A terhességi trofoblaszt daganatok molekuláris biológiája

TERHESSÉGI TROFOBLASZT BETEGSÉG

● Magyar Nôorvosok Lapja 69, 297–306 (2006)

A terhességi trofoblaszt daganatok molekuláris biológiája FÜLÖP VILMOS DR.1, VÉGH GYÖRGY DR.1, BÁTORFI JÓZSEF DR.1, NAGYMÁNYOKI ZOLTÁN DR.1, BERKOWITZ ROSS S DR.2, DANCSÓ JÁNOS DR.1 Az Országos Gyógyintézeti Központ, Szülészeti és Nôgyógyászati Osztályának1 (osztályveztetô fôorvos: Török Miklós dr.) és a Harvard Medical School Szülészet Nôgyógyászat Onkológiai Osztályának2 (igazgató Berkowitz Ross S dr.) közleménye

Összefoglalás: A terhességi trofoblaszt betegségek a chorion szövet abnormális növekedésével járó, egymással kapcsolatban lévô kórállapotok, melyek változatos helyi invazív és metasztázisképzô hajlammal rendelkeznek. Ezeket a betegségeket számos növekedést szabályozó faktor és onkogén megváltozott kifejezôdése jellemzi. A különbözô onkogének és növekedési faktorok expressziója alapján úgy tûnik, hogy a részleges mola inkább a normális placentára, míg a teljes mola a choriocarcinomára hasonlít. Ezeknek az eredményeknek egyaránt lehetnek prognosztikus és terápiás vonatkozásai, valamint betekintést nyújtanak a normális placenta és a terhességi trofoblaszt betegségek közötti kapcsolatba.

Kulcsszavak: onkogén, növekedési faktor, terhességi betegség

A normális lepény, a mola hydatidosa és a choriocarcinoma közötti kapcsolat még ma sem érthetô tisztán. A normális lepényi trophoblaszt sejtek igen proliferatívak, teljesítve a rosszindulatúság sok morfológiai kritériumát, betörhetnek az anyai deciduába, és az anyai érrendszer csatornáin keresztül a vér a tüdô érhálózatába szállíthatja a sejteket. A choriocarcinoma agresszív malignus trofoblaszt betegség, korai metasztázis hajlammal és kezelés hiányában várhatóan halálos kimenetelû [1]. A komplett (teljes) molaterhesség is lehet metasztatikus és invazív, és néhány esetben (5%) choriocarcinomává alakulhat [2]. Azonban az nem tisztázott, hogy vajon a teljes molaterhesMagyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

ség igazi trofoblaszt daganat, premalignus fenotípus, vagy az abbamaradt vetélés egy változata. Kato és munkatársai azt vizsgálták, hogy hogyan viselkedik a mola hydatidosa, miután beültették csupasz egerekbe [3]. A choriocarcinomától eltérôen a molaszövet atrófiássá és avaszkulárissá vált a transzplantációt követôen, és ezért nem úgy viselkedett, mint egy trofoblaszt daganat. Takeuchi feltételezése szerint a részleges mola hydatiosa azért fejlôdik, mert a blokkoló IgG antitestek az embrió halála után védik a trofoblaszt sejtek növekedését [4]. A spontán vetélô betegekhez viszonyítva a molaterhességben szenvedô betegeknél a blokkoló IgG ellenanyagok szintje megnövekedett. 297

A normális lepény, a komplett mola és a terhességi choriocarcinoma közötti antigén kapcsolat Bizonyos onkogéntermékek kifejezése tekintetében a mola trofoblasztsejtek viselkedése inkább a normális lepényi trofoblaszthoz hasonlít, mint a choriocarcinomához. A lepényi és a mola trofoblasztsejtek kifejezik az alfa 2-makroglobulint, az 5-ös lepényi fehérjét és a trofoblaszt specifikus membrán antigént, ezt a három molekulát ellenben nem lehetett kimutatni az invazív mola trofoblasztsejtjein vagy choriocarcinomában [5, 6, 7]. Mivel az alfa 2-makroglobulin és az 5-ös lepényi fehérje, mint proteáz inhibitorok köztudottan gátolják az olyan proteázok mûködését, mint a plazmin és a tripszin, az alfa 2makroglobulin és az 5-ös lepényi fehérje kifejezôdése a normális lepényi trofoblaszt sejteken közremûködhet a trofoblasztsejtek invazivitásának szabályozásában. Bizonyos onkofetális antigének kifejezôdésének megoszlását a normális lepényen, a mola hydatidosán és a choriocarcinomán fel lehet használni a trofoblasztsejtek differenciálódásának és ezen három terhességi szövet közötti kapcsolatnak a felderítésére. Az utóbbi idôben vizsgálatok történtek a murine fejlôdési szakasz specifikus embrionális antigének (SSEA-1, SSEA-3) és a humán spermium antigének lokalizálására normális lepényben, mola hydatidosában és choriocarcinomában [8, 9]. Az SSEA-1 kifejezôdik a beágyazódás elôtti murine trofoektodermán, valamint különféle humán daganatokban és daganatsejt vonalakon [10, 11]. Az SSEA-3 a korai egérembriókon és az emberi teratocarcinoma eredetû sejtvonalakon fejezôdik ki [12]. A spermium antigének megtalálhatóak a korai embriókon és a rosszindulatú embrionális sejtvonalakon [13, 14]. A vizsgálatok során az SSEA-3-at nem tudták detektálni a normális lepényben, a mola hydatidosában és a choriocarcinoma sejtvonalakon. Az SSEA-1 és a kétféle spermium antigén (MA2 és MA7) identifikálható volt az emberi choriocarcinoma sejtvonalakon, de a mola és a lepényi boholy trofoblasztsejtek nem hordozták ezeket az antigéneket. Ezért az itt alkalmazott onkofetális jelzôrendszer szerint a mola trofoblaszt inkább a lepényi trofoblaszthoz hasonlít, mint a choriocarcinomához. Az Egészségügyi Világszervezet Trofoblaszt 298

Workshopjának keretén belül humán placenta trofoblaszt (45 antitest) és humán sperma (66 antitest) ellen termelt rágcsáló monoclonális ellenanyagokat teszteltek normális placentán, komplett molán és choriocarcinomán. A komplett mola bolyhain minden ellenanyag lokalizációja ugyanolyan volt, mint a normális placenta chorion bolyhain. Öt spermiumellenes monoklonális antitest reagált choriocarcinomával, de nem reagált placentával vagy molaszövettel. Egy reagált placentával és molaszövettel, de choriocarcinoma sejtekkel nem. Tizenkettô trofoblasztellenes monoklonális antitest egyaránt reagált a choriocarcinoma sejtekkel, a placentával és a molaszövettel. További hét reagált choriocarcinoma sejtekkel, de sem a placentához, sem a molához nem kötôdött. Nyolc antitest reagált placentával és molával, de choriocarcinoma sejtekkel nem [15]. Bizonyos spermium–embrionális antigének kifejezôdése hasznos jelzôje lehet a trofoblasztok differenciálódásának. Mivel a teljes mola dupla készlettel rendelkezik az egymással azonos apai 23, X kromoszómagarnitúrából, a mola trofoblasztsejtek bizonyos spermium eredetû antigénekbôl többet fejezhetnek ki, mint a normális trofoblaszt. További monoclonális spermaellenes antitesteket kellene vizsgálni a komplett mola hydatidosán és placentán, hogy azonosítsuk azokat a sperma antigéneket, amelyek elsôsorban a molaszöveteken fejezôdnek ki [15]. A trofoblaszt proliferciós markereket azonosító vizsgálatokban különféle humán tumor antigénekkel reagáló monoclonális antitestek kiterjesztett paneljét tesztelték két humán terhességi choriocarcinoma sejtvonalon. A monoclanális antitestek közül négy (115-D8 – tejzsír membrángömböcske, 0C125 – petefészekrák, SSEA-1, 126G5 – mellrák) reagált mindkét choriocarcinoma sejtvonallal, de nem kötôdött a normális humán fibroblaszt sejtvonalakhoz [16, 17]. Ezután indirect immunfluorescens módszerrel vizsgálták mind a négy monoclonális antitest kötôdését elsô, második és harmadik trimeszterbôl származó normális placentákon és komplett molaterhességekbôl származó szöveteken. A trofoblaszt bolyhok sem a normális placentában sem a komplett molában nem reagáltak 115D8, 0C125 és SSEA-1 antitestekkel. Ezzel szemben a normális placenta és a mola hydatidosa egyaránt erôsen reaktív volt 126G5-tel. Ez a tanulmány Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

további bizonyítékokkal szolgál arra vonatkozóan, hogy a boholy trofoblaszt sejtek – akár mola, akár lepényi eredetûek – azonos mintázattal kötik az onkofetális antigénekkel szembeni monoklonális ellenanyagokat.

A protoonkogének, a tumorszuppresszor gének és a növekedési faktorok kifejezôdése a normális lepényben, a részleges molában, a komplett molában és a choriocarcinomában A mûködô szöveti szerkezet fejlôdése és fenntartása a sejtproliferáció, az érés és az apoptózis közötti egyensúlytól függ. A trofoblaszt sejtproliferáció szabályozása magában foglalja a protoonkogének és a tumorszuppressor gének expressziója közötti kényes egyensúlyt. Az onkogének bármelyik készletének kóros expressziója kontrollálatlan sejtproliferációhoz, végsô sejtciklus megálláshoz, vagy az apoptózis aktivációjához vezethet [18]. Éppen ezért, az onkogének, a növekedési faktorok és receptoraik kifejezôdése a kutatások potenciálisan gyümölcsözô területeit reprezentálják. Amennyiben ezeknek valóban szerepe van a növekedés és differenciálódás szabályozásában, akkor érdemes ôket összehasonlítani normális terhességben és terhességi trofoblaszt betegségekben. További tanulmányok szükségesek annak meghatározására, hogy vajon az onkogén kifejezôdés specifikus mintázata jellemzôje-e az invazív trofoblaszt neopláziának és képes-e elôre jelezni a rosszindulatú hajlamot. A sejtszaporodás bonyolultan szabályozott folyamat, amelynek egyes lépéseit kritikus proto-onkogén és tumorszuppresszor gének koordinált kölcsönhatása kapcsolja össze. Ezen gének kifejezôdési mintázatában történô változások összetett tumorrendszerekben hozzájárulnak a daganat kialakulásához. Mivel a trofoblaszt hormonokban és növekedési faktorokban egyedülállóan gazdag környezetben fejlôdik, a sokféle növekedési faktor közötti kölcsönhatások szintén valószínûek [19]. Az utóbbi tanulmányokban 53 terhességi trofoblaszt tumort és 18 normális placentát vizsgáltak meg, hogy immunhisztokémiai módszerrel bizonyítsák a TP53, p21, RB és DOC2/hDab2 tumorszuppresszor gének, valamint az Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

MDM2, EGFR, c-erbB-2, c-erbB-3, c-erbB-4 és bcl-2 onkogének túlzott kifejezôdését [20]. A 18 lepénybôl csak 4 (22,2%) és a 17 részleges molából pedig csak 3 (17,6%) eset mutatott fokális gyenge pozitivitást a TP53 magfestôdésre, és a minták többi része ezekben a csoportokban negatív volt. Mind a 11 choriocarcinoma és a 25 teljes molából 23 (92%) eset közepes vagy erôs festôdést adott a TP53-ra. TP53 ellenanyag festôdésre csak egy teljes molát pontoztak negatívnak. A TP53 festôdésben meglévô különbségek a lepény és a teljes mola között, valamint a lepény és a choriocarcinoma között szignifikánsak voltak (p<0,0001). A TP53 festôdésben a részleges mola és a teljes mola, valamint a részleges mola és a choriocarcinoma közötti eltérések is szignifikánsnak adódtak (p<0,0001). A choriocarcinomák TP53 festôdése erôsebb volt, mint a teljes moláké, de a különbség nem volt szignifikáns. A pozitívan festôdött sejtmagok túlnyomórészt a citotrofoblasztban jelentek meg, és elszórtan voltak jelen a bolyhon kívüli trofoblasztsejtekben. A szinciciotrofoblaszt-sejtek soha nem mutattak TP53 immunreaktivitást. A TP53 gén 5-11 exonjait PCR-rel erôsítették fel és SSCP-vel (egyszálú konfomációs polimorfizmus) vizsgálták meg a TP53 megnövekedett expressziójával rendelkezô 22 teljes molában és 11 choriocarcinomában elôforduló bárminemû mutációt. Csak egy értelmetlen mutációt találtak a 213-as kodonon (CGA-CGG), ez alapján erôsen valószínû, hogy a túlzottan expresszálódott TP53 fehérje valamennyi pozitívan festôdött mintában (teljes molák és choriocarcinomák) vad típusú volt [20]. A sejtmagfestôdést a p21 ellenanyagra a lepény, a részleges mola, a teljes mola és a choriocarcinoma összes mintáiban megfigyelték. Erôs pozitív festôdést egy lepényben, 3 részleges molában, 21 teljes molában (84%) és 9 choriocarcinomában (81%) találtak. A legerôsebb festôdést a teljes molákban és a choriocarciomákban lehetett látni. A festôdési mintázat a p53 ellenanyagétól eltérô volt, mivel azt leginkább a szinciciotrofoblaszt rétegben és egyszer-egyszer a bolyhon kívüli trofoblasztban lehetett látni. Ha a normál lepényhez és a részleges molához hasonlították, a p21 festôdés szignifikánsan erôsebb volt a teljes molában (p<0,0001), (p<0,0001) és choriocarciomákban (p<0,0001), (p<0,0001). 299

Az RB fehérje esetében 11 lepény (61%), 11 részleges mola (65%), 21 teljes mola (84%) és 10 choriocarcinoma (91%) szerzett 3(+)-et az intenzitásra, sejtszámra vagy mindkettôre, és egyik mintában sem fordult elô negatív festôdés. A teljes molákban (p<0,03) és a choriocarcinomákban (p<0,03) szignifikánsan erôsebb festôdést találtak, mint a részleges molákban. Azok a sejtmagok, amelyek az RB géntermékre pozitívan festôdtek elsôsorban a citotrofoblaszt és bolyhon kívüli trofoblasztsejtekben jelentek meg, de a szinciciotrofoblaszt sejtekben soha nem voltak kimutathatóak. Az MDM2-re erôs és közepes festôdést (intenzitás és sejtszám) figyeltek meg 8 (44%) lepényben, 14 (82%) részleges molában, 20 (80%) teljes molában és 11 choriocarcinomában [20]. A 18 lepénybôl 14 (77,7%), a 17 részleges molából 5 (29,4%), a 25 teljes molából 13 (12%) eset mutatott erôs festôdést a DOC2/hDab2 fehérjére, azonban a 11 choriocarcinomából egyetlenegy eset sem adott erôs jelet. Ezzel szemben a lepényi minták közül egyik sem, 2 (11,7%) részleges mola, 17 (68%) teljes mola és 7 (63,6%) choriocarcinoma kapott gyenge vagy negatív pontértékeket a DOC-2/hDab2 ellenanyagos immunfestôdésre. A DOC2/hDab2-re kapott festôdés a lepényben szignifikánsan erôsebb volt, mint a részleges molában, a teljes molában és a choriocarciomában (p<0,014; p<0,0001; p<0,0001 külön-külön). A részleges mola is szignifikánsan erôsebb DOC-2/hDab2 fehérje expressziót mutatott, mint a teljes mola és a choriocarcinoma (p<0,001; p<0,015 külön-külön). A festôdés a citoplazmában jelent meg a citotrofoblasztban és a szinciciotrofoblasztban egyaránt, de az utóbbiban némileg erôsebb volt. A bolyhon belüli stroma nem mutatott semmiféle DOC-2/hDab2 immunreaktivitást [21]. A különféle trofoblaszt betegségekben a DOC-2/hDab2 expresszió szignifikánsan alacsonyabb szintjei arra utalnak, hogy a DOC2/hDab2 fontos szerepet játszhat a normál trofoblaszt sejtek növekedésében és differenciálódásában és, hogy a DOC-2/hDab2 lecsökkent kifejezôdése involválva lehet a terhességi trofoblaszt betegségek, különösen a teljes molák és a choriocarcinomák kifejlôdésében [21]. Azt találták, hogy a DOC-2/hDab2-vel transzfektált choriocarcinoma sejtek növekedési mértéke 300

sejtkultúrában szignifikánsan alacsonyabb, ami arra utal, hogy a DOC-2/hDab2 szuppresszálhatja a choriocarcinoma sejtek növekedését in vitro. A TP53 és az MDM2 fehérjék közötti kölcsönhatás fontos szerepet játszhat a sejtosztódás szabályozásában [22]. Több tumorról, köztük szarkómákról, glioblasztomákról, anaplasztikus asztrocitómákról és a teljes molákról leírták már, hogy a vad típusú TP53 fehérje megnövekedett expresszióját mutatják [23, 24, 25]. Úgy vélik, hogy az MDM2 géntermék a TP53 fehérje egyik sejtes szabályozójaként mûködik, mivel az a vad-típusú TP53 fehérjéhez kötôdhet. Ezért az MDM2 túlzott expressziója elfojthatja a vadtípusú TP53 fehérje növekedés-szuppresszáló tulajdonságait és neopláziás transzformációt eredményezhet [24]. Ezért valószínû, hogy az MDM2 felerôsítése és túlzott expressziója folytán bizonyos humán daganatok megmenekülnek a TP53 által szabályozott növekedési kontroll alól. Az MDM2 túlzott expressziója a TP53 fehérje inaktiválásától eltérô mechanizmusokkal is elôsegítheti a daganatképzôdést [25]. Például a túlzottan expresszált MDM2 fehérjék komplexet képezhetnek az RB fehérjékkel és blokkolhatják a sejtmûködés RB fehérje általi szuppresszióját; ez az RB túlzott expresszióját eredményezheti ezekben a daganatokban [26]. Az MDM2 fehérje közvetetten blokkolhatja a p2l mûködését is azáltal, hogy az RB géntermékkel komplexeket képez [26]. Ezért az MDM2 a TP53 és a RB tumor szuppresszor gén termékek mûködését egyaránt gátolhatja [26]. Azon komplett molák és choriocarcinomák, amelyek mind a vad-típusú TP53 mind pedig az MDM2 fehérjéket túltermelik – szemben a mutáns TP53 fehérjét expresszáló daganatokkal – a kóros TP53 expressziót mutató tumorok egy másik csoportját képviselhetik. Következtetésként elmondhatjuk, hogy a TP53, p21, az RB és az MDM2 megváltozott expressziója a teljes mola és a choriocarcinoma patogenézisében egyaránt fontos lehet. Azonban a teljes molaterhességtôl eltérôen, a részleges mola a TP53 túlzott expressziójával nem jellemezhetô. A TP53 és MDM2 fehérjék túlzott expressziója a teljes molában és a choriocarcinomában összefüggésben lehet a terhességi trofoblaszt betegségben elôforduló agresszívabb viselkedéssel. Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

EGFR-re utaló festôdést immunhisztokémiai eljárással a terhességi trofoblaszt betegségek és a normális lepény valamennyi sejttípusában kimutatták. A 20 vizsgált szövetben az EGFR mRNS kimutatására elvégzett in situ hibridizáció ugyanazokat az eredményeket adta, mint amit az EGFR-re vonatkozó immunfestésnél találtak. A choriocarcinomás esetek mindegyike erôs festôdést mutatott az EGFR-re. A choriocarcinomában és a teljes mola szinciciotrofoblaszt sejtjeiben az EGFR expresszió szintje szignifikánsan nagyobb volt, mint akár a normális lepény, akár a részleges mola szinciciotrofoblasztjaiban (p<0,01). A teljes mola citotrofoblasztjaiban az EGFR expressziója szignifikánsan nagyobbnak adódott, mint a lepény és a részleges mola citotrofoblasztjaiban (p<0,0 1 és p=0,05, külön-külön) [27]. A c-erB-2 ellenanyag expresszió a bolyhon kívüli trofoblaszt sejtmembránjára korlátozódott. A c-erbB-2 fehérjére erôs pozitív festôdést találtak 1/18 (5,5%) lepényben, 3/17 (17,6%) részleges molában, 23/25 (92%) teljes molában és mind a 11 choriocarcinomában. Azonban 10/18 lepény, 4/17 részleges mola és 1/25 teljes mola negatív volt a c-erB-2 fehérjére. Ha a normális lepényhez vagy a részleges molához hasonlították, akkor a c-erbB-2 fehérje expressziója szignifikánsan erôsebb volt a teljes molában (p<0,0001, p<0,0001) és choriocarcinomában (p<0,0001, p<0,0001) [28]. A c-erbB-3 expressziója nem különbözött szignifikánsan a lepényi és a terhességi trofoblaszt betegségek szövetmintái valamint a trofoblasztsejtek típusai között, kivéve azt, hogy a részleges molában található citotrofoblasztokhoz képest a choriocarcinomában a c-erbB-3 fokozottabban expresszálódott (p=0,02). Megfigyelték, hogy a teljes molában a bolyhon kívüli trofoblasztokban az EGFR-re és a c-erbB-3-ra utaló erôs immunfestôdés szignifikáns összefüggésben van a perzisztáló posztmoláris terhességi trofoblasztdaganatok kifejlôdésével. A bolyhon kívüli trofoblasztokban az EGFR-t és a c-erbB-3-at jelölô erôs immunreaktivitást külön-külön a teljes molaesetek 100,0 illetve 75,0%-ban lehetett megfigyelni akkor, ha belôlük perzisztáló posztmoláris terhességi trofoblasztdaganat fejlôdött ki, szemben a spontán remissziót elérô esetekkel, ahol ez a festési arány 47,0 és 17,0%-nak adódott Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

külön-külön (p=0,02 és p<0,01, külön-külön) [27]. A fentiekbôl következôleg az onkogének EGFR-rokon családja (EGFR, c-erbB-2, c-erbB-3, c-erbB-4) fontos lehet a terhességi trofoblaszt betegségek patogenézisében. A c-erbB-2 fehérje gyakorlatilag kizárólagosan a teljes mola szövetekbe betörô bolyhon kívüli trofoblasztjában és a choriocarcinomában adott túlzott expressziót [28]. A c-erB-2 onkogén túlzott expressziója számos daganatban a rossz prognózissal van összefüggésben [29, 30]. A c-erbB-2 túlzott expressziója kapcsolatban lehet a teljes molában, és a choriocarcinomában egyaránt elôforduló agresszív kórtörténettel. A teljes molában az EGFR és a c-erbB-3 megnövekedett expressziója szintén befolyással lehet a perzisztáló terhességi trofoblasztdaganatok kifejlôdésére. Az EGFR-nek és az onkogének vele rokon családjának további tanulmányozása fontos betekintést adhat a terhességi trofoblaszt betegségek klinikai viselkedésébe és biológiájába, és hozzájárulhat az ezen betegségekben szenvedô betegek sikeres kezeléséhez. A 18 lepényi és 17 részleges molás minták közül csak 1 részleges mola mutatott erôs festôdési reakciót a bcl-2 fehérjére. Általánosságban a lepényi és részleges molás szövetek gyengén vagy közepesen festôdtek a bcl-2 fehérjére, mely festôdésre a szinciciotrofoblaszt sejtek diffúz sejtplazma festôdési mintázata volt jellemzô. Ezzel szemben a bcl-2 onkofehérjével erôs immunreaktivitást figyeltek meg 25-bôl 21 (84%) teljes molában, 11-bôl 8 (72,7%) choriocarcinomában. Mind a normális lepénnyel, mind a részleges molával való összehasonlításban, a teljes molában és a choriocarcinomában szignifikánsan erôsebb festôdést figyeltek meg a bcl-2 fehérjére (p<0,0001, p<0,0001, külön-külön) [28]. Az apoptózist gátló tulajdonságúnak tartott bcl-2 kifejezôdésének jelenlétét a szinciciotrofoblasztokban ki tudták mutatni, a citotrofoblasztokban viszont nem. A gének által irányított sejthalálprogram, az apoptózis a sejtpusztulás legfontosabb módozata. A necrózissal összehasonlítva egy energiafüggô öngyilkossági folyamat, amely jól szabályozott szintetikus események sorozatát foglalja magában. Az apoptózis megakadályozásán kívül a bcl-2 valószínûleg fontos szerepet játszik a végsô differenciálódáshoz vezetô úton is. A gesztációs trophoblaszt 301

betegség kemoterápiájában jelenleg alkalmazott gyógyszerek (pl. etoposid, methotrexát és a vincristin) apoptózist indukáló hatást mutatnak a sejtvonalak széles skáláján. A trofoblasztsejtek valószínûleg sejthalálra vannak ítélve a terhesség végén, míg a gesztációs trofoblaszttumorok trofoblasztsejtjei kikerülik a programozott sejthalált [28]. A fenti adatok tehát arra utalnak, hogy a c-erbB-2 és a bcl-2 onkoproteinek szintjének növekedése fontos szerepet tölthet be a komplett mola és a choriocarcioma patogenezisében [28]. Azonban, míg a komplett mola és a choriocarcinoma a c-erbB-2 és bcl-2 túlzott kifejezôdésével jellemezhetô, a partialis mola általában nem expresszálja erôsen ezeket az onkoproteineket. Az onkogének expressziójának vizsgálata gesztációs trofoblaszt betegségekben nemcsak a patogenezisbe adhat fontos betekintést, hanem prognosztikusan is hasznos lehet a terápiás irányelvekben.

Sejt adhéziós molekulák, amelyek a normális és kóros trofoblasztsejtek beágyazódását és invazivitását befolyásolják A lepényi szövet a sejtek heterogén populációjából tevôdik össze, magában foglalva a boholy szinciciotrofoblasztot és citotrofoblasztot éppúgy, mint a bolyhon kívüli trofoblasztot. Míg a boholy trofoblasztsejtek nem mutatnak invazív viselkedést, addig úgy tûnik, hogy a bolyhon kívüli trofoblaszt invazív képessége hasonló a daganatinvázió során jelenlevô rosszindulatú sejtek szerepéhez [31, 32]. Azonban a méhnyálkahártya trofoblasztinváziója szigorúan szabályozott a normális terhesség elsô trimeszterében [31]. A bolyhon kívüli trofoblasztsejtek a lepény rögzítô bolyhainak bazális membránjától migrálnak és a mélybe törve elérik a miometriumot. A trofoblasztinvázió folyamata a sejten kívüli mátrix enzimatikus bontásával jár együtt [33, 34]. Úgy gondolják, hogy az extracelluláris proteinázoknak fontos szerepük van az invázióhoz és a metasztázis-képzéshez szükséges bazális membrán lebomlásában és a sejt-mátrix kölcsönhatások módosításában egyaránt. A mátrixot szétbontó proteázok különbözô családjairól, köztük a szerin proteázokról és a mátrix metalloproteinázokról (MMP-k) kimutatták, hogy 302

közremûködnek az anyai szövetekbe történô trofoblasztinvázióban [33, 34, 35]. Tehát a placentáció során az MMP-k fontos szerepet játszanak a trofoblasztsejtek anyai endometriumba történô betörésében. Az MMP-k aktivitását több biológiai modulátor szabályozza, köztük a metalloproteinázok szöveti gátlói (TIMP-ek). Ezek a kiválasztódó gátlófehérjék az MMP-k aktív formáihoz kötôdnek és meggátolják azok sajátos proteolítikus aktivitását a szövetben [36, 37, 38]. Fontos, hogy a choriocarcinoma az MMP-let és az MMP-2-t szignifikánsan erôsebben fejezte ki, mint a normális lepény, a részleges mola és a teljes mola szinciciotrofoblasztjai, valamint a lepény bolyhon kívüli trofoblasztja. Míg a choriocarcinoma a lepényhez, a részleges molához és a teljes molához viszonyítva szignifikánsan megnövekedett MMP-l és MMP-2 expressziót mutat, addig a choriocarcinomának szignifikánsan kevesebb metalloproteináz-l szövetgátló kifejezése van, mint a lepénynek, a részleges molának és a teljes molának. A choriocarciomában az MMP-l és MMP-2 megnövekedett kifejezôdése és a TIMP-l csökkent kifejezôdése hozzájárulhat a choriocarcinoma sejtek invazivitásához [39]. Az MMP-k és szöveti gátlóik fontos szerepet játszhatnak a terhességi trofoblaszt betegségek patogenézisében. Elôfordulhat, hogy gyógyszerrezisztens terhességi trofoblasztdaganatokban szenvedô betegekkel találjuk szembe magunkat, ezért folyamatosan szükség van új kemoterápeutikumok kifejlesztésére és értékelésére. Jelenleg olyan neopláziaellenes gyógyszereket fejlesztenek ki, amelyek módosítják az MMP-k és inhibitoraik aktivitását; ezek a szerek terhességi trofoblaszt betegségekkel szembeni aktivitást mutathatnak [40, 41]. A terhességi trofoblaszt betegségek biológiájában az MMP-k szerepének jobb megértése, az ezen betegségekben szenvedô betegek új és eredeti terápiáihoz vezethet. Az osteopontin (OPN) az extracelluláris mátrix jól ismert glikoproteinje, mely kötôdni képes különbözô típusú receptorokhoz, ideértve az integrineket és a CD44 receptorokat is. Ez a sokoldalú kötôdôképesség magyarázza, hogy az OPN szerepet játszik több fiziológiás és patológiás folyamatban valamint, újabb kutatási eredmények alapján, számos rosszindulatú daganat tumorgenezisében. Az endometrium és a Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

méhlepény chorionbolyhainak trofoblastsejtjei is termelnek osteopontint, ahol feltételezések szerint szabályozó funkciót tölt be koraterhességben, az implantáció és placentáció során azáltal, hogy serkenti a sejtek közötti interakciókat, elôsegíti a beágyazódást, a trophoblastsejtek megtapadását, migrációját [42]. Egy tanulmányban az OPN mRNS és fehérje kifejezôdésbeli különbségének meghatározására a normális illetve a molás trofoblasztszöveteknél kvantitatív reverz transzkriptáz (RT)PCR-t és immunhisztokémiai festést alkalmaztak. A kvantitatív RT-PCR-t minden mintánál GAPDH (háztartási gén) kontroll mellett végezték a normalizáció érdekében. Minden szövetminta pozitívnak bizonyult OPN-re. A kapott OPN és GAPDH értékek különbségét véve alapul (∆CT), az eredményeket relatívan értékelték a legalacsonyabb értékhez viszonyítva (∆∆CT) logaritmikus átalakítás után (2∆∆CT). Az átlagos 2∆∆CT érték 690 volt normális trofoblaszt esetében (83-tól 1771-ig), 66 komplett molában (1212) és 328 parciális molában (315–340) [42]. Az immunfestés értékelésekor a festôdés intenzitása alapján felállított skála szerint pontozták az OPN pozitivitást (0-1-2-3). A 9 normális humán placenta szövet közül 8 erôteljes festôdést mutatott (a skálán 3-as érték), míg a molás esetek többségében a pozitivitás gyenge vagy mérsékelt OPN kifejezôdést jelzett (0, 1 illetve 2 érték). A 13 komplett mola mellett 2 esetben az immunfestés negatívnak bizonyult OPN-ra. A két részleges mola mérsékelt illetve erôteljes (2es és 3-as érték) festôdést mutatott. Ezek az eredmények tehát az OPN mRNS-ének és fehérjéjének szignifikánsan gyengébb kifejezôdését mutatják mola hydatidosában – különösen komplett molában – a hasonló terhességi korból származó normális trofoblaszthoz viszonyítva (1. ábra). Az extracelluláris mátrixban kialakuló változások komplett molában szerepet játszhatnak a perzisztens trofoblaszttumorok kialakulásában [43, 44]. Normális terhességben a trofoblasztsejtek betörése az endometriumba az implantáció és placentáció során olyan molekuláris mechanizmusokat igényel, melyek hasonlóak a malignus betegségek inváziójához. Az egészséges lepényszövetben ezek a folyamatok pontosan szabályozottak. Számos tényezô – a genomiális imprinting, a protoonkogének, a tumor Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

1. ábra A normális placenta, a részleges mola és a teljes mola osteopontin immunfestôdése (CM = komplett mola, PM = részleges mola, NP = normális placenta)

szuppresszor gének, növekedési faktorok, onkoproteinek és a mátrix-proteázok – játszhat szerepet a trofoblaszt proliferáció, a sejt terjedés, a sejt-sejt illetve a sejt-mátrix interakciók szabályozásában [20, 27, 43, 45]. A mátrix metalloproteináz-2 (MMP-2) kifejezôdése szignifikánsan erôsebb komplett molában a normális placentához viszonyítva. Az MMP-2 és egyéb mátrix metalloproteinázok emelkedett aktivitása komplett molában felelôs lehet a lokális invazív képességért az extracelluláris mátrix fehérjéinek bontása miatt. Az MMP-2 és az OPN a sejtfelszínen ugyanazon αVβ3 integrin receptorhoz kötôdnek, így lehetséges, hogy az OPN szabályozza az MMP-2 aktivitást a közös receptorért történô versengésen keresztül [46, 47].

A hôsokk protein-27 (Hsp-27) stresszfehérje gén kifejezôdése A Hsp-27 nagy koncentrációkban fejezôdik ki az ösztrogénérzékeny szervekben [48]. Padwich és mtsai [49], valamint Morrish és mtsai [50] leírták, hogy a Hsp-27 kifejezôdik az anyai deciduában és a korai trofoblasztsejtekben. A Hsp-27 fontos szerepet játszhat a lepény differenciálódásában a terhesség elsô trimesztere idején. A Hsp-27 úgyszintén szerepet játszhat számos humán daganat patogenezisében. Egyes szerzôk immunhisztokémiai festéssel nyolc részleges molában, nyolc teljes molában, nyolc choriocarciomában és nyolc normális le303

pényben vizsgálták meg a Hsp-27 kifejezôdését. A Hsp-27 a szinciciotrofoblasztokban, a bolyhon kívüli trofoblasztokban, a deciduában és a daganatsejtekben expresszálódott. A citotrofoblasztokban nem találtak festôdést. Míg a szinciciotrofoblasztok nukleáris és citoplazmatikus festôdést egyaránt mutattak, addig a többi sejttípus csak a citoplazmában volt pozitív [51]. A szinciciotrofoblasztokban a citoplazmatikus immunreaktivitás a négy szövetcsoportban csökkenô intenzitást mutatott; a choriocarciomában nem találtak erôs pozitív festôdést. A szinciciotrofoblasztokban a Hsp-27 citoplazmatikus expresszióját illetôen statisztikailag szignifikáns különbségek voltak a lepény és a choriocarcinoma között (p=0,003), valamint a részleges mola és a choriocarcinoma között (p=0.02). Ebben a vonatkozásban a kifejezôdésbeli különbségek nem voltak szignifikánsak a komplett mola és a choriocarcinoma között. A bolyhon kívüli trofoblasztsejtek többnyire negatívak voltak, csak néhány eset adott pozitív festôdést [51]. A Hsp-27 expressziója a kemoterápiás gyógyszerrezisztencia megszerzésében is fontos lehet. A Hsp-27 foszforilációja a citoszkeleton stabilizációját hozhatja létre, és ennek következtében sok rosszindulatú sejtvonalban növelheti a sejtes gyógyszerrezisztenciát [52, 53]. A choriocarcinoma még kiterjedt metasztatikus betegség jelenlétében is kivételesen jól gyógyítható kemoterápiával. A Hsp-27 lecsökkent expressziója a choriocarciomában (a normális trofoblaszthoz képest) hozzájárulhat a choriocarcinoma kifejezett kemoterápia iránti érzékenységéhez. A choriocarciomában elôforduló Hsp-27 expresszió további funkcionális vizsgálatai lennének szükségesek ahhoz, hogy kiértékeljük a Hsp-27 potenciális kapcsolatát a trofoblaszt differenciálódásával és kemoterápia iránti érzékenységével.

Konklúzió A különbözô onkogének és növekedési faktorok expressziója alapján úgy tûnik, hogy a részleges mola jobban hasonlít a normális placentához, míg a komplett mola a choriocarcinomához áll közelebb (I. táblázat). A részleges mola így inkább a vetélés egy variációjaként fogható fel, mintsem valódi tumorként. Ezek az 304

I. táblázat Funkcionális fehérjék kifejezôdése normális lepényben és terhességi trofoblaszt betegségekben Normális részleges teljes placenta mola mola

choriocarcinoma

SSEA-1 MA2 és MA7 TP53 p21 RB DOC-2/hDab2 MDM2 EGFR c-erbB-2 bcl-2 MMP-1 és MMP-2 TIMP OPN Hsp-27

– – –+ + ++ +++ + ++ –+ + + +++ ++++ ++

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – ++ +++ ++++ +++ +++ +

– –+ + ++ +++ ++++

Nem festôdô minták Egy-két közepesen festôdô minta Gyenge vagy közepes festôdés Közepes vagy erôs festôdés 60%-nál gyakrabban kapott erôs festôdés 80%-nál gyakrabban kapott erôs festôdés

– – –+ + ++ ++ + ++ -+ + + +++ ++ ++

– – ++++ ++++ ++++ –+ ++ +++ ++++ ++++ + +++ + +

+

eredmények prognosztikus és terápiás hatásaik mellett betekintést nyújthatnak a normális placenta és a gesztációs trofoblaszt betegségek kapcsolatába. Köszönetnyilvánítás: A cikk megjelenéséhez segítséget nyújtott az Országos Tudományos Kutatási Alapprogram 47891-es számú pályázata.

Irodalom [1] Goldstein DP, Berkowitz R. Gestational tropholastic neoplasms: clinical principles of diagnosis and management. W.B. Saunders, Philadelphia, 1982. [2] Berkowitz RS, Goldstein DP. Pathogenesis of gestational trophoblastic neoplasms. Pathobiol Ann 1981; 11: 391–411. [3] Kato M, Tanaka K, Takeuchi S. The nature of trophoblastic disease initiated by transplantation into immunosuppressed animals. Am J Obstet Gynecol 1982; 142: 497–505. [4] Takeuchi S. Immunology of spontaneous abortion. Am J Reprod Immunol 1980; 1: 23–28. Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

[5] Saksela O, Wahlstrom T, Lehtovirta P és mtsai. Presence of alpha 2-macroglobulin in normal but not malignant human syncytiotrophoblasts. Cancer Res 1981; 41: 2507–2513. [6] Seppala M, Wahlstrom T, Bohn H. Circulating levels and tissue localization of placental protein five (PP5) in pregnancy and trophoblastic disease: Absence of PP5 expression in the malignant trophoblast. Int J Cancer 1979; 24: 6–10. [7] Loke YW, Whyte A, Davies SP. Differential expression of trophoblast-specific membrane antigens by normal and abnormal human placentae and by neoplasms of trophoblastic and non-trophoblastic origin. Int J Cancer 1980; 25: 459–461. [8] Berkowitz RS, Alberti Jr O, Hunter NJ és mtsai. Localization of stage-specific embryonic antigens in hydatidiform mole, normal placenta and gestational choriocarcinoma. Gynecol Oncol 1985; 20: 71–77. [9] Berkowitz RS, Alexander NJ, Goldstein DP és mtsai. Reactivity of antihuman sperm monoclonal antibodies with normal placenta, hydatidiform mole and gestational choriocarcinoma. Gynecol Oncol 1985; 22: 334–340. [10] Solter D, Knowles BB. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1). Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: 5565–5569. [11] Fox N, Damjanov I, Knowles BB és mtsai. Immunohistochemical localization of the mouse stage-specific embryonic antigen 1 in human tissues and tumors. Cancer Res 1983; 43: 669–678. [12] Shevinsky LH, Knowles BB, Damjanov I és mtsai. Monoclonal antibody to murine embryos defines a stage-specific embryonic antigen expressed on mouse embryos and human teratocarcinoma cells. Cell 1982; 30: 697–705. [13] Menge AC, Fleming CH. Detection of sperm antigens on mouse ova and early embryos. Develop Biol 1978; 63: 111–117. [14] Anderson DJ, Adams PH, Hamilton MS és mtsai. Antisperm antibodies in mouse vasectomy sera react with embryonal teratocarcinoma. J Immunol 1983; 131: 2908–2912. [15] Berkowitz RS, Umpierre SA, Taylor-Emery S és mtsai. Immunobiology of complete molar pregnancy and gestational trophoblastic tumor. Cancer Metast Rev 1986; 5: 109–123. [16] Hilkens J, Baijs F, Hilgers J és mtsai. Monoclonal antobodies against human milk-fat globule membranes detecting differentiation antigens of the mammary gland and its tumors. Int J Cancer 1984; 34: 197–206. [17] Bast Jr RC, Feeney M, Lazarus H és mtsai. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest 1981;68: 1331–1337. [18] Williams GT, Smith CA. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death. Cell 1993; 74: 777–779. [19] Nelson DM. Apoptotic changes occur in syncytiotrophoblast of human placental villi where fibrin type fibrinoid is deposited at discontinuities in the villous trophoblast. Placenta 1996; 17: 387–391. [20] Fülöp V, Mok SC, Genest DR és mtsai. p53, p21, Rb

Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.

and mdm2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 1998; 43:119–127. [21] Fülöp V, Colitti CV, Genest D és mtsai. DOC2/hDab2, a candidate tumor suppressor gene involved in the development of gestational trophoblastic diseases. Oncogene 1998; 17: 419–424. [22] Wu X, Bayle JH, Olson D, el al. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes & Dev 1993; 7: 1126–1132. [23] Cheung ANY, Srivastava G, Chung LP és mtsai. Expression of the p53 gene in trophoblastic cells in hydatidiform moles and normal human placentas. J Reprod Med 1994; 39: 223–227. [24] Cordon-Cardo C, Latres E, Drobnjak M és mtsai. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res 1994; 54: 794–799. [25] Reifenberger G, Liu L, Ichimura K és mtsai. Amplification and overexpression of the MDM2 gene in a subset of human malignant gliomas without p53 mutations. Cancer Res 1993; 53: 2736–2739. [26] Xiao Z-X, Chen J, Levine AJ és mtsai. Interaction between the retinoblastoma protein and the oncoprotein MDM2. Nature 1995; 375: 694–697. [27] Tuncer ZS, Végh Gy L, Fülöp V és mtsai. Expression of epidermal growth factor receptor related family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta and its relationship with development of postmolar tumor. Gynecol Oncol 2000; 77: 389–393. [28] Fülöp V, Mok SC, Genest DR és mtsai. c-myc, cerbB-2, c-fms and bcl-2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 1998; 43: 101–110. [29] Wright C, Nicholson S, Angus B és mtsai. Relationship between c-erbB-2 protein product expression and response to endocrine therapy in advanced breast cancer. Br J Cancer 1992;65:118–121. [30] Pavlidis N, Briassoulis E, Bai M és mtsai. Overexpression of c-myc, ras and c-erbB-2 oncoproteins in carcinoma of unknown primary origin. Anticancer Res 1995; 15: 2563–2568. [31] Crescimanno C, Foidart JM, Noel A és mtsai. Cloning of choriocarcinoma cells shows that invasion correlates with expression and activation of gelatinase A. Exp Cell Res 1996; 227: 240-251. [32] Lala PK, Graham CH. Mechanism of trophoblast invasiveness and their control: the role of proteases and protease inhibitors. Cancer Metast Rev 1994; 9: 369–379. [33] Huppertz B, Kerschanska S, Demir AY és mtsai. Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases (MMP), their substrates, and their inhibitors (TIMP) during trophoblast invasion in the human placenta. Cell Tissue Res 1998; 291: 133–148. [34] Bishof P, Haenggli L, Campana A. Gelatinase and oncofetal fibronectin expression is dependent on integrin expression on human cytotrophoblasts. Hum Reprod 1995; 10: 734–742. [35] Castellucci M, Theelen T, Pompili E és mtsai. Immunohistochemical localization of serine-protease inhibitors in the human placenta. Cell Tissue Res 1994; 278: 283–289.

305

[36] Leber T, Boyd R, Balkwill F. Tumour Cell-stromal Cell Interactions: Proteases and Protease Inhibitors, in Sharp F, Blackett T, Berek J, Bast R (eds): Ovarian Cancer 5. Oxford, Isis Medical Media Ltd, 1998, pp 121–129. [37] Murray GI, Duncan ME, Arbucle E. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gastric cancer. Gut 1998; 43: 791–797. [38] Denhardt DT, Feng B, Edwards DR. Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP, akaEPA): structure, control of expression and biological functions. Pharmacol Ther 1993; 59: 329–341. [39] Végh Gy L, Tuncer ZS, Fülöp V és mtsai. Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors in Gestational Trophoblastic Diseases and Normal Placenta. Gynecol Oncol 1999; 75: 248–253. [40] Rasmussen HS, McCann PP. Matrix metalloproteinase inhibition as a novel anticancer strategy: a review with specifial focus on batimastat and marimastat. Pharmacol Ther 1997; 75: 69–75. [41] Wojtowitz-Praga S, Torri J, Johnson M és mtsai. Phase I trial Marimastat, a novel matrix metalloproteinase inhibitor, administered orally to patients with advanced lung cancer. J Clin Oncol 1998; 16: 2150–2156. [42] Bátorfi J, Fülöp V, Kim J és mtsai. Osteopontin is down-regulated in hydatidiform. Gynecol Oncol 2003; 89: 134–139. [43] Fülöp V, Mok SC, Gati I, et al. Recent advances in molecular biology of gestational trophoblastic diseases. J Reprod Med 2002; 47: 369–79. [44] Bischof P, Martelli M, Campana A. The regulation of endometrial and trophoblastic metalloproteinases during blastocyst implantation and placentation. Contracept Fertil Sex 1994; 22: 48–52. [45] Ohlsson R. Growth factors, protooncogenes and human placental development. Cell Growth Differ 1989; 28: 1–15. [46] Nemir M, Bhattacharyya D, Li X és mtsai. Targeted inhibition of osteopontin expression in the mammary gland causes abnormal morphogenesis and lactation deficiency. J Biol Chem 2000; 275: 969–76. [47] Brooks PC, Stromblad S, Sanders LC és mtsai. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3. Cell 1996; 85: 683–93. [48] Ciocca DR, Oesterreich S, Chamness GC és mtsai. Biological and clinical implications of heat shock protein 27.000 (Hsp-27): a review. J Natl Cancer Inst 1993; 85: 1558–1570. [49] Padwick ML, Whitehead M, King RJB. Hormonal regulation of Hsp-27 expression in human endometrial epithelial and stromal cells. Mol Cell End 1994; 102: 9–14.

306

[50] Morrish DW, Linetsky E, Bhardwaj D és mtsai. Identification by substractive hybridization of a spectrum of novel and unexpected genes associated with in vitro differentiation of human cytotrophoblast cells. Placenta 1996; 17: 431–441. [51] Végh GL, Fülöp V, Liu Y és mtsai. Differential Gene Expression Pattern between Normal Human Trophoblast and Choriocarcinoma Cell Lines: Downregulation of Heat Shock Protein-27 in Choriocarcinoma in Vitro and in Vivo. Gynecol Oncol 1999; 75: 391–396. [52] Garrido C, Ottavi P, Fromentin A és mtsai. Hsp-27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs. Cancer Res 1997; 57: 2661–2667. [53] Richards EH, Hickey E, Weber L és mtsai. Effect of overexpression of small heat shock protein Hsp-27 on the heat and drug sensitivities of human testis tumor cells. Cancer Res 1996; 56: 2446–2451.

Fülöp V, Végh Gy, Bátorfi J, Nagymányoki Z, Berkovitz RS, Dancsó J: Molecular biology of gestational trophoblastic neoplasia Gestational trophoblastic diseases are interrelated conditions characterized by abnormal growth of chorionic tissues with varying propensities for local invasion and metastases. These diseases are characterized by altered expression of several growth regulatory factors and oncogenes. On the basis of the expression of various oncogenes and growth factors, partial mole appears to be more like normal placenta, while complete mole seems to be more like choriocarcinoma. These results may have both prognostic and therapeutic consequences and provide insight into the relationship between normal placenta and gestational trophoblastic diseases.

Keywords: oncogen, growth factor, gestational trophoblastic desease

Levelezési cím: DR. FÜLÖP VILMOS Országos Gyógyintézeti Központ Szülészeti és Nôgyógyászati Osztály 1135 Budapest, Szabolcs u. 35. e-mail: [email protected]

Magyar Nôorvosok Lapja 69 (3) 2006.