Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event MIR162
I.
Pendahuluan
Jagung PRG event MIR162 adalah produk perusahaan Syngenta yang diklaim dikembangkan untuk memberikan manfaat bagi ketahanan terhadap berbagai spesies serangga hama. Jagung PRG event MIR162 menghasilkan protein Vip3Aa20 dan protein PMI (phosphomannose isomerase). Jagung PRG event MIR162 telah digunakan sebagai pangan dan atau pakan di 8 negara yaitu Australia (2009), Amerika Serikat (2008), Brazil (2009), Kanada (2010), Jepang (2010), Filipina (2010), Meksiko (2010) dan Taiwan (2009). Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan jagung PRG event MIR162 terhadap informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini. II. II.1
Informasi Genetik Elemen Genetik
Jagung PRG event MIR162 mengandung dua gen interes yaitu gen Vip3Aa20 memproduksi protein Vip3Aa20, yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap berbagai spesies serangga hama Ostrinia nubilalis, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Agrotis ipsilon, dan Striacosta albicosta; dan gen PMI (phosphomannose isomerase) yang bertanggung jawab sebagai marka seleksi. Promoter yang digunakan untuk gen Vip3Aa20 adalah ZmUbilInt (polyubiquitin Zea mays) dengan terminator 35S dari Cauliflower mosaic virus. Sedangkan promoter dan terminator yang digunakan gen PMI masing-masing adalah ZmUbilInt dan NOS (nopaline synthase) dari Agrobacterium tumefaciens. II.2
Sumber Gen Interes
a. Gen Vip3Aa20 berasal dari Bacillus thuringiensis strain AB88. Bacillus thuringiensis telah digunakan secara komersil sebagai pestisida hayati dengan aman oleh petani sejak tahun 1958. b. Gen PMI berasal dari Escherichia coli. II.3
Sistem Transformasi
Perakitan jagung PRG event MIR162 dilakukan melalui teknik transformasi dengan mediasi vektor Agrobacterium tumefaciens pada eksplan immature embryos tanaman jagung galur NP2500 x NP2499. Plasmid vektor yang digunakan untuk merakit jagung PRG event MIR162 adalah pNOV1300. II.4
Stabilitas Genetik
Hasil analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari jagung PRG event MIR162 dengan Southern blot fingerprint menunjukkan bahwa sampai empat generasi silang balik (BC4F1), gen interes masih dapat dideteksi dengan melihat adanya pita gen interes. Selain itu, berdasarkan analisis Southern blot fingerprint ditemukan hasil
1
yang penting yaitu tidak dideteksi sekuen backbone dari plasmid transformasi pNOV1300. Stabilitas genetik pewarisan sifat ketahanan serangga hama pada jagung PRG event MIR162 mengikuti prinsip segregasi hukum Mendel. Data dari analisis Southern blot menunjukkan bahwa jagung PRG event MIR162 mengandung masing-masing satu kopi gen Vip3Aa20 dan gen PMI (phosphomannose isomerase). II.5
Kesimpulan
1. Jagung PRG event MIR162 mengandung masing-masing satu kopi gen Vip3Aa20 dan gen PMI; 2. Jagung PRG event MIR162 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pNOV1300; 3. Dua gen interes (Vip3Aa20 dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event MIR162 masih stabil sampai empat generasi silang balik (BC4F1); 4. Dua gen interes (Vip3Aa20 dan PMI) yang diintroduksikan ke jagung PRG event MIR162 diwariskan mengikuti hukum Mendel. II.6
Pustaka
Katie Pence. 2006. Stability of Vip3Aa20 and Phosphomannose Isomerase (PMI) Protein Expression Across Multiple Generations of Maize (Corn) Derived from Transformation Event MIR162. Protocol No. MIR162-05-02. Report No. SSB-002-06. Syngenta Biotechnology, Inc. Regulatory Science Post Office Box 12257 3054 East Cornwallis Road Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257. III.
Informasi Keamanan Pangan
III.1
Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial jagung PRG event MIR162 secara lengkap dilaporkan dalam company report No. 146-06, berjudul “Compositional Analysis of Grain and Forage Derived from Event MIR162 Hybrid Maize Grown During 2005 in the USA” (K. Launis, 2007). Dalam pengkajian ini, komposisi biji jagung dan bagian tanaman jagung lainnya (forage) PRG event MIR162 dibandingkan dengan jagung non PRG yang ditanam di Amerika Serikat pada tahun 2005. Sebanyak 65 komponen dianalisis dalam jagung ini, termasuk komponen proksimat, mineral, vitamin, asam amino, asam lemak, metabolit sekunder dan zat anti-gizi. Dari hasil analisis ternyata ditemukan beberapa komponen yang berbeda di antara jagung PRG event MIR162 dan jagung non PRG, seperti kadar abu, neutral detergent fiber (NDF), pati, beta karoten, piridoksin, dan alfa tokoferol dalam biji jagung; serta NDF dalam bagian tanaman jagung lainnya (forage). Meskipun demikian, perbedaan kisarannya kecil dan nilai rata-rata masih berada dalam kisaran komposisi yang dilaporkan dalam pustaka (ILSI, 2006 dan OECD, 2002). Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa jagung PRG event MIR162 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG.
III.2
Alergenisitas
Pengujian protein dilakukan terhadap protein rekombinan yang berasal dari tanaman jagung dan protein rekombinan yang berasal dari Escherichia coli. Pengujian
2
dilakukan di laboratorium Syngenta yang menerapkan Good Laboratory Practice (GLP). Kedua protein diekstrak dan dimurnikan dengan metoda yang disampaikan dengan rinci menggunakan kromatografi kolom. Karakterisasi protein Vip3Aa20 dan protein PMI meliputi uji imunoreaktivitas, berat molekul, status glikosilasi, dan sekuen asam amino N-terminal. Protein PMI yang diproduksi di E. coli berbeda pada 16 asam amino di N-terminal yang sifatnya non fungsional, namun demikian karakteristik biokimiawi, reaksi imunitas, aktivitas biologi dan reaksi enzimatik dari kedua protein (E. coli dan tanaman) sama. Pengujian kualitas dan kuantitas protein dilakukan dengan metoda Bradford, SDSPAGE, ELISA, Western blot, uji aktivitas enzimatik maupun bioassay, analisis glikosilasi dengan DIG detection kit, Edman degradation dan peptide map. Ekspresi protein Vip3Aa20 dan PMI dilaporkan pada berbagai jaringan dan berbagai tahap pertumbuhan. Jumlah protein ditemukan pada kisaran 12 – 148 µg/g (Vip3Aa20) dan 0,2 – 25 µg/g (PMI). Protein Vip3Aa20 dan PMI ditemukan stabil selama empat generasi. Uji bioinformatik menggunakan data alergen yang tersimpan di NCBI maupun Bank Data Syngenta dengan menggunakan program SWISSPROT, BLASTP FASTA dan FARRP Data Base. Data alergen meliputi berbagai jenis alergen diantaranya yaitu: alergen pangan, allergen respiratory, protein venom, allergen contact, gliadin, glutenin. Hasil analisis bioinformatik pembandingan sekuen menunjukkan protein Vip3Aa20 tidak memiliki sekuen homologi dengan protein toksin manapun kecuali dengan protein tanaman yang bersifat insektisidal spesifik. Hasil pengujian analisis sekuen menunjukkan bahwa protein PMI juga tidak memiliki kesamaan sekuen dengan protein toksin. Pada pengujian bioinformatik untuk analisis homologi sekuen protein Vip3Aa20 (789 asam amino) dilakukan pembandingan keseluruhan sekuen dan peptida 80 asam amino (Peptida 1 : asam amino 1-80, peptida ke-2 : 2-81 dst.), kemudian dilakukan pencarian 8 asam amino berurutan yang biasa ditemukan pada protein alergen. Hasilnya menunjukkan tidak ada homologi diantara keseluruhan protein, peptida 80 asam amino berurutan dan segmen 8 asam amino berurutan dengan data alergen. Hasil analisis homologi sekuen asam amino PMI dengan semua alergen yang diketahui menunjukkan bahwa secara keseluruhan tidak ditemukan homologi sekuen asam amino dengan protein alergen manapun. Terdapat 1 lokasi pada pembandingan homologi sekuen 8 asam amino yang mirip dengan suatu alergen alfa parvalbumin (110 asam amino dari katak Rana). Sekuen asam amino “DLSDKETT” yang mirip tersebut terdapat pada posisi 327-334 pada PMI jagung PRG event MIR162 dan posisi 77-84 pada sekuen alergen parvalbumin dari katak Indonesia yang menimbulkan alergi. Uji selanjutnya di laboratorium Hilger (penemu parvalbumin) menggunakan PMI dari E. coli rekombinan menunjukkan tidak ada reaktivitas silang diantara IgE serum pasien yang alergi terhadap katak dan PMI. Jadi protein PMI berbeda dari protein katak Rana dan tidak menimbulkan reaksi alergi. Uji bioinformatik hasilnya dilaporkan sebagai company report yaitu : 1. “Vip3Aa20 (Entrez Accession Number ABG20429): Assessment of Amino Acid Sequence Homology with Known Allergens“ oleh Brian Harper dan dilaporkan pada tanggal (study completion date) 16 Juli 2007. 2. “Phosphomannose Isomerase Protein (Entrez Acession No. AAA24109): Assessment of Amino Acid Sequence Homology with Known Toxins” oleh Brian Harper dilaporkan pada tanggal (study completion date) 13 Juli 2007.
3
Uji daya cerna protein Vip3Aa20 dalam simulated gastric fluid (SGF) menunjukkan bahwa dalam 1 menit protein Vip3Aa20 habis terdegradasi. Sedangkan uji daya cerna protein PMI dalam SGF (pH 1,2) dan SIF (pH 7,5) yang konsentrasinya diencerkan sampai 0,001 kali menunjukkan bahwa PMI terdegradasi segera baik dalam SGF maupun dalam SIF, sedangkan pada pengenceran 0,0001 kali setelah 10 menit inkubasi tidak terdeteksi adanya protein dan aktivitas PMI (terdegradasi sempurna). Uji stabilitas panas pada protein Vip3Aa20 menunjukkan bahwa protein ini tidak stabil pada suhu 65°C selama 30 menit, walaupun stabil pada suhu 37°C selama 30 menit. Hasil ini dilaporkan sebagai company report nomor SSB-039-06 berjudul “Effect of Temperature on The Stability of Vip3Aa20 Protein” (Cheryl Stacy, 2007). Uji stabilitas panas terhadap protein PMI menunjukkan imunoreaktivitas yang turun sampai 78,66% pada suhu 37,55°C dan 22% pada suhu 65°C, sedangkan pada suhu 95°C selama 30 menit, reaktivitasnya 0 (nol). Dapat disimpulkan bahwa protein PMI tidak stabil pada suhu 37°C walaupun stabil pada suhu 25°C selama 30 menit. Aktivitas enzim pada suhu 55°C selama 30 menit menurun sampai 40%; pada suhu 65°C menurun sampai 3%; dan pada 95°C menurun sampai 0% (hilang). Hasil uji stabilitas panas menyimpulkan bahwa protein Vip3Aa20 dan PMI tidak stabil terhadap pemanasan. Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein Vip3Aa20 dan protein PMI tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi. III.3
Toksisitas
Uji toksisitas oral akut terhadap protein Vip3Aa20 telah dilakukan pada mencit, dan hasilnya dilaporkan pada tanggal (study completion date) 22 Februari 2007 sebagai company report (MIR162 VIP3A-0106): “Single Dose Oral Toxicity Study in Mice” oleh C. Draper. Penelitian dilakukan di Syngenta Central Toxicology Laboratory, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, United Kingdom, SK10 4TJ. Hasil pengujian menunjukkan bahwa tidak ada mortalitas dan tanda-tanda klinis yang menyimpang pada hewan percobaan (mencit). Pemberian oral dengan dosis tunggal 1250 mg protein Vip3Aa20 per kg berat badan pada mencit, tidak memberikan pengaruh negatif. Oleh karena itu protein Vip3Aa20 termasuk golongan zat yang bersifat dianggap tidak toksik. Uji toksisitas oral akut terhadap protein PMI telah dilakukan pada mencit, dan hasilnya dilaporkan pada tanggal (study completion date) 11 Agustus 1999 sebagai company report yaitu “Phosphomannose Isomerase (Sample PMI-0198): Acute Oral Toxicity Study in Mice” oleh Janice O. Kuhn. Penelitian dilakukan di STILLMEADOW Inc., 12852 Park One Drive, Sugar Land, TX 77478. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pada dosis tunggal 5050 mg per kg berat badan mencit, protein PMI-0198 termasuk kedalam golongan zat yang bersifat practically non toxic. Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein Vip3Aa20 dianggap tidak toksik dan protein PMI termasuk dalam golongan zat yang tidak toksik (practically non toxic).
4
IV.
Kesimpulan
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen Vip3Aa20 yang berasal dari Bacillus thuringiensis strain AB88 dan gen PMI yang berasal dari Escherichia coli yang disisipkan dalam jagung PRG event MIR162; analisis kesepadanan substansial antara komposisi jagung PRG event MIR162 dengan jagung non PRG; serta alergenisitas dan toksisitas dari protein Vip3Aa20 dan protein PMI, disimpulkan bahwa jagung PRG event MIR162 dapat dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
5
