Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event MIR604
I.
Pendahuluan
Jagung PRG event MIR604 adalah produk perusahaan Syngenta yang diklaim dikembangkan untuk memberikan manfaat bagi ketahanan terhadap serangga hama penggerek akar jagung (corn rootworm) Coleopteran. Jagung PRG event MIR604 menghasilkan protein mCry3A dan enzim PMI (phosphomannose isomerase). Jagung PRG event MIR604 telah dinyatakan aman sebagai pangan dan atau pakan di 10 negara yaitu Australia (2006), Taiwan (2007), Kanada (2007), Jepang (2007), Korea (2007), Meksiko (2007), Filipina (2007), Amerika Serikat (2007), Rusia (2007) dan Cina (2008). Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan jagung PRG event MIR604 terhadap informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini. II. II.1
Informasi Genetik Elemen Genetik
Jagung PRG event MIR604 mengandung dua gen interes yaitu gen mCry3A dan gen PMI. Gen mCry3A memproduksi protein mCry3A, yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap beberapa spesies serangga hama penggerek akar jagung Coleopteran (Diabrotica virgifera virgifera Le Conte, D. longicornis barberi Smith and Lawrence, dan D. virgifera zeae Krysan and Smith). Gen PMI (phosphomannose isomerase) bertanggung jawab sebagai marka seleksi. Promoter yang digunakan untuk gen mCry3A adalah MTL (metallothionein-like Zea mays) yang merupakan promoter spesisfik yang dapat mengarahkan ekspresi gen interes khusus pada akar tanaman jagung (Zea mays), dengan terminator NOS (nopaline synthase) dari Agrobacterium tumefaciens. Sedangkan promoter untuk gen PMI adalah ZmUbilInt (polyubiquitin Zea mays) dengan terminator NOS. II.2
Sumber Gen Interes
Gen mCry3A berasal dari Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; dan gen PMI berasal dari Escherichia coli. Bacillus thuringiensis telah digunakan sebagai pestisida hayati yang aman oleh petani sejak tahun 1958. II.3
Sistem Transformasi
Jagung PRG event MIR604 dirakit menggunakan plasmid vektor pZM26 melalui teknik transformasi dengan mediasi vektor Agrobacterium tumefaciens pada eksplan immature embryos tanaman jagung.
II.4
Stabilitas Genetik
1
Analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari jagung PRG event MIR604 pada beberapa generasi dilakukan dengan Southern blot fingerprint. Pola hibridisasi (hybridization pattern) jagung PRG event MIR604 selama tiga generasi silang balik (BC4, BC5 dan BC6) telah diidentifikasi. Hasilnya menunjukkan bahwa gen sisipan TDNA dari pZM26 yang diinkorporasikan ke dalam jagung PRG event MIR604 adalah stabil untuk enam generasi silang balik (BC6). Selanjutnya, tingkat kandungan protein mCry3A dan enzim PMI dalam jagung PRG event MIR604 diketahui stabil untuk empat generasi silang balik secara berturut-turut (over four successive backcross generations). Stabilitas genetik pewarisan sifat ketahanan serangga hama pada jagung PRG event MIR604 mengikuti prinsip segregasi Mendel. Data hibridisasi Southern blot memberikan konfirmasi bukti yang mendukung analisis PCR TaqMan® bahwa jagung PRG event MIR604 mengandung kopi tunggal (single copy) dari gen mCry3A dan gen PMI. Selain itu, berdasarkan analisis Southern blot ditemukan hasil yang penting yaitu tidak mengandung sekuen vektor backbone yang berada dalam pZM26. Stabilitas genetik jagung PRG event MIR604 dilaporkan dalam bentuk company report Syngenta Biotechnology dengan judul Molecular Characterization of Event MIR604 Maize (Corn) Expressing a Modified Cry3A Bacillus thuringiensis Protein oleh Hope Hart and Scott Rabe pada tahun 2004. Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik disimpulkan bahwa: a. jagung PRG event MIR604 mengandung satu kopi gen mCry3A dan gen PMI; b. jagung PRG event MIR604 tidak mengandung sekuen vektor backbone yang berada dalam pZM26; c. dua gen interes (mCry3A dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event MIR604 masih stabil sampai enam generasi silang balik; dan d. dua gen interes (mCry3A dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event MIR604 diwariskan mengikuti hukum Mendel. III.
Informasi Keamanan Pangan
III.1
Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial jagung PRG event MIR604 secara lengkap dilaporkan dalam company report No. SSB-111-04 A2, berjudul “Compositional Analysis of Grain and Whole Plants from Transgenic Maize (Corn) Event MIR604” (C.Kramer, 2005). Dalam pengkajian tersebut, komposisi biji jagung dan seluruh bagian tanaman jagung (forage) dari jagung PRG event MIR604 dan jagung non PRG diperoleh dari jagung yang ditanam pada tahun 2002 di 3 lokasi di USA dan yang ditanam pada tahun 2003 di 7 lokasi di USA. Semua sampel tahun 2002 dianalisis oleh WoodsonTenent Laboratory Inc., Goldston NC. Sedangkan semua sampel tahun 2003 dianalisis oleh Covance Laboratories Inc., Madison, WI. Secara lengkap komponen jagung dianalisis dalam pengkajian ini, yaitu komponen proksimat termasuk total dietary fiber (TDF), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), mineral (kalsium, fosfor, kalium, natrium, besi, tembaga, dan seng), vitamin (β-karoten, α-, β-, δ-, γ-tokoferol serta vitamin larut dalam air seperti asam folat, tiamin, riboflavin, niasin, asam pantotenat, piridoksin, dan vitamin C),
2
asam amino, asam lemak, metabolit sekunder seperti asam ferulat, asam p-kumarat, furfural, inositol, asam fitat, rafinosa, dan inhibitor tripsin. Dari hasil analisis ditemukan bahwa untuk penanaman tahun 2002 komposisi jagung PRG event MIR604 umumnya tidak berbeda dengan jagung non PRG. Untuk penanaman tahun 2003, ada sedikit perbedaan misalnya kadar protein biji jagung PRG event MIR604 lebih tinggi sekitar 4-7% dibandingkan dengan jagung non PRG, juga untuk kadar air (3% lebih tinggi) dan kalsium (4-10% lebih tinggi). Umumnya nilai rata-rata masih berada dalam kisaran komposisi yang dilaporkan dalam pustaka, seperti yang dilaporkan OECD (2002). Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa jagung PRG event MIR604 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG. III.2
Alergenisitas
Analisis sekuen asam amino telah dilakukan terhadap protein mCry3A yang dihasilkan dari gen mCry3A dan enzim PMI yang dihasilkan dari gen PMI. Hasilnya dilaporkan sebagai company report, yaitu: 1. “Modified Cry3A Protein as Expressed in Transgenic Maize Event MIR604: Assessment of Amino Acid Homology with Known Toxins”, oleh Jennifer Zawodny. Penelitian dilakukan di Syngenta Seeds, Inc. Product Registration Group, Post Office Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257. 2. “Phosphomannose Isomerase Protein as Expressed in Transgenic Maize Event MIR604: Assessment of Amino Acid Homology with Known Toxins”, oleh Jennifer Zawodny. Penelitian dilakukan di Syngenta Seeds, Inc. Product Registration Group, Post Office Box 12257, 3054 Cornwallis Road, Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257. Uji bioinformatik menggunakan data alergen yang tersimpan di NCBI maupun Bank Data Syngenta dengan menggunakan program SWISSPROT, BLASTP dan FASTA. Sekuen protein mCry3A juga di-screen dan dibandingkan pada setiap peptida dari 80 asam amino dan pada segmen 8 asam amino dengan protein alergen untuk melacak keberadaan epitop pengikatan terhadap IgE. Analisis perbandingan sekuen asam amino dengan data NCBI menunjukkan bahwa protein mCry3A tidak homolog dengan protein toksin atau alergen pada keseluruhan sekuen dan sekuen peptida 80 asam amino. Sedangkan pada enzim PMI, terdapat 1 lokasi yang mirip dengan suatu alergen alfa parvalbumin (110 asam amino dari katak Rana). Sekuen asam amino “DLSDKETT” yang mirip tersebut terdapat pada posisi 327-334 pada enzim PMI jagung PRG event MIR604 dan posisi 77-84 pada sekuen alergen alfa parvalbumin. Uji selanjutnya dilakukan di laboratorium Hilger (penemu parvalbumin). Hasil pengujian menggunakan enzim PMI dari E. coli rekombinan menunjukkan tidak ada cross reactivity diantara IgE serum pasien yang alergi terhadap katak dengan enzim PMI. Karakterisasi protein mCry3A dan enzim PMI yang diproduksi dari E. coli rekombinan dan jagung PRG meliputi uji imunoreaktivitas, berat molekul, status glikosilasi, dan sekuen asam amino N-terminal. Pengujian dilakukan di laboratorium Syngenta yang menerapkan Good Laboratory Practice. Kedua protein diekstrak dan dimurnikan dengan berbagai kromatografi kolom. Pengujian kualitas dan kuantitas
3
protein dilakukan dengan metoda Bradford, SDS-PAGE, ELISA, Western blot, uji aktivitas enzimatik maupun bioassay, analisis glikosilasi dengan DIG detection kit, dan sekuen asam amino dengan Edman degradation. Uji daya cerna dilakukan dengan menggunakan simulated gastric fluid (SGF) dan simulated intestine fluid (SIF). Enzim PMI yang diproduksi dari E. coli berbeda pada 16 asam amino di N-terminal yang sifatnya non fungsional. Namun demikian karakteristik biokimiawi, imunoreaktivitas, aktivitas biologi dan reaksi enzimatik kedua enzim PMI (E. coli dan jagung PRG) sama. Rata-rata protein mCry3A adalah 0,0001% dari protein total (kurang dari 1 µg protein mCry3A per gram pipilan atau kurang dari 1 ppm). Pada semua fase pertumbuhan, kandungan protein rata-rata adalah 3–23 µg/g (daun), 2–4 µg/g (akar) dan 0,9-11 µg/g (seluruh tanaman). Ekspresi protein mCry3A pada galur inbred lebih tinggi dari hibrida. Enzim PMI berkisar antara 0-0,4 µg/g. Pada biji kurang dari 0,14 µg/g dan pada inbred mirip dengan hibrida. Hasil analisis stabilitas terhadap protein mCry3A dan enzim PMI menunjukkan bahwa protein mCry3A stabil sampai empat generasi dan rata-rata kandungan mCry3A adalah 2,3 – 3,1 µg/g dan enzim PMI juga stabil selama beberapa generasi. Uji daya cerna protein mCry3A dari jagung PRG event MIR604 dan E. coli rekombinan dengan SGF yang mengandung pepsin menunjukkan degradasi cepat. Dalam 2 menit tidak ada lagi protein 67 kD yang utuh. Sedangkan uji daya cerna enzim PMI asal E. coli rekombinan dalam SGF setelah 1 menit tidak ditemukan molekul PMI yang utuh. Uji stabilitas panas pada suhu 4C, 25C, 37C, 65C, 95C menunjukkan bahwa pada suhu 95C protein mCry3A diinaktivasi (denaturasi atau degradasi) dan pada suhu 65C terjadi kehilangan bioaktivitas. Uji enzim PMI menunjukkan bahwa pada suhu 37C selama 30 menit masih stabil, dan pada suhu lebih dari 55C enzim PMI tidak stabil serta aktivitas protein turun menjadi 3% setelah inkubasi pada suhu 65C. Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein mCry3A dan enzim PMI tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi. III.3
Toksisitas
Uji toksisitas oral akut terhadap protein mCry3A telah dilakukan pada mencit, dan hasilnya dilaporkan sebagai company report yaitu “Acute Oral Toxicity of Modified Cry3A Protein (mCry3A-0102) in the Mouse”, oleh Ian Johnson. Penelitian dilakukan di Central Toxicology Laboratory, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, United Kingdom, SK10 4TJ. Kelompok mencit perlakuan (strain APfCD-1) yang terdiri dari 5 ekor jantan dan 5 ekor betina menerima dosis tunggal secara cekok(gavage) protein mCry3A-0102 sebanyak 2632 mg per kg BB. Berdasarkan hasil analisis, protein mCry3A-0102 yang diuji mengandung sekitar 90,3% protein Cry3A (berat per berat), sehingga dosis yang diberikan adalah sekitar 2377 mg protein Cry3A per kg berat badan. Kelompok mencit kontrol (strain APfCD-1) yang terdiri dari 5 ekor jantan dan 5 ekor betina, diberi cekokan larutan karboksi-metil-selulosa 1% (berat/volume), yang digunakan sebagai pelarut protein.
4
Pengujian dilaksanakan selama 14 hari setelah pemberian dosis; dan pengamatan dilakukan terhadap berat badan, konsumsi ransum (pakan) serta ada/tidaknya gejala toksisitas. Pada akhir percobaan, semua mencit dimatikan; kemudian organ otak, hati, ginjal dan limfa diambil untuk dilakukan pengujian histopatologis post mortem. Pengujian diselesaikan pada tanggal 11 Nopember 2003. Hasil pengujian menunjukkan bahwa tidak dijumpai kematian dan tanda-tanda klinis yang buruk pada mencit dengan dosis 2632 mg protein mCry3A-0102 per kg berat badan, yang setara dengan 2377 mg protein Cry3A per kg berat badan mencit. Oleh karena itu disimpulkan bahwa protein mCry3A-0102 (Cry3A) tidak menimbulkan efek toksik pada mencit. Uji toksisitas oral akut terhadap enzim PMI hasilnya dilaporkan sebagai company report yaitu “Phosphomannose Isomerase (Sample PMI-0198): Acute Oral Toxicity Study in Mice“ oleh Janice O Kuhn. Penelitian dilakukan di STILLMEADOW Inc., 12852 Park One Drive, Sugar Land, TX 77478. Pengujian dilakukan pada mencit putih (albino mice, strain HSD:ICR). Kelompok perlakuan terdiri dari 7 ekor jantan dan 6 ekor betina, yang diberi larutan protein PMI-0198 secara cekok (gavage) dengan dosis 5050 mg/kg berat badan. Berdasarkan hasil analisis, protein yang diuji mengandung sekitar 60% enzim fosfomanosa isomerase (basis berat). Protein yang diuji diberikan dua kali dengan jarak pemberian sekitar 1 jam, dengan konsentrasi 20% (berat/volume), yang dilarutkan dalam larutan karboksi-metil-selulosa 0,5%. Kelompok kontrol yang terdiri dari 6 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina, diberi cekokan larutan karboksimetil-selulosa 0,5% sebanyak 25,25 ml/kg berat badan. Pengujian dilaksanakan selama 14 hari setelah pemberian dosis; dan pengamatan dilakukan terhadap berat badan, konsumsi ransum (pakan) serta ada/tidaknya gejala toksisitas. Pada akhir percobaan, semua mencit dimatikan (dengan CO 2 over-dose); kemudian organ otak, hati, ginjal dan limfa diambil untuk dilakukan pengujian histopatologis post mortem. Pengujian diselesaikan pada tanggal 11 Agustus 1999. Hasil pengujian menunjukkan tidak ada kematian mencit selama percobaan berlangsung dan tidak ditemukan adanya gejala toksisitas secara klinis, demikian pula tidak ditemukan adanya abnormalitas pada organ dalam mencit. Disimpulkan bahwa pada dosis 5050 mg per kg berat badan mencit, enzim PMI-0198 tidak menimbulkan efek toksik pada mencit. Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein mCry3A dianggap tidak toksik dan enzim PMI termasuk dalam golongan zat yang tidak toksik (practically non toxic). IV.
Kesimpulan
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen mCry3A yang berasal dari Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; dan gen PMI yang berasal dari Escherichia coli yang disisipkan dalam jagung PRG event MIR604; analisis kesepadanan substansial antara komposisi jagung PRG event MIR604 dengan jagung non PRG; serta analisis alergenisitas dan pengujian toksisitas dari protein mCry3A dan enzim PMI, disimpulkan bahwa jagung PRG event MIR604 dapat dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
5
Disarankan bahwa selama jagung PRG event MIR604 belum memperoleh sertifikat aman lingkungan, maka jika ditemukan adanya biji jagung yang tumbuh (tanaman volunteer) harus segera dimusnahkan. Meskipun demikian, karena hal ini terkait dengan aspek keamanan lingkungan, saran ini dapat diabaikan apabila jagung PRG event MIR604 telah memperoleh sertifikat keamanan lingkungan.
6
