159
Samenvatting van het proefschrift. De lytische transglycosylase familie van Escherichia coli; in vitro activiteit versus in vivo functie. Bacteriën zijn niet alleen de oudste maar ook de meest talrijke bewoners van onze planeet (en wellicht ook van andere). Zoals Antonie van Leeuwenhoek al opmerkte, komen deze eencellige micro-organismen in vele verschijningsvormen voor en tijdens miljoenen jaren van evolutie hebben ze zich weten aan te passen aan de meest uiteenlopende omstandigheden. Zo zijn er bacteriën die leven in de bodem, in zoet en zout water, in de wortelknollen van bepaalde planten etc. Er zijn er zelfs die kunnen leven in omgevingen waar verder geen leven mogelijk is zoals in geisers en in de diepzee. Het meest bekend zijn bacteriën door hun interactie met de mens. Vele van deze interacties zijn van goedaardige aard en gebaseerd op symbiose, wat bijvoorbeeld geldt voor de bacteriën die onze darmen bevolken en ons helpen met de spijsvertering. Hun slechte naam hebben bacteriën echter te danken aan de kwaadaardige interactie van ziekteverwekkers met hun slachtoffers. Van deze pathogene bacteriën betaan er vele varianten, die vaak gespecialiseerd zijn in het veroorzaken van een specifieke infectie en zich daarbij ook weer perfect hebben aangepast aan het overleven in een vijandelijke omgeving. Om zich te beschermen tegen kwalijke invloeden van buitenaf, bezitten bijna alle bacteriën een celwand, die fungeert als een exoskelet, vergelijkbaar met dat van insecten. Deze celwand verleent de bacteriën stabiliteit en stelt hen in staat hun specifieke vorm te behouden. Verder kan dankzij de stevigheid van de celwand ook een hoge binnendruk in stand gehouden worden, die veroorzaakt wordt door de hoge concentratie van moleculen in de bacteriële cel. De belangrijkste structurele component van de celwand, waaraan deze zijn stevigheid ontleent, is het peptidoglycaan. Dit peptidoglycaan is een polymeer dat is opgebouwd uit strengen van aan elkaar gekoppelde suikermoleculen (glycaan-ketens) die onderling verbonden zijn door korte peptides (gekoppelde aminozuren). Een complex biosynthese systeem, waarin vele enzymen een rol spelen, is verantwoordelijk voor de opbouw van het peptidoglycaan. Deze synthese moet zeer goed worden gecoördineerd, aangezien de stevigheid van het peptidoglycaanomhulsel van essentieel belang is voor de cel. Wanneer er een zwakke plek in dit omhulsel aanwezig is, zal dit tot gevolg hebben dat de cel naar buiten stulpt en knapt, vergelijkbaar met de gevolgen van een gat in de buitenband van een fiets. Gezien het belang van het peptidoglycaan voor de cel, is het eigenlijk niet verwonderlijk dat de biosynthese van dit polymeer het doelwit is van de meest succesvolle klasse van antibiotica. Deze antibiotica zijn de penicillines, waarvan de antibacteriële werking in 1928 door Fleming werd ontdekt. Het werkingsmechanisme van penicilline berust erop dat de chemische structuur van dit antibioticum lijkt op die van één van de bouwstenen van het peptidoglycaan polymeer. Op grond van deze gelijkenis bindt penicilline aan de enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van het peptidoglycaan. Door deze binding worden deze enzymen geïnactiveerd, waardoor de synthese stopt en de cel niet verder kan groeien en zich niet kan delen. Alhoewel penicilline en ander zogenaamde β-lactaam antibiotica zeer succesvol zijn ingezet in de afgelopen decennia, beginnen de problemen met bacteriën die resistent
160 geworden zijn tegen deze antibiotica steeds groter te worden. In combinatie met het feit dat zich ook resistenties tegen andere klassen van antibiotica hebben ontwikkeld, betekent dit dat in een tijd waarin we dachten dat bacteriële infecties niet echt meer een serieus medisch probleem waren, we nu weer geconfronteerd worden met infecties die zeer moeilijk te behandelen zijn. Een voorbeeld hiervan, dat veel aandacht in de media gekregen heeft, is de methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Door het explosief toenemende resistentieprobleem is er een grote behoefte aan nieuwe antibiotica ontstaan en de farmaceutische industrie is dan ook naarstig op zoek naar verbindingen die de resistentie tegen de bekende antibiotica kunnen doorbreken. Eén van de mogelijkheden zou kunnen zijn om geheel nieuwe doelwitenzymen te identificeren en nieuwe moleculen te ontwikkelen die deze enzymen remmen. Goede kandidaten hiervoor zijn de enzymen die ook bij de opbouw en onderhoud van het peptidoglycaan betrokken zijn maar die niet worden geremd door penicilline. Van de enzymen die aan deze criteria voldoen zijn vele niet betrokken bij de synthese van het peptidoglycaan maar bij de afbraak (de hydrolyse). Het verbreken van bindingen in het peptidoglycaan is namelijk ook van essentieel belang; tijdens de groei van de bacterie moeten nieuwe stukken peptidoglycaan in het omhulsel worden ingevoegd en daarvoor moeten verbindingen verbroken worden. Ook tijdens de celdeling moeten tijdens de scheiding van de dochtercellen de twee nieuwe peptidoglycaan omhulsels van elkaar losgesneden worden. Het remmen van de hydrolasen zou dus ook een antibacterieel effect kunnen hebben. Er wordt vaak vanuit gegaan dat de enzymen die peptidoglycaan synthetiseren in balans zijn met de peptidoglycaan hydrolasen en dat deze balans wordt verstoord zodra de synthetische enzymen geremd worden. Volgens dit model zijn dan de hydrolasen verantwoordelijk voor het ontploffen van de cellen (lyse) wanneer de synthese is geblokkeerd door β-lactaam antibiotika. Het is van belang te begrijpen hoe deze lyse precies in zijn werk gaat omdat deze informatie zou kunnen helpen bij het ontwikkelen van antibiotica die niet alleen een groeiremmend effect hebben (bacteriostatisch) maar ook leiden tot lyse van de bacteriën (bacteriocidaal). Al met al is het vanuit antibacterieel oogpunt zeer wenselijk om meer informatie te krijgen over de peptidoglycaan hydrolasen en het oogmerk van dit proefschrift is daar een steentje aan bij te dragen. De hydrolasen die in dit proefschrift voornamelijk onder de loep worden genomen zijn de lytische transglycosylasen van de Gram-negative bacterie Escherichia coli. Deze enzymen verbreken specifieke bindingen in de suikerketens en kunnen op deze manier het hele peptidoglycaan polymeer afbreken. Het best gekarakteriseerde lid van deze enzym familie is de zgn. 70 kilodalton soluble lytic transglycosylase (Slt70). Dit enzym is de enige bacteriële peptidoglycaan hydrolase waarvan de driedimensionale structuur is opgehelderd. Hoewel de aminozuurvolgorde van Slt70 geen overeenkomst vertoonde met die van andere bekende peptidoglycaan hydrolasen, bleek een gedeelte van de structuur van het enzym te lijken op lysozym, een antibacteriëel enzym dat aanwezig is in vele organismen en bijvoorbeeld gevonden kan worden in bloed en speeksel. Op grond van deze gelijkenis, kon de meest aannemelijke positie van het actieve centrum van Slt70 worden bepaald. In hoofdstuk 2 wordt deze positie bevestigd doordat wordt aangetoond dat het aminozuur dat als belangrijkste kandidaat voor het katalytische aminozuur was aangewezen, inderdaad essentieel is voor de activiteit.
161 Het gedeelte van Slt70 dat overeenkomst vertoond met lysozym is verbonden met de ringvormige rest van het enzym. In hoofdstuk 2 wordt verder aangetoond dat het niet mogelijk is om het lysozym domein los te koppelen van de ring met behoud van de activiteit. Het is waarschijnlijk dat het lysozymdomein in een losse vorm niet structureel stabiel is. Een andere intrigerende vraag met m.b.t. het ring-gedeelte van Slt70 is of dit moet openen tijdens het enzymatische proces. Wanneer de suikerketens door de ring zouden gaan en de ring niet opent, zou het enzym blijven steken bij de eerste peptide-brug dat het op zijn weg tegenkomt. Om dit verder te onderzoeken werd er een vorm van het enzym geconstrueerd, waarin de ring “op slot” zit. Daarvoor werden door het veranderen van de genetische code (mutagenese) twee aminozuren in het enzym gebouwd die aan elkaar gekoppeld kunnen worden via een zwavelbrug. De resultaten van deze aanpak duiden erop dat ringopening niet noodzakelijk is voor de activiteit. Slt70 is niet de enige transglycosylase activiteit in E. coli. In een extract van cellen waarin het gen voor Slt70 is geïnactiveerd, kan nog steeds transglycosylase-activiteit gemeten worden. Dit duidt erop dat er nog meer transglycosylases aanwezig zijn en er werd tot voor kort aangenomen dat het hierbij om twee enzymen ging. Van een van enzymen was een gedeelte van de aminozuurvolgorde bepaald. In hoofdstuk 3 wordt beschreven hoe op grond van deze informatie het gen voor dit enzym werd geïsoleerd. Het bleek dat de aminozuurvolgorde waarvoor het gen codeert geen relevante overeenkomst vertoont met die van Slt70. Verder bleek dat het eiwit dat oorspronkelijk was geïsoleerd een afbraakprodukt is van een iets groter eiwit, dat waarschijnlijk aan de buitenmembraan van E. coli gebonden is via een lipide. Dankzij de isolatie van het gen kon het enzym in grote hoeveelheden worden geproduceerd en gezuiverd, hetgeen de weg vrijmaakte voor de bepaling van de driedimensionale structuur van deze nieuwe transglycosylase. In de afgelopen twee jaar heeft zich een zeer interessante ontwikkeling voorgedaan op het gebied van de (moleculaire) genetica. De grote vooruitgang in sequentietechnologie maakt het namelijk mogelijk om zeer snel van grote hoeveelheden DNA de volgorde te bepalen. Hierdoor is het bepalen van de totale genetische code (het genoom) van organismen binnen bereik gekomen. Het eerste organisme waarvoor dit gerealiseerd werd is de Gram-negatieve bacterie Haemophilus influenzae. Het beschikbaar komen van steeds meer DNA-sequentie-informatie maakt het mogelijk om in deze informatie te zoeken naar nieuwe genen die coderen voor eiwitten, die overeenkomsten vertonen (homoloog zijn) met bekende enzymen. In het geval van de transglycosylasen bleek het moeilijk om nieuwe genen te vinden die zeer duidelijke homologie vertoonden. Echter, op grond van de bovengenoemde structurele overeenkomst met lysozym, konden een paar stukken aminozuurvolgorde worden gedefinieerd, waarvan het waarschijnlijk is dat ze ook in andere transglycosylasen met een vergelijkbare structuur aanwezig zullen zijn (geconserveerd zijn). Zoals beschreven in hoofstuk 4 werd in de genomische informatie van H. influenzae en ook die van E. coli gezocht naar genen die coderen voor eiwitten die deze motieven bevatten en die daarmee mogelijke kandidaten voor nieuwe transglycosylasen zijn. Een kandidaat gen kon worden geïdentificeerd in de genomische sequentie van beide bacteriën. Het gen van E. coli werd tot expressie gebracht en inderdaad bleek het geproduceerde eiwit in staat peptidoglycaan af te breken. De identificatie van deze nieuwe transglycosylase, waarbij uitgegaan werd van genetische informatie en geëindigd met een
162 enzymactiviteit, verliep in de tegenovergestelde richting als de klassieke methode, zoals die in het vorige hoofstuk werd beschreven. Bij die methode werd namelijk begonnen met een enzymactiviteit en werd het corresponderende gen daarbij gezocht. Overproductie van het enzym bleek niet lytisch te zijn, wat erop duidt dat de activiteit op de een of andere manier wordt gereguleerd. De homologie van dit nieuwe lid van de transglycosylase familie, dat MltC werd gedoopt, met Slt70 bleek beperkt te zijn tot het lysozyme domein en het eerste gedeelte van het eiwit vertoont geen overeenkomst met bekende eiwitten. In tegenstelling tot Slt70, kon in het geval van MltC het lysozyme domein wel losgekoppeld worden zonder dat de activiteit verloren ging. Het losgekoppelde domein bleek in dit geval zelfs een stuk actiever, hetgeen impliceert dat de peptidoglycaan hydrolase-activiteit wordt gecontroleerd door het eerste domein. In hoofdstuk 4 wordt verder beschreven hoe een E. coli stam werd geconstrueerd, waarin het gen dat codeert voor MltC is geïnactiveerd. Het bleek dat deze stam levensvatbaar is, hetgeen tot de conclusie voert dat dit gen niet absoluut essentieel is voor het overleven van de bacterie. Zoals te lezen is in hoofdstuk 5, was met de identificatie van MltC de lytische transglycosylase familie van E. coli nog niet compleet. Middels een vergelijkbare aanpak werd namelijk nog een nieuw lid van de familie geïdentificeerd, waarvoor peptidoglycaan hydrolase activiteit kon worden aangetoond. De expressie van dit mltD gen, heeft, in tegenstelling tot mltC, wel directe lyse van de bacteriën tot gevolg. Een zeer interessant karakteristiek van deze nieuwe transglycosylase is dat het lysozym domein in dit geval midden in het enzym gelokaliseerd is en geflankeerd wordt door twee domeinen. Een van deze domeinen bevat een stukje aminozuur volgorde dat tot nu toe alleen maar was aangetroffen in peptidoglycaan hydrolasen van Gram-positieve bacteriën en waarvan wordt aangenomen dat het betrokken is bij de binding aan het peptidoglycaan. Dit is de eerste overeenkomst van een lytische transglycosylase met Gram-positieve hydrolasen en deze observatie is zeer interessant vanuit het oogpunt van identificatie van algemene principes in de verschillende bacteriële hydrolase systemen. Hoofdstuk 6 beschrijft de pogingen die werden ondernomen om verschillende analytische technologieën te combineren met als doel het snel kunnen identificeren van nieuwe peptidoglycaan hydrolasen m.b.v. genomische sequentie informatie. Deze benadering werd uitgetest op H. influenzae en een kandidaat-gen kon worden geïdentificeerd. Nadat het gen tot expressie was gebracht en het overgeproduceerde eiwit gezuiverd was, kon dit verder biochemisch worden bestudeerd. Het bleek dat het gen niet codeert voor een hydrolase maar eerder voor een peptidoglycaanbindend eiwit. In combinatie met de informatie die reeds voor dit eiwit aanwezig was, voerden deze resultaten tot de hypothese dat het eiwit een soort tunnel door het peptidoglycaan vormt, waardoor componenten van de buitenmembraan getransporteerd worden. Behalve de bovengenoemde identificatie van MltC en MltD in E. coli, voerde het speuren naar nieuwe eiwitten die de transglycosylase-motieven bezitten, ook nog tot de identificatie van mogelijke transglycosylasen in andere Gram-negatieve bacteriën. Een opvallend fenomeen is dat vescheidene van deze genen op de een of andere manier betrokken schijnen te zijn bij transportprocessen. In hoofdstuk 7 wordt verder op dit fenomeen ingegaan en wordt de hypothese geponeerd dat deze transglycosylasen fungeren als gaatjes-borende enzymen, die het transport van grote
163 moleculen zoals DNA en eiwitcomplexen mogelijk maken. Deze hypothese wordt ondersteund door argumenten die voortkwamen uit een uitvoerige literatuurstudie. In hoofdstuk 8 van dit proefschrift wordt een geheel ander aspect van de lytische transglycosylasen onder de loep genomen. De peptidoglycaan afbraakproducten, zoals die door de transglycosylasen worden geproduceerd, bezitten vele biologische activiteiten. Zo hebben ze een toxisch effect op bepaalde epitheel cellen, induceren ze slaap en activeren ze het immuunsysteem. Dit laatste effect werd bestudeerd in een diermodel. De belangrijkste observatie was dat de behandeling met lage concentraties van de transglycosylase-producten muizen beschermt tegen septische shock. Dit is een uit de hand gelopen infectie die leidt tot het op hol slaan van het immuunsysteem. De immunologische mechanismen die hieraan ten grondslag zouden kunnen liggen worden in dit hoofdstuk besproken. Tot voor kort werd aangenomen dat de lytische transglycosylase familie van E. coli uit twee of drie enzymen bestond. De identificatie van de drie nieuwe transglycosylasen, zoals in dit proefschrift beschreven, en het aanwezig zijn van verder homologe genen in de genomische sequentie, duidt erop dat er minstens vijf familieleden zijn en misschien zelfs wel zeven. Dit werpt de vraag op waarom E. coli zo’n arsenaal aan potentieel lytische enzymen bezit. Tot nu toe is geen van de transglycosylasen absoluut essentieel voor het overleven van E. coli onder labcondities gebleken. De huidige situatie is derhalve dat voor deze familie van enzymen waarvoor de in vitro activiteit is bepaald, namelijk de afbraak van peptidoglycaan, er geen eenduidig idee over de in vivo functie bestaat. Een tip van de sluier is misschien opgelicht door de identificatie van transglycosylasehomologen die een functie schijnen te hebben in transportprocessen. Dit zou erop kunnen duiden dat de verschillende transglycosylasen niet direct betrokken zijn bij de groei en deling van de cel maar eerder een rol spelen in specifiekere processen. Deze processen zouden belangrijk kunnen zijn voor het overleven van de bacterie onder omstandigheden die minder gunstig zijn dan die in het lab, of een rol kunnen spelen in het infectie-mechanisme van Gram-negatieve pathogenen. Verdere bestudering van deze enzymefamilie zal wellicht leiden tot meer duidelijkheid over de functie van de verschillende transglycosylasen. Misschien dat o.a. met behulp van de informatie in dit proefschrift, een manier gevonden kan worden om alle leden van deze enzymfamilie te remmen of, beter nog, deze enzymen te dereguleren en op die wijze lyse van de bacteriën te induceren.
164
Nawoord Nadat ik vanmiddag mijn Basler drukker nogmaals aan zijn verstand heb gepeuterd dat 24 bij 17 cm een heel normaal formaat is, en ik net, met on-line hulp van mijn zus, een hopeloze poging gedaan heb de nieuwe Nederlandse spellingsregels op mijn samenvatting los te laten, lijkt het einde dan nu toch echt in zicht te zijn. Ergo, het is tijd voor het nawoord. Op zo'n moment laat je natuurlijk de afgelopen jaren in gedachten de revue passeren en probeer je na te gaan wat je in al die tijd in vredesnaam hebt gedaan en wie je daarbij van dienst of tot steun is geweest. Mijn gedachten gingen dan ook even terug naar die nacht in San Diego waar ik, starende naar de sterren, besloot om het aanbod van Wolfgang om binnen zijn groep een promotieonderzoek te doen, aan te nemen. Ik wist dat ik in een prettige werkomgeving zou terechtkomen met Henk, John, Annemarie, Harald en natuurlijk Mark "prullebal" van der Linden, die ik hierbij allen nog wil bedanken voor de prettige samenwerking. Alhoewel ik tijdens mijn afstudeeronderzoek in de groep van Professor Robillard slechts in Wolfgang’s lab had "gelogeerd" en dus nog niet zoveel met hem te maken had gehad, ging ik ervan uit dat Wolfgang en ik het goed met elkaar zouden kunnen vinden en dat het een prettige samenwerking zou worden. Ik heb me wat dat betreft zeker niet vergist! Verder verheugde ik me erop nog een aantal jaren in Groningen te blijven. Wat dat betreft had ik me dus wel vergist. Na een aantal maanden werd al duidelijk dat we zouden verkassen en nadat het er een tijdje naar had uitgezien dat het New Jersey zou worden, was ik er niet rouwig om dat Wolfgang's keuze op Bazel viel. Gedrieën togen wij dus naar het Zwitserse Alpenland om daar een nieuw lab en bestaan op te bouwen. In het eerste jaar, waarin bleek dat het zeker niet meeviel om de boel bij Roche op de rails te krijgen, heb ik veel gehad aan mijn mede-strijder John, met wie ik ook buiten het lab een leuke tijd heb gehad. Verder waren daar gelukkig nog de samenwerkingsprojecten in Groningen, die wetenschappelijk gezien lekker liepen en waardoor ik zo nu en dan weer een excuus had om naar Nederland te komen: allereerst het doughnut-verhaal en de daarbij behorende prettige samenwerking met Andy-Mark, Bauke en later ook Erik en verder natuurlijk het het MTP-project met Wim en Dr. Edo Vellenga, waardoor ik een beetje werd ingewijd in de geheimen van de immunologie. Ik wil jullie allen hartelijk bedanken! Ook wil ik hier de gesprekjes met mijn eerste promotor Professor Robillard memoreren, die altijd zeer geïnteresseerd was in wat ik zoal deed en wiens enthousiasme over zijn eigen werkzaamheden altijd zeer aanstekelijk werkte. The fact that things did start to work for me in Basel also had to do with the fact that with the growth of the group, the working atmosphere changed for the better. I would like to thank the people from the Keck core-group Marcel, Marco, Sibylle, Rebecca, Kathrin, Fabrice, Yvonne and Sven for the nice collaboration and for putting up with my moods, especially during the last couple of months. Furthermore many thanks to the other people that made life in Switzerland a little more bearable: Hans, Frank, Gottfried and Sabine, Isabelle, Detlef, Glen, Howard who shared his philosophic thoughts with me, the Dutch connection: Ivo and Sibylle, Maarten and Alice, Chris and Maaike, all the people from PRPI that I hang out with, the guys from my basketball team that had to suffer when I was trying to get rid of some lab-frustration, and special thanks to my main man Richard. Of course the work described in this thesis would not have been possible without the help of a lot of people of which I would especially like to mention Clemens,
165 Hanno, Chris, Dr. Takacs, Dr. Huber, Dr. Angern, Francis Hermann and Monika Haiker. Veel dank ben ik ook verschuldigd aan mijn tweede en definitieve promotor Professof Bauke Dijkstra, bij wie ik als het ware te vondeling werd gelegd en die altijd zeer enthousiast was over mijn resultaten. Vooral tijdens de schrijfperiode waren het met name zijn snelle correcties die er voor zorgden dat toch alles nog op tijd bij de leescommissie lag. De leden van de leescommissie Professor Venema, Professor Robillard en Professor van Haastert wil ik bedanken voor de moeite die zij hebben genomen mijn werk te beoordelen. Het laatste gedeelte van dit na/dankwoord wil ik wijden aan de mensen in Nederland die mij dierbaar zijn. Allereerst natuurlijk mijn ouders en Yvette, die me altijd steun hebben gegeven als in in Bazel was en een thuis als ik in Nederland was. Alhoewel ik weet dat ze me liever wat dichter in de buurt zouden hebben, ondersteunen ze zelfs mijn beslissing om hier nog een tijdje te blijven en daar ben ik ze ontzettend dankbaar voor. Verder de Cityhop-Ameland gang: Gerard, Joep en Annie, Jacob en Frank. De uitstapjes met jullie waren altijd een welkome afwisseling en gedurende de zomers op Ameland met de vele strandactiviteiten, kon ik de batterij weer aardig opladen. Ook de vakanties in Vex en Tignes zal ik zo snel niet vergeten! The "Finest Table" verdient ook zeker een alinea. Op onze nu reeds legendarische congressen werd op onnavolgbare wijze het aangename met het serieuze verenigd en werd hoogstaande wetenschap afgewisseld met de grootst mogelijke onzin (schapir). Ook tijdens de andere activiteiten die we tezamen hebben ondernomen heb ik me altijd zeer goed vermaakt en met geen ander gezelschap heb ik zo vaak de slappe lach gehad. Ik hoop dat we dit contact tot in lengte van dagen volhouden en voel me zeer vereerd binnenkort “the Finest Seat” omgehangen te mogen krijgen. Ik prijs mezelf gelukkig dat ondanks al die jaren die ik hier heb doorgebracht, het contact met zoveel mensen in Nederland zo goed is gebleven en wil in dit verband ook speciaal nog even mijn goede vriendin Sabine, de de Groot-gang, oma Dijkstra, de Siedersen en Claudia noemen. Dit feit heeft mij ook doen inzien dat deze vriendschappen/contacten het echt nog wel wat langer zullen uithouden en dat inzicht is doorslaggevend geweest voor mijn beslissing om hier nog een tijdje te blijven. Dat ik ueberhaupt (sorry er moest gewoon even een Duits woord in) de kans heb gekregen om bij Roche te blijven heb ik voor een groot deel te danken aan de inspanningen van Wolfgang, waarvoor ik zeer dankbaar ben. Ik verheug me erop in de toekomst verder met hem samen te werken, wilde ideeën na te jagen, wat meer te genieten van het leven in Zwitserland en natuurlijk regelmatig in Nederland op bezoek te komen!
