Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai PRG event MON 87701 I.
Pendahuluan
Kedelai PRG event MON 87701 merupakan kedelai produk rekayasa genetik dari perusahaan Monsanto yang memproduksi protein Cry1Ac dan diklaim dapat memberikan perlindungan dari kerusakan akibat hama serangga Lepidoptera. Kapas Bollgard dan Bollgard II, yang menghasilkan protein Cry1Ac, telah digunakan secara komersial di Amerika Serikat selama lebih dari satu dekade untuk mengendalikan hama Lepidoptera. Protein Cry1Ac yang diproduksi oleh kedelai PRG event MON 87701 mempunyai identitas asam amino 100% sama dengan protein Cry1Ac kapas Bollgard, kecuali pada tambahan 4 asam amino di N-terminus. Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM HK.03.1.23.03.12.1563 Tahun 2012 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat Kepala Badan POM kepada Ketua Komisi Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik Nomor SD.11.05.1.52.04.11.03590 tanggal 13 April 2011 perihal Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Kedelai PRG event MON 87701, TTKH telah melakukan pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event MON 87701 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini. Kedelai PRG event MON 87701 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 5 negara yaitu Amerika Serikat (2010), Australia (2010), Kanada (2010), Selandia Baru (2010), Meksiko (2010), dan Jepang (2011). II. Informasi Genetik II.1 Elemen Genetik Kedelai PRG event MON 87701 mengandung satu gen interes yaitu gen Cry1Ac. Gen Cry1Ac memproduksi protein Cry1Ac yang bertanggung jawab pada ketahanan terhadap serangga hama Lepidoptera. Promoter yang digunakan adalah RbcS4 yang mengkode ribulosa sub unit kecil 1A carboxylase-1,5 biphosphate, CTP1 adalah sekuen target yang mengkodekan peptida transit pada Arabidopsis RbcS4 untuk mengarahkan protein Cry1Ac ke kloroplas; dengan terminator gen Sphas1 (7S α') yang mengkode protein penyimpanan (storage protein) benih 7S α', conglycinin, untuk menghentikan transkripsi dan mengarahkan poliadenilasi pada mRNA. II.2 Sumber Gen Interes Gen Cry1Ac berasal dari Bacillus thuringiensis yang telah digunakan sebagai pestisida hayati dengan riwayat penggunaan aman oleh petani selama tiga puluh tahunan. Gen Cry1Ac juga digunakan pada tanaman kapas PRG event MON531/757/1076 yang tahan serangga hama dan telah dikomersialkan secara global sejak tahun 1996. Promoter dari gen RbcS4 berasal dari Arabidopsis thaliana, sekuen target CTP1 berasal dari Arabidopsis thaliana, dan terminator dari gen Sphas1 (7S α') berasal dari kedelai (Glycine max). II.3 Sistem Transformasi
Perakitan kedelai PRG event MON 87701 dilakukan melalui teknik transformasi dengan mediasi vektor A. tumefaciens pada eksplan jaringan meristem yang dipotong dari embrio-embrio biji kedelai non PRG A5547. Plasmid vektor yang digunakan untuk merakit kedelai PRG event MON 87701 adalah PV-GMIR9. Vektor PV-GMIR9, berisi dua set sekuen left dan right border yang mengapit masingmasing dua DNA transfer (T-DNA I dan T-DNA II) untuk memfasilitasi transformasi. II.4 Stabilitas Genetik Hasil analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari kedelai PRG event MON 87701 dengan Southern blot fingerprint menunjukkan bahwa gen interes masih stabil sampai lima generasi dan dapat dideteksi dengan melihat adanya pita gen interes dalam genom kedelai PRG event MON 87701. Selain itu, berdasarkan analisis Southern blot fingerprint ditemukan hasil yaitu tidak dideteksinya elemen T-DNA II dan sekuen backbone plasmid PV-GMIR9. Stabilitas genetik pewarisan sifat pada kedelai PRG event MON 87701 mengikuti prinsip segregasi Mendel. Data dari analisis Southern blot menunjukkan bahwa kedelai PRG event MON 87701 mengandung satu kopi gen (Cry1Ac). Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa: 1. kedelai PRG event MON 87701 mengandung satu kopi gen (Cry1Ac); 2. kedelai PRG event MON 87701 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi PV-GMIR9; 3. gen interes (Cry1Ac) yang diintroduksikan ke kedelai PRG event MON 87701 masih stabil sampai lima generasi; dan 4. gen interes (Cry1Ac) yang diintroduksikan ke kedelai PRG event MON 87701 diwariskan mengikuti hukum Mendel. III. Informasi Kemanan Pangan III.1 Kesepadanan Substansial Pengkajian kesepadanan substansial dari kedelai PRG event MON 87701 dilakukan dengan mempelajari dokumen berikut: (1) “Composition Analyses of Forage and Seed Collected from MON 87701 Grown in United States during 2007” (Kristina H. Berman, Susan G. Riordan, and Roy Sorbet. Company Report No. MSL0021413, November 12, 2008), dan (2) “Compositions of Seed, Forage, and Processed Fractions from Insect-Protected Soybean MON 87701 are Equivalent to Those of Conventional Soybean” (Kristina H. Berman, George G. Harrigan, Susan G. Riordan, Margaret A. Nemeth, Christy Hanson, Michelle Smith, Roy Sorbet, Eddie Zhu, and William P. Ridley. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 11360–11369). Materi yang digunakan untuk uji kesepadanan substansial adalah tanaman dan biji kedelai PRG event MON 87701, kedelai non PRG A5547 sebagai kontrol dan empat kedelai komersial konvensional yang berbeda. Kedelai tersebut ditanam di lima daerah di Amerika Serikat (AS) selama masa tanam tahun 2007 dan di Argentina selama masa tanam tahun 2007-2008.
Biji dan bagian vegetatif tanaman kedelai untuk pengkajian kesepadanan substansial ini dipanen di AS di daerah Baldwin County, Alabama; Jackson County, Arkansas; Clarke County, Georgia; Jackson County, Illinois; dan Wayne County, North Carolina; dan di Argentina di provinsi Buenos Aires (Tacuari, Gahan, dan Berdier) serta di provinsi Cordoba (Alejo Ledesma) dan Santa Fe (San Francisco). Sampel biji dan bagian vegetatif tanaman kedelai dianalisis di laboratorium EPL BioAnalytical Services (EPL-BAS), 9095 W. Harristown Blvd., Niantic, IL 62551 dan Certus International, Inc., 1422 Elbridge Payne Road, Suite 200, Chesterfield, MO 63017. Parameter yang dianalisis untuk biji kedelai adalah kadar proksimat (air, protein, lemak, dan abu), karbohidrat by difference, acid detergent fiber (ADF), neutral detergent fiber (NDF), komposisi asam amino dan asam lemak, inhibitor tripsin, asam fitat, lektin, isoflavon, vitamin E, rafinosa, dan stakhiosa. Parameter yang dianalisis untuk toasted defatted (TD) meal adalah kadar proksimat (air, protein, lemak, dan abu), karbohidrat by difference, ADF, NDF, komposisi asam amino, asam fitat, dan inhibitor tripsin. Parameter yang dianalisis untuk refined bleached deodorized (RBD) oil adalah komposisi asam lemak dan vitamin E. Parameter yang dianalisis untuk isolat protein adalah komposisi asam amino dan kadar air. Parameter yang dianalisis untuk lesitin kasar adalah fosfatidilkolin dan fosfatidiletanolamin. Sedangkan parameter yang dianalisis untuk bagian vegetatif tanaman kedelai adalah kadar proksimat (air, protein, lemak, dan abu), karbohidrat by difference, ADF dan NDF. Pada umumnya hasil analisis biji dan bagian vegetatif tanaman kedelai untuk sampel yang diperoleh dari produksi tahun 2007 di AS, menunjukkan bahwa kedelai PRG event MON 87701 dengan kontrol tidak berbeda nyata (p>0,05). Demikian juga untuk yang ditanam di Argentina secara umum tidak ada perbedaan yang nyata (p>0,05) di antara kedelai PRG event MON 87701 dengan kontrol. Untuk yang ditanam di AS terdapat perbedaan nilai karbohidrat, protein, sembilan asam amino, asam lemak behenat (C22:0), inhibitor tripsin, daidzein dan vitamin E. Demikian juga untuk yang ditanam di Argentina terdapat perbedaan nilai triptofan, asam linolenat (C18:3), stakhiosa, dan vitamin E, serta untuk TD meal dan RBD oil. Walaupun demikian perbedaan nilai tersebut kecil dan masih termasuk dalam kisaran rata-rata pengujian kedelai non PRG komersial. Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial di atas dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON 87701 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG. III.2 Alergenisitas III.2.1 Analisis Homologi dengan Protein Alergen Analisis homologi struktur protein Cry1Ac dengan protein alergen dilakukan dengan dua algoritma pencarian yaitu program FASTA dengan database alergen dari Food Allergy Research and Resource Program Database (FARRP) dan database AD_2010. Hasil analisis bioinformatika ini menunjukkan tidak adanya kemiripan struktural antara protein Cry1Ac dengan toksin, alergen, atau protein-protein bioaktif lain yang mungkin berbahaya bagi kesehatan manusia atau hewan yang termuat pada berbagai database protein (AD8, TOXIN6) (Bioinformatics Evaluation of the Cry1Ac Protein Present in MON 87701 Soybean Utilizing the AD8, TOXIN6, and
PROTEIN Databases oleh Renee Girault. J. Scott McClain, Ph.D. December 12, 2008). Analisis yang dilakukan mencakup pembandingan sekuen asam amino yang menyusun protein Cry1Ac, struktur sekunder, tertier dan peptida 8 asam amino yang berpeluang sebagai epitop alergenik dengan protein alergen yang ada di database AD8. Hasil keseluruhan studi menunjukkan bahwa tidak ada homologi struktural antara protein Cry1Ac dengan protein lain yang bersifat alergenik terhadap manusia dan hewan. III.2.2 Analisis Konsentrasi Protein Cry1Ac Kandungan protein Cry1Ac sangat kecil, tidak lebih dari 0,0012% dari total protein kedelai PRG event MON 87701. Kandungan protein Cry1Ac di dalam berbagai jaringan kedelai PRG event MON 87701 yang relevan dengan penilaian risiko diuji dengan metoda ELISA yang tervalidasi (Assessment of the Cry1Ac Protein Levels in Soybean Tissues Collected from MON 87701 Produced in U.S. Field Trials During 2007 oleh Katherine E. Niemeyer, Andre Silvanovich, Ph.D. August 28, 2008). III.2.3 Analisis Stabilitas Protein Analisis ini menggunakan protein Cry1Ac yang diproduksi E. coli. Perbandingan protein Cry1Ac yang diproduksi kedelai PRG event MON 87701 dengan protein Cry1Ac yang diproduksi E. coli untuk keperluan analisis mengkonfirmasikan kesamaan kedua protein. Kepekaan protein terhadap degradasi proteolitik dievaluasi dengan simulated gastric fluid (SGF) yang mengandung pepsin dan simulated intestine fluid (SIF) yang mengandung pankreatin. Protein Cry1Ac yang diproduksi E. coli diuji dengan SDSPAGE dan Western blot. Hasilnya menunjukkan bahwa pada inkubasi selama 30 detik dalam SGF, 99,7% protein Cry1Ac terhidrolisis. Perbandingan dengan kontrol (dapar tanpa SGF dan SIF) mengkonfirmasi bahwa penguraian protein Cry1Ac adalah akibat aktivitas proteolitik pepsin yang terdapat di dalam SGF dan bukan akibat ketidakstabilan protein ketika diinkubasi pada kondisi pH ~1,2 suhu ~37 °C. Fragmen protein sebesar ~4 kDa terlihat selama pencernaan namun terhidrolisis menjadi fragmen yang lebih kecil, yaitu ~3,5 kDa. Analisis Western blot menunjukkan bahwa protein Cry1Ac tercerna pada inkubasi 30 detik di dalam SGF. Fragmen ~4 kDa selanjutnya terdegradasi sempurna dalam waktu 30 detik pada simulasi cairan usus SIF yang mengandung pankreatin. Pengujian stabilitas protein Cry1Ac terhadap pemanasan dilakukan dengan Western blot. Hasil pengujian menunjukkan bahwa protein Cry1Ac yang dipanaskan memiliki tingkat imunodetektabilitas yang berkurang secara signifikan hingga di bawah batas deteksi (LOD, limit of detection). Hal ini mengimplikasikan terjadinya penurunan signifikan reaktivitas imunologi protein Cry1Ac oleh panas. (Assessment of the In Vitro Digestibility of the Cry1Ac Protein in Simulated Gastric and Simulated Intestinal Fluids, oleh Brian E. Goertz, Erin Bell, Ph.D., and Elena A. Rice, Ph.D. December 16, 2008). Berdasarkan hasil pengkajian alergenisitas kedelai PRG event MON 87701 dapat disimpulkan bahwa protein Cry1Ac tidak menunjukkan adanya potensi yang dapat menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas Kedelai PRG event MON 87701 mengandung gen Cry1Ac yang mengekspresikan protein Cry1Ac, yang bersifat toksik terhadap hama target Lepidoptera, tetapi tidak toksik terhadap mamalia. US Environmental Protection Agency (EPA, 1998) telah mengevaluasi potensi dampak protein Cry1Ac pada organisme non target, termasuk mamalia, burung, ikan, serangga bermanfaat, hewan laut, dan tumbuhan. Hasil evaluasi menyimpulkan bahwa protein itu tidak menimbulkan risiko dampak negatif terhadap organisme-organisme tersebut. III.3.1 Perbandingan Homologi Protein Cry1Ac dengan Protein Toksin Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa protein Cry1Ac yang terkandung dalam kedelai MON 87701 tidak homolog dengan protein toksin (R Girault & JS McClain, 2008. Bioinformatics Evaluation of the Cry1Ac Protein present in MON 87701 Soybean Utilizing the AD8, TOXIN6, and PROTEIN Databases. Monsanto Company, Regulatory Product Characterization Team, 800 North Lindbergh Blvd, St Louis, MO 63167). Potensi kemiripan struktural yang dimiliki oleh protein Cry1Ac dan sekuen-sekuen dalam database protein toksin dievaluasi dengan menggunakan perangkat FASTA. Hasil analisis bioinformatika menunjukkan tidak adanya kemiripan yang relevan secara struktural antara protein Cry1Ac dan setiap toksin yang diketahui atau protein-protein lain yang aktif secara biologis yang mungkin berbahaya bagi kesehatan manusia atau hewan. III.3.2 Pengkajian Toksisitas Akut Pengujian toksisitas akut terhadap protein Cry1Ac pada mencit (CD-1 mice) telah dilakukan dan hasilnya dilaporkan sebagai company report (Smedley JW, 2009. An Acute Toxicity Study of Cry1Ac Protein Administered by the Oral (Gavage) Route to Mice. Monsanto Study Report, CRO-2007-325). Bahan uji berupa protein murni Cry1Ac yang dihasilkan oleh E. coli, dalam bentuk larutan untuk percobaan tahap I dan II. Berdasarkan laporan penelitian (Erin Bell, Kathleen S. Crowley, Joshua P. Uffman, and Elena A. Rice, 2008. Characterization of the Cry1Ac Protein Purified from the Harvested Seed of MON 87701 Soybean and Comparison of the Physicochemical and Functional Properties of the MON 87701Produced and E. coli-Produced Cry1Ac Proteins, Monsanto Study Report, Reg-07270 MSL No.0021146), protein murni Cry1Ac yang diperoleh dari E. coli sepadan dengan protein Cry1Ac kedelai MON 87701. Bahan yang digunakan sebagai kontrol adalah Bovine Serum Albumin (BSA) dalam bentuk larutan. Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit CD-1 jantan (berumur sekitar 8 minggu, dengan berat badan sekitar 28,4 - 33, 4 ram) dan mencit CD-1 betina (berumur sekitar 10 minggu dengan berat badan sekitar 23,1 - 29,4 gram). Untuk pengujian tahap I, digunakan mencit yang berasal dari Charles River Laboratories, St Constant, Quebec. Untuk pengujian tahap II, digunakan mencit yang berasal dari Charles River Laboratories, Portage, Michigan. Sebelum digunakan dalam pengujian, semua mencit dibiarkan beradaptasi dengan lingkungan laboratorium selama minimum 5 hari. Mencit dipelihara secara individual dalam kandang stainless steel selama periode aklimatisasi dan selama periode pengujian, sesuai dengan protokol USDA Animal Welfare Act (9 CFR, Parts 1, 2, and 3) dan the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [NRC (National
Research Council), 1996. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy ress, Washington, DC]. Ransum (PMI Nutrition International Certified Rodent Chow®) diberikan secara ad libitum selama pengujian berlangsung, kecuali pada waktu hewan dipuasakan yaitu 2 - 3 jam sebelum diberikan larutan uji atau kontrol. Air minum berupa air keran yang mengalami perlakuan reverse osmosis dan irradiasi ultraviolet, diberikan secara ad libitum. Pada pengujian tahap I, digunakan 20 ekor mencit jantan dan 20 ekor mencit betina, yang dibagi ke dalam 2 kelompok yaitu kontrol dan perlakuan. Kelompok kontrol dicekok dengan larutan BSA dosis 1280 mg prot/kg BB. Cekokan diberikan dalam 2 tahap dengan jarak 4 jam dan volume 33,3 ml/kg BB. Kelompok perlakuan dicekok dengan larutan protein Cry1Ac dosis 1290 mg prot/kg BB. Cekokan diberikan dalam 2 tahap seperti kelompok kontrol. Pemberian bahan uji dan kontrol dilakukan pada hari ke 0, dan percobaan berlangsung selama 14 hari. Pada pengujian tahap II, digunakan 20 ekor mencit jantan, yang dibagi ke dalam 2 kelompok yaitu kontrol dan perlakuan. Kelompok kontrol dicekok dengan larutan BSA dosis 1620 mg prot/kg BB. Kelompok perlakuan dicekok dengan larutan protein Cry1Ac dosis 1460 mg prot/kg BB. Prosedur lainnya sama seperti pada pengujian tahap I. Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati, baik pada tahap I maupun tahap II, (2) tidak terdapat tanda-tanda kelainan klinis pada mencit, (3) tidak ditemukan perbedaan nyata dalam hal konsumsi ransum dan perubahan berat badan antara kelompok kontrol dan perlakuan, dan (4) tidak ditemukan adanya kelainan organ dalam mencit.
III.3.3 Studi Pemberian Pakan pada Ayam Broiler Studi pemberian pakan telah dilakukan pada ayam broiler dan hasilnya dilaporkan sebagai company report (Stephen W Davis, 2009. Comparison of Broiler Performance and Carcass Parameters When Fed Diets Containing Soybean Meal Produced from MON 87701, Control, or Reference Soybean, Monsanto Study No. CQR-08-032). Bahan uji adalah bungkil kedelai dari MON 87701, sedangkan sebagai kontrol digunakan bungkil kedelai A5547. Sebagai pembanding digunakan bungkil kedelai Anand, Ozark, NK S38-T8, H437, NC+2A86, dan NK 25-J5. Selanjutnya bungkil kedelai tersebut dicampurkan sampai homogen dengan pakan ayam. Hewan percobaan yang digunakan adalah anak ayam broiler jantan dan betina komersial DOC (Cobb x Cobb 500) yang diperoleh dari Hoover’s Hatchery, Inc. Rudd, IA. Disain percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut: pada hari ke 0, 800 ekor ayam broiler jantan dan betina secara acak dibagi menjadi 8 kelompok, sesuai dengan perlakuan. Percobaan dilaksanakan selama 42 hari, periode starter hari ke 0 sampai ke 20, periode grower hari ke 21 sampai ke 42. Pakan dan air diberikan secara ad libitum. Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (a) berat badan ayam per ekor pada hari ke 0 rata-rata 38,25 gram (MON 87701) dan 38,46 gram (kontrol dan pembanding); (b)
berat badan ayam per ekor pada hari ke 42 antara kelompok perlakuan dan kontrol tidak berbeda nyata yaitu rata-rata 2,54 kg (MON 87701) dan 2,52 kg (kontrol dan pembanding). (c) konsumsi pakan rata-rata adalah 3,79 kg (MON 87701) dan 3,85 kg (kontrol dan pembanding); (d) konversi pakan rata-rata mencapai 1,52 kg/kg (MON 87701) dan 1,55 kg/kg (kontrol dan pembanding). Selama pengujian terjadi kematian pada ayam semua kelompok dengan rata-rata 2,6 % selama 7 hari pertama percobaan; dan rata-rata 1,3 % selama hari ke 7 sampai hari ke 42. Penyebab kematian awal diidentifikasi karena dehidrasi dan infeksi bakteri yang umum terjadi pada produksi ayam komersial dan tidak terkait dengan pemberian pakan. Penyebab kematian setelah hari ke 7 disebabkan karena gejala kematian mendadak dan ascites yang umum terjadi pada ayam broiler. Tidak terdapat perbedaan nyata secara statistik untuk semua parameter uji antara kelompok perlakuan, kelompok kontrol dan kelompok pembanding. Ayam dari semua kelompok berada dalam kondisi kesehatan yang baik. Berdasarkan hasil studi pemberian pakan pada ayam broiler dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON 87701 dianggap mempunyai nilai nutrisi sebanding dengan kedelai kontrol dan pembanding. Dari hasil pengkajian toksisitas di atas dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON 87701 yang mengandung protein Cry1Ac tidak bersifat toksik.
IV. Kesimpulan Atas dasar hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut: 1. Hasil pengkajian informasi genetik diketahui bahwa kedelai PRG event MON 87701 mengandung satu kopi gen Cry1Ac dan stabil sampai lima generasi. 2. Hasil pengkajian keamanan pangan disimpulkan bahwa: a. kedelai PRG event MON 87701 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG; b. kedelai PRG event MON 87701 yang mengandung protein Cry1Ac tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan c. kedelai PRG event MON 87701 yang mengandung protein Cry1Ac termasuk ke dalam golongan bahan yang tidak toksik. 3. TTKH menilai bahwa kedelai PRG event MON 87701 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan. 4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan kedelai PRG event MON 87701 perlu dikaji ulang. 5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik kedelai PRG event MON 87701 dari peredaran.
6. Kedelai PRG event MON 87701 tidak boleh digunakan sebagai pakan ternak sampai memperoleh sertifikat keamanan pakan dan tidak boleh dibudidayakan sampai memperoleh sertifikat keamanan lingkungan. V. Daftar Acuan 1. Arackal, S.M., K.R. Lawry, Z. Song, J.R. Groat, J.F. Rice, J.D. Masucci, Q. Tian. 2009. Amended Report for MSL0021167: Molecular Analysis of Insect-Protected Soybean MON 87701, Monsanto Study Report MSL0021960. 2. Bell, E., K.S. Crowley, J. P. Uffman and E.A. Rice. 2008. Characterization of the Cry1Ac Protein Purified from the Harvested Seed of MON 87701 Soybean and Comparison of the Physicochemical and Functional Properties of the MON 87701-Produced and E. coli-Produced Cry1Ac Protein. Monsanto Study Report, MSL0021146 3. Betz, F.S., B.G. Hammond and R.L. Fuchs. 2000. Safety and Advantages of Bacillus thuringiensis-protected Plants to Control Insect Pests. Regulatory Toxicology and Pharmacology 32:156-173. 4. Girault R. and J. S. McClain. 2008. Bioinformatics Evaluation of the Cry1Ac Protein Present in MON 87701 Soybean Utilizing the AD8, TOXIN6, and PROTEIN Databases. Monsanto Study Report, MSL0021658. 5. James, C. 2003. Preview: Global Status of Commercialized Transgenic Crops: 2003. ISAAA Briefs no. 30. ISAAA. Ithaca, New York. 6. Katherine E. Niemeyer, Andre Silvanovich, Ph.D., August 28, 2008. Assessment of the Cry1Ac Protein Levels in Soybean Tissues Collected from MON 87701 Produced in U.S. Field Trials During 2007. 7. Kristina H. Berman, George G. Harrigan, Susan G. Riordan, Margaret A. Nemeth, Christy Hanson, Michelle Smith, Roy Sorbet, Eddie Zhu, and William P. Ridley. 2009. Compositions of Seed, Forage, and Processed Fractions fromInsectProtected Soybean MON 87701 are Equivalent to Those of Conventional Soybean. J. Agric. Food Chem., 57, 11360–11369. 8. Kristina H. Berman, Susan G. Riordan, and Roy Sorbet. 2008. Composition Analyses of Forage and Seed Collected from MON 87701 Grown in United Staes during 2007. Monsanto Study Report No. MSL0021413 9. Smedley, J. W. 2009. An Acute Toxicity Study of Cry1Ac Protein Administered by the Oral (Gavage) Route to Mice. Monsanto Study Report, CRO-2007-325. 10. U.S. EPA. 1988. Guidance for the Registration of Pesticide Products Containing Bacillus thuringiensis as the Active Ingredient. NTIS PB 89-164198. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C. 11. U.S. EPA. 2001. Biopesticides Registration Action Document: Bacillus thuringiensis (Bt) plant-incorporated Protectants (October 15, 2001). U.S. Environmental Protection Agency, Washington D.C.
