A celluláris immunválasz és egyéb funkcionális fehérjék vizsgálata gesztációs trofoblaszt betegségekben Doktori értekezés
Dr. Nagymányoki Zoltán Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Fülöp Vilmos Ph.D. egyetemi magán tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Tóth Péter egyetemi docens, Ph.D. Dr. Póka Róbert egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Búzás Edit egyetemi docens, Ph.D. Dr. Füst György egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Uher Ferenc, Ph.D.
Boston 2008
2
1. Tartalomjegyzék 2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ........................................................................................................................5 3. BEVEZETÉS ...........................................................................................................................................6
3.1 Nevezéktan ..............................................................................................................................6 3.2 Etiológia és genetika ............................................................................................................8 3.3 Epidemiológia ......................................................................................................................11 3.3.1 Életkor .....................................................................................................................11 3.3.2 Szülészeti kórelőzmény ......................................................................................12 3.3.3 Faji különbségek ..................................................................................................12 3.3.4 AB0 vércsoport .....................................................................................................12 3.3.5 Egyéb faktorok ......................................................................................................13 3.3.6 Choriocarcinóma epidemiológiája ..................................................................13 3.4 Patológia (WHO osztályozás) ….....................................................................................14 3.5 A mola terhesség klinikai vonatkozásai ......................................................................16 3.5.1 Diagnosztika régen és most ..............................................................................16 3.5.2 Mola terhességek kezelése ................................................................................16 3.5.3 Ismétlődő mola terhesség ..................................................................................19 3.6 Onkogének és tumorszuppresszor gének ....................................................................21 3.7 Reproduktív immunológia ...............................................................................................22 3.7.1 Egészséges terhesség immunológiája.............................................................22 3.7.1.1 Th1/Th2 egyensúly ...............................................................................22 3.7.1.2 Regulátor T sejtek .................................................................................22 3.7.1.3 Trofoblaszt-immunsejt interakció .....................................................23 3.7.1.4 Natural Killer sejtek ..............................................................................24 3.7.1.5 Progeszteron indukált blokkoló faktor ............................................25 3.7.1.6 Egyéb immunszuppresszív molekulák.............................................25 3.7.2 A gesztációs trofoblaszt betegségekben tapasztalható immunológiai folyamatok ................................................................................26 3.8 Egyéb funkcionális fehérjék ...........................................................................................28 3.8.1 Laminin receptor 1 ...............................................................................................28 3.9 Angiogenezis .......................................................................................................................30 3.9.1 VEGF .......................................................................................................................30
3
3.9.2 Angiopoietin 1 és 2 ...............................................................................................30 3.9.3 Érsűrűség jelentősége (Microvessel Density, MVD) ................................31 4. CÉLKITŰZÉSEK ...........................................................................................................................32 5. MÓDSZEREK ......................................................................................................................................35
5.1 Vizsgálati anyagok .............................................................................................................35 5.2 Módszerek az immunsejtek jellemzéséhez .................................................................36 5.2.1 Immunfestés kivitelezése ...................................................................................36 5.2.2 Immunsejtek azonosítása ...................................................................................37 5.2.3 Immunsejtek quantitatív elemzése ..................................................................38 5.2.4 Statisztikai elemzés ..............................................................................................38 5.3 T limfociták aktivációjának vizsgálta T sejt receptor variábilis béta lánc profil elemzésével .......................................................................................................39 5.3.1 Vizsgálati anyagok és cDNS készítése ..........................................................41 5.3.2 RT-PCR vizsgálatok ............................................................................................41 5.3.3 Adat elemzés ...........................................................................................................43 5.4 Módszerek a Laminin receptor 1 kifejeződésének vizsgálatára ...........................44 5.4.1 RT-PCR mérések ...................................................................................................44 5.4.2 Laminin receptor 1 immunfestés .....................................................................44 5.4.3 Metszetek értékelése ............................................................................................45 5.4.4 Statisztikai elemzés ..............................................................................................45 5.5 Módszerek az angiogenezis vizsgálatára .....................................................................46 5.5.1 Érsűrűség meghatározása ...................................................................................46 5.5.1.1 CD31 immunfestés ................................................................................46 5.5.1.2 Metszetek kiértékelése .........................................................................46 5.5.2 Angiogenetikus faktorok vizsgálata ...............................................................47 5.5.2.1 Immunfestés ............................................................................................47 5.5.2.2 Metszetek kiértékelése .........................................................................47 6. EREDMÉNYEK ...........................................................................................................48 6.1 Immunsejtek jellemzése....................................................................................................48 6.1.1 Klinikai adatok .....................................................................................................48 6.1.2 Immunsejt infiltráció............................................................................................48 6.1.3 Regulátor T limfociták ........................................................................................48
4
6.1.4 CD8+ citotoxikus T sejtek és az effektor hányados....................................48 6.1.5 GrB+ Natural Killer sejtek, effektor Tc/GrB+ NK sejt hányados.........49 6.1.6 Immunsejtek infiltrációja gesztációs choriocarcinómában .................51 6.2 T sejt receptor variábilis béta lánc vizsgálatának eredményei ..............................52 6.3 Laminin receptor 1 vizsgálatok eredményei ...............................................................54 6.3.1 Quantitatív RT-PCR eredmények ...................................................................54 6.3.2 Immunfestés eredményei ...................................................................................54 6.4 Angiogenezis vizsgálatainak eredményei ...................................................................56 6.4.1 Az érsűrűség vizsgálat eredményei .................................................................56 6.4.2 VEGF kifejeződése...............................................................................................56 6.4.3 Angiopoietin 1 and 2 kifejeződése ..................................................................56 6.4.4 Klinikai adatok ...………………………………………………………………..57 7. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................................................59 7.1 Immunsejtek vizsgálata.....................................................................................................59 7.1.1 Immunsejtek eloszlása.........................................................................................59 7.1.2 NK sejtek ................................................................................................................59 7.1.4 Citotoxikus immunsejtek megoszlása a placenta ágyban ........................62 7.1.5 Regulátor T sejtek ................................................................................................62 7.1.6 Az immunsejtek eloszlása choriocarcinóma esetekben ............................64 7.1.6.1 Immunsejtek eloszlása az intraplacentáris choriocarcinóma esetekben .................................................................64 7.1.6.2 Immunsejtek eloszlása a posztmoláris choriocarcinóma esetekben ................................................................65 7.2 T sejt receptor variábilis béta lánc profil vizsgálatok .............................................67 7.3 Laminin receptor 1 kifejeződésének vizsgálata ........................................................70 7.4 Angiogenezis vizsgálata nem perzisztáló és perzisztáló molákban ....................71 8. KÖVETKEZTETÉSEK ......................................................................................................................74 9. ÖSSZEFOGLALÓ ...............................................................................................................................76 10. SUMMARY ........................................................................................................................................77 11. IRODALOMJEGYZÉK ....................................................................................................................78 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .........................................................................................91 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...........................................................................................................93
5
2. Rövidítésjegyzék
GTB Gesztációs trofoblaszt betegség
PIBF
Progeszteron indukált blokkoló faktor
GTT Gesztációs trofoblaszt tumor
Fc
Fragment crystallizable
PSTT Placental site trophoblastic tumor
WHO
World Health Organization
hCG Humán Choriogonadotropin
CD
Cluster of differentiation
hPL
Humán placentáris laktogén
MHC
Major histocompatibility complex
NP
Normál placenta
HLA
Humán leukocita antigén
PM
Partial mole –Részleges mola
NCAM Neural cell adhesion molecule
CM
Complete mole –Teljes mola
LR1
CC
Choriocarcinóma
RT-PCR Real time polimerase chain reaction
Tc
Citotoxikus T limfocita
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
NK
Natural Killer sejtek
Ang1
Angiopoietin 1
uNK Uterinális Natural Killer
Ang2
Angiopoietin 2
Th
FDA
Food and Drug Administration
Treg Regulátor T limfocita
DAB
Diamonobenzidin
APC Antigén prezentáló sejtek
GrB
Granzyme B
TCR T sejt receptor
PBS
Phosphate Buffered Solution
KIR
VBC
Variable beta chain
Helper T limfociták
Killer inhibitor receptor
Laminin receptor 1
KAR Killer aktivátor receptor
LFA-1 Leukocyte function antigen 1
IL
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1
Interleukin
ADCC Antibody derived cell cytotoxicity
VCAM Vascular adhesion molecule 1
TNFα Tumor nekrózis faktor alfa
VLA-4 Very late antigen 4
TGFβ Tranforming growth factor beta
HESC
IFN-γ Interferon gamma
6
Human endometrial stromal cells
3. Bevezetés 3.1 Nevezéktan A gesztációs trofoblaszt betegség (GTB) egy átfogó fogalom, mely számos jó és rosszindulatú kórállapotot foglal magába. A gesztációs trofoblaszt betegségeket általában a placenta kóros fejlődése és a trofoblaszt sejtek burjánzása jellemzi. (1) A gesztációs trofoblaszt betegségek közé a következő kórállapotokat soroljuk: mola hydatiosa, mely tovább bontható részleges és teljes mola hydatiosa-ra. (2) Ezek adják a gesztációs trofoblaszt betegségek nagy részét. (3) Ezen kívül ide tartoznak az invazív, a metasztatikus és a perzisztáló molák, melyek a méhüreg kiürítése után is a szervezetben maradnak, ezért összefoglaló néven perzisztáló trofoblaszt betegségeknek (PTB) nevezzük őket. (4) A gesztációs choriocarcinóma, a placenta ágyi trofoblaszt tumor (PSTT) és számos egyéb rendkívül ritka kórkép, mint például a placenta ágyi trofoblaszt nodulus és az epitheloid trofoblaszt tumor pedig trofoblaszt sejtekből eredő rosszindulatú tumorok csoportját képezi, melyek leggyakrabban, de nem kizárólagosan mola terhességből fejlődnek és a GTB-n belül összefoglaló néven gesztációs trofoblaszt tumoroknak (GTT) nevezzük őket. (1. ábra) (5-8) Mola terhességben a trofoblaszt burjánzás mellett a placenta bolyhainak hidrópikus elfajulása észlelhető. A mola terhesség, azon belül is a részleges mola az összes gesztációs trofoblaszt betegség közül a leggyakoribb. (9) Előfordulási gyakorisága rendkívüli változatosságot mutat a világ különböző részein. Az egyszerű mola hydatiosa terhességek alapvetően jóindulatú elváltozások, hiszen az invázió és a metasztázis képzés nem jellemző rájuk. Amennyiben a trofoblaszt sejtek másodlagosan invazívvá válnak, vagy áttétet képeznek, vagy csak a méh kiürítését követően a szervezetben maradnak, a kórállapotot invazív, metasztatikus vagy perzisztáló molaként diagnosztizáljuk. Mind a három kórkép gyakrabban alakul ki teljes, mint részleges mola hydatiosa-ból. (1,5,10)
7
A jóindulatú mola hydatiosával ellentétben a gesztációs choriocarcinóma a trofoblaszt sejtek valódi daganata, invazív és metasztázist ad. (1) Általában erősen nekrotizált vérzéses tumor képét mutatja. A choriocarcinóma egészséges és mola terhességből is kialakulhat. A rendkívül ritkán előforduló placenta ágyi trofoblaszt tumor (PSTT) ezzel ellentétben egy elhúzódó, lappangó, kedvezőtlen kimenetelű kórállapot, melyben az myometrium lassan osztódó trofoblaszt sejtekkel szűrődik át. A PSTT az esetek többségében kemoterápia rezisztens, mely lassan emelkedő hCG szinttel és vérzési rendellenességgel hívja fel magára a figyelmet sokszor évekkel a megelőző terhességet követően. (11) Ekkorra azonban már általában a távoli metasztázisok is kialakultak. 1. ábra. A gesztációs trofoblaszt betegségek nevezéktana
Az ábra a leggyakoribb gesztációs trofoblaszt betegségeket (GTB), perzisztáló trofoblaszt betegségeket PTB) és gesztációs trofoblaszt tumorokat (GTT) mutatja be. A nyilak a leggyakoribb átalakulások irányát jelzik.
8
3.2 Etiológia és Genetika A mola terhesség a legtöbb esetben patológiás fogamzás eredményeképpen alakul ki. Részleges mola esetén a haploid petesejt a zona pellucida hibás működése következtében 2 spermiummal egyesül. (12,13) A részleges mola terhesség genetikai állománya éppen ezért triploid, azaz 69 XXY, XYY vagy XXX. A genetikai tartalom egyharmad része anyai, kétharmad része pedig apai eredetű. (14-16) Teljes mola esetén a fogamzás kétféleképpen történhet. Az első esetben az üres petesejt 1 spermiummal termékenyül meg, amelynek genetikai tartalma a későbbiek során megduplázódik (diandric diploidy). A teljes molák nagy része ebbe a csoportba tartozik. A molaszövet genetikai tartalma ebben az esetben 46 XX. (12,17-19) A megtermékenyülés másik, ritkább változata a dispermiás megtermékenyülés, mely hasonlóan a részleges molához két spermiummal történik. Ekkor a genetikai tartalom 46 XY (diandric dispermy). (20,21) Teljes mola esetén az anyai genetikai tartalom minden esetben elvész vagy a fogamzás előtt (üres petesejt elmélet) vagy azt követően. A teljes mola tehát diploid, legtöbb esetben 46 XX. A teljes mola esetén nincsenek jelen anyai kromoszómák, így immunológia szempontból a terhesség teljesen idegen, apai eredetű. Korábbi tanulmányokkal ellentétben modern vizsgálatok kimutatták, hogy a teljes mola eredete (mono- vagy dispermiás) nincs hatással a klinikai kórlefolyásra. (22) Fisher R.A. és mtsai. a közelmúltban írták le a mola terhességek ritka családi halmozódását. Ezen mola terhességek genetikai állománya a fentiektől eltérően teljesen normális (biparentalis, diploid). (23-26) Éppen ezért a kutatók a molák ezen ritka fajtáinak
hátterében
valamilyen
génmutációt
sejtenek,
amely
trofoblaszt
proliferációjához, és következésképpen a placenta bolyhainak elfajulásához vezet. Több kísérlet igyekezett feltárni a kérdéses gént, mely valószínűleg a 19-es kromoszóma hosszú karján helyezkedik el, azonban jelen időpontig a gént azonosítani nem sikerült. (27,28) Az uniparentalis teljes mola szövet ideális alanya a korai embrió fejlődését irányító epigenetikai programok tanulmányozásának. (29-33) Az anyai és apai
9
imprinting ezen túl jelentős szerepet játszik a betegség patofiziológiájában is, hiszen az apai imprinting által kikapcsolt (metilált) gének az anyai kromoszóma hiányában nem fejeződnek ki teljes mola szövetben. Ezzel ellentétben az anyai imprinting által kikapcsolt gének expressziója jelentősen fokozott minden mola terhességben. Az eddig ismert imprinted gének közül a p57kip2-ről bizonyították, hogy jelentős szerepe van az trofoblaszt proliferációban. (34) A p57Kip2 egy apai imprinting által kikapcsolt fehérje, amely a ciklin dependens kináz (CDK) inhibitoraként funkcionál. (35) Normál sejtekben jelentős tumorszuppresszor szerepet játszik, így kifejeződésének hiánya mola terhességben (a működő anyai allél hiányának következtében) a trofoblaszt sejtek proliferációját eredményezi. Nem magyarázza azonban a részleges molában található elváltozásokat, ahol ez a gén normális mértékben fejeződik ki, hiszen az anyai kromoszómák a részleges mola terhességben jelen vannak és működnek. Az inzulin like growth factor 2 (IGF-2) gén azonban a p57kip2-vel ellentétben éppen a maternális kromoszómán metilálódik, így a paternalis génekről íródik át. Mind két molatípusban a kifejeződése éppen ezért jelentősen fokozott. (36) A p57kip2 immunfestés a részleges és teljes mola elkülönítésének kiváló diagnosztikus eszközzé vált, mivel képes kimutatni az anyai kromoszómák jelenlétét a szövetben. A molekuláris diagnosztikára jelentősen megnőtt az igény, miután a mola terhességek megjelenése az ultrahangnak köszönhetően olyan korai időpontra tolódott el, hogy a részleges és teljes mola elkülönítése klasszikus szövettani módszerrel továbbra már nem lehetséges. Mivel a mola terhesség perzisztálása és malignus elfajulása nagymértékben függ a mola szövet fajtájától, a nagyobb centrumok a p57Kip2 immunfestés mellett DNS Flow Cytometria-t alkalmaznak a pontos diagnózis felállítására. A p57Kip2 immunfestődés az anyai kromoszómák jelenlétét bizonyítja, így elkülöníti a teljes molát a részeges molától és a hidropikus placentától. A DNS flow cytometria pedig különbséget tud tenni diploid és triploid (esetleg magasabb) genetikai tartalmak között, így pozitív p57Kip2 esetekben képes elkülöníteni a hidropikus placentát a részleges molától. (37,38) Jelen tanulmány elkészítéséhez szükségem volt a szövetek pontos genetikai tartalmának ismeretére, ezért minden diagnosztikai eszközt, mely rendelkezésünkre állt
10
(szövettani azonosítás nőgyógyászati patológiában jártas szakember segítségével, DNS Flow Cytometria és p57Kip2 analízis) felhasználtunk, hogy elkerüljük a ritka kivételekből adódó tévedéseket. A továbbiakban a részleges mola alatt triploid, két szülőtől eredő (p57Kip2 pozitív) mola szövetet, teljes mola alatt pedig diploid, csak apai genetikai tartalommal rendelkező (p57Kip2 negatív) szövetet értünk. A choriocarcinóma genetikai állománya igen nagy változatosságot mutathat. A choriocarcinóma eredhet a petefészekből, mint germ cell tumor (diploid csak „anyai” genetikai tartalom) normál terhességből (diploid, biparentalis), részleges molából (triploid, biparentalis) valamint teljes molából is (diploid, monoparentalis – csak apai eredetű). (39) A tanulmányban éppen ezért a továbbiakban choriocarcinóma megnevezés mellett mindig jelzem, hogy az milyen eredetű, különös tekintettel arra, hogy ennek a ténynek kiemelt jelentősége van az immunológiai vizsgálatokban. A choriocarcinóma eredetének megállapításánál a kórtörténet és a fent említett diagnosztikai módszerek voltak segítségemre.
11
3.3 Epidemiológia A mola terhesség incidenciája a világ különböző pontjain igen eltérő. Zavarja a mola gyakoriságáról kialakított képet, hogy a korábbi tanulmányok jelentős része eltérő diagnosztikai kritériumokat használt az elmúlt húsz évben. E mellett a világ különböző részein az epidemiológiai tanulmányok különböző nevezőket vettek figyelembe az adatok megadásakor (eset/élveszülés/év, eset/terhesség/év, eset/100.000 fő/év). A legújabb felmérések szerint (melyek a WHO diagnosztikai útmutatása alapján készültek és kizárólag a diagnosztizált terhességeket vették alapul, beleértve az élveszülést, spontán és indukált abortuszt és méhen kívüli terhességet) a legmagasabb incidenciát Ázsiában találták (Indonézia), ahol minden 120. terhesség mola terhesség. Az Egyesült Államokban és a nyugat-európai fejlett országokban (hazánk is ide tartozik) kb. minden 1500. terhességre esik egy mola terhesség. Az észak-európai államokban még ennél is alacsonyabb az előfordulása. Ott 2000 terhességből mindösszesen 1 mola terhesség fordul elő. (40) Habár a mola terhesség Magyarországon ritka, kiemelt jelentőséget ad neki az a tény, hogy kezelés nélkül magas mortalitással járó betegségről van szó, amely a fiatal egészséges nőket sújtja leginkább. Szakszerű diagnosztika és ellátás mellett azonban elhanyagolható halálozással jár. A kezelés és főleg az utánkövetés azonban drága és időigényes, amire a fejlődő országokban, ahol a betegség előfordulása jelentősen magasabb, mint nálunk, sajnos nincs megfelelő forrás. A gesztációs trofoblaszt betegségek ott tehát továbbra is jelentős népegészségügyi problémát jelentenek. 3.3.1 Életkor Az anyai életkor az egyik legegyértelműbb rizikófaktor. A huszadik életév előtt és a 40. életév után a mola terhesség előfordulása magasabb, mint a reproduktív kor közepén. (41) A rizikó enyhén emelkedett 15 és 20 év között, ugyanakkor megközelítően 20-szoros incidencia emelkedést írtak le 15 évnél fiatalabb terhesek esetében. (42) Hasonlóan a 40 és 50 év közötti terhes nők esetén tízszeres, míg az 50. év felett a tanulmányok közel 200-szoros relatív rizikót növekedést találtak. (43-45) Ezen epidemiológiai eredmények ugyanakkor alátámasztják azt az elméletet, miszerint a mola
12
terhesség a petesejt érésének zavara következtében alakul ki. Tizenéves korban a peték éretlen volta, 50. életév felett pedig az életkorral együtt járó genetikai sérülések okozhatják a pete funkciójának zavarát. Az apai életkorral kapcsolatban a vita még nem tekinthető lezártnak, de metaanalízisek arra utalnak, hogy az apai életkor nem játszik szerepet a mola terhességek kialakulásában. (46,47) 3.3.2 Szülészeti kórelőzmény Számos tanulmány vizsgálta a megelőző terhességek, vetélések, műszeres befejezések számát, és időpontját, de az egyetlen kiemelkedő faktor, mely jelentősen befolyásolta a mola terhességek incidenciáját, az a megelőző mola terhességek száma volt. (48-49) Ikerterhesség után és a visszatérő vetélő nullipara nők esetében úgyszintén szignifikánsan növelte a rizikót, azonban közel sem olyan mértékben, mint a megelőző mola terhességek. (50,51) 3.3.3 Etnikai különbségek Szinte mindegyik tanulmány egyetért abban, hogy az eurázsiai populációban a legmagasabb a mola terhességek, következésképpen a gesztációs trofoblaszt tumorok incidenciája. (52) Egy az Amerikai Egyesült Államokban készült tanulmány továbbá azt is kimutatta, hogy a kaukázusi rasszhoz viszonyítva az afroamerikai populációban 50%kal alacsonyabb a mola terhesség incidenciája. (43) 3.3.4 AB0 vércsoport Számos tanulmány vizsgálta az anya és az apa vércsoportja közti összefüggéséket, és úgy tűnik, hogy amennyiben az anya és az apa ABO vércsoportja különböző, akkor magasabb a gesztációs trofoblaszt tumorok kialakulásának rizikója. (53) Széles körben elfogadott ugyanakkor, hogy amennyiben az apa, azaz a mola 0-ás vércsoportú a GTT kialakulásának esélye kis mértékben ugyan, de megemelkedik. (47)
13
Az anyai oldalon az A vércsoport hordoz magasabb rizikót a choriocarcinóma kialakulását illetően. (54) 3.3.5 Egyéb faktorok Kiterjedt epidemiológiai vizsgálatok igyekeztek felmérni többek között az anya dohányzását, alkohol fogyasztását, táplálkozását, a házastársi viszonyt és iskolai végzettséget. A legtöbb faktort összefüggésbe hozták a mola terhesség emelkedett rizikójával, azonban az egyetlen faktor, amelynek prediktív értéke egybehangzóan magasabb volt minden tanulmányban, az iskolai végzettség volt. (49,55) Ez az eredmény azonban valószínűleg észlelési hiba (detection bias) következménye. Spontán vetélést követően ugyanis a magasabb iskolai végzettséggel rendelkező anyák nagyobb valószínűséggel kerülnek specializált trofoblaszt centrumokhoz, így nyilvánvalóan magasabb arányban detektálják/regisztrálják náluk a betegség előfordulását. 3.3.6 Choriocarcinóma epidemiológiája A choriocarcinóma egy rendkívül ritka tumor, mely eredhet a gonádokból (germ cell tumorok) illetve lehet gesztációs eredetű. A gesztációs choriocarcinóma kialakulását általában a következő állapotok előzik meg: mola hidatiosa (50%), spontán vetélés (20%), normális terhesség (20-25%) és méhen kívüli terhesség (2%). (56) Az előfordulás ugyanúgy, mint a mola terhesség, jelentős földrajzi eltéréseket mutat. Amíg Észak-Európában, Észak- és Dél-Amerikában az incidencia 0,2-1,2 per 10.000 terhesség addig Dél-Ázsiában ez az érték 8 és 19,1 per 10.000 terhesség között változik. (40) Choriocarcinóma nagyon ritkán kialakulhat a terhesség alatt is. Ilyenkor a tumor a placentában fejlődik és általában nem befolyásolja a terhesség kimenetelét, hacsak nem ér el akkora méretet, hogy a placenta funkcióját zavarja, vagy áttétet nem ad. Az intraplacentáris choriocarcinóma diagnózisát általában szülés után a méhlepény alapos vizsgálata után állítják fel. Ez esetben kiterjedt képalkotó és hCG utánkövetéssel kell kizárni mind az anyai, mind a magzati áttétek lehetőségét.
14
3.4 Patológia (WHO osztályozás) A trofoblaszt sejtek normális funkciója az invázió, a spirális erek átalakítása és chorion bolyhok kialakítása, amellyel összességében a beágyazódott zigóta, később a magzat tápanyag ellátását biztosítja. Az egészséges terhességek többségében is előfordul, hogy a trofoblaszt sejtek az anyai vérkeringés útján eljutnak a tüdőig, ahol megrekednek. (57,58) Panaszt azonban a normál terhességből származó trofoblaszt szövet nem okoz a tüdőben. A szabályozott invázió és a metasztázis tehát a trofoblaszt sejtek normális működésének velejárói és nem jelentik feltétlenül neoplázia kialakulását, hiszen a trofoblaszt a méhen kívül nem képes proliferálni és valódi malignus metasztázist képezni. Egészséges terhességben a terhes méh speciális környezete szükséges a trofoblaszt túléléséhez. A GTB a trofoblaszt sejtek burjánzásának eredménye. Patológiai szempontból a trofoblaszt sejteknek két lényeges típusa van: villózus és extravillózus trofoblaszt. (56) A villózus trofoblaszt sejtek, melyek a bolyhok felszínét borítják, tovább bonthatók citotrofoblaszt és synciotrofoblaszt sejtekre. A citotrofoblaszt sejtek erőteljes proliferációs képességgel bírnak, azonban nem termelnek jelentős mennyiségű hormont. A többmagvú óriás synciotrofoblaszt sejtek a citotrofoblaszt sejtekből erednek és velük ellentétben jelentős mennyiségű hormont (hCG, ösztrogén, progeszteron, hPL) választanak el. Proliferációs képességük azonban alacsony. Mola terhességek esetében a villózus trofoblaszt sejtek proliferációja észlelhető különböző kombinációban. A trofoblaszt proliferációval párhuzamosan a bolyhok hidrópikus elfajulása is nyomon követhető. Teljes mola esetén mindkét folyamat jelentősen kiterjedtebb, mint részleges mola esetében. Az extravillózus trofoblaszt sejtek, más néven az intermedier trofoblaszt, a placenta ágyban helyezkednek el, és jelentős szerepet játszik a terhességi szövet inváziójában, az anyai erezet megnyitásában és nyitva tartásában. Morfológiailag denz eozinofil citoplazmájuk különbözteti meg őket a villózus trofoblaszt sejtektől. Jelentős mennyiségben termelnek proteolítikus enzimeket, valamint tromboplasztint és
15
plasminogén aktivátort, mellyel hozzájárulnak az endometrium erezetének nyitva tartásához. Ezen sejtek hCG termelése és proliferációs képessége jelentősen alacsonyabb, mint a villózus trofoblaszt sejteké, éppen ezért az ezen sejtekből származó betegségek felismerése kihívást jelent a szakemberek számára. Sokszor évekkel az utolsó terhesség után derül fény a méhben hátramaradó extravillózus trofoblaszt sejtek proliferációjára. Mivel ezen sejtek osztódása lassabb, ezért kevésbé érzékenyek a kemoterápiára. Kimenetelüket tekintve malignusabbak, mint a villózus trofoblaszt sejtekből kiinduló gesztációs trofoblaszt betegségek. Az extravillózus trofoblaszt sejtek proliferációjából származik a placenta ágyi trofoblaszt csomók és a kifejezetten rosszindulatú placenta ágyi trofoblaszt tumor. A GTB patológiai osztályozását és szövettani azonosításhoz használt legfontosabb kritériumokat a mellékelt táblázat tartalmazza (1. tábla). 1 táblázat. A WHO által elfogadott patolgógiai osztályozás és diagnosztikai kritériumok Diagnózis
Embrió
Hydrops
Trofoblaszt proliferáció
Hydrops fetalis Részleges mola hydatiosa (PHM) Teljes és invazív mola hydatiosa (CHM) Choriocarcinóma Excessive implantation site Placenta ágyi trofoblaszt tumor (PSTT) Placenta ágyi trofoblaszt nodulus (PSTN) Epithelioid trofoblaszt tumor (ETT)
Igen Igen Nem Nem Nem Nem Nem Nem
Enyhe Fokális Kiterjedt Nincs boholy Nincs boholy Nincs boholy Nincs boholy Nincs boholy
Nincs Néhol kiterjedt Jelentősen kiterjedt Neoplasztikus Mérsékelt Neoplasztikus Mérsékelt Neoplasztikus
16
3.5 A mola terhesség klinikai vonatkozásai 3.5.1 Diagnosztika régen és most A mola terhesség jelentősen eltérő klinikai képet mutatott a 80-as évek előtt, mint manapság. Az ultrahang elterjedése előtt a mola terhesség diagnózisa elsődlegesen klinikai volt. A terhességi korhoz képes nagyobb méh, a vérzés és az abból eredő anaemia, valamint a gyakoribb és súlyosabb hyperemesis gravidarum voltak a mola terhesség első jelei. (59,60) Ritkán előrehaladott áttétek vagy a terhességhez társuló súlyos hyperthyreosis hívta fel a figyelmet a gesztációs trofoblaszt betegségekre. Az ultrahang és a hCG tesztek széleskörű elterjedése megváltoztatta a diagnózis módját, és a mola terhesség tünetegyüttesét. Jelenleg a mola terhességek nagy része tünetmentes állapotban kerül diagnózisra, még mielőtt az életveszélyes kórállapot kifejlődne. Ma a jellegzetes ultrahang kép a legszenzitívebb bár nem kellően specifikus diagnosztikus módszere a mola terhesség felismerésének. Az ultrahang a hCG méréssel kiegészítve azonban már kellően szenzitív és specifikus is a klinikus számára. 3.5.2 Mola terhességek kezelése A mola terhesség kezelésének első lépése szinte minden esetben a méh óvatos kiürítése vákummal. A hysterectómia továbbra is megfontolandó komplikált esetekben idősebb anyáknál, akiknek családalapítási tervei már befejezetnek tekinthetők. Teljes mola terhesség esetében ugyanis a méh eltávolítása kismértékben csökkenti a perzisztáló gesztációs trofoblaszt tumorok kialakulásának esélyét. (61) Néhány országban az első curettage után egy héttel rutinszerűen megismétlik a méh kiürítését (pl. Japán). Egyes adatok szerint az ismételt curettage csökkenti a perzisztáló tumorok számát. Más országokban végzett tanulmányok a rutinszerűen végzett második curettage előnyét azonban nem igazolták. (62) A második curettage ugyanakkor indokolt lehet olyan ritka esetekben, amikor a diagnózis időpontjában már enyhe tünetek észlelhetőek és azok az első kezelés után továbbra is fenn állnak. A diagnózis időpontjában mért alacsony hCG úgyszintén követelmény. Magas hCG-vel
17
járó betegségek esetén a kemoterápia megkezdése indokolt. Amennyiben a feltételek a követelményeknek megfelelnek, a másodlagos curettage csökkenti a kemoterápiára szorulók számát. (63) A profilaktikus kemoterápia, melyet a diagnózis időpontjában kezdenek, továbbra is vita tárgyát képezi. Jelentős szerepe van azonban magas rizikójú molák esetében azokban az országokban, ahol a klinikai vagy technikai lehetőségek nem teszik lehetővé a betegek utánkövetését. A profilaktikus kemoterápia széles körben elterjedt azokban az országokban is, ahol a betegek nem kellően együttműködőek az anyagi nehézségek, vagy az iskolázottság hiánya miatt (pl. Fülöp-szigetek). Magas rizikójú GTB (2. táblázat) esetén a diagnózis időpontjában megkezdett profilaktikus methotrexát 50%-ról 10%-ra csökkenti a perzisztáló trofoblaszt tumorok kialakulásának esélyét. (64) A fennmaradó 10% ugyanakkor perzisztáló tumorrá fejlődik és utánkövetés hiányában ezek a betegek jelentős késéssel kerülnek csak szakértők kezébe. A legtöbb országban azonban, így hazánkban is a hosszútávú szérum β-hCG utánkövetés a perzisztáló trofoblaszt betegségek diagnózisámal elfogadott módszere. Az utánkövetésnek kiemelt fontossága van a mola terhesség kezelésében, hiszen a teljes molák kb. 20, a részleges moláknak pedig kb. 5%-a perzisztáló trofoblaszt tumorrá fejlődik hosszabb rövidebb tünetmentes időszakot követően. (65,66) Teljes mola hydatiosa szövettani diagnózisa mellett hetente β-hCG szint ellenőrzés javasolt 3 egymást követő negatív titer eléréséig, ezután havi ellenőrzések következnek 6 egymást követő negatív hónapig, ettől kezdve a beteg gyógyultnak tekinthető. Részleges mola hydatiosa esetén, amennyiben a szérum β-hCG szint a mola evakuációt követően 7 héten belül negatívvá válik, a havi ellenőrzéseket elegendő 3 egymást követő negatív hónapig megkövetelni, a többi esetben a teljes molára is vonatkozó követési szabályok érvényesek. A jelenleg alkalmazott nyomonkövetési protokollok a hCG titer negatívvá válása után hónapokig megkívánják a rendszeres kontrollt, és a teljes gyógyulás csak több havi negatív eredmény után mondható ki. Ez idő alatt fogamzásgátlás javasolt, elkerülendő a terhességből származó β-hCG szint emelkedést, mely elrejtheti a perzisztáló trofoblaszt
18
betegséget. Az utánkövetés alatt az intrauterin eszközök a méhperforáció fokozott veszélye miatt nem alkalmazhatóak. A hosszú utánkövetés és a jelentős anyagi és pszichés megterhelés miatt a betegek jó része idő előtt abbahagyja a javasolt nyomonkövetési programot. A betegek együttműködését vizsgáló tanulmányokban a trofoblaszt centrumok különböző arányokat mértek. A betegek 19-81 %-a nem fejezi be a nyomonkövetési programot. (67) A betegek együttműködését leginkább meghatározó tényező érdekes módon a trofoblaszt centrum és a lakóhely közötti távolság volt, még akkor is, ha a helyi laboratórium postázta a hCG eredményeket a trofoblaszt centrumba. A kapott eredmények
tehát
a
trofoblaszt
centrumok
müködési
körzetének
nagyságát
reprezentálták. Amennyiben az utánkövetés alatt emelkedő vagy hosszútávon stagnáló hCG értékeket mérnek a kemoterápia az elsődleges választás. A klinikai tünetek, a kórtörténet, képalkotó vizsgálatok és biokémiai tesztek (hCG) eredményei alapján a betegséget alacsony vagy magas rizikójú csoportba sorolják (2. táblázat). Az alacsony rizikójú esetek általában egy komponensű kemoterápiával (methotrexát vagy Actinomycin D), míg a magas rizikójú eseteket kombinált kemoterápiás kezelésben részesítik (MAC, EMA-CO, MEA). A kombinált kemoterápiás protokollok azonban jelentős mellékhatással bírnak, és néhány előrehaladott esetben sajnos drogrezisztencia kialakulásával is számolni kell. (60) (A World Health Organisation részletes kemoterápiás protokolljai megtalálhatóak angol nyelven a következő oldalon: http://www.emro.who.int/ncd/publications/GTT_hamad.pdf) Mivel az utánkövetés a betegek számára jelentős kellemetlenséggel jár, a kemoterápia pedig nem mellékhatásoktól mentes, kijelenthetjük, hogy a mola terhességek jelenlegi kezelési protokollja eredményes ugyan, de közel sem ideális a betegek számára.
19
3.5.3 Ismétlődő mola terhesség Az első mola terhességet követően az anyának 1% esélye van arra, hogy a soron következő terhessége is mola terhességként végződjön, függetlenül attól, hogy az első terhesség részleges, vagy teljes mola volt. (68) Mangili és mtsai bemutattak egy esetet, amelyben az anya második mola terhességet követően donor inszeminációval kívánt teherbe esni, hogy elkerülje az esetleges rizikót. (69) Azonban harmadik terhessége is részleges mola terhességként végződött. Több más tanulmány is leírta, hogy a soron következő terhesség magasabb rizikója a partnertől független. Ez az eredmény úgyszintén alátámasztja azt a feltételezést, miszerint a mola terhesség az ovum patológiás érésének eredménye. A második mola terhesség után a harmadik mola terhesség kialakulásának esélye 15 és 28 % között mozog. A legnagyobb tanulmány, melyet a New England-i trofoblaszt centrumban végeztek 23,1 %-os rizikót mutatott ki. (65) A második mola után posztmoláris tumor kialakulásának az esélye komplett mola esetén 20%-ról 50%ra, részleges mola esetén pedig 5%-ról 15%-ra növekszik. (65) Mindezek ellenére, amennyiben egy mola terhességen átesett asszony egészséges gyermeket fogan, a terhesség kimenetele mind a spontán vetélést, mind a koraszülést, fejlődési rendellenességeket, császármetszési rátát tekintve teljesen azonos a populációs átlaggal, még akkor is, ha előtte perzisztáló gesztációs trofoblaszt tumor miatt az anya kombinált kemoterápiában (EMA-CO) részesült. (70,71) Összefoglalva tehát: amennyiben az anyának volt előző mola terhessége, a következő mola terhesség kialakulásának esélye jelentősen fokozott. Ennek tükrében érthető tehát az ajánlás, miszerint egy előzőleg mola terhességgel diagnosztizált anya terhessége esetén kiemelt figyelemmel végezzük az ultrahang vizsgálatot a terhesség első szemeszterének végén. Amennyiben az ultrahang nem utal gesztációs trofoblaszt betegségre, az anya rutin terhesgondozásban részesülhet. A szülés során azonban a placentát, illetve vetélés esetén az abortumot kiemelt gondossággal vizsgáljuk át és 6 hét elteltével mérjünk humán choriogonadotropin szintet annak érdekében, hogy
20
biztosak legyünk abban, hogy a terhesség után nem maradt vissza proliferáló trofoblaszt szövet az anyában. Song és mtsai. mola terhességet követő egészséges terhességből született gyermekeket vizsgáltak és megállapították, hogy a gyermekek semmilyen kromoszómális rendellenességet nem mutattak. Fejlődésük és értelmi képességeik nem különböztek a populációs átlagtól. (72) A mola terhességen átesett anyáknak tehát javasolhatjuk következő terhesség vállalását, miután a perzisztáló mola lehetőségét gondos utánkövetéssel kizártuk. Kiemelt elentősége van azonban a korrekt betegtájékoztatásnak. Ilyen esetben mindig hívjuk fel az anyák figyelmét a soronkövetkező molaterhességek előfordulásának magasabb rizikójára. 2. táblázat
A gesztációs trofoblaszt betegségek prognosztikai pont táblázata (World Health Organization) Prognosztikai pontérték Életkor Megelőző terhesség Érintett terhesség óta eltelt idő A kezelés előtti HCG szint AB0 vércsoport Legnagyobb tumor mérete Metasztázis helye Metasztázisok száma Megelőző kemoterápia
0
1
2
3
< 39
> 39 yr
--
--
Mola
Vetélés
Szülés
< 4 hó
4-6 hó
7-12 hó
>12 hó
< 103 mIU/mL --
103 – 104 mIU/mL 0 vagy A
104 – 105 mIU/mL B vagy AB
> 105 mIU/mL --
<3cm
3-5 cm
>5 cm
--
Tüdő, pelvis, Vagina
Lép, Vese
Gasztrointesztinális traktus
Máj, agy
--
1-4
5-8
>8
--
--
Monoterápia
Kombinált
A rizikó csoportot az összpontszám határozza meg: Alacsony rizikó Közepes rizikó Magas rizikó
0–4 5–7 >8
21
3.6 Onkogének és tumorszuppresszor gének
A trofoblaszt szöveteken végzett korábbi vizsgálatok számos onkogén és tumorszuppresszor
gén
kifejeződését
találták
eltérőnek
gesztációs
trofoblaszt
betegségek esetén. A legjelentősebb onkogének (P53, P21, Rb, mdm2, erbB-2 és bcl-2) vizsgálata során azt a meglepő eredményt találták, hogy a részleges molából és a normál terhességből származó trofoblaszt sejtek ezen fehérjéket normális mértékben fejezi ki, míg a teljes mola és choriocarcinóma esetén ezen gének kifejeződése jelentős mértékben megemelkedett. (73-75) A jelenség összefüggésben állhat a trofoblaszt sejtek proliferációs képességével, hiszen a teljes mola esetén a trofoblaszt proliferáció igen kiterjedt, míg a részleges mola esetén a hidrópikus bolyhok mellett normális bolyhok is jelentős számmal fellelhetők. Fülöp és mtsai. ezen eredményekből arra a következtetésre jutottak, hogy a részleges mola biológiai szempontból nem egyszerűen a normál terhesség és a teljes mola között átmenetet képviselik, hanem sokkal inkább egy genetikai defektus eredményéből származó spontán vetélés. A részleges mola perzisztálása úgyszintén jelentősen alacsonyabb, majdhogynem elhanyagolható. A nemzetközi adatok azonban igen ellentmondóak. Amíg egy holland kutatócsoport az elmúlt 10 év során egyetlen triploid (részleges) molával sem találkozott, melyből GTT alakult ki, addig az Egyesült Államokban és a kelet-ázsiai régióban a részleges molából kialakuló gesztációs trofoblaszt tumorok kialakulásának valószínűségét 1-5%-nak találták, ami a normál terhességben talált 0.01%-hoz képest jelentősen fokozott kockázatot jelent. (76,65) A különbség adódhat a faji eltérésekből, tekintve, hogy az eurázsiai rassz Ázsiában és Észak Amerikában Észak Európához képest jelentősen felülreprezentált. A holland kutatócsoport jelenleg a mola diagnózisa után genetikai elemzést végez és a betegeket csak diploid (teljes) mola esetén követi hCG vizsgálattal. Véleményem szerint érdemes kivárni a holland vizsgálat eredményeit, és amennyiben kedvező kimenetellel zárulnak, nálunk is elgondolkodni a mola terhességek protokolljának átalakításán.
22
3.7 Reproduktív immunológia 3.7.1 Egészséges terhesség immunológiája 3.7.1.1 Th1/Th2 egyensúly Normál terhesség esetén a beágyazódott embrió genetikai állománya semiallogén, mely a normál, nem terhes egyénekre jellemző immunstátusz mellett az embrió illetve magzat kilökődésével járna. A terhesség alatt azonban számos immunszuppresszív mechanizmus biztosítja a magzat egészséges fejlődését. Az immunrendszer szinte összes sejtje részt vesz a terhességi immunszuppresszív állapot kialakításában. Az immunológiai kutatások e területen azt mutatják, hogy a helper T sejtek (Th) játsszák a legkiemelkedőbb szerepet az immunrendszer szabályozásában. Számos tanulmány kimutatta, hogy terhességben a Th sejtek citokin termelése a terhesség során megváltozik és az úgynevezett Th1 típusú citokinek termelődése (IL2, TNF alfa) a terhesség során csökken. (77) Ezen citokinek elsődleges szerepe a sejtes immunválasz kialakítása és fenntartása. A Th1 citokin szintek csökkenése tehát a sejtes immunválasz gyengüléséhez vezet, ami önmagában kedvező a terhesség szempontjából. Ezzel egyidőben a Th2 citokinek (IL-4, IL12 stb.) termelődése fokozódik, mely a humorális immunválasz felerősödéséhez vezet. (78) A Th2 citokinek hatására az immunglobulin termelés az anyában megsokszorozódik, és egyelőre nem ismert okból a terhesség esetén az asszimetrikus antitestek aránya úgyszintén megnövekszik. Ezen asszimetrikus antitesteknek (Fc domén nélküli antitestek) feltehetően az apai antigének elrejtésében van szerepe. (79) 3.7.1.2 Regulátor T sejtek A terhesség során a Th sejtek nem csak az antitest termelés növekedésével, hanem a sejtes immunválasz egyéb úton történő blokkolásával is hozzájárulnak a sikeres terhességhez. Az egyik legfontosabb mechanizmus a regulátor T sejtek differenciálódása és proliferációja a perifériás keringésben, mely úgy tűnik kiemelt
23
szerepet játszik a terhesség fenntartásában. (80) A regulátor T sejtek a Th sejtekből származnak, CD4 receptort hordoznak. A regulátor T sejt differenciálódás alatt az IL-2 receptor (CD25) kifejeződése jelentősen fokozódik. Ez lehetővé teszi a sejtek viszonylag könnyű elkülönítését FACS készülékkel (CD4+, CD25high). (81) A regulátor T sejtek differenciálódásáért az úgynevezett FoxP3, forkhead/winged helix családba tartozó, transzkripciós faktor a felelős. (82) A FoxP3-nak a differenciálódás mellett kiemelt jelentősége van a funkció fenntartásában is. A regulátor T sejtek leginkább TGF béta és IL10 termelésével járulnak hozzá a terhességben és esetenként tumorokban észlelhető immunszuppresszió kialakításához. A TGF béta és IL10 mind az antigén prezentáló sejtek (APC), mind az citotoxikus T (Tc) sejtek működését gátolja. (83) A regulátor T sejtek a citokinek mellett a CTLA-4 sejtfelszíni molekulán keresztül sejt-sejt interakcióban is résztvesznek a fent említett immunsejtekkel. A CTLA-4 a B-7 molekulához kapcsolódva egy negatív szignált továbbít a Tc és az APC sejtek felé, mely az érintett sejteket anergia állapotába hozza. (84) 3.7.1.3 Trofoblaszt-immunsejt interakció A sejtes és humorális immunszuppresszió mellett valószínűleg jelentős szerepe van a trofoblaszt sejtek speciális immunológiai atributumainak is. Az emberi szervezetben minden egészséges sejt kifejezi az MHC I-es típusú molekulát, mely a sejten belüli fehérjék (saját antigének) bemutatásában játszi szerepet. Amennyiben a bemutatott antigén idegen (vírusfertőzött sejt vagy mutált tumorsejt), citotoxikus sejtek az MHC molekulák felszínén felismerik az idegen antigént és különböző citotoxikus mechanizmusok segítségével (FAS-FAS-L interakció vagy Perforin-Granzyme B hatás) elölik a kérdéses sejtet. (85) A trofoblaszt sejt az egyetlen ismert emberi sejt, mely IL10 hatására a terhesség első 3 hónapjában csökkenti a HLA A és B molekulák kifejeződését és egyidejűleg indukálja a HLA G és E expresszióját. (86) Bár a tanulmányok ellentmondóak a tekintetben, hogy milyen mértékben fejeződnek ki ezen HLA molekulák (nincs kifejeződéstől az alacsony mértékű kifejeződésig terjed a skála), a legtöbb kutató azonban egyetért abban, hogy a trofoblaszt sejtek nem fejezik ki a HLA A és B molekulákat olyan mértékben, hogy azok a citotoxikus sejtek által sebezhetővé válhassank. (87,88)
24
3.7.1.4 Natural Killer sejtek A citotoxikus sejtek egy másik csoportját képezi a Natural Killer (NK) sejtek, amely sejtpopuláció a veleszületett immunválasz részét képezi. Sejtfelszínükön megtalálható a Killer Inhibitor Receptor (KIR) és Killer Aktivátor Receptor (KAR). A KAR molekula kötődése után az NK sejt aktiválódik és amennyiben a KIR molekula nem kötődik a célsejt felszínén található MHC molekulákhoz, akkor a NK sejtek a target sejtet elölik FAS vagy proteináz (Granzyme B) molekulák segítségével. Amennyiben a KIR molekula felismeri a sejten jelenlévő MHC molekulákat, az NK sejtekben a killer program leáll. (85) A trofoblaszt sejtek azonban, mint már említettük jelentősen csökkent mértékben fejezik ki felszínükön a klasszikus HLA A és B típusú MHC molekulákat, helyettük azonban a nem klasszikus HLA G és E molekulák expressziója indul be és fokozódik a trofoblaszt differenciálódása során. A HLA G és E molekulák a hagyományos MHC molekulákkal szemben nem képesek sem saját sem idegen antigén bemutatásra, azonban a KIR molekulához kapcsolódva védik a trofoblaszt sejtet a NK sejt lízistől. A HLA-C a HLA-A és B molekulákkal ellentétben közel normális mértékben fejeződik ki a trofoblaszt sejtek felszínén, és a legújabb adatok arra utalnak, hogy a HLA C molekuláknak jelentős szerepük van a méhűri NK (uNK) sejtek differenciálódásában. (89) Az uNK sejtek a normál NK sejtekkel ellentétben nem fejezik ki felszínükön az L selectin és CD16 molekulát. Az utóbbi molekulának nem terhes egyénekben kiemelt jelentősége van az ADCC-ben, mint kis affinitású Fc receptor. Az uNK sejteken ezzel szemben jelentősen fokozódik a CD56 molekula kifejeződése (NCAM), melynek a homoadhézióban van kiemelt szerepe. (9092) Számos tanulmány vizsgálta az uNK sejtek altípusait és citokintermelését, valamint azok szerepét a beágyazódásban. Nem terhes személyek vérében az NK sejtek leginkább Th1-es citokineket termelnek. IL-12 hatására azonban az uNK sejtek NK1 típusú sejtekké specializálódnak, melyek jelentős mennyiségű gamma interferont termelnek, amely nagymértékben hozzájárul a humán endometrium stróma sejtek decidualizációhoz. Ezen kívül az uterinális NK sejteknek további szerepe van a spirális arteriolák átalakításában és az angiogenezisben. IL-4 hatására az NK sejtek IL-5-t
25
termelő NK2 sejtekké alakulnak. Az NK3 sejtek TGF bétát, az NKr1-es sejtek pedig IL10-et termelnek, melyek segítenek kialakítani a magzat beágyazódásához szükséges immunszuppresszív környezetet. (93-96) Összességében, azt mondhatjuk tehát, hogy normál terhesség esetén a NK sejtek a méhüregben immunszuppresszív szerepet tölthetnek be és nem pusztán inaktivált ölősejtekként vándorolnak a szövetek között. 3.7.1.5 Progeszteron indukált blokkoló faktor A progeszteronnak jelentős immunmoduláló hatást tulajdonítanak, mely jelenlegi elképzelésünk szerint a Szekeres-Barthó és mtsai. által leírt progeszteron indukált blokkoló faktoron (PIBF) keresztül fejti ki hatását az immunrendszerre. (97) Ez a faktor jelentős szerepet játszik az immunrendszer modulálásában. A gamma/delta T sejtek a magzati antigének felismerése után progeszteron receptort fejeznek ki felszínükön és progeszteron hatására PIBF-t termelnek. (98) A PIBF molekula szerepet játszik az NK sejtek citotoxikus aktivitásának gátlásában, és a terhességre jellemző Th2 dominancia kialakításában. (99,100) 3.7.1.6 Egyéb immunszuppresszív molekulák A trofoblaszt sejtek számtalan immunszuppresszív molekulát termelnek, amelyek a fentebb említett mechanizmusokon túl a terhesség számára kedvezően befolyásolják az anyai immunrendszer működését. Egy részük az immunsejtek inaktiválásában játszik szerepet (pl. citokinek, HLA G), másik részük protektív molekula, melyek az aktivált citotoxikus sejtek ellen nyújtanak védelmet (pl. Granzyme B inhibitorok, Fas L, stb.) A 3. táblázat összefoglalóan mutatja be a trofoblaszt sejtek által termelt immunszuppresszív molekulákat. (101)
26
3. táblázat. Trofoblaszt sejtek által termelt protektív molekulák
HLA molekulák (C,G,E,F) Szolubilis HLA G Fas L citokinek (TGF-β, IL-10, IL4, IL-6) Indoleamin 2,3deoxigenase DAF, MCP, CD59 PI-9 hCG
3.7.2
A
Kifejeződését növeli IL-10
ligand KIR
Érintett immunsejt/rendszer NK
IL-10 Th2 citokinek Nem ismert
Nem ismert Fas Citokin receptorok
Tc sejt Tc sejtek Th sejtek, Tc sejtek, NK, (trofoblaszt sejt)
apoptózis apoptózis szupresszió
Nem ismert
nincs
Nem ismert Nem ismert Nem ismert
változó Granzyme B hCG receptor
T sejt, Complement rendszer Complement rendszer Tc sejt, NK sejt Trofoblaszt, immunsejtek
T sejt érés gátlása, complement gátlás MAC gátlás Granzyme B inhibitor Fas L kifejeződés a trofoblaszt sejteken hCG Æ ProgeszteronÆPIBF
gesztációs
trofoblaszt
betegségekben
hatás Aktivitást csökkenti
tapasztalható
immunológiai
folyamatok Mint már fentebb utaltunk rá, a mola terhességek és az azokból származó gesztációs trofoblaszt tumorok genetikai tartalma eltér a normál terhesség genetikai tartalmától. Részeleges mola esetén az apai antigének túlsúlyba kerülnek, a komplett mola pedig teljes mértékben idegen az anyai szervezet számára. Habár egy genetikailag és antigenitás szempontjából ilyen mértékben különböző szövet szervezetbe kerülése esetén jelentős citotoxikus válasz várható az anyai immunrendszertől, árnyalja a képet, hogy a fent említett immunszuppresszív hatások egy jó része a trofoblaszt szövettől származik közvetlen, vagy közvetett módon. Éppen ezért GTB esetében az antigenitás növekedése
együtt
jár
a
proliferáló
trofoblaszt
sejtek
által
elválasztott
immunszuppresszív molekulák magasabb szintjével. Tekintve, hogy számos esetben a mola terhesség spontán vetélésként végződik, és nem eredményez semmilyen perzisztáló betegséget, az immunrendszer legtöbb esetben képes tehát a trofoblaszt proliferációt megfékezni. Az invazív, metasztatikus vagy perzisztáló mola esetében azonban az immunszuppresszív és citotoxikus folyamatok egyensúlya felborul a trofoblaszt invázió javára. Ezekben az esetekben a gesztációs trofoblaszt betegség kezelés nélkül az anya halálához vezethet.
27
Mola terhességben az immunszuppresszív faktorok kifejeződése nem csak a proliferáló trofoblaszt sejtek magasabb száma miatt kifejezettebb. Számos tanulmány kimutatta, hogy a szolubilis és a sejtfelszíni HLA-G kifejeződése a neoplasztikus trofoblaszt sejtekben erősebb, mint normál terhességben. (102) Továbbá, hogy a choriocarcinóma sejtkultúra felülúszójából gyűjtött minta szignifikánsan erősebben szupresszálta a citotoxikus T sejteket kísérletes körülmények között, mint a normális terhességből származó trofoblaszt tenyészet felülúszója. (103) E mellett Shaarawy és mtsai. a szolubilis IL-2 receptor szintjét is magasabbnak találták olyan anyák perifériás keringésében, akikben később az utánkövetés során gesztációs trofoblaszt tumor fejlődött ki. (104) Tekintve, hogy az immunsejt aktivitás és trofoblaszt proliferációja közötti kényes egyensúly jelentősen befolyásolja a mola terhesség és a gesztációs trofoblaszt tumorok kimenetelét, ezért számos tanulmány igyekezett feltárni a normál terhesség és a mola terhességek placenta ágyában található immunsejtek közötti különbségeket. A normál terhességek placenta ágyában a következő sejttípusokat írták le eddig: Natural Killer sejtek, makrofágok, T sejtek (α/β és γ/δ) és kis számban Natural Killer T sejtek. Kabawat és mtsai. mola terhesség placenta ágyában a CD4 sejtek abszolút számának emelkedése mellet a CD4/CD8 arányt is magasabbnak találta. (105) Wongweragiat és mtsai. normál placentához hasonlítva a CD8 sejtek számát is szignifikánsan magasabbnak találták mola terhességben. (106) Az NK sejtek tekintetében az a két tanulmány, amit CD56 immunfestéssel végeztek, ellentmondó adatokat hozott. Az első tanulmány nem talált különbséget az NK sejtek számában mola terhesség és normál terhesség placenta ágya között, amíg a második tanulmány szignifikánsan (p<0.001) alacsonyabb sejtszámról számol be mola terhesség esetén. (107) Tekintve, hogy a második tanulmány későbbi (feltehetően jobb antitestet használtak a kutatók) és jelentősen nagyobb mintaszámon vizsgálta a kérdést, az a feltételezés terjedt el, hogy mola terhesség esetében a T sejtek számának emelkedése mellett az uNK sejtek száma csökken normál terhességhez viszonyítva. A jelenlévő immunsejtek fenotípusának pontosabb leírására azonban mindezidáig nem történt meg.
28
3.8 Egyéb funkcionális fehérjék Kato és mtsai. mola terhességben microarray módszerrel vizsgálta 589 olyan jól ismert gén kifejeződését, melyek összefüggésben állnak a sejtproliferációval és a sejtmigrációval. (108) 598 génből 57 gén kifejeződését találta erősebbnek és mindössze néhány gén expressziója bizonyult alacsonyabbnak mola terhességben normál terhességből származó szövethez viszonyítva. A mola terhességben erőteljesebben kifejeződő gének nagyrésze, a már fent említett onkogéneken kívül, proliferációs jelútvonalak fehérjéi voltak, mint például Ras-MAP kináz, Wnt vagy Jak-STAT5. Ezek mindegyike hozzájárulhat a mola terhességben tapasztalható fokozott trofoblaszt proliferációhoz. A vizsgált gének közül néhány azonban a sejt migráció szabályozásában vesz részt, melyek a trofoblaszt sejtek inváziójával egyidejűleg befolyásolhatják a méhben található immunsejtek vándorlását is. Ezen gének közül kiemelt figyelmet fordítottam a CEACAM1 (Carcioembrional Antigen Cell Adhesion Molecule 1) és a Laminin receptor-1 molekulának. A CEACAM1 molekula erőteljesebb kifejeződését RT-PCR vizsgálatokkal a saját mintáimon nem sikerült megerősítenem (nem publikált adat), így azzal a továbbiakban nem foglalkoztam. 3.8.1 Laminin receptor 1 A kollagének mellett a lamininok (extracelluláris mátrix glikoproteinek) a bazális membrán fő összetevői. Jelentős szerepet töltenek be különböző biológiai folyamatban, többek között a sejtadhézióban, differenciálódásban, migrációban, jelátvitelben és a tumorok metasztázis képzésében. (109) A laminin sejtekre gyakorolt hatásait sejtfelszíni receptorok közvetítik. A legismertebb laminin receptorok az integrinek, melyek különböző alfa és béta láncok heterodimérjei. Ismert azonban számos nem integrin típusú laminin receptor is, melyek közül a laminin receptor 1 (LR1) az egyik leggyakrabban vizsgált molekula. Ez a receptor molekula számos különböző néven ismert az irodalomban, úgy, mint: 67kD laminin receptor, 37 kD laminin receptor prekurzor (37 LRP), p40 riboszóma asszociált protein és laminin kötő
29
fehérje. A laminin receptor 1 egy konzervatív aminosav szekvenciájú protein, melynek kiemelt jelentősége van az állatvilágban szinte mindenütt. Számos tanulmány bizonyította, hogy a laminin receptor 1 képes megváltoztatni az extracelluláris környezetet és ezáltal fokozza a sejtek invázióját. (110,111) In vitro kísérletek azt mutatták, hogy a laminin receptor 1 valószínűleg megváltoztatja a laminin konformációját, mellyel javítja annak affinitását az integrin típusú molekulákhoz. (112) Tumorokban a laminin recetor 1 kifejeződének erőssége a tumorsejtekben erősen korrelált a daganat inváziós és metasztatizáló képességével in vitro és in vivo. (113,114) A laminin receptor 1-nek az embrió beágyazódásban betöltött szerepét egér kísérletekben vizsgálták, ahol azt találták, hogy az anti-LR1 antitesttel végzett méhűri lavage képes volt az egér embriók beágyazódását megakadályozni. (115) Tekintve, hogy a molekula egy konzervatív fehérje, feltehetően az emberben is hasonló súlyú szerepe lehet a beágyazódás és a trofoblaszt invázió folyamatában. Mindezidáig azonban humán endometrium, placenta és mola szöveteken a laminin receptor 1 kifejeződését még nem vizsgálták.
30
3.9 Angiogenezis Az utóbbi években az angiogenezis vizsgálata szolid tumorokban az onkológia kutatások középpontjába került. A nagyszámú kutatás eredményeképpen rengeteg értékes felfedezéssel gazdagodtunk, melyek ma már gyógyszerek formájában szolgálják az emberiséget. Jól ismert tény, hogy a tumorok megfelelő vérellátás hiányában nem képesek 2-3 mm-nél nagyobb méretet elérni. (116) Továbbá, hogy a tumorokat ellátó erek fejlődésének hiányában az áttétképzés esélye is nagymértékben csökkent, tehát habár a tumor a szervezetben jelen van, az hosszú ideig tünetmentes marad. (117) Több éven át tartó intenzív kutatások eredménye képpen az angiogenezisben szerepet játszó legfontosabb faktorok ismerté váltak és már több anti-angiogenezis terápia klinikai kipróbálása is elkezdődött. A legismertebb angiogenetikus faktorok a következők: a VEGF, az angiopoietin 1 (Ang1) és angiopoietin 2 (Ang2), a bFGF, a TGF-β, a PDGF, és placenta esetében a PLGF (placenta growth factor). Ezek közül a VEGF és az angiopoietin 1 és 2 hatásmechanizmusa a legtöbb kutató számára elfogadott, a többi faktor szerepe azonban jelenleg még vita tárgyát képezik. (118) 3.9.1 VEGF A VEGF az összes ismert érképződést befolyásoló faktorok közül a legjelentősebb. VEGF nélkül gyakorlatilag nincs érképződés. A többi ismert faktor a VEGF hatását csupán módosítani képesek. A VEGF molekulának számos formája ismert, melyek alternatív splicing útján jönnek létre (VEGF 121, 145, 165, 189, 206). A VEGF az endothel sejtek felszínén található VEGF receptorok valamelyikéhez (VEGFR1 és VEGFR2) kötődve serkentik az endothel sejtek proliferációját és migrációját. Kemotaxis útján irányítják az érképződés folyamatát. (119) 3.9.2 Angiopoietin 1 és 2 Az angiopoietin molekulák jelentős modulátor szereppel rendelkeznek az érképződés folyamatában. Az angiopoietin molekuláknak 4 különböző formája ismert Ang1, Ang2, Ang3 és Ang4. Ezek közül emberben az angiopoietin 1 és 2 játszik
31
jelentős szerepet az érképződésben. Hatásukat ugyanazon receptoron (Tie-2) keresztül fejtik ki. Az Ang1 a Tie-2 receptor agonistája, míg az Ang2 antagonizálja az Ang1 hatását. A Tie-2 receptor nagy számban található az ér körüli struktúrákban és jelentős szerepe van az erek érésében. Az Ang1 Tie-2 receptorhoz kötődése a simaizom és fibroblaszt sejtek proliferációjához, és ezáltal érett érstruktúra kialakulásához vezet. Az Ang 2 ezzel szemben az endothel körüli sejtek apoptózisát és az erek destabilizációját eredményezi. Egészséges felnőtt egyedben tehát az Ang1/Ang2 hányados magas szintje az érképződést akadályozza és az ereket érett formában tartja. (120-122) Tumorok környezetében azonban ez az arány felborul és az alacsonyabb Ang1/Ang2 hányados a magas VEGF-fel együtt egy éretlen szerkezetű, áteresztő érhálózatot hoz létre, amely kedvez a tumorok áttét képződésének. (123) 3.9.3 Érsűrűség jelentősége (Microvessel Density, MVD) Az érképződést befolyásoló faktorok eredményeképpen a tumorokban, illetve a környező szövetekben az erek sűrűsége megnövekszik. Vese tumorok (renal cell cancer) esetén például bebizonyosodott, hogy a tumorban található erek sűrűsége (microvessel density, MVD) független prognosztikai értékkel bír (regressziós analízis). (124) Egy tanulmány malignus melanómában úgyszintén kimutatta, hogy az MVD a daganat remissziójának előrejelzésében pontosabb prognosztikai faktor, mint a Breslow score. (125) Premalignus elváltozások esetén a környező szövetekben mért MVD azonban is képes előre jelezni a rosszindulatú elfajulás esélyét. Az MVD hasznosnak bizonyult vulváris lichen sclerosus malignus progressziójának előrejelzésében. Ezen túl hepatitis C cirrhózisban szenvedő betegek májában az emelkedett MVD szintén képes volt előre jelezni a hepatocelluláris carcinóma kialakulását. (126,127) Tekintve, hogy több tanulmány leírta, hogy a trofoblaszt sejtek VEGF-t termelnek, felmerül a kérdés, hogy mola terhesség esetén az érképződés mértéke a placenta ágyban összefüggésben állhat-e a trofoblaszt invázió mértékével, az áttétképzéssel vagy a perzisztáló trofoblaszt tumorok kialakulásával. (128)
32
4. Célkitűzések A gesztációs trofoblaszt tumorok szerencsére azon betegségek közé tartoznak ma már, amelyeket időben képesek vagyunk felismerni, és megfelelően kezelni. A gesztációs trofoblaszt tumorok területén történt áttörés az onkológiai kutatások sikertörténetének mondható. Az egykoron halálos betegség a különböző kemoterápiás eljárásoknak köszönhetően ma már 95%-os sikerrel gyógyíthatóvá vált, hála. (65) A gesztációs terhességek kutatása azonban nem állhat le. A magas rizikójú betegek esetén a kombinált kemoterápia továbbra is számos mellékhatással bír, amelyek nemegyszer a beteg életét veszélyeztetik. A betegség utánkövetése jelentős költséggel és kellemetlenséggel jár a betegek számára. A hosszú és jelentős pszichikai teherrel járó utánkövetés pedig hónapokig bizonytalanságban tartja a betegeket a kórkép kimeneteléről. A ideális kezeléstől általában elvárható, hogy az egyszeri adagban, kellően hatásos legyen, mentes legyen a mellékhatásoktól és amennyiben lehetséges, legyen olcsó. Kiemelt jelentősége van ennek a gesztációs trofoblaszt betegségek esetében, hiszen a terápiára a legnagyobb igény a fejlődő országokban van, ahol a betegség incidenciája jelentősen magasabb, mint a fejlett nyugati államokban. Éppen ezért egy alternatív, az eddigieknél valamivel hatékonyabb, de kevesebb mellékhatással járó terápiára mindenképpen nagy igény lenne a klinikusok részéről. Amennyiben ez a terápia hasonló hatékonysággal, de kevesebb mellékhatással rendelkezne, mint a kombinált kemoterápiás protokollok, akkor az biztosan átvenné a hCG utánkövetés és a profilaktikus kemoterápia helyét a kezelésben. Tekintve, hogy a mola terhesség egy jelentős mértékben idegen genetikai állománnyal rendelkező allograft, felvetődik egy alternatív immunterápia lehetősége. Ehhez azonban ismernünk kell az egészséges és patológiás terhességek hátterében fekvő immunológiai mechanizmusokat. Feltételezésünk szerint a terhességi immunszuppresszió gátlása a mola terhességek esetén a trofoblaszt szövetek kilökődésével járna. Jelenleg azonban a terhesség hátterében álló immunmechanizmusok nem kellően ismertek. A mola terhesség esetén még az a kérdés sem tisztázott, hogy a fokozott immunszuppresszió,
33
vagy a trofoblaszt sejtek proliferációs potenciálja játssza az elsődleges szerepet a perzisztáló trofoblaszt tumorok kialakulásában. Első feladatunk volt tehát meghatározni a már leírt immunsejtek fenotípusát, és válaszolni a következő kérdésekre: A jelenlévő citotoxikus immunsejtek (Tc, NK) vajon inaktív sejtek a placenta ágyban, vagy jelentős rejekciós potenciállal rendelkező aktív, citotoxikus sejtek? Jelen vannak-e regulátor T sejtek a placenta ágyban, és ha igen, befolyásolják-e a citotoxikus sejtek aktivitását? Első lépésként tehát a sejtes immunválasz funkcióját igyekeztünk feltárni egészséges és patológiás placentában. A jelenlévő sejtek citotoxikus potenciálját (Granzyme B termelés) és az újonnan leírt regulátor sejttípus (regulátor T sejt) jelenlétét vizsgálatuk. Ezek után a sejtek aktivációjának és specificitásának vizsgálata következett. Vagyis arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a T sejtek antigénspecifikusan aktiválódnak-e, és ha igen, az immunsejt aktiválódása szolgáltathat-e bármilyen információt magáról az aktiváló antigénről. Másodsorban olyan fehérjéket kerestünk, amelyek felelősek lehetnek a gesztációs trofoblaszt betegség fennmaradásáért (perzisztálás). A proliferáció mind a perzisztáló, mind a nem perzisztáló trofoblaszt betegségek sajátja. Nőgyógyászati patológiában jártas szakértővel vizsgáltuk a hematoxilin-eozinnal festett perzisztáló és nem perzisztáló mola metszeteket. Sem a morfológiában sem a trofoblaszt proliferáció mértékében (trofoblaszt szigetek mérete, hidropikusan elfajult bolyhok száma) nem találtunk eltérést (nem publikált adat). Így feltehetően nem a proliferációs potenciál növekedése, hanem a trofoblaszt sejtek egyéb biológiai tulajdonságai vezetnek a kórállapot perzisztálásához. A fent említett immunszuppresszív hatás mellett ilyen lehet az angiogenetikus faktorok termelődése, vagy a sejtadhéziót módosító fehérjék fokozott kifejeződése. A microarray-jel talált laminin receptor 1 fokozott kifejeződése egy lehetséges mechanizmus a sejtinvázió fokozására. Célunk volt tehát a laminin receptor 1 molekula kifejeződésének, lokalizációjának tisztázása, valamint az esetleges funkció meghatározása.
34
Harmadsorban a fent említett mechanizmusok közül az angiogenezis vizsgálata vetődött fel. Tekintve, hogy az érsűrűség prediktív értékét már számos más premalignus elváltozásban bizonyították, felvetődött a lehetőség, hogy gesztációs trofoblaszt betegségekben is hasonló prognosztikai értéke lehet az MVD-nek. Mivel jelentős különbséget találtunk a placenta ágy érsűrűségében a teljes és részleges molák esetében (ld. eredmények fejezet), a vizsgálatot tovább folytattuk és a legismertebb angiogenetikus faktorok kifejeződését igyekeztünk tisztázni a placenta szövetekben.
Kezdetnek
a
VEGF,
az
angiopoietin
1
és
2
molekulák
immunlokalizációját végeztük normál placenta és mola metszeteken. Ezen kívül vizsgáltuk a legfontosabb klinikai faktorok (hCG szintek, kor, kemoterápia fajtája, metasztázisok száma, stb.) összefüggéseit a placenta ágyban található érsűrűséggel, hogy a talált eltérést megmagyarázzuk. Összefoglalva tehát a Ph.D. munkám célja azon mechanizmusok keresése és azonosítása, amelyek a legtöbbször benignus lefolyású mola terhességet malignus irányba terelik. Átfogóan próbáltam vizsgálni azokat a lehetséges mechanizmusokat, amelyek befolyásolhatják az invazivitást, a metasztázis képzést és a perzisztálást. Igyekeztem olyan területeket tanulmányozni, melyek kisérleti eredményei rövidtávon beépíthetőek lehetnek a klinikai terápiába. Kutatómunkám középpontjában az immunológiai mechanizmusok tisztázása állt, hiszen ezen a területen várható leginkább jelentős áttörés egy esetleges új alternatív terápia kifejlesztésére. Ugyanakkor az angiogenezisből származó vizsgálatoknak akár néhány éven belül hatása lehet a klinikai gyakorlatra, hiszen a fokozott placánta ágyi érsűrűség felvetheti egy már elfogadott érképződést gátló kezelés (Avastin) protokollba építését is.
35
5. Módszerek 5.1 Vizsgálati anyagok Minden szövetet, melyet a vizsgálatokhoz használtunk, a Brigham and Women’s Hospital
Nőgyógyászati
és
Perinatológiai
Patológia
Osztálya
bocsátotta
rendelkezésünkre. A friss mola szövetet a vákumos kiürítés után a Patológiai Osztály egy szakértője makroszkóposan átvizsgálta és 30 percen belül nekünk átadta. Mindegyik mintából ezzel párhuzamosan paraffin blokk, majd metszet készült. A normál placenta szövetek az interrupció után úgyszintén a Patológiai Osztályról kerültek hozzánk a molához hasonló módon. A friss szöveteket gondosan steril PBS oldatban többször is átmostuk, és a vizsgálathoz szükséges módon fagyasztottuk. Minden egyes mintát egy nőgyógyászati patológus makroszkóposan és mikroszkóposan megvizsgált, és felállította a diagnózist. A diagnózis alátámasztására és a genetikai tartalom tisztázására p57kip2 immunfestést és flow cytometriás vizsgálatot végeztünk. Azon szöveteket, melyekhez az utánkövetés eredménye (perzisztáló vagy nem perzisztáló GTB) is szükséges volt, a patológiai szövetbank bocsátotta rendelkezésünkre. Minden szövet és klinikai információ a Brigham and Women’s Hospital Institutional Review Board engedélyével és tudtával került felhasználásra. A klinikai információk közül a következők áltak a rendelkezésünkre: anya életkora, terhességi hét, előző mola terhesség volt-e, patológiai diagnózis, p57kip2 immunfestés és a flow cytometria eredménye. A szövetbanktól kapott minták esetén a hCG utánkövetés eredménye és pozitív esetben annak szövettani diagnózisa is rendelkezésünkre állt. A reproduktív korú egészséges nők vérét a Brigham and Women’s Hospital Kísérleti Vérbankja bocsátotta rendelkezésünkre.
36
5.2 Módszerek az immunsejtek jellemzéséhez 5.2.1 Immunfestés kivitelezése Granzyme B (GrB) pozitív és negatív citotoxikus T sejtek (Tc) GrB pozitív Natural Killer (NK) sejtek valamint regulátor T sejtek (Treg) immunfestését végeztük 19 részleges és 17 teljes mola, valamint 11 normál placenta, 5 intraplacentáris (normál terhesség) és 7 teljes mola után kialakult choriocarcinóma szövettani metszetén. Mindegyik esetből két metszetet használtunk fel. Az első metszeten GrB és CD8 kettős immunfestést végeztünk az alábbiak szerint: A parafin metszeteket deparafináltuk, rehidráltuk, majd „Target Retrieval Solution” oldatban (Dako, Carpinteria, CA) 120 Celsius fokon 20 percig főztük. BSA-val (Bovine Serum Albumin) történő blokkolás után a metszeteket egér anti-humán anti-CD8 ellenanyaggal (clone C8/144B, 1:50, DAKO, Carpinteria, CA) szobahőmérsékleten inkubáltuk 90 percig. Alapos mosás után DAKO polymer oldatot (DAKO, Carpinteria, CA, 30 perc) használtunk másodlagos antitest helyett. A CD8 pozitív sejteket Vector Blue AP Substrate Kit III (Vector Laboratories, Burlingame, CA) segítségével tettük láthatóvá. Ezt követően a metszetet alaposan átmostuk, majd 5%-os H2O2 oldatban inkubáltuk 10 percig, hogy az endogén peroxidáz aktivitást kimerítsük. Újabb blokkolás után a metszeteket Granzyme B (clone GrB7, 1:50, DAKO, Carpinteria, CA) antitest oldattal fedtük és a 4 Celsius fokos hűtőbe helyeztük éjszakára. „Vectastain ABC reagent” kittet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) és Diaminobenzidin-t (DAB, Vector labratories, Burlingame, CA) használtunk a Granzyme B pozitív sejtek megjelenítésére. A második metszeten a Treg sejtek immunlokalizácóját végeztük. Deparafinálás és főzés után a metszeteket 5%-os H2O2 oldattal kezeltük. Blokkolás után a metszeteket FoxP3 antitesttel (clone236/E7, 1:100, Abcam, Cambridge MA) szobahőmérsékleten 90 percig inkubáltuk. Ezek után Vectastain ABC reagens és DAB segítségével a fent leírtak alapján tettük láthatóvá a FoxP3 pozitív regulátor T sejteket. Mindegyik ellenanyaghoz pozitív (tonsilla) és negatív (aspecifikus IgG elsődleges ellenanyag) kontroll immunfestéseket végeztünk.
37
5.2.2 Immunsejtek azonosítása A GrB pozitív NK, effektor Tc, naiv Tc, valamint Treg sejteket számoltuk meg a metszeteken. A kettősen festett metszeten a csak GrB+ sejteket GrB+ NK sejtekként azonosítottuk, a CD8+ citotoxikus sejtek vagy termeltek Granzyme B-t (effektor Tc) vagy nem (naiv Tc). A második egyszeresen festett metszeten a FoxP3-mal jelzett sejtek a regulátor T sejtek (2. és 3. ábra) 2. ábra.
3. ábra. Immunfestés teljes mola placenta ágyában
A
B
A: CD8 (kék) and GrB (barna) kettős festés teljes mola terhesség placenta ágyában B: FoxP3 festés (barna) teljes mola placenta ágyában
38
5.2.3 Immunsejtek quantitatív elemzése Minden egyes metszet chorion bolyhait 20-szoros nagyítással (Olympus BX 60) vizsgáltuk, hogy kizárjuk a chorioamnitist, és minden olyan fertőzést, amely a gesztációs trofoblaszt betegségekben és a normál placentában található immunsejtek számát és fenotípusát befolyásolhatja. A placenta ágy infiltrációjának vizsgálatához először 4-szeres nagyítással 20 véletlenszerű területet választottunk ki. Mindegyiket pontoztuk az infiltráló immunsejtek számától függően. 0 értéket kapott az a terület, amelyben nem találtunk immunsejteket és 1-es értéket kapott a terület, amennyiben 1 vagy több immunsejt volt látható. A kapott pontértéket 20-szal elosztva kaptuk az infiltrációs rátát, amely tükrözi a placenta ágy immunsejtekkel infiltrált területét százalékos arányban. Posztmoláris choriocarcinóma esetében a placenta ágy helyett a tumort körülvevő szöveteket vizsgáltuk ugyanilyen módon. Ezt követően minden egyes metszeten a legnagyobb mértékben infiltrált területet választottuk további elemzés céljából. Öt 20-szoros látótérben számoltuk a CD8+/GrB+, CD8+/GrB-, CD8-/GrB+ és a FoxP3+ sejteket. A számolást Image Pro Plus szoftverrel végeztük, amit egy független megfigyelő számolásaival vetettünk össze. A manuális és számítógépes számolások eltérése általában kisebb volt 5 %-nál. Az öt látótérben talált sejtek összege adta a további analízisekhez használt sejtszámokat. 5.2.4 Statisztikai elemzés Az adatok elemzésére non-parametrikus Mann-Whitney U tesztet használtunk. Ezen túl a sejtszámok közötti összefüggések feltárására Spearman korrelációs analízist végeztünk. 0,05-nél kisebb p értéket (two sided) tekintettük statisztikailag szignifikáns különbségnek. Minden számítást SPSS 14.0 (windows) szoftveren végeztünk.
39
5.3 T limfociták aktivációjának vizsgálta T sejt receptor variábilis béta lánc profil elemzésével A variábilis beta lánc elemzés a T sejt aktiváció vizsgálatának elfogadott módszere. Számos autoimmun betegségben bizonyították specifikus antigének szerepét variábilis béta lánc analízis használatával. (129-132) A módszer alapja a klónszelekciós elmélet, mely szerint mindegyik perifériára kikerülő T limfocita sejt specifikus T sejt receptorral (TCR) bír. A T sejt receptor specificitása a thymusban az ontogenezis során lezajló VDJ rekombináció eredménye. Az emberi genom (germline DNA) számos T sejt receptor Variability (V), Diversity (D) és Joining (J) gént tartalmaz (4. táblázat). Ezek véletlenszerű átrendeződése hozza létre a sejtspecifikus TCR DNS-t (4. ábra). Ez további módosulásokon megy keresztül, tovább növelve a T sejt receptorok diverzitását (1016 féle TCR). A periférián minden érett T sejt különböző sejtre specifikus átrendeződött DNS-t tartalmaz. Amennyiben a T sejt receptor találkozik a bemutatott antigénnel, mely hozzá kötődni képes, aktivációs szignált indít el a sejt felé. A teljes aktivációhoz ugyan számos co-aktivációs molekulák kapcsolódása is szükséges, de az aktiváció specificitásáért a T sejt receptor a felelős. (133) Amennyiben a T sejt aktiválódik, proliferálni kezd és az utód sejtek az anyasejt TCR molekulájával teljesen megegyező receptorokat
kezdenek szintetizálni, melynek hatására a szövetben
megemelkedik a T sejtre specifikus variábilis láncok kifejeződése (5. ábra). 4. ábra. T-sejt receptor béta láncának V, D, J génátrendeződése (az ábra engedéllyel átvéve és fordítva a következő helyről: Janeway’s Immunobiology, 6/e. Figure 4-12 Garland Science, 2005)
40
Tekintve, hogy a TCR gének közül a béta lánc variábilis gének száma kellően nagy ahhoz, hogy a specificitást bizonyítsa, ugyanakkor még kellően alacsony ahhoz, hogy vizsgálható legyen, ezen lánc használatának elemzése terjedt el általánosan az immunológiai kutatásokban. 4. táblázat. Az alfa és béta lánc V, D és J génjeinek száma az emberi genomban
V α
75
β
25
D
J 50
2
12
5. ábra. A klónszelekciós elmélet és a TCR variábilis béta lánc vizsgálat egyszerűsített magyarázata
A T sejt felismeri az MHC molekulán bemutatott antigént, melynek hatására a specifikus T sejt aktiválódik, proliferálni kezd. Az utódsejtek a specifikus TCR DNS-t átírják, hogy TCR molekulát szintetizáljanak. A szövetben megnő tehát a specifikus variábilis béta lánc mRNS-ének koncentrációja, mely RT-PCR módszerrel egyszerűen mérhető.
41
5.3.1 Vizsgálati anyagok és cDNS készítése A vizsgálatot 14 friss fagyasztott teljes mola és 7 normál placenta szöveten, valamint 10 egészséges reproduktív korú nőből származó vér fehérvérsejtjein végeztük. A friss szöveteket, alaposan megtisztítottuk, majd apró 5-7 mm3-es darabokra vágtuk. Steril PBS oldatban átmostuk (vortexeltük) 5-ször, hogy a szövetre tapadt perifériás anyai vért kellően kimossuk a szövetekből. Ezt követően a szövetet folyékony nitrogénba mártva lefagyasztottunk. Mozsár segítségével a szövetet porrá morzsoltuk, majd fecskendő és tű használatával homogenizáltuk. Homogenizált szövetekből és a fehérvérsejtekből totál RNS-t izoláltunk RNeasy mini kit (Qiagen, Maryland, USA) segítségével, majd SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, California, USA) kittel az RNS-ből cDNS-t készítettünk. 5.3.2 RT PCR vizsgálatok a Variábilis béta lánc használat meghatározásához Quantitatív RT-PCR-t végeztünk minden egyes mintán 25 variábilis beta láncra specifikus primerekkel. (132) Referencia génnek a konstans béta láncot használtuk (5. táblázat). Desztillált vízzel negatív kontroll mérést végeztünk minden RT-PCR reakció esetén. Minden egyes primerre meghatároztuk a hatékonysági görbét (efficiency curve) és E (efficiency) értéket számoltunk. Az E értékek 0,78-0,83 között mozogtak. Tekintve, hogy ezen értékek megfelelően közel esnek egymáshoz (max. 6,4%-os eltérés), a különböző primerekkel mért gének expressziói tehát egymással összevethetőek. Quantitatív RT-PCR reakcióit az alábbiak alapján mértük össze: 2μl cDNS-t, 2 μl primert és 6 μl sterilizált desztillált vizet mértünk 10 μl SYBR GREEN PCR Master Mix-hez (Applied Biosystems, Warington, UK). Mindegyik reakciósorozat az alábbiak szerint zajlott: 10 perc 95 oC-os indulást 40 ciklus 125 másodpercig tartó 95 o
C-os denaturálás és 1 perces 60 oC-os annelláció követte. A reakciókat Applied
Biosystems 7300 Real-Time PCR System készüléken mértük le. Minden mérést egyszer ismételtünk és a Ct értékek átlagát használtuk a további elemzésekhez. Az egyes gének relatív expresszióját a következő képlet alapján számítottuk:
TCRBVn(%)= TCRBVn(%)
2 -(BVnCt-BC Ct) x 100 -(BV1-25 Ct – BC Ct)
Σ(2
42
x 100
x 100
5. táblázat 25 variábilis béta lánc és a konstans béta lánc primerek szekvenciák Gén
Szekvencia 5’-3’
BV1
AAGCACCTGATCACAGCAACT (forward) TAGTTCAGAGTGCAAGTCAGG (reverse) GGTTATCTGTAAGAGTGGAACCT AGGATGGGCACTGGTCACTGT TCGAGATATCTAGTCAAAAGGACG GGTGCTGGCGGACTCCAGAAT AAGCAGGGATATCTGTCAACGT TTCAGGGCTCATGTTGCTCAC GATCAAAACGAGAGGACAGCA AGCACCAAGGCGCTCACATTCA CTCAGGTGTGATCCAATTTCA CCCCCGCTCTGTGCGCTGGAT CATGGGAATGACAAATAAGAAGTCT TGGCTGCAGGGCGTGTAGGTG CCCCGCCATGAGGTGACAGAG GAGTCCCTGGGTTCTGAGGGC CCAAAATACCTGGTCACACAG CCAGGGAATTGATGTGAAGATT ACCTAGACTTCTGGTCAAAGCA GGACTGGATCTCCAAGGTACA TTATAGGGACAGGAAAGAAGATC ATGTGAGGGCCTGGCAGACTC CAAGACACAAGATCACAGAGACA GGCAGCAGACTCCAGAGTGAG TGAAGACAGGACAGAGCATGACA CACAGATGTCTGGGAGGGAGC ACCCAAGATACCTCATCACAGTG AGAGGTCTGGTTGGGGCTGGG TCACAAAGACAGGAAAGAGGATT GGGGATGGCAGACTCTAGGGA GTTCCCCAGCCACAGCGTAATA CAGTTCTGCAGGCTGCACCTT GTCCCCAAAGTACCTGTTCAGA AGCTGTCGGGTTCTTTTGGGC AGACACCTGGTCAGGAGGAGG TGCCGAATCTCCTCGCACTAC CCAGGACATTTGGTCAAAGGAAAA CAGTGCCGTGTCTCCCGGTTC GACCCTGGTGCAGCCTGTG GAGGAGGAGCTTCTTAGAACT CCCAGATATAAGATTACAGAGAAA CTGGATCTTGAGAGTGGAGTC CACAGATGGGACAGGAAGTGATC GTCCTCCAGCTTTGTGGACCG AAGAGGGAAACAGCCACTCTG CAGCTCCAAGGAGCTCATGTT CCAAGATACCAGGTTACCCAGTTT CAGGCCTGGTGAGCGGATGTC AAAACATCTTGTCAGAGGGGAA TGAATCCTCAAGCTTCGTAGC CAGCGCCCTTGTGTTGATG AAGCGCTGGCAAAAGAAGAA
BV2 BV3 BV4 BV5 BV6 BV7 BV8 BV9 BV10 BV11 BV12 BV13 BV14 BV15 BV16 BV17 BV18 BV19 BV20 BV21 BV22 BV23 BV24 BV25 TCRBC
Amplicon mérete (bp)
43
209 229 228 235 217 195 214 239 207 223 224 224 227 242 215 235 244 240 246 223 219 221 207 228 238 121
5.3.3 Adat elemzés A relatív expresszió számítására Microsoft Excel 2002 táblázatot hoztunk létre, mely képes a Ct eredményekből relatív expressziót számolni és az eredményt grafikusan megjeleníteni. (6. ábra). A különböző szövettani csoportok között az egyes gének relatív expressziójának összehasonlítására non-parametrikus Kruskal-Wallis, majd MannWhitney U tesztet használtunk Bonferoni korrekcióval. 0,05-nél kisebb p értéket (two sided) tekintettük statisztikailag szignifikáns különbségnek. Minden számítást SPSS 14.0 (windows) szoftveren végeztünk. 6. ábra. A variábilis béta lánc használat analízisére létrehozott Microsoft Excel táblázat Sample ID: Gene BV1 BV2 BV3 BV4 BV5 BV6 BV7 BV8 BV9 BV10 BV11 BV12 BV13 BV14 BV15 BV16 BV17 BV18 BV19 BV20 BV21 BV22 BV23 BV24 BV25 BC denominator
6 Ct 22,9 22,72 22,75 22,24 22,55 24,13 23,25 24,23 24,13 26,57 25,51 24,02 22,99 23,55 25,22 26,14 23,44 24,28 23,38 25,21 26,38 23,53 28,15 24,7 24,12 19,33
Buffy coat BVnCt-BCCt 3,57 3,39 3,42 2,91 3,22 4,8 3,92 4,9 4,8 7,24 6,18 4,69 3,66 4,22 5,89 6,81 4,11 4,95 4,05 5,88 7,05 4,2 8,82 5,37 4,79
2 to -(BVnCt-BCCt) power 0,084202099 0,095391201 0,093428078 0,133046273 0,10732068 0,035896824 0,066063628 0,033492921 0,035896824 0,006615198 0,013792234 0,038740866 0,079109787 0,05366034 0,016862941 0,008912217 0,057911754 0,032352029 0,060371021 0,016980232 0,007546378 0,05440941 0,002212664 0,024180703 0,036146506
numerator 8,42021 9,53912 9,342808 13,30463 10,73207 3,589682 6,606363 3,349292 3,589682 0,66152 1,379223 3,874087 7,910979 5,366034 1,686294 0,891222 5,791175 3,235203 6,037102 1,698023 0,754638 5,440941 0,221266 2,41807 3,614651
1,194542803
119,4543
TCR BVn (%) 7,048897564 7,985582459 7,821241549 11,13784056 8,984247301 3,005068006 5,530452936 2,803827591 3,005068006 0,553784907 1,154603609 3,243154244 6,622599618 4,492123651 1,411664877 0,746077621 4,848026686 2,70831893 5,053901827 1,421483783 0,631737728 4,55483136 0,185231022 2,024264259 3,025969907 Σ=100
Usage of Variable Beta chain 12 10 %
8 6 4 2 0 1
3
5
7
9
11
13 BV
44
15
17
19
21
23
25
5.4 Módszerek a laminin receptor 1 kifejeződésének vizsgálata Laminin receptor 1 molekula kifejeződését RT-PCR és immunhisztokémiai módszerrel mértük. RT-PCR mérésekhez 10 komplett és 4 részleges mola valamint 11 friss azonos terhességi hétből származó normál placenta szövetet használtunk fel. Az immunhisztokémiai vizsgálatokat 17 részeges, 19 teljes mola metszeten és 17 azonos terhességi hétből származó normál placentán végeztük. 5.4.1 RT-PCR mérések A friss szövetekből a cDNS készítése az előző fejezetben leírt módon történt. Quantitatív RT-PCR reakcióit az alábbiak alapján mértük össze: 2 μl cDNS-t, 1 μl LR1 TaqMan Gene Expression probe mix-et, 1 μl cyclophilin A (endogén kontroll) primer mix-et, és 6 μl sterilizált desztillált vizet mértünk 10 μl TaqMan Universal PCR Master Mix-hez (Applied Biosystems). Mindegyik reakciósorozat az alábbiak szerint zajlott: 10 perces 95 oC-os indulást 40 ciklus 125 másodperc 95 oC-os denaturálás és 1 perc 60 o
C-os annelláció követte. A reakciókat Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR
System készüléken mértük le. Minden mérést egyszer ismételtünk és a Ct értékek átlagát használtuk a további elemzésekhez. A mennyiségi értékeléshez a ΔΔ Ct számítási módszert használtuk. (134) 5.4.2 Laminin receptor 1 immunfestés A parafin metszeteket deparafináltuk, rehidráltuk, majd „Target Retrieval Solution” oldatban (Dako, Carpinteria, CA) 120 Celsius fokon 10 percig főztük. A metszeteket 5%-os H2O2 oldatban inkubáltuk 10 percig, hogy az endogén peroxidáz aktivitást kimerítsük. Blokkolás után a metszeteket poliklonális nyúl anti-LR1 ellenanyaggal (ab2508-500, Abcam, Cambridge, MA) szobahőmérsékleten 90 percig inkubáltuk. Alapos mosás után „Vectastain ABC reagent” kittet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) és Vector Blue-t (Vector labratories, Burlingame, CA) használtunk a LR1 pozitív sejtek, struktúrák megjelenítésére. Az ellenanyag megbízhatóságának
45
bizonyítására pozitív (tonsilla) és negatív (aspecifikus IgG elsődleges ellenanyag) kontroll immunfestéseket végeztünk. 5.4.3 Metszetek értékelése A metszeteket Image Pro Plus szoftver segítségével értékeltük. A programba beépített hisztogram funkció használatával digitalizált képeken mértük a kijelölt terület (AOI, area of interest) szín intenzitását. Minden metszeten azonos méretű AOI-t használtunk. Metszetenként, a szabad szemmel legerősebben festődő területekből, 3 mérést végeztünk, amelyeknek átlagát kivontuk a 3 háttér mérés átlagából. Az így kapott intenzitás értéket használtuk további analízisekhez (immunfestés intenzitása = 3 háttér mérés átlaga – 3 AOI mérés átlaga). Mivel a szoftver nem képes felismerni a festődési mintázatot (citoplazmatikus vagy membránfestődés) a citoplazmatikus festődés erősségét semiquantitatív módon is elemeztük. 0-tól 3-ig terjedő pontskálán szabdaszemmel értékeltük a citoplazmatikus festődés erősségét. A metszetek kiértékelését két független vizsgáló végezte. 5.4.4 Statisztikai elemzés Az adatok elemzésére non-parametrikus Mann-Whitney U tesztet használtunk. 0,05-nél kisebb p értéket (two sided) tekintettük statisztikailag szignifikáns különbségnek. Minden számítást SPSS 14.0 (windows) szoftveren végeztünk.
46
5.5 Módszerek az angiogenezis vizsgálatára 5.5.1 Érsűrűség meghatározása A vizsgálathoz 16 normál placenta, 10 nem perzisztáló és 10 perzisztáló részleges mola, valamint 11 nem perzisztáló és 13 perzisztáló teljes mola szövettani metszetet használtunk. Az érkeresztmetszetek azonosítására CD31 immunfestést végeztünk. A CD31 (PECAM-1, Platelet Endotehlial Cell Adhesion Molecule) molekula egy 130-140 kD tömegű fehérje, melynek kiemelt szerepe van a sejtek közötti adhézióban. Az endothel sejtek igen erősen kifejezik a CD31-t, így morfológiai azonosítással együtt a CD31 immunfestés az érsűrűség meghatározásának általánosan elfogadott módszere lett. 5.5.1.1 CD31 immunfestés A parafin metszeteket deparafináltuk, rehidráltuk, majd „Target Retrieval Solution” oldatban (Dako, Carpinteria, CA) 120 Celsius fokon 15 percig főztük. A metszeteket 5%-os H2O2 oldatban inkubáltuk 10 percig, hogy az endogén peroxidáz aktivitást kimerítsük. Blokkolás után a metszeteket monoklonális egér anti-CD31 ellenanyaggal (DAKO, Carpinteria, CA, 1:20) szobahőmérsékleten 60 percig inkubáltuk. Alapos mosás után „Vectastain ABC reagent” kittet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) és DAB-t (Vector labratories, Burlingame, CA) használtunk a CD31 pozitív
endothel
sejtek
megjelenítésére.
Az
ellenanyag
megbízhatóságának
bizonyítására pozitív (szerózus ovárium tumor) és negatív (aspecifikus IgG elsődleges ellenanyag) kontroll immunfestéseket végeztünk. 5.5.1.2 Metszetek kiértékelése Az
érsűrűség
meghatározásához
a
CD31
immunfestett
metszeteket
mikroszkóposan átvizsgáltuk, és a legnagyobb érsűrűséget mutató területeken (hot spots)
47
10-szeres nagyítás alatt Image Pro Plus szoftver segítségével megszámoltuk az érkeresztmetszeteket. 3 számítógépes és három manuális számolás eredményét átlagoltuk és a kapott átlag értékeket használtuk a további elemzésekhez. 5.5.2 Angiogenetikus faktorok vizsgálata Az angiogenetikus faktorok kifejeződésének vizsgálatához ugyanazokból az esetekből származó szövettani metszeteket használtuk, amelyeken az érsűrűség meghatározása is történt. Immunfestést, valamint morfológiai és qualitatív elemzést végeztünk az alábbiak szerint: 5.5.2.1 Immunfestés A VEGF, az Ang1 és Ang2 festéshez 3 további metszetet használtunk mindegyik esetből. A metszeteket deparafináltuk, rehidráltuk, majd „Target Retrieval Solution” oldatban (Dako, Carpinteria, CA) 120 Celsius fokon 15 percig főztük. A metszeteket 5%-os H2O2 oldatban inkubáltuk 10 percig, hogy az endogén peroxidáz aktivitást kimerítsük. Blokkolás után a metszeteket VEGF (AbCam, Cambridge, MA 1:750, 1 óra szoba hőmérsékleten), Angiopoietin 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, 1:20, 1,5 óra szoba hőmérsékleten) and angiopoietin 2 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, 11µg/ml, 4 ºC-on egy éjszakán át) monoklonális antitestekkel inkubáltuk. Alapos mosás után „Vectastain ABC reagent” kittet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) és DAB-t (Vector labratories, Burlingame, CA) használtunk az antigén kötődés megjelenítésére. Pozitív és negatív kontroll immunfestéseket végeztünk mindegyik ellenanyaggal. 5.5.2.2 Metszetek kiértékelése és statisztikai elemzés A metszeteket mikroszkóposan átvizsgáltuk, hogy a különböző angiogenetikus faktorok termelődési helyét azonosítsuk. Az immunfestés intenzitását számítógépen értékeltük a laminin receptor 1 vizsgálatnál leírtakkal megegyező módon, majd a kapott eredményeket Mann-Whitney U teszttel hasonlítottuk össze. A klinikai faktorok és az MVD összefüggéseit többváltozós regressziós analízissel vizsgáltuk (SSPS 14.0).
48
6. Eredmények 6.1 Immunsejtek jellemzése 6.1.1 Klinikai adatok Az átlag terhességi hét 10,6 hét volt a normál terhességek esetében, 11,6 hét a részleges és 9,9 hét volt a teljes molák esetében. 6.1.2 Immunsejt infiltráció Mononukleáris sejt (limfociták és NK sejtek) infiltráció volt látható normál placenta, részleges, valamint teljes mola placenta ágyában. A chorion bolyhokban nem észleltünk immunsejt infiltrációt, így a chorioamnitis lehetőségével nem kell tovább számolnunk. Normál terhesség placenta ágyában az infiltrált területek aránya 0 és 25% között mozgott. Mindössze egy esetben érte el az infiltrációs ráta a 60%-t. Mind részeleges, mind teljes mola esetében az infiltrációs ráta szignifikánsan magasabb volt, mint normál placenta esetében (p=0,035, p=0,008, 6. táblázat, 7. ábra). 6.1.3 Regulátor T limfociták Normál placentában sem a chorion bolyhok felszínén sem a placenta ágyban nem észleltünk regulátor T sejteket. Részleges és teljes mola esetében a regulátor T sejtek azon esetekben voltak jelen a placenta ágyban, ahol a citotoxikus T sejt számot is magasnak találtuk. Mola terhességben (részleges és teljes mola) a regulátor T sejt szám pozitívan korrelált a citotoxikus T sejtek számával (CD8+) (p=0,032, 7. táblázat). 6.1.4 CD8+ citotoxikus T sejtek és az effektor hányados A CD8+ citotoxikus T limfociták száma a placenta ágyban magasabb volt részleges és teljes molában, mint normál placentában. Szignifikáns különbséget azonban csak a teljes mola és a normál placenta között láttunk (NP vs. PM p=0,117, NP vs. CM 49
p=0,009, 6. táblázat). A részleges mola esetében a szórás igen jelentős volt. A részleges molák 1/3-a a normál terhességhez hasonló sejtszámokat mutatott. Az effektor hányados, mely az effektor Tc sejtszám (GrB+, CD8+) és az összes Tc sejtszám hányadosa (CD8+), nem különbözött szignifikánsan a normál placenta és a mola típusok között és nem korrelált a regulátor T sejt számmal. 6.1.5 GrB+ Natural Killer sejtek, effektor Tc/GrB+ NK sejt hányados A GrB+ NK sejtek száma részleges és teljes mola esetén magasabb volt, mint normál placentában, szignifikáns különbséget azonban csak a teljes mola terhesség és normál placenta között találtunk (p=0,007, 6. táblázat). Az effektor Tc/GrB+ NK sejtszám hányadosa folyamatosan emelkedett, ahogy az idegen genetikai tartalom növekedett a szövetekben. (6. táblázat).
7. ábra. Immunsejt infiltráció normál terhesség, részleges és teljes mola placenta ágyában
A: Normál terhesség placenta ágyának mononukleáris immunsejt infiltrációja (Tc és GrB+ NK sejtek) 20X B: Részleges mola placenta ágyának mononukleáris immunsejt infiltrációja (Tc és GrB+ NK sejtek) 20X C: Teljes mola placenta ágyának mononukleáris immunsejt infiltrációja (Tc és GrB+ NK sejtek) - 20X
50
6. táblázat. Citotoxikus immunsejtek számának alakulása normál terhesség, részleges és teljes mola placenta ágyában valamint posztmoláris choriocarcinóma környező szöveteiben Effektor
citotoxikus
Infiltrációs
citotoxikus
T
GrB+ natural
Összes GrB+
ráta
T sejtek
limfociták
killer sejtek
citotoxikus sejt
(CD8+,GrB+)
(CD8+)
(GrB+, CD8-)
14
21,5
34
Szövet típusa
Normál terhesség (n=11)
5%
62,5
Részleges mola (n=19)
30%*
75
88
240
318
Teljes mola (n=18)
60%*
144,5*
158*
242*
328*
90%* *
453**
470**
305**
897**
Posztmoláris choriocarcinóma (n=7)
Öt 20-szoros látótér sejtszámainak median értékekei. A posztmoláris choriocarcinóma mindegyike teljes molából fejlődött ki. *Szignifikáns eltérés a normál placentához hasonlítva (p<0,05) ** Szignifikáns eltérés a teljes molához viszonyítva
7. táblázat Regulátor T limfociták száma normál terhesség, részleges és teljes mola placenta ágyában és posztmoláris choriocarcinóma környező szöveteiben
Regulátor T limfociták Szövet típusa
Normál terhesség (n=11) Részleges mola (n=19) Teljes mola (n=18) Posztmoláris choriocarcinóma (n=7)
0 42,16* 24,47* 345**
Öt 20-szoros látótér sejtszámainak átlag értékekei. A posztmoláris choriocarcinóma mindegyike teljes molából fejlődött ki. * Szignifikáns eltérés a normál placentához hasonlítva (p<0,05) ** Szignifikáns eltérés a teljes molához viszonyítva
51
6.1.6 Immunsejt infiltráció gesztációs choriocarcinómában Az intraplacentáris choriocarcinómák mindegyike a chorion bolyhokból fejlődött és egyik esetben sem észleltünk immunsejt infiltrációt a környező bolyhokban. A placenta ágyban a normál terhességre jellemző immunaktivitás volt megfigyelhető. A teljes molából kialakult posztmoláris choriocarcinóma mind a 7 esetében igen jelentős immunsejt infiltrációt észleltünk a tumort körülvevő szövetekben. Posztmoláris choriocarcinóma eseteiben a környező szövetekben található immunsejtek száma jelentősen magasabb volt, mint amit teljes molák placenta ágyában találtunk. Az immunsejt infiltráció érdekes morfológiát mutatott. 7-ből 6 esetben a környező szövet erős immunsejt infiltrációja ellenére sem találtunk immunsejteket a tumorszövet belsejében. Az infiltrált terület határa élesen elkülönült és mind a hat esetben egybeesett a tumor és környező szövet határával (8. ábra). Egy esetben a tumorban gyenge infiltrációt találtunk. 8. ábra. Immunsejt infiltráció posztmoláris choriocarcinómában
A choriocarcinóma környező szöveteinek immunsejt infiltrációja GrB+ NK és CD8+ citotoxikus T sejtekkel. Éles infiltrációs határ látható
a
határvonalán
52
tumor
és
környező
szövet
6.2 T sejt receptor variábilis béta lánc vizsgálatának eredményei A poliklonális fehérvérsejt mintáink variábilis béta lánc (VBC) használata megközelítőleg egybeesik az irodalomban már publikált profilokkal. (132) A 2-es, 4-es, 5-ös és 13-as variábilis béta lánc expressziója igen enyhe dominanciája látható a fehérvérsejt (buffy coat) profilokban (10. ábra). A normál placenta immunsejtjei a buffy coat-hoz képest kisebb variábilis béta lánc diverzitást mutattak. A 2-es és 4-es VBC gének domináltak elsődlegesen. 7-ből 5 esetben a VBC 4-es gén expressziója kiemelkedően magas volt. 5-ből 3 esetben a relatív expresszió majdnem elérte a 100%ot. A 7 normál placentából 2 esetben a VBC 2-es gén kifejeződése dominált. 1 esetben pedig mind a 2-es mind a 4-es gén kifejeződése jelentősen fokozott volt (9. ábra). Teljes mola esetében a VBC 4-es gén fokozott kifejeződése még kiemelkedőbb volt. 14 teljes molából 11 esetben a 4-es gén kifejeződése egyedülállóan kiemelkedő volt és mindössze 1 eset mutatott fokozott VBC 2-es gén kifejeződést is. A VBC grafikon 2 minta esetében nagymértékben hasonlított a buffy coat profiljához. Ennek legvalószínűbb magyarázata a szövetminta szennyeződése perifériás vérrel. Az átlagos teljes mola VBC profilt a 10. ábra mutatja. A VBC gén profilok statisztikai analízise kimutatta, hogy mind a normál placenta, mind a teljes mola T sejt receptor variábilis béta lánc használata szignifikánsan különbözik a poliklonális perifériás fehérvérsejt profiltól. A 8. táblázat tartalmazza azon gének sorszámát, melyek valamilyen irányba szignifikáns eltérést mutatnak a szövettani csoportok között.
8. táblázat. A különböző csoportok között szignifikáns kifejeződésbeli különbséget mutató variábilis béta láncok NP-ban mint BC-ben Magasabb alacsonyabb
3, 5, 6, 7, 9, 10,12,13, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24
TM-ben, mint BC-ben 4 2, 5, 7, 9, 12, 13, 17, 20, 22, 24
TM-ben, mint NP-ben 5, 6, 12, 19
A táblázat azoknak a VBC géneknek a számát mutatja, melyek Mann-Whitney U teszttel eltértek a különböző csoportokban. NP –normál placenta, BC- buffy coat (fehérvérsejtek), TM- teljes mola
53
9. ábra. Normál placenta variábilis béta lánc profilok Normal placenta 1 60
% % 100
40
80
30
60
20
40
10
20
0
0 3
100
%%
%
50
1
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25
80 60 40 20 0 1
3
5
7
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 BV
Normal placenta 5
Normal placenta 6
%
% %
40 35 30 25 20 15 10 5 0 3
5
3
BV
Normal placenta 4 80 70 60 50 % 40 30 20 10 0
1
9 11 13 15 17 19 21 23 25
BV
1
Normal placenta 3
Normal placenta 2
%
%
35 30 25 20 15 10 5 0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 BV
BV
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 BV
Normal placenta 7 30
Az oszlopok a VBC gének relatív expresszióját mutatják %-ban egymáshoz viszonyítva.
25 20 %
15 10 5 0 1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 BV
10. ábra. Buffy coat-ban, normál placentában és teljes molában található T limfociták T sejt receptorának variábilis béta lánc profilja
54
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
1
25 variábilis béta lánc gén relatív kifejeződése poliklonális fehérvérsejtekben (n=9)
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
25 variábilis béta lánc gén relatív kifejeződése normál placentában (n=7)
90 80
Az oszlopok a VBC gének relatív expresszióját mutatják %-ban egymáshoz viszonyítva.
70 60 50 40 30 20 10 0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
25 variábilis béta lánc gén relatív kifejeződése mola terhességben (n=14)
6.3 Laminin receptor 1 vizsgálatok eredményei 6.3.1 Quantitatív RT-PCR eredmények Quantitatív RT-PCR mérésekben a laminin receptor 1 expressziója mola terhességben 13-szoros emelkedést mutatott normál placentához képest (p<0,004). 6.3.2 Immunfestés eredményei Az immunfestés feltárta, hogy a trofoblaszt sejtek ugyan kifejezik a laminin receptor 1-t, a festődés intenzitása azonban nem mutat szignifikáns különbséget a részleges és teljes mola, valamint a normál placenta között. Laminin receptor 1 festődést lehetet még látni egyéb sejteken is, mint például immunsejteken, endothel sejteken és fibroblaszt sejteken. A számítógépes analízis azonban itt sem talált szignifikáns eltérést az összehasonlított csoportok között. A decidua sejtek laminin receptor 1 kifejeződése az előző sejt típusokkal ellentétben jelentős eltérést mutatott a diagnosztikai csoportok között. Számítógépes intenzitásméréssel azt találtuk, hogy részleges és teljes molák esetében az LR1
55
kifejeződése a decidua sejteken szignifikánsan magasabb volt, mint normál placenták esetében (p=0,001 és P=0,045). Meglepő módon a deciduális sejtek LR1 expressziója magasabb volt részleges mola esetében, mint teljes molában (p=0,045, 11. ábra). Mola terhességben (részleges és teljes) a deciduális sejteken membrán és citoplazmatikus festődés is látható volt. Ezzel ellentétben a normál terhesség esetén a decidua sejteken többnyire csak gyenge membrán és citoplazmatikus festődést észleltünk (12. ábra). A citoplazmatikus festődés manuális elemzése azt mutatta, hogy a részleges molában a decidua sejtek szignifikánsan magasabb mértékben mutatnak citoplazmatikus prekurzor festődést, mint a teljes molában vagy a normál placentában (p=0,005 és p<0,001). Továbbá, a citoplazmatikus festődés mértéke teljes molában is szignifikánsan magasabb volt, mint normál placentában (p=0,024, 13. ábra). 11. ábra. Decidua sejtek LR1 festődésének erőssége különböző kórképekben
Decidua sejteken Image Pro Plus szoftverrel mért LR1 festődés relatív intenzitásának átlaga normál terhességben, teljes és részleges molában 12. ábra. Laminin receptor 1 festődés részeleges mola és normál terhesség decidua sejtjein
A
B
56
A: Lamini n recept or 1 festődé s részleg es mola placent a ágyában. A decidua sejtek erős citoplazmatikus festődést mutatnak, ami aktív prekurzor szintézisre utal. B: Laminin receptor 1 festődés normál terhesség placenta ágyában. A decidua sejtek gyenge membrán és citoplazmatikus festődést mutatnak 13. ábra. Citoplazmatikus festődés manuális értékelése 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
NP NP NP NP
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
PM PM PM PM PM PM PM PM PM
Az ábra a különböző csoportokban található deciduális sejtek citoplazmatikus festődését mutatja. 0-tól 3ig terjedő skálán értékeltük a citoplazmatikus festődés erősségét. NP - normál placenta, CM- Teljes mola, PM- Részleges mola
57
6.4 Angiogenezis vizsgálatainak eredményei 6.4.1 Az érsűrűség vizsgálat eredményei A CD31 festéssel nem találtunk eltérést a nem perzisztáló részleges és teljes mola valamint a normál terhesség placenta ágyában található érkeresztmetszetek száma között. Ugyanakkor normál terhességhez viszonyítva az érsűrűség magasabb volt a perzisztáló részleges molában, valalmint perzisztáló teljes molában. (p=0,036, p=0,001, 14. ábra). Teljes molában összességében az érsűrűség szignifikánsan magasabb volt, mint normál placentában és részleges molában (p=0,002, p=0,032). A 9. táblázat mutatja az érsűrűség mediánjait és az összehasonlítások p értékeit, normál placenta, perzisztáló valamint nem perzisztáló mola csoportok között. 6.4.2 VEGF kifejeződése A trofoblaszt sejtek minden esetben erős VEGF festődést mutattak, de a festődés intenzitása nem mutatott szignifikáns különbséget az összehasonlított csoportok között (p>0,05, 15. ábra). 6.4.3 Angiopoietin 1 and 2 kifejeződése Nem észleltünk Angiopoietin 1 kifejeződést sem normál placenta, sem mola szövetekben. Az angiopoietin 2 festődés ezzel szemben látható volt a trofoblaszt sejteken és az egyes mola eseteken belül is chorion bolyhonként eltérő volt a kifejeződés mértéke. Összességében a mola trofoblaszt sejtek Angiopoietin 2 kifejeződése szignifikánsan alacsonyabb volt, mint normál placentában (p<0,05, 16. ábra). A mola szövetek típusai között szignifikáns eltérést azonban nem tapasztaltunk. A trofoblaszt sejtek angiopoietin 2 kifejeződése nem mutatott összefüggést sem a hidrópikus elfajulás mértékével, sem a bolyhok érettségi fokával.
58
6.4.4 Klinikai adatok Mola terhességben (n=37) a klinikai faktorok közül csak a postevacuációs hCG szint mutatott korrelációt a placenta ágyban található érsűrűséggel (spearman rho=0,6368 p<0,001). A postevacuációs hCG értékek a perzisztálás tekintetében is prediktívek voltak, az érsűrűség azonban általában nem jelezte előre a perzisztáló eseteket. Perzisztáló teljes mola esetében a placenta ágyban mért MVD értékek mediánja magasabb volt, mint a nem perzisztáló esetekben, de a különbség nem ért el megfelelő szignifikancia szintet, feltehetően a mintaszám kis mérete miatt (p=0,115). A VEGF, az Ang 1 és Ang 2 nem korrelált a klinikai adatok egyikével sem. A MVD úgyszintén nem mutatott összefüggést a korral, a metasztázisok számával, a szükséges kemoterápia fajtájával. Sajnálatos módon a hCG szint a diagnozis időpontjában csak 26 személynél állt rendelkezésünkre, így ezzel a klinikai adattal nem tudtunk regressziós analízist végezni. A dignózis és a beavatkozások között eltelt idő emellett igen nagy szórást mutatott (1-17 nap), amíg a posztevakuációs hCG mindig pontosan egy nappal követte a vákumos kiürítést. Éppen ezért esetünkben a posztevakuációs hCG szint meghatározóbb a szövettani minta szempontjából, mint a diagnózis időpontjában mért hCG értékek. 9. táblázat. Érsűrűség értékek normál placenta, nem perzisztáló és perzisztáló részleges valamint teljes mola placenta ágyában.
Normál placenta (n=16) Nem perzisztáló részleges mola (n=10) Perzisztáló részleges mola (n=10) Nem perzisztáló teljes mola (n=11) Perzisztáló teljes mola (n=13)
Érsűrűség medián
P értékek a normál placentához történő összehasonításkor
P értékek a nem perzisztáló azonos patológiai csoporthoz történő összehasonításkor
29,15
-
-
35,3
0,08
-
35,5
0,036*
0,863
43,6
0,068
-
56,5
<0,001*
0,115
Mann-Whitney U teszt összehasonlításokból származó p értékek. * jelöli a szignifikáns (p<0,05) eltéréseket.
59
14. ábra. Érsűrűség meghatározása CD31 immunfestéssel normál terhesség és perzisztáló teljes mola placenta ágyában
A
B
A: Normál terhesség placenta ágya CD31 immunfestéssel. Az érkeresztmetszetek nagyok és gyengén festődnek. -10X látótér B: Perzisztáló teljes mola placenta ágya CD31 immunfestéssel. Az érkeresztmetszetek erős CD31 festődést mutatnak, az erek átmérője általában kisebbek, ami aktív angiogenezisre utal. -10X látótér 15. ábra. VEGF festődés részleges mola chorion bolyhain
Mind a villózus trofoblaszt, mind a trofoblaszt szigetek erős VEGF festődést mutatnak részleges mola bolyhainak felszínén. 10X látótér, HE háttérfestés
16. ábra. Angiopoietin 2 festődés normál placenta és nem perzisztáló részleges mola bolyhain
A
B
A: Normál terhességben a trofoblaszt sejtréteg erősen kifejezi az angiopoietin 2 molekulát -10X látótér B: Nem perzisztáló részleges mola bolyhainak egy része pozitívan festődik, másik része negatív -10X látótér
60
7. Megbeszélés 7.1 Immunsejtek vizsgálata 7.1.1 Immunsejtek eloszlása Mind egészséges, mind mola terhességben az immunsejtek csak a placenta ágyat infiltrálták. Nem találtunk infiltrációt sem a chorion bolyhokban, sem az amnionban, ami egyértelműen kizárja az chorioamnionitis zavaró diagnózisát. A placenta ágy, mint az anyai-magzati határfelület, fontos szerepet játszik a beágyazódás szabályozásában, a magzati antigének felismerésében és az anyai immunválasz regulációjában. Az ott jelenlévő decidua sejteknek kiemelt jelentőségük van a magzat befogadásában, és a trofoblaszt invázió szabályozásában. (135) A másik szabályozó rendszer, az anyai immunsejtek, úgyszintén a placenta ágyban találkoznak a magzati antigénekkel és sejtekkel. Amennyiben a terhesség genetikai vagy immunológia okból nem megfelelő, a kilökődés folyamata is a placenta ágyban kezdődik el. (136) Normál és mola terhességben is azt találtuk, hogy az immunsejtek többnyire csoportokban infiltrálják a placenta ágyat és nem egyenletesen oszlanak el. Normál terhességben mind a klaszterek száma (infiltrációs ráta), mind a benne lévő sejtek száma igen alacsony volt. Mola terhességben az idegen genetikai állomány arányának fokozódásával párhuzamosan egyértelműen növekedett a klaszterek száma. A vizsgált immunsejtek sűrűsége az egyes klasztereken belül azonban csak a teljes mola esetén mutatott szignifikáns eltérést a normál terhességhez képest. A klaszterek számának növekedése azonban egyértelművé teszi, hogy az összsejtszám a placenta ágyban a részleges mola esetén is növekedett. 7.1.2 NK sejtek Korábban az irodalomban közölt adatok szerint a CD56 pozitív NK sejtek száma a normál terhességben nagyon magas volt, ehhez képest a GrB+/CD8- sejtek száma (citotoxikus NK sejtek) a mi vizsgálatainkban alacsonynak adódtak. Az irodalmi adat és a saját eredményeink összevetését követően arra következtethetünk, hogy normál terhességben a citotoxikus NK sejtek aránya az össz CD56+ sejthez viszonyítva
61
kevesebb, mint 1%. A CD56+ NK pool jelentős része tehát feltehetően NK1 vagy NKr1 sejtek, melyeknek kiemelt szerepük van a normál terhesség fenntartásában (17. ábra). Mola terhességek esetében a korábbi adatok az össz NK pool (CD56+) tekintetében radikális csökkenést írtak le a normál terhességhez viszonyítva. (107) A mi vizsgálataink a Granzyme B pozitív NK sejtszám növekedését mutatták mind részleges mind teljes mola terhesség esetében. Ebből arra következtethetünk, hogy a CD56+/GrBregulátor típusú uNK sejtek száma tehát mola terhességben nyilvánvalóan csökken, viszont a citotoxikus NK sejtek száma növekedik (17. ábra). Knoeller és munkatársai a CD56+ NK sejtek számát choriocarcinómában még alacsonyabbnak találták, mint mola terhességben. (107) Miután GrB+/CD8sejtszámainkat
az
általuk
megadott
sejtszám/mm2
formába
konvertáljuk,
és
összehasonlítjuk az ő általuk számolt sejtszámokkal jól látszik, hogy amíg normál terhességben a jelenlévő NK sejteknek töredéke termel Gr B-t, addig mola terhességben ez az arány 10%-ra, majd posztmoláris choriocarcinóma esetében pedig 56%-ra emelkedik. A regulátor NK sejttípusokban ugyanakkor, mint arra már korábban utaltunk az allogenitás fokozódásával radikális csökkenés következik be (17. ábra). 17. ábra. CD56+ NK sejtek megoszlása Granzyme B termelés szempontjából (Knoeller és munkatársainak adataira támaszkodva) 1800
NP CM CC
GrB+ NK 8.5 60.5 76
GrB-NK 1597.5 578.5 59
1600 1400 1200 1000
GrB-NK GrB+ NK
800 600 400
“CD56+ in CC (135⁄mm2) and CM (639 ⁄mm2)
200 0
versus NP (1606 ⁄mm2)”
NP
CM
CC
Knoeller és munkatársai, valamint a saját adataink összevetéséből számolt Granzyme B pozitív (citotoxikus) és negatív (regulátor típusú) NK sejtek száma a különböző szövet típusokban NP: normál placenta, CM: teljes mola, CC: posztmoláris choriocarcinóma (107)
62
7.1.3 Citotoxikus T limfociták Amennyiben a kapott sejtszámokat a szövet antigenitása és agresszivitása szerint sorba rendezzük, jól láthatóvá válik, hogy a citotoxikus T limfociták száma az apai antigenitással együtt radikálisan növekszik a placenta ágyban, illetve a tumort körülvevő szövetekben. (Posztmoláris choriocarcinóma esetében a tumort körülvevő szövetek képezik az idegen és az anyai szövet közötti határfelületet.) Habár a részleges mola esetén szignifikáns különbséget nem tudtunk kimutatni a sejtsűrűségek tekintetében, azonban az infiltrációs ráta szignifikáns eltérése jelzi, hogy a citotoxikus T limfociták össz sejtszáma egyértelműen emelkedett a placenta ágyban. A jelenlévő citotoxikus T limfociták a terhességi szövet genetikai tartalomától függetlenül igen magas százalékban (92-96%) termelnek Granzyme B molekulát, vagyis a jelenlévő limfociták többnyire effektor T sejtek. (18. ábra). 18. ábra. CD8 pozitív citotoxikus T sejtek (Tc) Granzyme B termelésének aránya a különböző szövettípusokban
Jól látható, hogy mindegyik szövettípusban a citotoxikus T sejtek jelentős többsége termel Granzyme B-t. Naiv Tc: CD8+/GrB-, Effector Tc: CD8+/GrB+, NP: normál placenta, PM: részleges mola, CM: teljes mola, CC: posztmoláris choriocarcinóma
63
7.1.4 Citotoxikus immunsejtek megoszlása a placenta ágyban Amennyiben azt vizsgáljuk, hogy a citotoxikus (GrB+) sejtek vajon a limfociták, vagy a Natural Killer sejtek közül kerülnek ki, azt tapasztaljuk, hogy a normál terhességben az NK sejtek Granzyme B termelése van túlsúlyban, amely elsődlegesen a jelenlévő T limfociták alacsony számából adódik. Az antigenitás növekedésével és a T sejtes immunválasz jelentősebb fokozódásával azonban a Granzyme B termelődés a citotoxikus T sejtek irányába tolódik el (19. ábra). 19. ábra. A Granzyme B-t termelő sejtek megoszlása a különböző szövettípusokban
Effektor Tc: GrB+/CD8+, GrB+ NK: GrB+/CD8-, NP: normál placenta, PM: részleges mola, CM: teljes mola, CC: posztmoláris choriocarcinóma
7.1.5 Regulátor T sejtek A FoxP3 pozitív regulátor T sejtek nincsenek jelen a normál terhesség placenta ágyában. Mola terhességben azonban a magasabb citotoxikus T sejtszámmal együtt megjelennek a szövetben. Tekintve, hogy a normál terhesség placenta ágyában nem észleltünk regulátor T sejteket, a normál terhességben a citotoxikus T sejtszám alacsony szintjéért helyileg nem a FoxP3+ regulátor T sejtek, hanem más helper T sejtek, az NKr1 sejtek, maguk a trofoblaszt sejtek vagy esetleg a deciduális környezet lehet a felelős. A Tc és Treg sejtszámok közötti korreláció arra utal ugyanakkor, hogy a Treg sejtek jelenlétét nem maga a mola terhesség, hanem a fokozott immunválasz
64
okozza. A Treg sejteknek feltehetően negatív feedback szerepe lehet az immunválasz kontrolálásában. A regulátor T sejtek száma ugyan a T sejt válasz erősségével együtt emelkedik mola terhességekben, a jelenlévő regulátor T sejtek azonban nem befolyásolják az effektor hányadost, tehát a gátlásukat nem a jelenlévő citotoxikus T limfociták fenotípusának megváltoztatásával érik el. Arra a kérdésre, hogy mola terhességben és posztmoláris choriocarcinómában a citotoxikus T sejtek proliferációját lassíthatják-e a jelenlévő regulátor T sejtek, sajnos a jelen vizsgálati módszer nem tud választ adni.
Összefoglalva tehát a vizsgálat eredményei választ adnak a feltett kérdésre. Az immunfestésekből megtudtuk, hogy az immunsejtek száma az immunogenitással párhuzamosan nő, valamint hogy a jelenlévő CD8+ citotoxikus limfociták jelentős része (89-91%) a terhesség genetikai tartalmától függetlenül Granzyme B-t termel, vagyis citotoxikus aktivitással rendelkező effektor T sejtek. Az immunrendszer tehát felismeri az apai genetikai állomány erőteljesebb jelenlétét és mola terhességben a trofoblaszt sejtek által elválasztott immunszuppresszív anyagok sem képesek az immunsejt aktiválódást és proliferációt gátolni. Kérdéses azonban, hogy a jelenlévő aktivált immunsejtek képesek-e a trofoblaszt sejteket elpusztítani. Mola terhességek esetében a trofoblaszt szövet túlélését az anyai szervezetben alapvetően két mechanizmus magyarázhatja. Az egyik, hogy a trofoblaszt sejtek proliferációja gyorsabb, mint amivel az effektor T limfociták és az NK sejtek lépést tudnak tartani. A másik pedig, hogy az aktivált és jelenlévő immunsejtek sejt-sejt interakció hiányában nem tudják a trofoblaszt sejteket elölni.
65
7.1.6 Az immunsejtek eloszlása intraplacentáris és posztmoláris choriocarcinóma esetekben 7.1.6.1 Immunsejtek eloszlása az intraplacentáris choriocarcinóma esetekben Intraplacentáris choriocarcinómában nem találtunk immunsejt infiltrációt sem a tumorban, sem a tumort körülvevő normális bolyhokban. Choriocarcinómát tartalmazó lepény placenta ágyában az infiltráció mértéke (10%) hasonlóan alacsony volt, mint az egészséges terhesség placenta ágyban található infiltrációs ráta (5%). A placenta ágyban jelen lévő sejtek hasonlítottak a normális terhességben talált sejttípusokra. Az intraplacentáris choriocarcinomát mind az öt esetben a normál szülést követő alapos vizsgálat derítette fel. A tumorok átlagos mérete 1,2 cm volt. A szülések átlagosan a 38,9. Héten történtek, és mind az öt esetben egészséges magzat született. Kiterjedt radiológiai és hCG vizsgálatok mind az anyában, mind a magzatban kizárták az áttétek lehetőségét. Összefoglalva
tehát
azt
mondhatjuk,
hogy
a
ritka
intraplacentáris
choriocarcinomát az anyai immunrendszer nem ismeri fel. Ennek oka lehet egyrészt, hogy a tumor genetikai tartalma allogenitás tekintetében nem tér el a normális terhességtől, valamint, hogy a choriocarcinóma az anyai immunrendszertől elrejtve a placenta bolyhain fejlődik, így nem érintkezik közvetlenül az anya immunsejtjeivel. Az anyai immunrendszer tehát nem reagál a tumor jelenlétére, ami a magzat számára előnyös, hiszen nem kell tartanunk a fokozott immunválasz eredményeképpen kialakuló placentáris
károsodástól.
Az
esetek
nagyrészében
tehát
az
intraplacentáris
choriocarcinóma nem befolyásolja a terhesség kimenetelét. Ritkán azonban az immunfelismerés hiánya káros is lehet, hiszen előfordulhat, hogy a tumor akkora méretet ér el, hogy az már gátolja a placenta működését, esetleg áttéteket ad az anyába és magzatba egyaránt. Az intraplacentáris tumor szabad szemmel könnyen összetéveszthető az egyszerű infarktussal, így minden olyan esetben, amikor a placentán körülírt, vérzéses infarktust látunk, kiemelt fontossága van a placenta szövettani vizsgálatnak, hogy
66
kizárjuk az intraplacentáris choriocarcinomát. Amennyiben choriocarcinóma diagnózisa igazolódik hCG és radiológiai követés indokolt az anyában és a magzatban egyaránt. 7.1.6.2 Immunsejtek eloszlása a posztmoláris choriocarcinóma esetekben Posztmoláris choriocarcinóma esetében mind a három vizsgált sejttípus számát igen magasnak találtuk a choriocarcinómát körülvevő szövetekben. Tc sejtek 96%-a termelt Granzyme B-t, tehát az effektor hányados ugyan olyan magas volt, mint a többi szövettípus esetében. A posztmoláris choriocarcinómában a regulátor T sejtek igen magas számban voltak jelen, a FoxP3+/CD8+ sejtek aránya a teljes molában tapasztalható 15%-ról 73%-ra növekedett. A regulátor T sejteknek tehát feltehetően itt erősebb proliferáció gátló szerepe lehet, mint teljes molában. Meglepő jelenség volt azonban, hogy az immunsejtek annak ellenére, hogy a tumor környezetében nagy számban voltak jelen, az esetek többségében képtelenek voltak a tumor szövetbe hatolni. Éles infiltrációs határt észleltünk a tumor szélén. Ez arra utal, hogy az elsődleges védelmi vonalat a choriocarcinóma részére nem az immunszuppressszív anyagok elválasztása és az immunsejtek proliferációjának gátlása játssza, hanem a sejtsejt interakció elkerülése jelenti. Az első kézenfekvő magyarázat az I-es típusú MHC gének kifejeződésének hiánya volna, ez azonban nem magyarázza az infiltráció teljes hiányát és az éles infiltrációs határt. Az MHC gének felismerését minden esetben megelőzi egy aspecifikus kötődés, amely kétféle molekuláris kapcsolat eredménye. Az első a limfociták LFA-1 (Lymphocyte Function-associated Antigen-1) integrin receptora és a célsejtek felszínén kifejeződő ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) között alakul ki. (137) A másik kötődés az immunsejt CD2 molekulája és a célsejt LFA-3 (Lymphocyte Function-associated Antigen-3) molekulája között jön létre. (138) A Limfociták vándorlásához és a működő immunológiai szinapszishoz mindkét kapcsolódás szükséges. Korábbi kísérletek azt mutatták, hogy habár a trofoblaszt sejtek kifejezik az ICAM-1 molekulát, és in vitro körülmények között az immunsejtek gyengén kötődnek a trofoblaszt sejtekhez, az adhézió nem válik erősebbé az ICAM-1 overexpresszió hatására. (139) Elsődleges citotrofoblaszt tenyészet esetében pedig a
67
gyenge trofoblaszt-immunsejt adhéziót anti-VLA-4 antitesttel blokkolni tudták. (140) A VLA-4 (Very Late Antigen-4) a VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule) integrin receptora. A gyenge adhéziót sem az anti-LFA-1, anti-LFA-3, sem az anti-CD2 ellenanyag nem befolyásolta, ami arra utal, hogy ezek az adhéziós molekulák nem vesznek részt a trofoblaszt-immunsejt interakcióban, ami márpedig szükséges az immunsejt mozgáshoz és a hatékony killinghez. Az adhéziós molekulák hiányán kívül is több lehetséges mechanizmus vetődik fel, amely magyarázatot adhat a T sejt-trofoblaszt interakció hiányára. Elképzelhető, hogy az immunsejtek nem képesek a tumorszövetbe infiltrálni, mert a sejtek olyannyira összetapadtak egymással, hogy az immunsejtek nem tudnak beférkőzni közéjük. Ezt az álláspontot támasztja alá, hogy szövettani metszeteken a choriocarcinóma esetében nem látunk strómát, nincsenek tumor asszociált fibroblasztok a tumor környezetében. (141) A sejtek sűrű, egymással szoros kapcsolatban álló mono vagy dimorf sejtek csoportját alkotják. Az egyes choriocarcinóma szigetek közötti szövet pedig intrauterin choriocarcinóma esetén a myometrium. Továbbá, a choriocarcinóma sejtek rendkívüli homoadhezív tulajdonságát támasztják alá azok az in vitro megfigyelések, melyek során a choriocarcinóma sejtek kivételes módon formáltak 3 dimenziós spheroidokat, amennyiben a tumorsejt szuszpenziót lassan, de folyamatosan keverték. (142) A harmadik esetleges magyarázat lehet, hogy a mola és GTT trofoblaszt sejtek a proteolítikus molekulákat a normál trofoblaszttól eltérő mértékben választják el (Mátrix Metaloproteinázok, kollagenáz A és B, Osteopontin stb.), ami az invázió elősegítése mellett megakadályozza, hogy normális extracelluláris mátrix (EM) kialakulását. (143145) Valószínű azonban, hogy mind a három fent említett mechanizmusnak szerepe van az immunsejtek infiltrációjának megakadályozásában, és ezáltal a kilökődés elkerülésében.
68
7.2 T sejt receptor variábilis béta lánc profil vizsgálatok
A T sejt recetor variábilis béta lánc használatának vizsgálata rendkívül kifinomult módszer az immunsejt funkciójának tanulmányozására. Az immunsejtek jelenléte a placenta ágyban rengeteg információval szolgál az immunrendszer aktivitásáról, azonban nem árulja el, hogy a jelenlévő immunsejtek specifikusan aktiválódtak-e, vagy általános gyulladásban résztvevő kemokinek hatására növekedett meg a számuk a szövetben. A T sejt receptor analízis képes a jelenlévő sejtekről nagy valószínűséggel megállapítani, hogy a T sejtes reakciót specifikus aktiváció okozta-e, és bár nem 100%-os valószínűséggel, de azt is, hogy, egy vagy néhány antigén okozza-e az immunsejtek aktiválódását. Leukémia és autoimmun betegségek vizsgálataiban a TCR variábilis lánc elemzést általában kiegészítik egy igen drága és időigényes immunoszkóp vizsgálattal, ami nem csak a variábilis beta lánc használatot elemzi, hanem a TCR CDR3-as régió mRNS-ének hosszát vizsgálja. (146) Ez a vizsgálat alkalmas arra, hogy abszolút monoklonális aktivációt igazoljon. Amennyiben az immunoszkóp azt mutatja, hogy a jelenlévő T sejtek azonos variábilis láncot használnak és a TCR CDR3 régiójának hossza mindig állandó akkor az csak egy klón proliferációjából származhat. A mi esetünkben azonban eltekinthetünk ettől a költséges vizsgálattól, hiszen a vizsgálati kérdés az volt, hogy az immunsejtek az apai genom változatos antigén repertoárjára reagálnak-e vagy egy, esetleg néhány specifikus antigén aktiválja-e az anyai immunrendszert. Amennyiben az aktiváló antigén az apai genom változatos antigénjei közül kerülnek ki, akkor a variábilis béta lánc használat egy rendkívül poliklonális aktivációt mutatna változatos variábilis béta lánc használat profillal, és ezek a profilok esetről esetre változnának, hiszen minden eset más apai antigéneket tartalmaz. Amennyiben az aktiváció terhességre specifikus antigén által történik, a TCR profil egy vagy néhány variábilis lánc felülexpresszióját mutatja, és az valószínűleg minden esetben ugyanaz, az apai genetikai tartalmától függetlenül.
69
Eredményeink egyértelműen mutatták, hogy a vizsgálati módszer jól működik, hiszen a poliklonális fehérvérsejtek az irodalomban már eddig is megerősített profilját mutatta. (132) Mind normál, mind mola terhességben a variábilis béta láncok többsége szignifikáns eltérést mutatott a poliklonális buffy coat-hoz képest. A vizsgálatok igazolni látszanak azt a feltevést, hogy a T sejtek a placenta ágyban specifikusan aktiválódnak, hiszen normál placenta esetén a 2-es és 4-es variábilis béta láncok igen nagy mértékben felülreprezentáltak. Azonban a 2-es és 4-es láncok variabilitása miatt a statisztikai próbák nem adtak szignifikáns eredményt. Jól látszik azonban, hogy mind a hét esetben legalább az egyik variábilis béta lánc (2-es vagy 4-es) expressziója fokozott volt. Egy esetben mind a kettő kifejeződése magasabb volt, mint amit a buffy coat esetekben tapasztaltunk. Továbbá úgyszintén ezt erősíti meg, hogy a többi gén nagy részének kifejeződése normál terhességben szignifikánsan alacsonyabb, mint a poliklonális fehérvérsejtekben (8. táblázat). Teljes mola terhesség esetében a 4-es VBC gén kifejeződése még hangsúlyosabb volt. Mindössze egy esetben fordult elő a kettes VBC gén enyhe overexpressziója. Két esetben a TCR profil hasonlított a buffy coat profilra, és nem mutatott VBC gén predominanciát. Az utóbbi két minta esetben valószínűleg nem sikerült a perifériás vért kellően kimosni a mintából. Korábbi kutatások úgyszintén használták ezt a módszert visszatérő vetélések vizsgálatára, és ők korábban nem találtak ilyen specifikus aktiválódást normál terhesség esetén. (147) A kettes gén aktivációját azonban több vizsgálat is összefüggésbe hozta a spontán vetélésekkel. (148,77) Mi a korábbi vizsgálatokhoz képest érzékenyebb módszert használtunk, és igen nagy hangsúlyt fektettünk a szövetek tisztítására. A korábbi vizsgálatok, mivel nem tartalmaztak többlépcsős mosást és szűrést, könnyen lehet, hogy fals poliklonális eredményt adtak, hiszen mosás nélkül nem a szövetbe infiltrált immunsejtek, hanem a szövetre tapadt perifériás vér T sejtjeinek receptor használatát vizsgálták. A szövetek feldolgozásának folyamatába mi is később iktattuk be a többlépcsős mosást, ami jelentősen megváltoztatta az eredményeinket. A 2-es gén expressziójának eltérését mola és normál terhességek között magyarázhatja az, hogy mola terhességek esetén a 2-es gén (vetéléssel asszociált variábilis béta lánc) a fokozott immunaktivációval együtt a molaszövet korábbi
70
rejekcióját eredményezte. Vizsgálatunkban így már nem találtunk 2-es gén aktivációt mutató teljes mola terhességet. Azok egyszerű vetélésként már korábbi terhességi hetekben kiürülhettek az anya szervezetéből. Tekintve, hogy a trofoblaszt sejtek nem fejezik ki a klasszikus MHC antigéneket, továbbra sincs magyarázat arra, hogy mi eredményezi ezt a specifikus T sejtes immunválaszt. A variábilis béta lánc profil jelentős specifikus aktivációra utal ugyanakkor, mely nem mutatott variabilitást a különböző esetek között. Igen valószínű tehát, hogy az anyai T limfociták egy vagy maximum néhány terhességre specifikus konzervatív antigént ismernek fel egyelőre nem ismert módon. Az aktivációban szerepe lehet az endometriumban elhelyezkedő speciális makrofág típusú sejteknek, melyek antigén prezentáló szerepüknél fogva képesek a T sejteket aktiválni. A későbbiek folyamán a TCR receptor analízis segítségével akár képesek lehetünk az aktiváló antigént azonosítani. Ennek kiemelt jelentősége lehet egy alternatív immunterápia kidolgozásában.
71
7.3 Laminin receptor 1 kifejeződésének vizsgálata
A beágyazódásban szerepet játszó decidua sejtek molekuláris biológiai vizsgálatai még mindig a reproduktív kutatások középpontjában állnak. Kiterjedt vizsgálatokat végeztek már a laminin és a laminin integrin típusú receptorain. (149-152) Tudjuk, hogy az extracelluláris mátrix elemei, a lamininok, a fibronectin, és ezek receptorai jelentős szerepet játszanak a beágyazódás folyamatában. Az is igazolást nyert, hogy a hCG növeli a laminin kifejeződését és csökkenti a laminin integrin receptorainak expresszióját ugyanakkor integrin típusváltást is eredményez a decidua sejteken. (153) Saját vizsgálataink egyértelműen kimutatják, hogy a deciduális sejtek kifejezik a laminin receptor 1 molekulát. Mola terhesség esetében a membránfestődés mellett citoplazmatikus prekurzor festődés is látható, amely az LR1 molekula aktív szintézisére utal. Meglepő módon a részeleges mola erőteljesebb citoplazmatikus festődést mutat, mint a teljes mola. Ennek magyarázatát egyelőre nem ismerjük. A laminin receptor kifejeződés szabályozásáról nem sok ismeretünk van, azonban tudjuk, hogy mellrákok esetén a progeszteron készítmények jelentősen fokozták a tumorok LR1 expresszióját, és ezáltal hozzájárulhatnak a tumorsejtek fokozott invazivitásához is. (110,111) A hCGnek közvetlen vagy közvetett módon úgyszintén lehet hatása az adhéziós molekulák kifejeződésére. (154) A hCG közvetlen hatása a decidua sejtekre a mai napig vita tárgyát képezi, hiszen korábbi vizsgálatok nem tudtak hCG receptor kifejeződést igazolni az endometriális stróma sejteken. In vitro kísérletekben azonban kimutatták a hCG kötődését humán endometriális stróma sejtekhez (HESC) a receptorok jelenléte nélkül is. (155,156) Ezen túl leírták, és én magam is tapasztaltam, hogy a hCG kezelés egyértelmű morfológiai változást eredményez a immortalizált HESC sejtkultúrán. Saját nem publikált kísérleteinkben megpróbáltuk igazolni HESC sejteken a különböző hormonok LR1 expressziójára kifejtett hatását. A HESC sejtkultúrákat 7 napon át ösztrogénnal (E), progeszteronnal (P), a kettő kombinációjával (E+P) és hCGvel kezeltük. A sejtek morfológiai változáson estek át (decidualizáció az E+P és
72
aspecifikus morfológiai változás a hCG csoportban), azonban az LR1 gén expresszió változása nem mutatott szignifikáns eltérést a különböző csoportok között. A hCG és a progeszteron tehát közvetlen módon nem befolyásolja a laminin receptor 1 kifejeződését az endometriális stróma sejteken. A laminin receptor 1 kifejeződésének szabályozása a decidua sejteken tehát továbbra is ismeretlen marad.
7.4 Angiogenezis vizsgálata nem perzisztáló és perzisztáló molákban
Teljes mola esetén az érsűrűség szignifikánsan magasabb volt, mint egészséges és részleges mola terhességekben. A perzisztáló részleges és teljes mola pacenta ágyában mért érsűrűség úgyszintén szignifikánsan magasabb volt, mint normál placentában. Az MVD nem mutatott szignifikáns különbséget nem perzisztáló és perzisztáló részleges mola között. Teljes mola esetében az érsűrűség ugyan magasabb volt a perzisztáló esetekben, azonban az alacsony mintaszám miatt a különbség nem érte el a megfelelő szignifikancia szintet. Az angiopoietin 2 festődés jellegzetes mintázatot mutatott mola terhességben. A különböző mola csoportok között nem adódott szignifikáns különbség a trofoblaszt festődési intenzitás átlagában. Megfigyeltük azonban, hogy a festődés intenzitása boholyról boholyra változik. A festődés intenzitása nem mutatott összefüggést a boholy morfológiájával, a hidrópikus elfajulás mértékével. A trofoblaszt angiopoietin termelése tehát feltételezhetően a bolyhok oxigén ellátottságával állnak összefüggésben. A VEGF festődés mind a normál placentában, mind a mola terhességek esetében erős festődést mutatott a trofoblaszt sejteken, ugyanakkor a festődés intenzitásának átlagában a csoportok között nem észleltünk különbséget. Magyarázatot adhat azonban a molában talált magasabb érsűrűségre és korábbi vizsgálatokban talált magasabb szérum VEGF szintre az a tény, hogy mola terhesség esetében a megnövekedett mennyiségű trofoblaszt szövet összességében több VEGF molekulát választ el, mint az egyrétegű villózus trofoblaszt az egészséges terhességek esetében.
73
Nem találtunk korrelációt sem a különböző vizsgált angiogenetikus faktorok között, sem az angiogenetikus faktorok és a placenta ágyban található érsűrűség között. Ez arra utal, hogy más angiogenetikus molekulák is feltehetően szerepet játszanak a placenta ágyban észlelt magasabb érsűrűség kialakításában. A vizsgált angiogenetikus faktorokon (VEGF, Ang1 és Ang2) kívül szóba kerül még a placentáris növekedési faktor (PLGF), a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF) és terhesség esetén maga a hCG is. Számos tanulmány leírta a hCG angiogenetikus hatását. (157) Az endothel sejtek felszínűkön egyértelműen kifejezik a hCG receptort. (158) Ismert továbbá, hogy a hCG kezelés megváltoztatja az ovárium endothel sejtjeinek expressziós profilját, ami a lutheális
fázisban
nagymértékben
hozzájárul
a
corpus
haemorhagicum
fennmaradásához. (159) Nem meglepő módon ez a hatás VEGF inhibitorokkal blokkolható. Egy másik tanulmány bemutatta, hogy hCG hatására az endothel sejtek jelentős proliferálásba kezdenek, és nem reagálnak apoptotikus szignálokra, amennyiben VEGF-fel és hCG-vel egyidejűleg kezelik őket. A hCG illetve VEGF kezelés önmagában azonban nem alakította ki az endothel sejtek apoptotikus rezisztenciáját. (160) Belátható tehát hogy a VEGF és a hCG szinergista módon fokozza az endometriumban talált endothel sejtek proliferációját és ezáltal alakítja ki a terhességre jellemző uterinális érhálózatot. A terhesség előrehaladásával és a magzat növekedésével együtt a hCG szint is növekedik egy bizonyos pontig, amely érképző hatásánál fogva hozzájárulhat az anyai méh érhálózatának bővüléséhez. Ismert továbbá az is, hogy mola terhességekben a hCG szint jelentősen emelkedett. (65) Különösen igaz ez teljes molák esetében. A megemelkedett VEGF és hCG (mindkettő a trofoblaszt sejtek terméke) együttesen exponenciálisan fokozhatják az angiogenezist a placenta ágy területén. Molák esetében pedig úgyszintén ismert, hogy a diagnózis időpontjában mért terhességi kórhoz viszonyított hCG szint a perzisztáló trofoblaszt betegségek kialakulásának független prognosztikai faktora (regressziós analízis). A hCG és a VEGF szintek tehát együttesen magyarázhatják a placenta ágyban található érsűrűség különbségeket. Alátámasztja ezt a feltételezést,
74
hogy mintáinkban erőteljes korrelációt találtunk a postevakuációs hCG szint és a placenta ágyban mért érsűrűség között. Jelenleg a minták alacsony száma miatt az MVD ugyan nem mutat szignifikáns eltérést teljes mola csoportban perzisztáló és nem perzisztáló esetekben, azonban nagyobb esetszám mellett ez az összefüggés valószínűleg fennáll. Patológusok bevonásával tervezzük azonban a vizsgálat kiterjesztését és utókövetéses vizsgálatok elindítását a placenta ágy érsűrűség további vizsgálatára. Az MVD bár úgy tűnik, hogy a hCG-től függő változó, mégis teljes mola esetében esetleg további prognosztikus információval rendelkezhet. Éppen ezért az MVD és a hCG együttes mérését tervezzük nagyobb mintaszámon és az értékek szenzitivitásának, specificitásának, valamint prediktív értékeinek meghatározására törekszünk. A kapott eredmények úgyszintén felvetik a VEGF inhibitorok bevonását a terápiás protokollba. (161) Mind részleges, mind teljes mola esetében a perzisztáló esetek magasabb érsűrűséget mutattak a placenta ágyban, mint az egészséges terhességben. Lehetséges ugyan, hogy az érsűrűség növekedése a placenta ágyban, csak az elválasztott faktorok másodlagos következménye és annak elmaradása nem járna a szövet hypoxiás károsodásával, valószínű azonban, hogy az angiogenetikus faktorok (VEGF) blokkolásával az endothel proliferáció leállna és megindulna az érhálózat nagyfokú involúciója (terhességi előtti állapotba), amelynek előnyös hatása lehet a mola szövet proliferációjának lassítására is. További vizsgálatok szükségesek ezen a területen is, hiszen jelenleg nincsenek információnk a méhen belüli mola szövet oxigenáltsági állapotáról, valamint a szövet anoxia érzékenységéről. Továbbá ismeretlen az is, hogy a VEGF inhibitorok milyen hatással vannak a terhes méhre, illetve annak érhálózatára. Összefoglalva tehát azt mondhatjuk, hogy eredményeink alátámasztják a hCG, mint angiogenetikus faktor, szerepét az érképzésben. Ez az első olyan vizsgálat, amely klinikai mintákon egyértelmű össszefüggést talált a szérum hCG szint és a placentaágyban talált érsűrűségek között. Ezen túl az MVD-nek szerepe lehet teljes molák perzisztálásának előrejelzésében, ennek bizonyítására azonban nagyszámú kiterjedt patológiai vizsgálatok szükségesek.
75
8. Következtetések
1.
Gesztációs trofoblaszt betegségekben a szövet allogenitásával és agresszivitással párhuzamosan a T sejtes immunválasz egyre jelentősebb szerepet játszik a szövet elleni reakcióban. Ezzel párhuzamosan az NK sejtek száma csökken, de a szövetben maradó NK sejtek egyre inkább citotoxikus típusú, Granzyme B-t termelő sejtekké alakulnak. A regulátor T sejtek, melyek a normál terhességben nincsenek jelen a méh üregben, mola terhességben a T sejtes immunválasz erősödésével párhuzamosan megjelennek a placenta ágyban.
2.
A placenta ágyban jelen lévő T sejtek variábilis béta lánc használata arra utal, hogy egészséges és főként mola terhességekben a T sejtek specifikusan aktiválódnak egy vagy néhány antigén ellen, melyeknek felismerése a 4-es illetve 2-es variábilis béta lánc használatát igényli a T sejt receptorokban. Az aktiváló antigén feltehetően egy konzervatív lepényi antigén, mivel a variábilis béta lánc profil nem mutat jelentős variabilitást a különböző apától származó esetek között.
3.
Az intraplacentáris choriocarcinómát az anyai immunrendszer nem ismeri fel, így a tumor környezetében és a placenta ágyban sem észlelhető fokozott sejtes antitumor immunválasz Ezzel szemben a valószínűleg
a
fokozott
antigenitásának
posztmoláris choriocarcinóma köszönhetően
erőteljes
sejtes
immunválaszt vált ki az anya oldaláról. Meglepő azonban, hogy az immunsejtek a jelentős aktiváció ellenére sem képesek a tumorba infiltrálni. Éles immunsejt infiltrációs határ látható a tumor szélén, melynek oka egyelőre nem ismert.
76
4.
A decidua sejtek kifejezik a laminin receptor 1 molekulát, mely az extracelluláris mátrix konformációjának megváltoztatásán keresztül kiemelt szerepet játszik a sejtmigráció
szabályozásában.
Mola terhességekben (különösen részleges
molában) a decidua sejtek fokozott mértékben fejezik ki a laminin receptor 1 molekulát.
Az
immortalizált
humán
endometriális
stróma
sejteken
a
hormonkezelés nem változtatta meg a laminin receptor 1 kifejeződését, így a jelenség oka egyelőre nem ismert
5.
A perzisztáló részleges, és a perzisztáló teljes molák placenta ágyában az érsűrűség magasabb, mint egészséges terhességben. A megemelkedett érsűrűség és a festődési mintázat aktívabb angiogenezisre utal teljes mola terhesség esetében. A postevakuációs hCG szint erőteljesen korrelált a placenta ágyban mért érsűrűséggel,
amely
immár
klinikai
mintákon
is
alátámasztja
a
hCG
angiogenetikus hatását. A trofoblaszt sejtek elválasztják mind a VEGF, mind az angiopoietin 2 molekulát. Az angiopoietin 2 molekula kifejeződése mola terhesség trofoblaszt sejtjein boholyról boholyra változott. A vizsgált angiogenetikus faktorok (VEGF, Ang1 és 2) kifejeződésének erőssége azonban nem mutatott összefüggést a placenta ágyban található érsűrűséggel és egyéb klinikai faktorokkal sem.
77
9. Összefoglalás A gesztációs trofoblaszt betegségek az esetek többségében multispermiás fogamzás eredményeképpen jönnek létre. A rendkívül heterogén, főként apai genetikai tartalommal rendelkező mola terhesség a trofoblaszt sejtek proliferációjával jellemezhető. A teljes mola, mely kizárólag apai kromoszómákat tartalmaz, jelentős invazív tulajdonsággal rendelkezik, és az esetek egy ötödében a méh kiürítését követően is perzisztál, mely szakszerű kemoterápia nélkül a beteg életét veszélyezteti. Munkám során az anyai, valamint a mola szövet közti határfelület, a placenta ágyat vizsgáltam, hogy jobban megértsem a trofoblaszt inváziót szabályozó mechanizmusokat. Célom volt továbbá, hogy a jelenlegi hCG követésnél alkalmasabb markert találjak a perzisztáló esetek előrejelzésére. Jelenlegi elképzelésünk szerint az anya oldaláról 3 mechanizmus szabályozza a terhességi szövet invázióját és annak fennmaradását a méh üregében: az anyai immunválasz, a decidua sejtek fehérje profilja és az endometrium vérellátása. Hisztológiai metszeteken vizsgáltam a placenta ágyban jelen lévő immunsejtek számát és funkcióját, a decidua sejteken kifejeződő sejtmigrációt szabályozú fehérjéket, valamint az érképződés mértékét és az ezzel összefüggésben álló angiogenetikus faktorok termelődését különböző terhességi szövetekben. E mellett friss fagyasztott normál placenta és mola szövetekből meghatároztam a placenta ágyban jelen lévő T sejtek T sejt receptor variábilis béta lánc használatát. Az eredményekből arra következtethetünk, hogy mola terhességben a fokozott T sejtes immunválasz egy, esetleg néhány konzervatív placentáris antigén ellen irányul. Mola terhességben a fokozott T sejtes aktiváció eredményeképpen megjelennek a szövetben a regulátor T sejtek, amelyek normál terhességben nincsenek jelen a placenta ágyban, így a méhüregen belül nem játszhatnak szerepet a normál terhességi immunszuppresszió kialakításában. Részleges mola terhességek placenta ágyában a decidua sejtek jelentősen fokozott mértékben fejezik ki a laminin receptor 1 nevű sejtfelszíni molekulát, melynek szerepe lehet a megnövekedett trofoblaszt invázióban. Terhességek esetében pedig a hCG, mint angiogenetikus faktor, feltehetően hozzájárul a placenta ágy érsűrűségének növekedéséhez. Az érsűrűség meghatározása emellett teljes molák esetében esetleg alkalmas lehet perzisztáló esetek előrejelzésére.
78
10. Summary Gestational trophoblastic diseases are mostly the results of a multispermic conception. The molar pregnancies containing extremly heterogenic mainly paternal chromosomes are characterized by excessive trofoblast proliferation. The complete mole which contains only paternal chromosomes have significant invasive potential and in 20% of the cases it persists in the uterus after evacuation. The persistent mole can compromise the life of the patient without effective chemotherapy. I investigated the maternal-molar interface, the implantation site, to better understand the mechanizms of the trophoblast invasion, and to find a better marker than hCG followup to predict molar persistence. According to our understanding 3 mechanizms can control the invasion and the persistance of the molar pregnancy in the uterus: the maternal immune system, the expression profile of the decidual cells and the blood supply of the endometrium. On histologic slides I investigated the number and function of the maternal immune cells, the expression profile of the decidual cells and the level of angiogenesis at the implantation site and the associated angiogenic factors produced in different gestational tissues. Besides, from fresh frozen normal placental and molar tissues I characterized the T cell receptor variable beta chain usage to determine the specificity of the T cells at the implantation site. The results demonstrate that in molar tissues the vigorous immune response is specific to one or few conservative placental antigens. In molar pregnancy, as a result of the T cell activation, the regulator T cells apear at the implantation site. However at the normal implantation site regulator T cells can not be found therefore they do not play a role in the development of the maternal immunosuppression. Besides, higher expression of the laminin receptor 1 was noted on decidual cell at the molar implantation sites and the higher level of hCG as an angiogenic factor might contribute to a higher microvessel density (MVD) at the placental implantastion site. The evaluation of MVD at the implantation site might also be a useful predictor of persistence in complete moles.
79
11. Irodalomjegyzék
1.
Park WW. Choriocarcinóma: A Study of its Pathology. Heinemann, London. 1971 45-51.
2.
Vassilakos P, Riotton G, Kajii T. (1977) Hydatidiform mole: two entities. A morphologic and cytogenetic study with some clinical considerations. Am J Obstet Gynecol, 127:167-70.
3.
Fisher RA., Lawler SD, Ormerod MG. et al. (1987) Flow cytometry used to distinguish between complete and partial hydatidiform moles. Placenta, 8:24956.
4.
Dinh-De T. Minh HN. (1961) Hydatidiform mole with recurrent vaginal metastases. Am J Obstet Gynecol, 82:660-3.
5.
Elston CW. (1976) The histopathology of trophoblastic tumours. J Clin Path, 29:111-31.
6.
Eckstein RP, Paradinas FJ. Bagshawe KD. (1982) Placental site trophoblastic tumour (trophoblastic pseudotumour):a study of four cases requiring hysterectomy including one fatal case. Histopathology, 6:211-26.
7.
Scully RE. Young RH. (1981) Trophoblastic pseudotumour: a reappraisal. Am J of Surg Path, 5:75-6.
8.
Shih IM, Kurman R. (1998) Epithelioid trophoblastic tumour: a neoplasm distinct from choriocarcinóma and placental site trophoblastic tumour simulating carcinoma. Am J of Surg Path, 22:1393-1403.
9.
Fisher RA, Povey S, Jeffreys AJ. et al. (1989) Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles estimated by locusspecific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics, 82:259-63.
10.
Shih IM, Kurman R. (2001) The pathology of intermediate trophoblast, tumours and tumour-like lesions. Int J Gynecol Path, 20:31-47.
11.
Paradinas FJ. (1997) Pathology. In Hancock, B.W., Newlands, E.S. and Berkowitz, R.S. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, pp. 64-67.
12.
Kajii T, Ohama K. (1977) Androgenetic origin of hydatidiform mole. Nature, 268:633-4.
80
13.
Lage JM, Mark SD, Roberts DJ. et al. (1992) A flow cytometric study of 137 fresh hydropic placentas: correlation between types of hydatidiform moles and DNA ploidy. Obstet Gynecol, 79:403-10.
14.
Szulman AE, Surti U (1978). The syndromes of hydatidiform mole. I. Cytogenetic and morphologic correlations. Am J Obstet Gynecol, 131:665-671
15.
Jacobs PA, Szulman AE, Funkhouser J, Matsuura JS, Wilson CC (1982). Human riploidy: relationship between parental origin of the additional haploid complement and development of partial hydatidiform mole. Ann Hum Genet, 46:223-231.
16.
Lawler SD, Fisher RA, Dent J (1991). A prospective study of hydatidiform mole. Am J Obstet Gynecol, 164:1270-1277.
17.
Wake N, Takagi N, Sasaki M (1978). Androgenesis as a cause of hydatidiform mole. J Natl Cancer Inst, 60:51-57.
18.
Jacobs PA, Wilson CM, Sprenkle JA, Rosenshein NB, Migeon BR (1980). Mechanism of origin of complete hydatidiform moles. Nature, 286:714-716.
19.
Lawler SD, Povey S, Fisher RA, Pickthall VJ (1982). Genetic studies on hydatidiform moles. II. The origin of complete moles. Ann Hum Genet, 46:209222.
20.
Sasaki M, Fukuschima T, Makino S (1962). Some aspects of the chromosome constitution of hydatidiform moles and normal chorionic villi. Gann, 53:101-106
21.
Ohama K, Kajii T, Okamoto E, Fukada Y, Imaizumi K, Tsukahara M, Kobayashi K, Hagiwara K (1981). Dispermic origin of XY hydatidiform moles. Nature, 29:551-552.
22.
Wake N, Seki T, Fujita H, Okubo H, Sakai K, Okuyama K, Hayashi H, Shiina Y, Sato H, Kuroda M, Ichinoe K. (1984) Malignant potential of homozygous and heterozygous complete moles. Cancer Res, 44:1226-1230.
23.
Helwani MN, Seoud M, Zahed L, Zaatari G, Khalil A, Slim R. (1999) A familial case of recurrent hydatidiform molar pregnancies with biparental genomic contribution. Hum Genet, 105:112-115.
24.
Fisher RA, Khatoon R, Paradinas FJ, Roberts AP, Newlands ES. (2000) Repetitive complete hydatidiform mole can be biparental in origin and either male or female. Hum Reprod, 15:594-598.
25.
Vejerslev LO, Sunde L, Hansen BF, Larsen JK, Christensen IJ, Gorm L. (1991) Hydatidiform mole and fetus with normal karyotype: support of a separate entity. Obstet Gynecol, 77:868-874.
81
26.
Sunde L, Vejerslev LO, Jensen MP, Pedersen S, Hertz JM, Bolund L. (1993) Genetic analysis of repeated, biparental, diploid, hydatidiform moles. Cancer Genet Cytogenet, 66:16-22.
27.
Sensi A, Gualandi F, Pittalis MC, Calabrese O, Falciano F, Maestri I, Bovicelli L, Calzolari E. (2000) Mole maker phenotype: possible narrowing of the candidate region. Eur J Hum Genet, 8:641-644.
28.
Moglabey YB, Kircheisen R, Seoud M, El Mogharbel N, Van den Veyver I, Slim R. (1999) Genetic mapping of a maternal locus responsible for familial hydatidiform moles. Hum Molec Genet, 8:667-671.
29.
Morison IM, Reeve AE. (1998) A catalogue of imprinted genes and parent-oforigin effects in humans and animals. Hum Molec Genet, 7:1599-1609.
30.
Mutter GL, Stewart CL, Chaponot ML, Pomponio RJ (1993). Oppositely imprinted genes H19 and insulin-like growth factor 2 are coexpressed in human androgenetic trophoblast. Am J Hum Genet, 53:1096-1102.
31.
Ariel I, Lustig O, Oyer CE, Elkin M, Gonik B, Rachmilewitz J, Biran H, Goshen R, De Groot N, Hochberg A. (1994) Relaxation of imprinting in trophoblastic disease. Gynecol Oncol 53:211-219.
32.
Walsh C, Miller SJ, Flam F, Fisher RA, Ohlsson R. (1995) Paternally-derived H19 is differentially expressed in malignant and non-malignant trophoblast. Cancer Res, 55:1111-1116.
33.
Jinno Y, Ikeda Y, Yun K, Maw M, Masuzaki H, Fukuda H, Inuzuka K, Fujishita A, Ohtani Y, Okimoto T, Ishimaru T, Niikawa N. (1995) Establishment of functional imprinting of the H19 gene in human developing placentae. Nat Genet, 10:318-324.
34.
Lee MH, Reynisdottir I, Massague J (1995). Cloning of p57KIP2, a cyclindependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution. Genes Dev, 9:639-649.
35.
Chilosi M, Piazzola E, Lestani M, et al. (1998). Differential expression of p57kip2, a maternally imprinted cdk inhibitor, in normal human placenta and gestational trophoblastic disease. Lab Invest, 78:269-276.
36.
Wake N, Arima T, Matsuda T (1998). Involvement of IGF2 and H19 imprinting in choriocarcinóma development. Int J Gynaecol Obstet, 60:S1-8.
37.
Castrillon DH, Sun D, Weremowicz S, Fisher RA, Crum CP, Genest DR (2001). Discrimination of complete hydatidiform mole from its mimics by immunohistochemistry of the paternally imprinted gene product p57KIP2. Amer J Surg Pathol, 25:1225-1230.
82
38.
Hemming JD, Quirke P, Womak C. et al. (1987) Diagnosis of molar pregnancy and persistent trophoblastic disease by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology, 40:615-20.
39.
Fischer RA Genetics In Hancock BW, Newlands ES, Berkowitz RS. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, pp. 9-10
40.
Kim SJ. Epidemiology in Hancock BW, Newlands ES, Berkowitz RS. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, pp. 27-30
41.
Sasaki K, Yamoto M, Hata H, Nakano R. (1979) The relationship between maternal aging and the incidence of hydatidiform mole and malignant changes. Acta Obstet. Gynecol. Jpn., 31:292-6.
42
Matalon M, Modan B. (1972) Epidemiologic aspects of hydatidiform mole in Israel. Am J Obstet Gynecol, 112:107-12.
43.
Hayashi K, Bracken MB, Freeman DH Jr, Hellenbrand K. (1982) Hydatidiform mole in the United States (1970-1977): A statistical and theoretical analysis. Am J Epidemiol, 115:67-77.
44.
Yen S, MacMahon B. (1968) Epidemiologic features of trophoblastic disease. Am J Obstet Gynecol, 101:126-32.
45.
Bracken MB. (1987) Incidence and aetiology of hydatidiform mole: An epidemiological review. Br J Obstet Gynaecol, 94:1123-35.
46.
Matsuura J, Chiu D, Jacobs PA, Szulman AE. (1984) Complete hydatidiform mole in Hawaii: an epidemiological study. Genetic Epidemiol., 1:271-84.
47.
Messerli ML, Lilienfeld AM, Parmley I, Woodruff JD, Rosenshein NB. (1985) Risk factors for gestational trophoblastic neoplasia. Am J Obstet Gynecol, 153:294-300.
48.
Acosta-Sison, J. (1959) The chance of malignancy in a repeated hydatidiform mole. Am J Obstet Gynecol, 78:876-7.
49.
Berkowitz RS, Cramer DW, Bernstein MR, Cassells S, Driscoll SG, Goldstein DP. (1985) Risk factors for complete molar pregnancy from a case control study. Am J Obstet Gynecol, 152:1016-20.
50.
La Vecchia C, Francheschi S, Parazzini F. Fasoli M, Decarli A, Gallus G, Tognoni G. (1985) Risk factors for gestational trophoblastic disease in Italy. Am J Epidemiol, 121:457-64.
51.
Be George FV. (1981) Hydatidiform mole in other pregnancies of mothers of twins. Am J Obstet Gynecol, 108:369—71.
83
52.
Ho HN, Gill TJ 3rd, Klionsky B, Ouyang PC, Hsieh CY, Seski J, Kunschner A. (1989) Differences between white and Chinese populations in human leukocyte sharing and gestational trophoblastic tumors. Am J Obstet Gynecol, 161(4), 9428.
53.
Bagshawe, KD, Rawlins G, Pike MC, Lawler SD. (1971) ABO blood-groups in trophoblastic neoplasia. Lancet, 7699:553-6.
54.
Scott JS. (1962) Choriocarcinóma: Observation on the etiology. Am J Obstet Gynecol, 83:185-93.
55.
Grimes DA. (1984) Epidemiology of gestational trophoblastic disease. Am J Obstet Gynecol, 150:309-18
56.
Paradinas FJ. Pathology in Hancock BW, Newlands ES, Berkowitz RS. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, 1997 pp. 77-129.
57.
Meyer, J.S. (1966) Benign pulmonary metastasis from hydatidiform mole: report of a case. Obstet Gynecol, 28,826-9.
58.
Jacobson, T.J. and Enzer, N. (1959) Hydatidiform mole with benign metastasis to lung: histologic evidence of regressing lesions in the lung. Am J Obstet and Gynecol, 78, 868-75.
59.
Berkowitz RS, Goldstein DP. (1993) The management of molar pregnancy and gestational trophoblastic tumors. In Gynecologic Oncology, 2nd ed. New York: McGraw Hill.
60.
Berkowitz RS, Goldstein DP. (1996) Gestational trophoblastic disease. In Novak's Gynecology, 12th ed. Baltimore: Williams and Wilkins.
61.
Berkowitz RS. Presentation and management of molar pregnancy in Hancock BW, Newlands ES, Berkowitz RS. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, pp. 206-228.
62.
Goldstein DP, Garner EI, Feltmate CM, Berkowitz RS. (2004) The role of repeat uterine evacuation in the management of persistent gestational trophoblastic disease. Gynecol Oncol, 95(3):421-2.
63.
Pezeshki M, Hancock BW, Silcocks P, Everard JE, Coleman J, Gillespie AM, Tidy J, Coleman RE. (2004) The role of repeat uterine evacuation in the management of persistent gestational trophoblastic disease. Gynecol Oncol, 95(3):423-9.
64.
Goldstein DP, (1971) Prophylactic chemotherapy of patients with molar pregnancy. Obstet Gynecol., 38, 817—22.
84
65.
Berkowitz, R.S., Goldstein, D.P. (1996) Chorionic tumours. N Engl J Med, 335, 1740-1748.
66.
Rice, L.W., Berkowitz, R.S., Lage, J.M. and Goldstein, D.P. (1990) Persistent gestational trophoblastic tumor after partial hydatidiform mole. Gynecol Oncol, 36, 358—62.
67.
Garner E, Goldstein DP, Berkowitz RS, Wenzel L. (2003) Psychosocial and reproductive outcomes of gestational trophoblastic diseases. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 17(6):959-68. Review.
68.
Berkowitz RS, Tuncer ZS, Bernstein MR, Goldstein DP. (2000) Management of gestational trophoblastic diseases: subsequent pregnancy experience. Semin Oncol, 27(6):678-85.
69.
Mangili G, Parazzini F, Maggi R, Spolti N. (1993) Repeated gestational trophoblastic disease after natural and heterologous assisted conception. A case report. J Reprod Med. 38(5):405-6.
70.
Garner EI, Lipson E, Bernstein MR, Goldstein DP, Berkowitz RS (2002) Subsequent pregnancy experience in patients with molar pregnancy and gestational trophoblastic tumor. J Reprod Med, 47(5):380-6.
71.
Woolas, R. P., Bower, M., Newlands, E. S., Seckl, M. J., Short, D., Holden, L. (1998) Influence of chemotherapy for gestational trophoblastic disease on subsequent pregnancy outcome. B J Obstet Gynecol, 105:1032-5.
72.
Song HZ, Yang XY, Xiang Y. (1998) Forty-five year's experience of the treatment of choriocarcinóma and invasive mole. Int J Gynaecol Obstet, 60 Suppl 1:S77-83.
73.
Fulop V, Mok SC, Genest DR, Szigetvari I, Cseh I, Berkowitz RS. (1998) cmyc, c-erbB-2, c-fms and bcl-2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinóma. J Reprod Med, 43(2):101-10.
74.
Fulop V, Mok SC, Genest DR, Gati I, Doszpod J, Berkowitz RS. (1998) p53, p21, Rb and mdm2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinóma. J Reprod Med, 43(2):119-27.
75.
Fulop V, Mok SC, Berkowitz RS. (2004) Molecular biology of gestational trophoblastic neoplasia: a review. J Reprod Med, 49(6):415-22. Review.
76.
van de Kaa CA, Schijf CP, de Wilde PC, Hanselaar AG, Vooijs PG. (1997) The role of deoxyribonucleic acid image cytometric and interphase cytogenetic analyses in the differential diagnosis, prognosis, and clinical follow-up of hydatidiform moles. A report from the Central Molar Registration in The Netherlands. Am J Obstet Gynecol, 177(5):1219-29.
85
77.
Chaouat G. (2007) The Th1/Th2 paradigm: still important in pregnancy? Semin Immunopathol, 29(2):95-113. Review.
78.
Szekeres-Bartho J. (2002) Immunological relationship between the mother and the fetus. Int Rev Immunol, 21(6):471-95. Review.
79.
Gutierrez G, Gentile T, Miranda S, Margni RA. (2005) Asymmetric antibodies: a protective arm in pregnancy. Chem Immunol Allergy, 89:158-68. Review.
80.
Somerset DA, Zheng Y, Kilby MD, et al. (2004) Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+ CD4+ regulatory T-cell subset. Immunol, 112:38-43.
81.
Saito S, Sasaki Y, Sakai M. (2005) CD4(+)CD25high regulatory T cells in human pregnancy. J Reprod Immunol, 65:111-120.
82.
Zenclussen AC. (2006) Regulatory T cells in pregnancy. Springer Semin Immunopathol, 28(1):31-9. Review.
83.
Aluvihare VR, Betz AG. (2006) The role of regulatory T cells in alloantigen tolerance. Immunol Rev, 212:330-43. Review.
84.
Wilczynski JR, Radwan M, Kalinka J. (2008) The characterization and role of regulatory T cells in immune reactions. Front Biosci, 13:2266-74. Review.
85.
Rajnavölgyi É. NK sejtek In:Gergely J, Erdei A. (szerk.) Immunbiológia. Medicina, Budapest, 2004: 239-243
86.
Moreau P, Adrian-Cabestre F, Menier C, Guiard V, Gourand L, Dausset J, Carosella ED, Paul P. (1999) IL-10 selectively induces HLA-G expression in human trophoblasts and monocytes. Int Immunol, 11(5):803-11.
87.
Blaschitz A, Hutter H, Dohr G. (2001) HLA Class I protein expression in the human placenta. Early Pregnancy, 5:67-69.
88.
van den Elsen PJ, Gobin SJ, van der Stoep N, Datema G, Viëtor HE. (2001) Transcriptional control of MHC genes in fetal trophoblast cells. J Reprod Immunol, 52:129-45.
89.
Varla-Leftherioti M. (2005) The significance of the women's repertoire of natural killer cell receptors in the maintenance of pregnancy. Chem Immunol Allergy, 89:84-95. Review.
90.
Croy BA, He H, Esadeg S, et al. (2003) Uterine natural killer cells: insights into their cellular and molecular biology from mouse modelling. Reproduction, 126:149-160.
86
91.
Bulmer JN, Lash GE. (2005) Human uterine natural killer cells: a reappraisal. Mol Immunol, 42:511-521.
92.
Dosiou C, Giudice LC. (2005) Natural killer cells in pregnancy and recurrent pregnancy loss: endocrine and immunologic perspectives. Endocrine Reviews, 26:44-62.
93.
Hanna J, Goldman-Wohl D, Hamani Y, et al. (2006) Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine, 12:1065-1074.
94.
Sargent IL, Borzychowski AM, Redman CW. (2006) NK cells and human pregnancy--an inflammatory view. Trends in Immunology, 27:399-404.
95.
Sentman CL, Wira CR, Eriksson M. (2007) NK cell function in the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol, 57:108-115.
96.
Koopman LA, Kopcow HD, Rybalov B, et al. (2003) Human decidual natural killer cells are a unique NK cell subset with immunomodulatory potential. J Experiment Med, 198:1201-1212.
97.
Szekeres-Bartho J. (1997) Progesterone-induced immunosuppression. Hum Reprod, 12(3):629.
98.
Szekeres-Bartho J, Barakonyi A, Miko E, Polgar B, Palkovics T. (2001) The role of gamma/delta T cells in the feto-maternal relationship. Semin Immunol, 13(4):229-33. Review.
99.
Faust Z, Laskarin G, Rukavina D, Szekeres-Bartho J. (1999) Progesteroneinduced blocking factor inhibits degranulation of natural killer cells. Am J Reprod Immunol, 42(2):71-5.
100.
Par G, Geli J, Kozma N, Varga P, Szekeres-Bartho J. (2003) Progesterone regulates IL12 expression in pregnancy lymphocytes by inhibiting phospholipase A2. Am J Reprod Immunol, Jan;49(1):1-5.
101.
Wang X, Fu S, Freedman RS, Liu J, Kavanagh JJ. (2006) Immunobiology of gestational trophoblastic diseases. Int J Gynecol Cancer, 16(4):1500-15. Review.
102.
Singer G, Kurman RJ, McMaster MT et al. (2002) HLA-G immunoreactivity is specific for intermediate trophoblast in gestational trophoblastic disease and can serve as a useful marker in differential diagnosis. Am J Surg Pathol, 26:914–20.
103.
Fülöp V, Szigetvári I, Szepesi J, Gáti I. (1992-1993) Effect of choriocarcinóma supernatant on natural killer and lymphokine-activated killer cell activity. Acta Med Hung, 49(3-4):239-47.
87
104.
Shaarawy M, Darwish NA, Abdel-Aziz O. (1996) Serum interleukin-2 and soluble interleukin-2 receptor in gestational trophoblastic diseases. J Soc Gynecol Investig, 3(1):39-46.
105.
Kabawat SE, Mostoufi-Zadeh M, Berkowitz RS, Driscoll SG, Goldstein DP, Bhan AK. (1985) Implantation site in complete molar pregnancy: a study of immunologically competent cells with monoclonal antibodies. Am J Obstet Gynecol, 152(1):97-99.
106.
Wongweragiat S, Searle RF, Bulmer JN. (1999) Decidual T lymphocyte activation in hydatidiform mole.J Clin Pathol, 52(12):888-94.
107.
Knoeller S, Lim E, Aleta L, et al. (2003) Distribution of immunocompetent cells in decidua of controlled and uncontrolled (choriocarcinóma/hydatidiform mole) trophoblast invasion. Am J Reprod Immunol, 50:41-47.
108.
Kato HD, Terao Y, Ogawa M, et al. (2002) Growth-associated gene expression profiles by microarray analysis of trophoblast of molar pregnancies and normal villi. Int J Gynecol Path, 21:255-260.
109.
Mecham RP. (1991) Receptors for laminin on mammalian cells. J FASEB 5:2538-2546.
110.
Menard S, Tagliabue E, Colnaghi MI. (1998) The 67 kDa laminin receptor as a prognostic factor in human cancer. Breast cancer research and treatment, 52:137-145.
111.
Viacava P, Naccarato AG, Collecchi P, et al. (1997) The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression. J Path, 182:36-44.
112.
van den Brule FA, Buicu C, Berchuck A, et al. (1996) Expression of the 67-kD laminin receptor, galectin-1, and galectin-3 in advanced human uterine adenocarcinoma. Hum path, 27:1185-1191.
113.
Morais Freitas V, Nogueira da Gama de Souza ., Cyreno Oliveira E, et al. (2007) Malignancy-related 67kDa laminin receptor in adenoid cystic carcinoma. Effect on migration and beta-catenin expression. Oral oncol, 43(10):987-98.
114.
Castronovo V, Sobel ME. (1990) Laminin and fibronectin increase the steady state level of the 67 kD high affinity metastasis-associated laminin receptor mRNA in human cancer cells. Biochemical and biophysical research communications, 168:1110-1117.
115.
Zhang C, Duan E, Cao Y, et al. (2000) Effect of 32/67 kDa laminin-binding protein antibody on mouse embryo implantation. J Repro Fert, 119:137-142.
88
116.
Folkman J, Cole P, Zimmerman S. (1966) Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastases of biopsy material in rabbit thyroid and canine intestinal segment. Ann Surg, 164:491-502.
117.
Langer R. (1980) Control of tumor growth in animals by infusion of an angiogenesis inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA, 77:4331-4335.
118.
Kuwano M, Fukushi J, Okamoto M et al. (2001) Angiogenesis factors. Intern Med, 40(7):565-72.
119.
Ferrara N. (2000) Vascular endothelial growth factor and the regulation of angiogenesis. Recent Prog Horm Res, 55:15–6.
120.
Asahara T, Chen D, Takahashi T et al. (1998) TIE2 receptor ligands, angiopoietin-1 and angiopoietin-2, modulate VEGF-induced postnatal neovascularization. Circ Res, 83:233–40.
121.
Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, et al. (1997) Angiopoietin-2, a natural antagonist for TIE2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science, 277:55– 60.
122.
Suri C, Mcclain J, Thurston G et al. (1998) Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1. Science, 282:468 –71.
123.
Plank MJ, Sleeman BD. (2003) Tumor-induced angiogenesis: A review. J Theor Med, 5:137-153.
124.
Mertz KD, Demichelis F, Kim R et al. (2007) Automated immunofluorescence analysis defines microvessel area as a prognostic parameter in clear cell renal cell cancer. Hum Pathol, 38(10):1454-62.
125.
Depasquale I, Thompson WD. (2005) Microvessel density for melanoma prognosis. Histopathol, 47(2):186-94.
126.
Saravanamuthu J, Reid WM, George DS et al. (2003) The role of angiogenesis in vulvar cancer, vulvar intraepithelial neoplasia, and vulvar lichen sclerosus as determined by microvessel density analysis. Gynecol Oncol, 89(2):251-8.
127.
Mazzanti R, Messerini L, Comin CE, et al. (2007) Liver angiogenesis as a risk factor for hepatocellular carcinoma development in hepatitis C virus cirrhotic patients. World J Gastroenterol, 13(37):5009-14.
128.
Nomura S, Okamoto T, Matsuo K, et al. (1994) Serum and tissue vascular endothelial growth factor levels in hydatidiform mole. Life Sci. 1998;63(20):1793-805. Li Y, Sun GR, Tumang JR, et al: CDR3 squence motifs shared by oligoclonal rheumatoid arthritis synovial T cells. Evidence for an antigen-driven response. J Clin Invest, 94:2525-2531.
129.
89
130.
Laplaud DA, Ruiz C, Wiertlewski S, et al. (2004) Blood T-cell receptor beta chain transcriptome in multiple sclerosis. Characterization of the T cells with altered CDR3 length distribution. Brain, 127:981-95.
131.
Martin A, Barbesino G, Davies TF. (1999) T-cell receptors and autoimmune thyroid disease – signpost for T-cell antigen driven diseases. Int Rev Immunol, 18:111-40.
132.
Sun W, Nie H, Li H, et al. (2005) Skewed T-cell receptor BV14 and BV16 expression and shared CDR3 sequence and common motifs in synovial T cells of rheumatoid arthritis. Genes Immun, 6:248-61.
133.
Rajnavölgyi É. T sejtek aktiválódása In:Gergely J, Erdei A. (szerk.) Immunbiológia Medicina, Budapest, 2004 222-239.
134.
Livak KJ, Schmittgen TD. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25:402-408.
135.
Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. (2007) Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med, 25(6):445-53. Review.
136.
Christiansen OB, Nielsen HS, Kolte AM. (2006) Inflammation and miscarriage. Semin Fetal Neonatal Med, 11(5):302-8. Review.
137.
Shaw S, Luce GE, Quinones R, et al. (1986) Two antigen-independent adhesion pathways used by human cytotoxic T-cell clones. Nature,;323:262 - 264
138.
Shaw S, Luce GE. (1987) The lymphocyte function-associated antigen (LFA)-1 and CD2/LFA-3 pathways of antigen-independent human T cell adhesion. J Immunol, 4:1037-1045
139.
Jarousseau AC, Thibault G, Reverdiau P, et al. (1994) Adhesive properties of choriocarcinóma cells toward lymphocytes activated or not by interleukin-2. Cell Immunol, 157(1):38-47
140.
Douglas GC, Hu J, Thirkill TL, et al. (1994) Effect of cytokines and antiadhesion molecule antibodies on the adhesion of lymphocytic cells to human syncytiotrophoblast. J Reprod Immunol, 27(1):49-62.
141.
Paradinas, F.J. (1997) Pathology. In Hancock, B.W., Newlands, E.S. and Berkowitz, R.S. (eds), Gestational Trophoblastic Disease. Chapman & Hall, London, pp. 60-63.
142.
White TE, Saltzman RA, Di Sant'Agnese PA, Keng PC, Sutherland RM, Miller RK. (1988) Human choriocarcinóma (JAr) cells grown as multicellular spheroids. Placenta, 9(6):583-98.
90
143.
Vegh GL, Tuncer S, Fulop V, et al: (1999) Matrix metalloproteinases and their inhibitor in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Gynecol Oncol, 75:248-253
144.
Emonard H, Christiane Y, Smet M, et al: (1990) Type IV and interstitial collagenolytic activities in normal and malignant trophoblast cells are specifically regulated by the extracellular matrix. Invasion Metastasis, 10(3):170-7.
145.
Batorfi J, Fulop V, Kim JH, et al: (2003) Osteopontin is downregulated in hydatidiform mole, Gynecol Oncol, 89:134-139.
146.
Rezvany MR, Jeddi-Tehrani M, Wizell H, et al: (2003)Leukemia-associated monoclonal and oligoclonal TCR-BV use in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 101:1063-1070.
147.
Wang X, Zhengen M, Hong Y, et al: (2005) The skewed TCR-BW repertoire displayed at the maternal-fetal interface of women with unexplained pregnancy loss. Am J Reprod Immunol, 54:84-95.
148.
Piccinni MP: (2006) T cells in normal pregnancy and recurrent pregnancy loss. Reprod Biomed Online, 13:804-4.
149.
Church HJ, Vicovac LM, Williams JD, et al. (1996) Laminins 2 and 4 are expressed by human decidual cells. Lab Invest, 74:21-32.
150.
Das C, Basak S. (2003) Expression and regulation of integrin receptors in human trophoblast cells: role of estradiol and cytokines. Indian journal of experimental biology, 41:748-755.
151.
Kayisli UA, Korgun ET, Akkoyunlu G, et al. (2005) Expression of integrin alpha5 and integrin beta4 and their extracellular ligands fibronectin and laminin in human decidua during early pregnancy and its sex steroid-mediated regulation. Acta Histochemica, 107:173-185.
152.
Korhonen M, Virtanen I. (1997) The distribution of laminins and fibronectins is modulated during extravillous trophoblastic cell differentiation and decidual cell response to invasion in the human placenta. J Histochem Cytochem, 45:569-581.
153.
Kayisli UA, Selam B, Guzeloglu-Kayisli O, et al. (2003) Human chorionic gonadotropin contributes to maternal immunotolerance and endometrial apoptosis by regulating Fas-Fas ligand system. J Immunol, 171:2305-2313.
154.
Licht P, von Wolff M, Berkholz A, et al. (2003) Evidence for cycle-dependent expression of full-length human chorionic gonadotropin/luteinizing hormone
91
receptor mRNA in human endometrium and decidua. Fertility and sterility, 79 Suppl 1:718-723. 155.
Ku SY, Choi YM, Suh CS, et al. (2002) Effect of gonadotropins on human endometrial stromal cell proliferation in vitro. Arch Gynecol Obstet, 266:223228.
156.
Cameo P, Szmidt M, Strakova Z, et al. (2006) Decidualization regulates the expression of the endometrial chorionic gonadotropin receptor in the primate. Biol Repro 75:681-689.
157.
Islami D, Bischof P, Chardonnens D. (2003) Modulation of placental vascular endothelial growth factor by leptin and hCG. Mol Hum Reprod, 9(7):395-8.
158.
Toth P, Lukacs H, Gimes G, (2001) Clinical importance of vascular LH/hCG receptors-a review. Reprod Biol, 1(2):5-11.
159.
Takahashi N, Itoh MT, Ishizuka B. (2008) Human Chorionic Gonadotropin Induces Nestin Expression in Endothelial Cells of the Ovary via Vascular Endothelial Growth Factor Signaling. Endocrin, 149(1):253-60.
160.
Phan B, Rakenius A, Pietrowski D et al. (2006): hCG-dependent regulation of angiogenic factors in human granulosa lutein cells. Mol Reprod Dev, 73(7):87884.
161.
Selvakumaran M, Yao KS, Feldman MD, O'Dwyer PJ. (2008) Antitumor effect of the angiogenesis inhibitor bevacizumab is dependent on susceptibility of tumors to hypoxia-induced apoptosis.Biochem Pharmacol, 75(3):627-38.
92
12. Saját közlemények jegyzéke
A dolgozat alapjául szolgáló közlemények:
1. Fülöp V, Végh G, Bátorfi J, Nagymányoki Z, Berkowitz RS, Dancsó J. (2006) A terhességi trofoblaszt daganatok molekuláris biológiája. Magyar Nőorvosok Lapja, 69(4):297-306. 2. Nagymanyoki Z, Callahan MJ, Parast MM, Berkowitz RS, Mok SC, Fulop V. (2008) Overexpression of laminin receptor 1 on decidual cells in partial and complete mole. Gynecol Oncol, 108(1):121-5. 3. Nagymanyoki Z, Callahan MJ, Parast MM, Fulop V, Mok SC, Berkowitz RS. (2007) Immune cell profiling in normal pregnancy, partial and complete molar pregnancy. Gynecol Oncol, 107(2):292-7. 4. Nagymanyoki Z, Callahan MJ, Parast MM, Fulop V, Mok SC, Berkowitz RS. (2008) Immune cell profiling in intraplacental and postmolar choriocarcinomas. J Reprod Med, (accepted in 2008) 5. Nagymanyoki Z, Growdon W, Sarno J, Callahan MJ, Parast MM, Fulop V, Horowitz N, Mok SC, Berkowitz RS. (2008) Vascularization and expression of angiogenic factors in partial and complete molar pregnancies. J Reprod Med, (submitted) 6. Nagymanyoki Z, Callahan MJ, Parast MM, Fulop V, Mok SC, Berkowitz RS. (2008) Antigen specific T cell immune response detected by skewed T cell receptor usage in normal placenta and complete molar pregnancy. Gynecol Oncol, (submitted)
93
Egyéb közlemények:
1. Padányi Á, Kotlán B, Fülöp V, Bátorfi J, Réti M, Gyódi É, Rajczy K, Nagymányoki Z, Doszpod J, Petrányi Gy. (2004) Rekurrens spontán vetélők immunterápiájával elért eredményeink. Transzfúzió 37:71-78 2. Fülöp V, Kotlán B., Padányi Á, Bátorfi J, Nagymányoki Z, Vályi-Nagy I, Dancsó J, Petrányi Gy. (2006) Az immunpatológiai hátterű visszatérő spontán vetélések és sikertelen IVF beültetések korszerű diagnosztikája és kezelési lehetőségei. Magyar Nőorvosok Lapja 69(4):95-113 3. Szigetvári I, Szepesi J, Végh Gy, Bátorfi J, Nagymányoki Z, Arató G, Gáti I, Fülöp V. (2006) Negyedszázados tapasztalat a hazai terhességi trofoblasztbetegségek ellátásában. Magyar Nőorvosok Lapja 69(6):543-554. 4. Callahan M, Nagymanyoki Z, Bonome T, Johnson EJ, Lithkouhi B, Sullivan EH, Hirsh MS, Matulonis UA, Liu J, Birrer M, Berkowitz RS, Mok S. Increased HLADMB expression in the tumor epithelium is associated with increased cytotoxic lymphocyte infiltration and improved prognosis in advanced serous ovarian cancer. Clin Cancer Res, (submitted)
94
13. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom, minden kedves munkatársamnak, akikkel az évek során együtt dolgoztam, és akik mindig megértően mellettem álltak, amikor szükségem volt segítségre. Név szerint is szeretnék köszönetet mondani az Országos Gyógyintézeti Központ, különösen a Tumorimmunológia Osztály egykori munkatársainak. Köszönet illeti elsősorban Petrányi Győző professzor urat, aki lehetővé tette, hogy Ph.D. tanulmányaimat elkezdjem. Benczúr Miklós tanár urat, aki minden technikai segítséget megadott, hogy a PhD képzésemet sikerrel teljesítsem. Szeretném még köszönetemet kifejezni Simsa Péternek, Kotlán Beatrixnak, Pócsik Évanak és Németh Júliának, akik megértően és türelemmel tanítgattak munkám elején. Köszönet illeti meg a Nőgyógyászati Osztály munkatársait is, különösen Végh György és Bátorfi József doktor urakat, akik elő példaként álltak előttem, és sok hasznos tanáccsal segítették boldogulásomat a Ph.D. képzés rögös útján. Úgyszintén végtelen hálával tartozom a Harvard Egyetem munkatársainak, név szerint Michael Callahan, Sam Mok és Mana Parast munkatársaimnak, akik minden lehetőt megtettek, hogy munkám sikerrel járjon. Külön köszönet és hála illeti meg Ross Berkowitz professzor urat, aki mindvégig mentorként és tanárként lektorálta közleményeimet és készséggel adott tanácsot mindenben, lehetővé téve ezáltal, hogy doktori munkámat sikerrel befejezzem. És végül, de nem utolsósorban szeretnék köszönetet mondani annak, aki nélkül mindez a munka el sem kezdődött volna. Aki annak idején, amikor fiatal egyetemistaként találkoztam vele, fantáziát látott bennem és bizalmat ültetett belém. Aki mindvégig tanácsaival mutatta az irányt, aki motivált és lelkesített a nehéz időkben, aki lehetővé tette, hogy tanulmányaimat a Harvard Egyetem keretein belül végezhessem, és aki megmutatta milyen finom az amerikai Burrito: Fülöp Vilmos témavezetőmnek, akinek segítségét meghálálni ezer oldal sem volna elég, de itt most csak ennyit írhatok: NAGYON, NAGYON KÖSZÖNÖM.
95
