329, 1993. 113. Winterhager E, Kaufmann P, Gruemmer R: Cell-cell-communication during placental development and possible implications for trophoblast proliferation and differentiation. Troph Res 14: 61-68, 2000. 114. Winterhager E, von Ostau C, Gerke M, Gruemmer R, Traub O, Kaufmann P: Connexin expression patterns in human trophoblast cells during placental development. Placenta 20: 627-638, 1999. 115. Hellmann P, Winterhager E, Spray DC: Properties of connexin40 gap junction channels endogenously expressed and exogenously overexpressed in human choriocarcinoma cell lines. Eur J Physiol 432: 501-509, 1996. 116. Unemori EU, Ehsani N, Wang M, Lee S, Mcguire J, Amento E: Interleukin 1 and transforming growth factor alpha synergistic stimulation of metalloproteinases, PGE2 and proliferation in human fibroblasts. Exp Cell Res 210: 166-171, 1994. 117. Bischof P, Meisser A, Campana A, Tseng L: Effects of decidua conditioned medium and insulin-like growth factor binding protein-1 on trophoblast matrix metalloproteinases and their inhibitors. Placenta 19: 457-462, 1998. 118. Hamilton GS, Lysiak JJ, Han VK, Lala PK: Autocrine-paracrine regulation of human trophoblast invasiveness by insulin-like growth factor (IGF)-II and IGFbinding protein (IGFBP)-1. Exp Cell Res 214: 147-152, 1998. 119. Lala PK, Graham CH: Mechanism of trophoblast invasiveness and their control: the role of proteases and protease inhibitors. Cancer Metast Rev 9: 369-379, 1994.

IX

120. Fülöp V, Szigetvári I, Szepesi J, Gáti I, Doszpod J: Újabb adatok a normál lepény és a terhességi trofoblaszt betegségek onkogenetikájához. Nőgyógyászati Onkológia 3: 211-223, 1997. 121. Garrido C, Ottavi P, Fromentin A, Hammann A, Arrigo AP, Chauffert B, Mehlen P: Hsp-27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs. Cancer Res 57: 2661-2667, 1997. 122. Richards EH, Hickey E, Weber L, Masters JRW: Effect of overexpression of small heat shock protein Hsp-27 on the heat and drug sensitivities of human testis tumor cells. Cancer Res 56: 2446-2451, 1996. 123. Cao H, Lei ZM, Rao Ch. V: Transcriptional and posttranscriptional mechanisms in epidermal growth factor regulation of human chorionic gonadotropin (hCG) subunits and hCG receptor gene expression in human choriocarcinoma cells. Endocrinology 135: 962-970, 1995. 124. Ladines-Llave CA, Maruo T, Manalo AM, Mochizuki M: Decreased expression of epidermal growth factor and its receptor in the malignant transformation of trophoblasts. Cancer 71: 4118-4123, 1993. 125. Maurer CA, Friess H, Kretschmann B, Zimmermann A, Stauffer A, Baer HU, et al: Increased expression of erbB3 in colorectal cancer is associated with concomitant increase in the level of erbB2. Human Pathol 29: 771-777, 1998. 126. Cameron B, Gown AM, Tamimi HK: Expression of c-erbB-2 oncogene product in persistent gestational trophoblastic disease. Am J Obstet Gynecol 170: 16161622, 1994. 127. Matrisian LM: The matrix-degrading metalloproteinases. Bioassays 14: 455, 1992. 128. Chambers AF, Matrisian LM: changing view of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. JNCI 89: 1260, 1997. 129. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. 130. PolyATtractâmRNA Corporation, 1998. 131.

isolation

systems

Technical

Manual,

Promega

Atlasä cDNA Expression arrays User Manual, Clontech Laboratories, 1997.

132. Parks CS, Brigati DJ, Manahan LJ: Automated molecular pathology: one-hour in situ DNA hybridization. J Histotechnol 14: 219-229, 1991.

X

133. Vegh GL, Fulop V, Liu Y, Ng SW, Tuncer ZS, Genest DR, Paldi-Haris P, Foldi J, Mok SC, Berkowitz RS: Differential gene expression pattern between normal human trophoblast and choriocarcinoma cell lines: Downregulation of Heat shock protein-27 in choriocarcinoma in vitro and in vivo. Gynecol Oncol 75: 391-396, 1999. 134. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Cseh I, Mok SC, Szepesi J, Szigetvári I, Berkowitz RS, Doszpod J: Génkifejeződés eltéréseinek meghatározása normál és malignus trofoblaszt sejtvonalak között membránhibridizációs módszerrel. Magy Nőorv L 63: 403-407, 2000. 135. Fülöp V, Végh Gy, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Doszpod J, Földi J: A hő shock fehérje-27 kifejeződése normál méhlepényben és a choriocarcinomában. Magy Nőorv L 64: 23-27, 2001. 136. Tuncer ZS, Vegh GL, Fulop V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Expression of epidermal growth factor receptor-related family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta and its relationship with development of postmolar tumor. Gynecol Oncol 77: 389-393, 2000. 137. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Genest DR, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Földi J, Szepesi J, Szigetvári I, Doszpod J: Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbB onkogének és termékeinek szerepe terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál lepényben. Magy Nőorv L 63: 129-134, 2000. 138. Vegh Gy, Tuncer ZS, Fulop V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Gynecol Oncol 75: 248-253, 1999. 139. Durand S, Dumur C, Flury A, Abadie P, Patrito L, Podhajcer O, Genti-Raimondi S: Altered mitochondrial gene expression in human gestational trophoblastic diseases. Placenta 22: 220-226, 2001. 140. Bilban M, Head S, Desoye G, Quaranta V: DNA microarrays: A novel approach to investigate genomics in trophoblast invasion – A review. Troph Res 14: 99-105, 2000. 141. Sehgal A, Boynton AL, Vermeulen SS, Yonemura KS, Kohler EP, Aldape HC, Simrell CR, Murphy GP: Application of the differential hybridization of Atlasä human expression array technique in the identification of differentially expressed genes in human glioblastoma multiforme tumor tissue. J Surg Oncol 67: 234-241, 1998. 142. Sharma HW, Narayanan R: The NF-kB transcription factor in oncogenesis. Anticancer Res 16: 589-596, 1996.

XI

143. Wang W, Abbruzzese JL, Evans DB, Larry L, Cleary KR, Chiao PJ: The nuclear factor-kB RelA transcription factor is constitutively activated in human pancreatic adenocarcinoma cells. Clin Cancer Res 5: 119-127, 1999. 144. La Rosa FA, Pierce JW, Sonenshein GE: Differential regulation of the c-myc oncogene promoter by NF-kB Rel family of transcription factors. Mol Cell Biol 14: 1039-1044, 1994. 145. Sharma HW, Perez JR, Higgins-Sochaski K, Hsiao R, Narayanan R: Transcription factor decoy approach to decipher the role of NF-kB in oncogenesis. Anticancer Res 16: 61-70, 1996. 146. Bours V, Dejardin E, Goujon-Letawe F, Merville MP, Castronovo V: The NFkB transcription factor and cancer: high expression of NF-kB and IkB related proteins in tumor cell lines. Biochem Pharmacol 47: 145-149, 1994. 147. Higgins KA, Perez JR, Coleman TA, Dorshkind K, McComas WA, Sarmiento UM, Rosen CA, Narayanan R: Antisense inhibition of the p65 subunit of NF-kB blocks tumorigenicity and causes tumor regression. Proc Natl Acad Sci. USA 90: 9901-9905, 1993. 148. Rosen T, Krikun G, Ma Y, Wang EZ, Lockwood CJ, Guller S: Chronic antagonism of nuclear factor-kB activity in cytotrophoblasts by Dexamethasone: A potential mechanism for antiinflammatory action of glucocorticoids in human placenta. J Clin Endocrinol Metab 83: 3647-3652, 1998. 149. Piao YS, Peltoketo H, Vihko P, Vihko R: The proximal promoter of the gene encoding human 17b-hydroxisteroid dehydrogenase type 1 contains GATA, AP-2, and Sp1 response elements: analysis of promoter function in choriocarcinoma cells. Endocrinology 138: 3417-3425, 1997. 150. Weiner HL: The role of growth factor receptors in central nervous system development and neoplasia. Neurosurgery 37: 179-193, 1995. 151. Akiyama SK, Larjava H, Yamada KM: Differences in the biosynthesis and localization of the fibronectin receptor in normal and transformed cultured human cells. Cancer Res 50: 1601-1607, 1990. 152. Dale EC, Yang X, Moore SK, Shyamala G: Murine 86-kDa heat shock protein gene and promoter. Cell Stress Chaperones 2: 87-93, 1997. 153. Ciocca DR, Oesterreich S, Chamness GC, McGuire WL, Fuqua SA: Biological and clinical implication s of heat shock protein 27.000 (Hsp-27): a review. J Natl Cancer Inst 85: 1558-1570, 1993. 154. Schnaider T: A 90 kDa molekulatömegű dajkafehérjék funkcióinak biokémiai alapjai. Doktori (Ph.D.) értekezés, 2000.

XII

155. Padwick ML, Whitehead M, King RJB: Hormonal regulation of Hsp-27 expression in human endometrial epithelial and stromal cells. Mol Cell End 102: 914, 1994. 156. Morrish DW, Linetsky E, Bhardwaj D, Li H, Dakour, J, March RG, Paterson MC, Godbout R: Identification by substractive hybridization of a spectrum of novel and unexpected genes associated with in vitro differentiation of human cytotrophoblast cells. Placenta 17: 431-441, 1996. 157. Tetu B, Brisson J, Landry J, Huot J: Prognostic significance of heat-shock protein-27 in node-positive breast carcinoma: an immunohistochemical study. Breast cancer Res Treat 36: 93-97, 1995. 158. Storm FK, Mahvi DM, Gilchrist KW: Lack of association between tumor necrosis and Hsp-27 expression in primary breast cancer. J Sur Oncol 61: 14-16, 1996. 159. Ciocca DR, Puy LA, Fasoli LC: Study of estrogen receptor, progesterone receptor, and estrogen-regulated Mr 24.00 protein in patient with carcinomas of the endometrium and cervix. Cancer Res 49: 4126-4129, 1989. 160. Thomas SA, Brown IL, Hollins GW, Hocken A, Kirk D, King RJ, Leake RE: Detection and distribution of heat shock proteins 27 and 90 in human benign and malignant prostatic tissue. Br J Urol 77: 367-372, 1996. 161. Khalid H, Tsutsumi K, Yamashita H, Kishikawa M, Yasunaga A, Shibata S: Expression of the small heat shock protein (Hsp) 27 in human astocytomas correlates with histopathologic grades and tumor growth fractions. Cell Mol Neurobiol 15: 257-268, 1995. 162. Strahler JR, Kuick R, Hanash SM: Diminished phosphorylation of a heat shock protein (Hsp-27) in infant acute lymphoblastic leukemia. Biochem Biophys Res Commun 175: 134-142, 1991. 163. Strahler JR, Kuick R, Eckerskorn C, Lottspeich F, Richardson BC, Fox DA, Stoolman LM, Hanson CA, Nichols D, Tueche HJ: Identification of two related markers for common acute lymphoblastic leukemia as heat shock proteins. J Clin Invest 85: 200-207, 1990. 164. Lavoie JN, Lambert H, Hickey E, Weber LA, Landry J: Modulation of cellular thermoresistance and actin filament stability accompanies phosphorilation-induced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27. Mol Cell Biol 15: 505516, 1995. 165. Ciocca DR, Fuqua AW, Lock-Lim S, Toft DO, Welch J, McGuire WL: Response of human breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic drugs. Cancer Res 52: 3648-3654, 1992.

XIII

166. Oesterreich S, Weng CN, Qiu M, Hilsenbeck SG, Osborne K, Fuqua SAW: The small heat shock protein Hsp-27 is correlated with growth and drug resistance in human breast cancer cell lines. Cancer Res 53: 4443-4448, 1993. 167. Muhlhauser J, Crescimanno C, Kaufman P, Hofler H, Zaccheo D, Castellucci M: Differentiation and proliferation patterns in human trophoblast revealed by c-erbB-2 oncogene product and EGFR. J Histochem Cytochem 41: 165-173, 1993. 168. Poller DN, Spendlove I, Baker C, Ellis IO, Plowman GD, Mayer RJ: Production and characterization of a polyclonal antibody to the c-erbB3 protein: examination of c-erbB-3 protein expression in adenocarcinomas. J Pathol 168: 275-280, 1992. 169. Bodey B, Bodey Jr. B, Groger AM, Luck JV, Siegel SE, Taylor CR, et al: Clinical and prognostic significance of the expression of the c-erbB-2 and c-erbB-3 oncoproteins in primary and metastatic malignant melanomas and breast carcinomas. Anticancer Research 17: 1319-1330, 1997. 170. Travis A, Pinder SE, Robertson JF, Bell JA, Wencyk P, Gullick WJ, et al: cerbB-3 in human breast carcinoma: expression and relation to prognosis and established prognostic indicators. Br J Cancer 74: 229-233, 1996. 171. Riese DJ, vanRaaij TM, Plowman GD, Andrews GC, Stern DF: The cellular response to neuroregulins is governed by complex interactions of the erbB receptor family. Mol Cell Biol 15: 5770-5776, 1995. 172. Karameris A, Kanavaros P, Aninos D, Gorgoulis V, Mikou G, Rokas T, et al: Expression of epidermal growth factor (EGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric and colorectal carcinomas. An immunohistological study of 63 cases. Pathol Res Pract 189: 133-137, 1993. 173. Chang J, Tsao Y, Liu D, Han C, Lee W, Chen S: The expression of type I growth factor receptors in the squamous neoplastic changes of the uterine cervix. Gynecol Oncol 73: 62-71, 1999. 174. Balaram P, John M, Rajalekshmy TN, Nair B, Schultz G, Nair K: Expression of epidermal growth factor in gestational trophoblastic diseases. J Cancer Res Clin Oncol 123: 131, 1997. 175. Cottam DW, Rees RC: Regulation of matrix metalloproteinases: their role in tumor invasion and metastasis (Review). Intl J Oncol 2: 861-872, 1993. 176. Murphy G, Reynolds JJ, Hembry RM: Metalloproteinases and cancer invasion and metastasis. Intl J Cancer 44: 757-760, 1989. 177. Murray GI, Duncan ME, Arbucle E, Melvin WT, Fothergill JE: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gastric cancer. Gut 43: 791-797, 1998.

XIV

178. Murray GI, Duncan ME, O’Neil P: Matrix metalloproteinase-1 is associated with poor prognosis in colorectal cancer. Nat Med 2: 461-462, 1996. 179. Murray GI, Duncan ME, O’Neil P: Matrix metalloproteinase-1 is associated with poor prognosis in oesophageal cancer. J Pathol 185: 256-261, 1998. 180. Montironi R, Fabris G, Lucarini G, Biagini G: Location of 72-kD metalloproteinase (type IV collagenase) in untreated prostatic adenocarcinoma. Path Res Pract 191: 1140-1146, 1995. 181. Montironi R, Lucarini G, Castaldini C, Galluzzi CM, Biagini G, Fabris G: Immunohistochemical evaluation of type IV collagenase (72-kD metalloproteinase) in prostatic intraepithelial neoplasia. Anticancer Res 16: 2057-2062, 1996. 182. Tamakoshi K, Kikkawa F, Nawa A, Ishikawa H, Mizuno K, Tamakoshi A, Yamagata S, Suganuma N, Tomoda Y: Characterization of extracellular matrix degrading proteinase and its inhibitor in gynecologic cancer tissues with clinically different metastatic form. Cancer 76: 2565-2571, 1995. 183. Davidson B, Goldberg I, Liokumovich P, Kopolovic J, Gotlieb WH, LernerGeva L, Reder I, Ben-Baruch G, Reich R: Expression of metalloproteinases and their inhibitors in adenocarcinoma of the uterine cervix. Intl J Gynecol Pathol 17: 295-301, 1998. 184. Talvensaari-Mattila A, Apaja-Sarkkinen M, Hoyhtya M, Westerlund A, Puistola U, Turpeenniemi-Hujanen T: Matrix metalloproteinase 2 immunoreactive protein appears early in cervical epithelial dedifferentiation. Gynecol Oncol 72: 306-311, 1999. 185. Davidson B, Goldberg I, Kopolovic J, Lerner-Geva L, Gotlieb WH, Weis B, Ben-Baruch G, Reich R: Expression of matrix metalloproteinase-9 in squamous cell carcinoma of the uterine cervix - Clinicopathologic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization. Gynecol Oncol 72: 380386, 1999. 186. Ioachim EE, Athanassisdou SE, Kamina S, Carassavoglou K, Agnantis NJ: Matrix metalloproteinase expression in human breast cancer: An immunohistochemical study including correlation with cathepsin D, Type IV collagen, laminin, fibronectin, EGFR, c-erbB-2 oncoprotein, p53, steroid receptors status and proliferative indices. Anticancer Res 18: 1665-1670, 1998. 187. Kusukawa J, Sasaguri Y, Morimatsu M, Kameyama T. Expression of matrix metalloproteinase-3 in stage I and II squamous cell carcinoma of the oral cavity. J Oral Maxillofac Surg 53: 530-534, 1995. 188. Uria JA, Balbin M, Lopez JM, Alvarez J, Vizoso F, Takgawa M, Lopez-Otin C: Collagenase-3 (MMP-13) expression in chondrosarcoma cells and its regulation by basic fibroblast growth factor. Am J Pathol 153: 91-101, 1998.

XV

189. Sawatsubashi M, Mizokami H, Tokunaga O, Shin T: Expression of MMP-1, TIMP-1 and Type I collagen in laryngeal carcinoma. Mod Pathol 11: 878-885, 1998. 190. Wojtowitz-Praga S, Torri J, Johnson M, Steen V, Marchall J, Ness E, Bickson R, Sale M, Rasmussen HS, Chiodo TA, Hawkins MJ: Phase I trial Marimastat, a novel matrix metalloproteinase inhibitor, administered orally to patients with advanced lung cancer. J Clin Oncol 16: 2150-2156, 1998. 191. Rasmussen HS, McCann PP: Matrix metalloproteinase inhibition as a novel anticancer strategy: a review with specifial focus on batimastat and marimastat. Pharmacol Ther 75: 69-75, 1997.

XVI

9. FÜGGELÉK

Publikáció lista

1. Az értekezéssel kapcsolatos külföldi közlemények: 1. Végh Gy, Tuncer ZS, Fülöp V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Gynecol Oncol 75: 248-253, 1999. (IF: 1.860) 2. Végh Gy, Fülöp V, Liu Y, Ng SW, Tuncer ZS, Genest DR, Páldi-Haris P, Földi J, Mok SC, Berkowitz RS: Differential gene expression pattern between normal human trophoblast and choriocarcinoma cell lines: Downregulation of Heat shock protein-27 in choriocarcinoma in vitro and in vivo. Gynecol Oncol 75: 391-396, 1999. (IF: 1.860) 3. Tuncer ZS, Végh Gy, Fülöp V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Expression of epidermal growth factor receptor-related family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta and its relationship with development of postmolar tumor. Gynecol Oncol 77: 389-393, 2000. (IF: 1.860)

2. Az értekezéssel kapcsolatos hazai közlemények: 4. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Cseh I: A protoonkogének és tumorszupresszor gének kifejeződése terhességi trofoblaszt tumorokban és a normál lepényben. In: A szülészet-nőgyógyászat aktuális elméleti és gyakorlati kérdései. Ed: Cseh I; Richter Gedeon RT, Budapest, 1998, 252-255. (ISBN: 963-715218010) 5. Fülöp V, Mok S, Szigetvári I, Szepesi J, Gáti I, Dancsó J, Végh Gy, Berkowitz RS, Doszpod J: Módosított, szelektív kalcium-foszfát precipitációs módszer alkalmazása a choriocarcinoma sejtekbe történő géntranszfekcióra. Klin Kisérl Med 25: 88-92, 1999. 6. Fülöp V, Cseh I, Mok S, Szigetvári I, Szepesi J, Dancsó J, Végh Gy, Berkowitz RS: A c-erbB-2 és c-fms onkogének kifejeződése normál lepényben és terhességi trofoblaszt betegségekben. Magy Nőorv L 62: 39-43, 1999.

XVII

7. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Genest DR, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, PáldiHaris P, Földi J, Szepesi J, Szigetvári I, Doszpod J: Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbB onkogének és termékeinek szerepe terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál lepényben. Magy Nőorv L 63: 129-134, 2000. 8. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Szepesi J, Szigetvári I, Gáti I, Doszpod J: Az MMP-1, MMP-3 és MMP-9 tumormarkerek megjelenése terhességi trofoblaszt tumorokban és a normál lepényben: Immunhisztokémiai analízisen alapuló tanulmány. Magy Nőorv L 63: 241-245, 2000. 9. Fülöp V, Végh Gy, Cseh I: Az onkogének és tumor szupresszor gének, valamint egyéb funkcionális fehérjék szerepe a normál lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben. (review) A fogamzástól a változás koráig 3(1-2): 27-44, 2000. 10. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Cseh I, Mok SC, Szepesi J, Szigetvári I, Berkowitz RS, Doszpod J: Génkifejeződés eltéréseinek meghatározása normál és malignus trofoblaszt sejtvonalak között membránhibridizációs módszerrel. Magy Nőorv L 63: 403-407, 2000. 11. Fülöp V, Végh Gy, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Doszpod J, Földi J: A hő shock fehérje-27 kifejeződése normál méhlepényben és a choriocarcinomában. Magy Nőorv L 64: 23-27, 2001. 12. Fülöp V, Végh Gy, Doszpod J: A c-erbB családba tartozó onkofehérjék a normális lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben (in vitro vizsgálatok). Orv Hetil 142: 1147-1154, 2001. 13. Végh Gy, Tuncer ZS, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Saoud G, Páldi-Haris P, Földi J, Doszpod J, Fülöp V: A zselatinázok és inhibitoruk szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál lepényben. A fogamzástól a változás koráig 2001. (in press)

3. Egyéb közlemények: 14. Cseh I, Végh Gy, Dancsó J: A portio vaginalis uteri diagnosztikus konizációja a terhesség alatt. Magy Nőorv L 60: 221-225, 1997. 15. Cseh I, Dancsó J, Thürmer A, Végh Gy, Arató G: Különböző cytológiai anyagvevő eljárások hatása a cervix szűrés eredményességére. Magy Nőorv L 61: 135-142, 1998.

XVIII

16. Fülöp V, Végh Gy: A differenciáldiagnózis és progresszív betegellátás szerepe az uterus hegszétválás sikeres kezelésében. Magy Nőorv L 63: 246-248, 2000. 17. Murányi Z, Illyés M, Vajda M, Zsirai L, Végh Gy, Drávucz S: 24 órás ambuláns vérnyomás monitorizálással szerzett tapasztalataink patológiás terhességekben. Magy Nőorv L 63: 439-443, 2000. 18. Dancsó J, Vajda M, Végh Gy, Fülöp V: Testösszetétel vizsgálata bioelektromos impedancia analízissel. Magy Nőorv L 64, 2001. (in press)

4. Idézhető absztraktok:

19.Mitsányi A, Fedina L, Forgács B, Végh Gy, Pásztor E: Response patterns of

postganglionic sympathetic neurons to volleys in cutaneous and muscular afferent nerves. Abstracts of the XXXII. Congress of the International Union of Physiological Sciences held in Glasgow, August 1-6. 3, 67-68, 1993.

20. Mitsányi A, Fedina L, Végh Gy, Forgács B, Pásztor E: Incidence of A- and Cresponses in somatosympathetic reflexes to excitation of A+C fibre afferents of muscular and cutaneous origins. Neurobiology 2: 87, 1994. 21. Török M, Hamvas F, Végh Gy, Doszpod J: Passive versus activa sensorial cardiotocography in the prenatal period. Acta Obst Gynec Japon (Supplement) 49: 533, 1997. 22. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Mok SC, Berkowitz RS, Cseh I: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in normal placenta and gestational trophoblastic diseases. Placenta (Supplement) 20: 60, 1999. (IF: 2.101) 23. Fülöp V, Tuncer ZS, Végh Gy, Mok SC, Berkowitz RS, Doszpod J: Expression of epidermal growth factor receptor family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta: Association of c-erbB-3 and c-erbB-4 with persistence in hydatidiform mole. Placenta (Supplement) 20: 56, 1999. (IF: 2.101) 24. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Mok SC, Doszpod J, Berkowitz RS: Identification of differences in gene expression between normal and malignant trophoblast cell lines using membrane hybridization technique: Downregulation of Heat shock protein-27 in choriocarcinoma. Placenta 21: A18, 2000. (IF: 2.101) 25. Fülöp V, Végh Gy, Tuncer ZS, Bátorfi J, Mok SC, Cseh I, Gáti I, Berkowitz RS: The role of epidermal growth factor receptor related c-erbB oncogene family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Placenta 21: A19, 2000. (IF: 2.101)

XIX