REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Debbie S. Retnoningrum Sekolah Farmasi, ITB
Pustaka: 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, hal. 27-28; 110-120 2. Groves MJ, 2006, hal. 40 – 44 3. Brown TA, 2006, hal 6-7; 181-193
DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 2
REPLIKASI • • • • •
Replikasi adalah penggandaan DNA Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA Konsep pasangan basa Arah 5’ ke 3’ pada untai yang disintesis Dikatalisis oleh DNA polimerase
www.uic.edu/.../lecture4/replication4.jpg Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 3
Komponen – komponen Replikasi DNA z Mulai pada origin of replication (ori) z Protein pengikat DNA untai tunggal z Helikase (pembuka untai) z Primase (RNA polimerase) z DNA polimerase
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 4
Replikasi DNA • REPLIKASI DNA: – Pemanjangan untai baru DNA – dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP – Dikatalisis oleh DNA polimerase
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 5
DNA Polimerase Prokariot Pol I Pol II
Fungsi Gap filling & DNA repair Gap filling & DNA repair
Pol III Eukariot
Replikasi
Pol-α Pol-β Pol-δ Pol-γ Pol-ε
Replikasi lagging strand Gap filling & DNA repair Replikasi leading strand Replikasi pada mitokondria Gap filling & DNA repair
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 6
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Karry Mullis, penemu PCR Pemenang hadiah Nobel
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 7
SIKLUS PCR SIKLUS 1
SIKLUS 2
SIKLUS 3
94 oC T
72 oC
55 oC
WAKTU (DETIK) Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 8
SIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASI
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 9
Polymerase Chain Reaction (PCR)
www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/07/PCR.gif Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 10
KOMPONEN PCR • cetakan DNA • oligonukleotida pendek (primer) • DNA polimerase termostabil :Taq Polymerase (Thermus aquaticus) & buffer • dNTP (dATP, dTTP, dCTP dan dGTP)
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 11
Genom yang ditentukan urutannya http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 12
Contoh informasi pada data genBank
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 13
Amplifikasi DNA target dalam genom organisme
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 14
Amplifikasi DNA target dalam genom organisme
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 15
DETEKSI PRODUK PCR
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 16
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 17
PCR untuk deteksi Patogen GEN TARGET P1 P2
PRODUK PCR: 490 pb
TARGET HARUS SPESIFIK PATOGEN Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 18
PCR UNTUK DETEKSI PATOGEN
DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DNA TARGET: FRAGMEN TARGET IS6110 BERSALINAN TINGGI Bahan dahak Sekolah Farmasi ITB
DETEKSI Chlamydia trachomatis DNA TARGET: GEN MAJOR OUTER MEMBRANE PROTEIN = MOMP Bahan usap vagina (4), darah (5), mata (6)
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 19
MODIFIKASI PCR • PCR-HIBRIDISASI (PRODUK PCR DIHIBRIDISASI DENGAN PELACAK) • PCR multipleks • Nested-PCR • PCR-sekuensing • Real-time PCR
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 20
PRINSIP HIBRIDISASI
Hybridization
Addition of probe
Denaturation
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 21
PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRI lisis
PCR deteksi kolorimetri
Σ molekul target ⇒ Σ sinyal
substrat
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
denaturasi
hibridisasi
Replikasi dan PCR 22
DETEKSI KOLORIMETRI
TMB H2O2
Horse radish peroxidase Avidin Biotin
Produk PCR Pelacak
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 23
PCR MULTIPLEKS • PASANGAN PRIMER UNTUK DNA TARGET > 1 • CONTOH: – Escherichia coli: GEN TARGET gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2, VTE – 7 PASANGAN PRIMER – 7 PRODUK PCR
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 24
HASIL PCR MULTIPLEKS S
A
B
C
D
LT1 ST1 SLT1 SLT2 VT1 VT2 VTE
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 25
Contoh Hasil PCR multipleks
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 26
Nested-PCR GEN FLAGELIN S. typhi ST1
PCR pertama
458 pb
ST2
ST3 ST4 PCR kedua
343 pb Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 27
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 28
PCR SEKUENSING
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 29
PCR REAL-TIME • PCR KONVENSIONAL: – TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA KONSEKUTIF
• PCR REAL-TIME – TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA SIMULTAN
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 30
Deteksi pada PCR konvensional
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 31
Daerah deteksi real-time PCR
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 32
PELACAK HIBRIDISASI
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 33
PELACAK HIBRIDISASI
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 34
Contoh hasil realtime PCR
Sekolah Farmasi ITB
Bioteknologi Farmasi-FA 4202
Replikasi dan PCR 35
