Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaksin Nobilis® rHVT-ILT I.
Pendahuluan Vaksin Nobilis® rHVT-ILT merupakan vaksin rekombinan aktif yang mengandung Herpesvirus Turkey (HVT) strain FC-126 dengan membawa sisipan gen gD dan gI dari virus Infectious Laryngotracheitis (ILT) strain USDA Challenge Lot No. 83-2. Virus HVT menginduksi kekebalan terhadap Marek’s Disease (MD), gen gD dan gI dari virus ILT yang disisipkan mengekspresikan protein gD dan gI yang akan menginduksi kekebalan terhadap virus ILT. Oleh karena itu, vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT dapat memberikan perlindungan ganda terhadap penyakit Marek dan ILT. Kelebihan penggunaan vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT dibandingkan dengan vaksin konvensional adalah mampu memberikan kekebalan hingga 60 minggu terhadap penyakit Marek dan ILT tanpa menimbulkan lesi pasca vaksinasi maupun infeksi laten. Pemberian vaksin ini tidak mengganggu penggunaan vaksin lain yang diberikan sebelum atau sesudahnya. Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT diproduksi oleh Intervet Inc. (Merck Animal Health) USA, yang di negara lain terdaftar dengan nama Innovax® - ILT atau Innofusion® - ILT atau Fowl Larynotracheitis - Marek’s Disease Vaccine Serotype 3, Live Marek’s Disease Vector. Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT akan dipasarkan oleh PT Intervet Indonesia untuk pengendalian dan penanggulangan penyakit Marek’s Disease (MD) dan Infectious Laryngotracheitis (ILT) pada ayam di Indonesia. Hingga saat ini, vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT telah terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale di berbagai negara, yaitu di USA (2007); Peru (2008); Argentina dan Bolivia (2009); Canada, Colombia, dan Nepal (2010); Brazil, Costa Rica, Kazakhstan, Mexico, Philippines, Rusia, dan Thailand (2011); Ecuador (2012); Belarus dan Ukraine (2013); Bangladesh dan South Africa (2014); Uni Eropa (2015). Berdasarkan Peraturan Pemerintah No.21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik, dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No.25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas, sifat genetik yang direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, hospes alami dari tetua jasad renik PRG dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II.
Informasi Jasad Renik PRG
II.1 Deskripsi Umum Jasad Renik PRG Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi Nobilis ® rHVT-ILT adalah Herpesvirus Turkey (HVT) sebagai inang yang membawa sisipan gen gD dan gI dari virus Infectious Laryngotracheitis (ILT) sebagai gen donor. II.2 Informasi Sifat Genetik Jasad Renik Tetua jasad renik PRG adalah HVT serotipe 3 strain FC-126 (NCBI n.a. AF291866) yang merupakan strain virus MD yang tidak patogen dan telah digunakan secara luas sebagai strain vaksin untuk pencegahan penyakit Marek (Calnek et al., 1997).
1
Donor gen vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT adalah virus ILT strain USDA Challenge Lot No. 83-2 dengan nomor akses pada bank data U28832, sedangkan gen yang disisipkan adalah gen gD dan gI, dengan nomor identitas protein gD AAC55100.1 dan gI AAC55101.1 (Wild et al., 1996). Kedua protein membran tipe I ini diekspresikan pada permukaan virion virus ILT dimana gD berfungsi sebagai mediator proses pelekatan dan masuknya virus ke dalam sel inang dan berperan penting dalam replikasi virus ILT, sedangkan gI berperan dalam penyebaran virus dari sel ke sel lainnya ( Pavlova et al., 2013). Studi efikasi vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT (Study Report 11. Efficacy testing by in ovo administration - Study One; dan Study Report 12. Efficacy testing by in ovo administration - Study Two) menunjukkan bahwa kedua protein ini merupakan kandidat vaksin yang baik. Lokasi penyisipan adalah di dalam open reading frame (ORF HVT-064) yang merupakan bagian non-esensial bagi HVT. Fragmen genom virus ILT yang mengandung gen glikoprotein D dan I disisipkan ke dalam genom HVT tanpa mengubah struktur gennya sebanyak satu kopi pada situs restriksi XhoI di posisi nukleotida 111,241 genom HVT. Penyisipan tersebut tidak memberikan dampak yang merugikan dan tidak mempengaruhi virus tetuanya, bahkan memberikan perlindungan tambahan terhadap penyakit ILT pada ayam. Pada studi back passage 5 kali baik secara in vitro pada chicken embryo fibroblast (CEF) maupun secara in vivo pada inang alami (ayam), terbukti gen gD dan gI dalam genom HVT FC-126 stabil secara fenotip menggunakan metode RT PCR, dan stabil pula secara genotip menggunakan metode southern hybridization. Hal ini menunjukkan tidak adanya kemungkinan virus menjadi virulen pada pemberian vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT (Report 7: Genetic and phenotypic stability of HVT/ILT-138 following back passage through the natural host).
II.3 Metode Konstruksi Genetik Strategi kloning yang digunakan dalam proses konstruksi rekombinan HVT/ILT-138 yang mengekspresikan protein heterolog gD dan gI virus ILT adalah metode rekombinasi homolog dari fragmen-fragmen overlapping genom HVT yang terdapat pada Report 13R/0279. Construction of the HVT Vector Vaccine Innovax-ILT (HVT/ILT-138).
Tahapan utama proses konstruksi dibagi menjadi tiga sebagai berikut: I.
Pembuatan pustaka DNA cosmid yang mengandung fragmen overlapping sub genom HVT strain FC-126 DNA HVT dipotong secara acak dan potongan-potongan DNA dengan ukuran 40 – 50 kpb diseleksi dengan metode gradien gliserol yang telah didemostrasikan oleh van Zijl et al. (1988). Fragmen DNA terpilih dibuat menjadi ujung papak (blunt ends) sebelum diligasi dengan vektor cosmid-pWE15 yang telah dibuat linear dengan pemotongan pada tapak enzim BamHI dan kedua ujungnya dibuat menjadi papak (blunt ends). Seleksi menggunakan probe spesifik, pelabelan dengan sistem non-radioaktif, didapatkan tiga cosmid yang berisikan fragmen genom target yang tidak mengandung tapak enzim restriksi NotI, yaitu cosmid-pWE15 407-32.2C3, 407-32.5G6, 40732.1C1. Cosmid-pWE15 407-32.1C1 selanjutnya, dipakai untuk menghasilkan plasmid-pNEB193 672-01.A40, 672-01.C40 mengapit plasmid vektor homolog pNEB193 711-92.1A yang mengandung sisipan gen penyandi gD dan gI virus ILT pada ORF HVT064. Dua fragmen genom HVT dimana masing-masing memiliki dua tapak enzim restriksi NotI dihasilkan dari pemotongan dengan enzim restriksi BamHI. Selanjutnya, kedua fragmen tersebut diklon pada vektor kloning yang berbeda. Fragmen BamHI#1 yang memiliki ukuran 29 kpb diklon pertama kali pada cosmid-pWE15 pada tapak unik BamHI, lalu disubklon pada cosmid-pSY1005 melalui tapak enzim restriksi BamHI menghasilkan cosmid-pSY1005 415-09.BA1. Sedangkan fragmen BamHI#II dengan
2
ukuran 26 kpb diligasi pada tapak unik BamHI milik plasmid-pSP64 menghasilkan plasmid-pSP64 172.07.BA2. II. Pembuatan vektor homolog yang mengandung sisipan gen pengkode gD dan gI virus ILT Vektor penyisipan HVT disiapkan dengan melakukan ligasi fragmen genom HVT strain FC-126 sebesar 8.6 kpb, merupakan hasil pemotongan dengan enzim restriksi AscI pada Cosmid-pWE15 407-32.1C1, pada tapak AscI dari turunan plasmid antara pNEB193 (586-36.6) untuk menghasilkan plasmid 633-93.2. Modifikasi dilakukan pada plasmid ini dengan penyisipan sekuen pendek PacI pada tapak XhoI (posisi 111,241 pada genom HVT, AF291866) menghasilkan plasmid 654-45.1. Sekuen pendek tersebut mengandung tapak PacI yang digunakan untuk menyisipkan dan mengekspresikan gen asing dimana tapak pengenalan PacI diapit dengan tapak restriksi XhoI. Fragmen genom ukuran 7,971 pb dari unique short region (US) virus ILT merupakan hasil pemotongan dengan enzim restriksi Asp7181 yang mengandung gen gD dan gI. Fragmen ini diklon pada tapak Asp7181(KpnI) pUC19 menghasilkan plasmid 45348.8A. Pemotongan menggunakan kombinasi enzim restriksi SalI dan HindIII pada plasmid 453-48.8A didapatkan fragmen dengan ukuran 3,563 pb dimana gen gD dan gI ada di dalamnya. Fragment SalI-HindIII diklon pada tapak restriksi yang sama pada turunan plasmid antara pSP64 (546-93.A3) menjadi plasmid 684-40.B1. Tahapan akhir ialah fragmen hasil pemotongan PacI plasmid 684-40.B1, yang mengandung gen pengkode gD dan gI virus ILT, disisipkan pada vektor penyisipan HVT plasmid 654-45.1 di tapak PacI sehingga menghasilkan vektor homolog 711.92.A1 yang siap pakai untuk konstruksi virus rekombinan HVT/ILT. III. Konstruksi virus rekombinan dilakukan dengan cara transfeksi kultur sel chicken embryo fibroblast (CEF) dengan campuran cosmid yang mengandung fragmen genom HVT yang saling overlap Proses rekonstruksi diawali dengan menyiapkan campuran cosmid sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
407-32.2C3 dipotong dengan NotI 172-07.BA2 dipotong dengan BamHI 407-32.5G6 dipotong dengan NotI 672-07.C40 dipotong dengan NotI 672-01.A40 dipotong dengan Notl 711-92.1A uncut/dalam keadaan sirkular 415-09.BA1 dipotong dengan BamHI.
Campuran cosmid ditransfeksikan dengan sistem lipofection ke dalam sel CEF. Seleksi dan purifikasi virus rekombinan yang berasal dari plak yang terbentuk dilakukan sebanyak tiga kali sehingga diperoleh virus vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT. II.4 Karakter Modifikasi Genetik Penyisipan sekuen DNA penyandi gD dan gI virus ILT ke dalam genom HVT strain FC126 tidak memberikan dampak yang merugikan atau tidak mempengaruhi virulensi virus tetuanya (SID, Starting Material Not in a Pharmacopoeia 2.C.2.1.a.Source). Hal ini ditunjukan dari hasil pengujian vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT yang diinokulasikan secara subkutan pada ayam berumur satu hari bahwa tidak terlihatnya perbedaan yang berarti dengan virus tetuanya (HVT strain FC-126) baik pada pola persebaran virus pada jaringan (jaringan tropisme) maupun pada kemampuan replikasi virus (Report 13R/0201. Dissemination of InnovaxILT in One Day Old SPF Chicken Vaccinated Via The Subcutaneous Route).
3
Penyisipan gen gD dan gI virus ILT sebaliknya, memberikan nilai tambah untuk penggunaan vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT sebagai vaksin, yaitu berupa perlindungan terhadap penyakit Infectious Laryngotracheitis selain penyakit Marek (Vagnozzi et al., 2012). II.5 Kemungkinan terjadinya gen yang disisipkan pada jasad renik PRG untuk vaksin hewan dipindahkan ke organisme lain Gen yang disisipkan pada PRG Nobilis® rHVT-ILT tidak dapat dipindahkan ke inang/organisme lain, karena HVT tidak berintegrasi dengan genom ayam. Berdasarkan hasil pencarian BLAST (http:/VT/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) tidak ditemukan homologi dengan genom ayam dan organisme lain. Dengan demikian kemungkinan terjadinya integrasi genom HVT atau sekuens sisipan ILTV pada genom ayam melalui rekombinasi homolog persentasenya sangat kecil. II.6 Kesimpulan Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa: a. Ekspresi dari gen interes (gen gD dan gI dari virus ILT) yang disisipkan dalam genom HVT tidak mengubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberikan nilai tambah berupa perlindungan ganda terhadap penyakit Marek dan ILT. b. Virus rekombinan HVT-ILT mengandung satu kopi gen gD dan gI yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip. c. Gen gD dan gI yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-ILT) tidak mungkin menyebar atau pindah ke organisme lain.
4
III.
Informasi Keamanan Lingkungan
III.1 Kemampuan Penyebaran Jasad Renik Jasad renik PRG Nobilis® rHVT-ILT memiliki sifat yang sama dengan virus HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan dalam ekskreta ayam sehingga tidak menimbulkan risiko buruk terhadap lingkungan (Report 13R/0201. Dissemination of Innovax-ILT in one day old SPF chickens vaccinated via the subcutaneous route).
III.2 Informasi Cakupan Inang Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin Jasad renik tetua vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT ini adalah virus HVT strain FC-126. Inang alami dari virus HVT adalah kalkun (Calnek et al., 1997). III.3 Informasi Kajian Molekuler Modifikasi genetik HVT strain FC-126 dengan penyisipan gen gD dan gI dari virus ILT. Lokasi penyisipan adalah di dalam open reading frame (ORF HVT-064) yang merupakan bagian non-esensial bagi HVT. Tujuan dari modifikasi gen ini adalah untuk membuat vaksin PRG yang mengandung virus HVT rekombinan yang mengkespresikan protein gD dan gI virus ILT, sehingga penggunaan vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT dapat menginduksi kekebalan dan memberikan perlindungan ganda terhadap penyakit Marek dan ILT. Virus rekombinan HVT-ILT mengandung satu kopi gen gD dan gI virus ILT yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip, serta tidak ada kemungkinan penyebaran atau pemindahan gen gD dan gI yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-ILT) ke organisme lain sehingga aman terhadap lingkungan. Penanda yang dapat dipakai untuk mengidentifikasi jasad renik PRG ini adalah sekuens fragmen genom HVT yang mengapit gen gD dan gI virus ILT. Teknik untuk mengidentifikasi sekuens ini dapat menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sekuensing DNA dengan menggunakan primer (Report 13R/0280. Southern blot characterization of Innovax-ILT) sebagai berikut: No.
Nama Primer
Sekuens Primer
1
Left gD-Fw (1)
5’-caacacggtcttcaaagcaa-3’
2
Left gD –Rev (2)
5’-cgctgctcttccacactgta-3’
3
Right gI –Fw (3)
5’-atcctctcaaaaggggcagt-3’
4
Right gI-Rev (4)
5’-gatgtcaccctaatgccaca-3’
5
gDgI-Fw (5)
5’-gctttgtacgcaacgctatg-3’
6
gD-gI –Rev (6)
5’-gatccacgccattttctagc-3’
Panjang produk 894 pb 889 pb 2000 pb
III.4 Kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG vaksin terhadap lingkungan Hasil analisis BLAST nukleotida dari gen gD dan gI menunjukkan homologi sekuens genom organisme lain tidak ditemukan, sehingga kemungkinan transfer gen ke organisme lain tidak mungkin. Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT tidak membentuk spora karena tetua dari vaksin ini adalah temasuk golongan virus. Hasil studi menunjukkan bahwa tidak ada penyebaran virus melalui kontak antara ayam yang divaksinasi dan ayam yang tidak divaksinasi (Report 5. Shed and Spread of Turkey Herpesvirus Vectored Infectious Laryngotracheitis Vaccine, HVT/ILT-138 in Chickens).
5
Virus vaksin dapat menginfeksi inang alamiahnya yaitu kalkun, namun sebagaimana sifat alami tetuanya virus ini tidak bersifat patogen dan tidak berisiko menyebar ke spesies lain maupun ke lingkungan. Kesimpulan 1. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan. 2. Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan. 3. Berdasarkan kajian stabilitas genotip dan fenotip, jasad renik PRG dalam vaksin Nobilis® rHVT-ILT dinyatakan stabil. 4. Apabila telah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT yang berada di wilayah teritori Indonesia. 5. Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam sebelum memperoleh Sertifikat Keamanan Lingkungan dari Kementerian Lingkungan Hidup dan Kehutanan. 6. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan lingkungan terhadap vaksin PRG Nobilis® rHVT-ILT perlu dikaji ulang. Pustaka 1
Calnek BW, Barnes JH, Beard CW, McDougald LR, Saif YM. 1997. Disease of Poultry: Marek’s Disease. Iowa State University Press: USA. Hal. 369–413. 2 Wild MA, Cook S, Cochran M. 1996. A genomic map of infectious laryngotracheitis virus and the sequence and organization of genes present in the unique short and flanking regions. Virus Genes 12:2, 107-116. 3 Pavlova S, Veits J, Mettenleiter TC, Fuchs W. 2013. Identification and functional analysis of membrane proteins gD, gE, gI, and pUS9 of infectious laryngotracheitis virus. Avian Diseases 57:416-426. 4 SID Innovax-ILT. Intervet Schering-Plough, 2008. Report 11. Efficacy testing by in ovo administration (study one). Hal. 291-299. 5 SID Innovax-ILT. Intervet Schering-Plough, 2008. Report 12. Efficacy testing by in ovo administration (study two). Hal. 338-344. 6 SID Innovax-ILT. Intervet Schering-Plough, 2008. Report 7: Genetic and phenotypic stability of HVT/ILT-138 following backpassage through the natural host. 168-190. 7 Report No. 13R/0279. Construction of the HVT vector vaccine Innovax-ILT (HVT/ILT-138). Hal. 1-21. 8 Starting materials not in a pharmacopoeia, Standard International Dossier (SID) INNOVAX-ILT. Intervet/Schering-Plough Animal Health, 2008. Hal: 20-23. 9 Report No. 13R/0201. Dissemination of Innovax-ILT in one day old SPF chickens vaccinated via the subcutaneous route. Intervet R&D Laboratories. 2014. 10 Vagnozzi A, Zavala G, Riblet SM, Mundt A, Garcia M. 2012. Protection induced by commercially available live-attenuated and recombinant viral vector vaccines against infectious laryngotracheitis virus in broiler chickens. Avian Pathology. Vol 4(1): 21-31. 11 Report No. 13R/0280. Southern blot characterization of Innovax-ILT (HVT/ILT-138). Hal. 1-11. 12 SID Innovax-ILT. Intervet Schering-Plough, 2008. Report 5. Shed and spread of HVT/ILT-138 in chickens. Hal. 157-162.
6
