PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT
OLEH SHABARNI GAFFAR, M.Si. NIP: 132 313 560
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN 2007
PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM SEL EUKARIOT
OLEH SHABARNI GAFFAR, M.Si. NIP: 132 313 560
Bandung, September 2007 Mengatahui : Ketua Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Padjadjaran
Dr. Unang Supratman NIP. 131929830
DAFTAR ISI 1. Pendahuluan...............................................................................................
1
2.
Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae...................................................
3
2.1. Vektor untuk S. Cerevisiae..................................................................
5
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae.........
8
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae.....................................
10
Sistem ekspresi Pichia pastoris..................................................................
11
3.1. Vektor ekspresi untuk P. Pastoris.....................................................
14
3.2. Integrasi multicopy............................................................................
16
4.
Sistem ekspresi ragi yang lain.................................................................
16
5.
Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga..................................
17
5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus.................................................
19
5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus...................................
20
5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.............
20
5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.....
21
Sistem ekspresi untuk sel mamalia.........................................................
22
6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia..........
26
Daftar Pustaka............................................................................................
28
3.
6.
3
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada
2
ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C)................................ Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp..................................................................................
7
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/ZnSOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) ragi............................................................................
10
Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris...........................................
13
Gambar 5. Peta vektor pPICZ/pPICZα...................................................
14
Gambar 6. Peta vektor pGAPZ/pGAPZα...............................................
15
Gambar 7. Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus............................................................................................
18
Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV)............
19
Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan.............................................
21
Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia...............................
23
Gambar 11. Vektor ekspresi bicistronik.....................................................
4
DAFTAR TABEL Tabel 1. Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae............................................................................................
4
Tabel 2. Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. Pastoris..............................................................................................
16
5
Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot 1. Pendahuluan Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat mengkontaminasi produk. Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur; dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya dengan protein natif. Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada eukariot
terdapat
enzim
Protein
Disulfida
Isomerase
(PDI)
yang
mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein, sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas. Terdapat beberapa tipe modifikasi pasca translasi. Beberapa urutan asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui pemotongan proteolisis protein precursor untuk menghasilkan protein fungsional. Penambahan gula spesifik (glikosilasi) terhadap asam amino tertentu
6
merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin atau asparagin (O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (Nlinked glycosylation) (gambar 1). Sekitar 30% protein mamalia mengalami glikosilasi.
Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C). T adalah threonin, S adalah serin, N adalah asparagin dan X asam sembarang asam amino. Monosakarida/oligosakarida yang berbeda.dilambangkan oleh bentuk yang berbeda. Kenyataanya tidak ada sel inang eukariot yang efektif secara universal, dimana proses modifikasi terjadi dengan benar untuk setiap protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin menambahkan gula yang tidak lazim ke asam amino yang tidak tepat sehingga menghasilkan protein antigen atau mungkin protein yang mempunyai fungsi yang tidak tepat. Walaupun beberapa protein rekombinan, mungkin memiliki sifat-sifat yang tidak cocok untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanfaatkan untuk
7
penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor ekspresi
tergantung
pada
kualitas
protein
rekombinan
yang
akan
diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting untuk dipertimbangkan. Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang positif. Karena dilakukan
prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk
menggunakan
sel
eukariot,
kebanyakan
vektor
eukariot
merupakan suttle vector dengan dua origin of replication (ORI) dan gen penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain, jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk memfalisitasi insersi ke kromosom.
2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae. Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut: 1. Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi. 2. Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan dikarakterisasi. S. cerevisiae secara alami mengandung plasmid yang disebut plasmid 2µm dan dapat digunakan sebagai vektor ekspresi. 3. S. cerevisiae mempunyai mekanisme modifikasi pasca translasi.
8
4. Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular, maka produk dapat segera di purifikasi. 5. Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S. cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration sebagai organisme “generally recognize as safe” (GRAS).
Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen terapeutik, dan untuk diagnosa (table 1). Sebagai contoh lebih dari 50% suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.
Tabel 1 Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae. Protein rekombinan Antigen permukaan virus hepatitis B Protein circumsporozoide malaria Envelope protein HIV-1 Protein virus hepatitis C Antigen HIV-1 Faktor pertumbuhan epidermal Insulin insulin-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growt factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor α1 antitripsin faktor koagulasi darah XIIIa hirudin human growth factor human serum albumin
Kegunaan Vaksin
diagnostik Agen terapetik untuk manusia
9
2.1. Vektor untuk S. cerevisiae Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi (Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs]. Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi protein heterolog intra atau ekstraselular. Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena
medium
pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh. Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae
sudah diambil untuk
efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor yang
dapat
direpresi,
konstitutif
dan
promotor
hibrida
yang
menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang sama. Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen asam amino (urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula) yang
10
memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S. cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi
proteolisis, dan
menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan protease
sehingga
bisa
dipotong
dari
protein
rekombinan
setelah
dimurnikan. Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar (≥ 10 L) walaupun diberi tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi. Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik (gambar 2). DNA plasmid dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen.
11
Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp. Gen marker seleksi (LEU2) dan gen yang diinsersi (GOI) diinsersikan ke vektor diantara dua segmen yang merupakan ujung gen nonesensial ragi (A1 dan A2). Urutan ini mengalami rekombinasi dengan kromosom sehingga GOI dan LEU2 terintegrasi ke kromosom. Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang. Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom (rRNA) dan sekitar 400 copy urutan δ pada genom S. cerevisiae. Urutan δ merupakan bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon. Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi. Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan δ memproduksi sejumlah rekombinan protein. Vektor YAC dirancang untuk mengkloning segmen DNA dengan ukuran besar (100 kb), yang kemudian dipertahankan sebagai bagian dari
12
kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari kromosom
manusia.
Vektor
YAC
menyerupai
kromosom
karena
mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI (autonomous replicating sequence), urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk mempertahankan kestabilan kromosom. (gambar 2). Dalam beberapa kasus, input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog dengan subunit berbeda.
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae Kebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae
mempunyai
dasar yang sama. Produksi enzim manusia superoksida dismutase akan digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida merupakan produk samping dari penyediaan oksigen pada organisme aerob. Pada manusia anion ini membantu
merangsang
respon
inflamasi
dari
fagosit
dan
untuk
mengarahkan lekosit ke sisi infeksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu banyak,
turunannya
dapat
menyebabkan
kerusakan
sel.
Untuk
meminimalkan efek cytotoxic, enzim Cu/Zn superoksida dismutase (Cu/ZnSOD) mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian didegradasi menjadi air dan oksigen oleh katalase atau peroksidase. Anion superoksida juga dihasilkan bila darah masuk kembali ke organ-organ (reperfusion)
13
setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini, dokter berspekulasi bahwa Cu/Zn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang sedang mengalami reperfusi. Cu/Zn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis, rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk penggunaan ini bentuk natif dari Cu/Zn-SOD lebih disukai untuk mencegah respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari penggunaan enzim dari spesies lain. Pada awalnya, cDNA untuk Cu/Zn-SOD manusia di kloning di sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli membuang N terminal metionin dari protein Cu/Zn-SOD, dan asam amino selanjutnya (alanin) tidak di asetilasi, seperti yang terdapat pada sel manusia. Sehingga kemudian, cDNA Cu/Zn-SOD manusia dikloning ke vektor YEp (gambar 3). Vektor YEp mengandung: (1) gen untuk biosintesis leusin (LEU2); (2) ORI plasmid 2 µm; (3) gen resistan ampisilin (Ampr); (4) ORI dari E. Coli; dan (5) cDNA Cu/Zn-SOD manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) dan urutan yang mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi mRNA dari gen yang sama (GAPDp). Strain ragi dengan leusin defektif (leu2) ditransformasi dengan vektor ini, dan sel di tumbuhkan pada medium tanpa leusin. Hanya sel dengan gen LEU2 fungsional (yang terdapat pada vektor) yang akan tumbuh.
Promotor
GAPD
di
transkripsi
secara
konstitutif
selama
pertumbuhan sel. Pada percobaan ini sel ragi memproduksi Cu/Zn-SOD intraselular dengan level tinggi, dan residu alanin pada N terminal di asetilasi seperti protein yang sama pada manusia (Gambar 3).
14
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) ragi. 2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae, disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula dari gen yeast mating factor type α (prepro-α-factor) diinsersikan pada bagian depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini, pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg. Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA, sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal. Strategi tambahan juga sudah ditemukan untuk meningkatkan sekresi protein rekombinan oleh S. cerevisiae. Sebagai contoh, overproduksi PDI (Protein Disulfide Isomerase) yang secara natural terdapat pada sistem enzim sekresi. PDI menyebabkan terjadinya pelipatan protein (folding) yang tepat
15
selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal. Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein dengan pembentukan ikatan disulfida.
3. Sistem ekspresi Pichia pastoris. Ekspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae
telah berhasil
digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber yang berbeda. Namun dalam beberapa kasus level ekspresinya rendah. Pada contoh lain protein rekombinan mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu manosa pada rantai samping N-linked oligosakarida. Kelebihan manosa ini sering merubah fungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang bersifat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi pada S. cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma, sehingga menambah biaya dan waktu untuk pemurnian. Selanjutnya, bila densitas sel tinggi maka S. cerevisiae
akan memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel.
Sebagai konsekuensinya menurunkan jumlah protein yang disekresikan. Untuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain dan sel eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang efektif untuk produksi protein rekombinan. Sebagai eukariot, P. pastoris memiliki berbagai manfaat seperti sistem ekspresi eukariot lain, seperti pemrosesan protein, pelipatan protein, dan
16
modifikasi pascatranslasi, serta mudah dimanipulasi seperti E. coli dan S. cerevisieae. Penggunaannya juga mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan protein dengan level tinggi. P. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu: 1.
P. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat, yaitu promotor gen AOX1 yang mengkode enzim alkohol oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol, gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promotor gen AOX1 dengan cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain, promotor AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan transkripsi gen yang dikloning dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah besar;
2.
Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel; dan
3.
P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri, sehingga
memudahkan
pemurnian
protein
rekombinan
yang
disekresikan.
Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang sama. Gen yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor dan urutan terminator transkripsi dari gen AOX1 P. pastoris , ORI dan gen marker seleksi dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi (gambar 4). Selain itu juga terdapat penambahan urutan signal dari gen fosfatase PHO1 P. pastoris atau gen dari ragi lain yang memfasilitasi sekresi protein rekombinan. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Gen asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom
17
spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris.
Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris. Gen yang dikloning (GOI) diinsersikan diantara promotor dan terminator gen alkohol oksidase (AOX1). Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat banyak (Invitrogen, 2004). Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia, termasuk manusia (Tabel 2). Protein-protein rekombinan ini, seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya. Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis
18
penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein dalam P. pastoris. 3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris. Vektor pPICZ dan pPICZα merupakan vektor dengan tingkat ekspresi tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain dan mengurangi ukuran vektor (Gambar 5).
Gambar 5. Peta vektor pPICZ/pPICZα
19
Kedua
vektor
ini
memiliki:
(1)
promotor
AOX1,
untuk
mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol. (2) C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. (3) gen 5’ AOX1 yang berfungsi untuk
menargetkan
integrasi
ke
genom
P.
pastoris.
pPICZα
juga
mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium. Vektor pGAPZ dan pGAPZα dapat mengekspresikan protein tanpa menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar. Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal cmyc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. pGAPα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium (Gambar 6).
Gambar 6. Peta vektor pGAPZ/pGAPZα
20
3.2. Integrasi multicopy. Beberapa
vektor
ekspresi
untuk
Pichia
yang
tersedia
dapat
meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin.
Tabel 2 Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris Protein rekombinan Protein bakteri: Toksin tetanus fragmen C a-amilase T2A peroksidase Fragmen neurotoxin C. botulinum Protein Ragi: Catalase L Glukoamilase Lipase Protein tumbuhan: Hidroksinitril liase Aeroallergen Wheat lipid transfer protein Protein mamalia: Mouse gelatin Human tumor necrosis factor Human IGF-1 Human CD-38
Tingkat ekspresi (mg/L) 12000 2500 2470 78 2300 400 60 22000 720 60 14000 10000 600 455
4. Sistem ekspresi ragi yang lain Protein heterolog untuk kepentingan industri dan pengobatan juga telah diekspresikan di yeast lain. Contohnya cDNA untuk rantai α dan β globin dari hemoglobin A manusia, masing-masingnya diklon diantara promotor metanol oksidase (MOXp) dan urutan terminator transkripsi (MOXt) dari ragi metilotropik Hansenula polymorpha, dan ditempatkan secara
21
berurutan pada vektor ekspresi. Secara kebetulan terjadi integrasi dan setelah 40 generasi dihasilkan hemoglobin A fungsional yang memiliki tetramer yang tepat yaitu dua rantai globin α dan dua rantai globin β. Sejumlah spesies jamur Aspergillus juga telah digunakan secara ekstensif untuk produksi enzim komersial, seperti α-amilase, lipase, amyloglukosidase, katalase, dan selulase untuk industri makanan dan kertas. Jamur ini mensekresikan sejumlah besar natif protein, tumbuh dengan cepat pada medium yang tidak mahal, memproses mRNA eukariot dan melakukan modifiksi pasca translasi. Beberapa vektor telah dicocokkan dengan elemen pengontrol trankripsi dan translasi jamur, untuk ekspresi protein rekombinan. Chymosin manusia, laktoferin tikus, interleukin-6 manusia, xantin oksidase Drosophilla
dan protein lain telah berhasil
diproduksi pada sel inang jamur. Sebagai kesimpulan sistem ekspresi ragi telah memberikan peranan yang penting dalam memproduksi protein rekombinan untuk kepentingan penelitian, industri, dan aplikasi medik. Bagaimanapun, pengalaman telah menunjukkan bahwa tidak ada satu sistempun yang dapat memproduksi versi autentik dari protein heterolog, sehingga sistem ekspresi yang menggunakan insek atau sel mamalia juga dikembangkan.
5. Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga Baculovirus menginveksi invertebrata, termasuk beberapa spesies serangga. Selama siklus infeksi dihasilkan dua bentuk Baculovirus. Pertama single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi, dan dapat menginfeksi sel lain. Kedua, kluster dari nucleocapsid (virion) yang terperangkap dalam matriks protein. Protein matriks ini disebut polyhedrin dan
keseluruhannya
disebut
polyhedron
(Gambar
7).
Sekumpulan
polyhedron (polyhedra) dibebaskan ke lingkungan setelah sel lisis dan mati. Polyhedron memproteksi virion dari inaktifasi oleh agen-agen asing. Selama siklus akhir infeksi Baculovirus, protein polyhedrin diproduksi dalam
22
jumlah besar. Sintesis polyhedrin dimulai sekitar 36-48 jam setelah infeksi dan berlanjut selama 4-5 hari, sampai infeksi selesai dan sel inang mati.
Gambar 7. Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus. (A) single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi. (B) kluster dari nucleocapsid (virion) yang terperangkap dalam matriks protein.
Promotor untuk gen polyhedrin (polyh) sangat kuat, dan tidak dibutuhkan untuk produksi virus. Sehingga penggantian daerah pengkode polyhedrin dengan protein heterolog dan diikuti dengan infeksi sel serangga, akan menghasilkan produksi sejumlah besar protein heterolog. Selanjutnya, karena kesamaan sistem modifikasi pascatranslasi antara serangga dan mamalia, maka protein rekombinan yang dihasilkan akan sangat mirip dengan bentuk aslinya. Baculovirus yang telah digunakan secara ekstensif sebagai vektor ekspresi adalah Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Sel yang umum digunakan adalah Spadoptera frugiperda. Dalam sel ini promotor polyhedrin aktif, dan selama infeksi dengan Baculovirus wild type, polyhedrin dengan level tinggi di sintesis.
23
5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus Langkah pertama dalam produksi rekombinan AcMNPV adalah merancang vektor transfer. Transfer vektor merupakan plasmid E. coli-based yang membawa segmen DNA dari AcMNPV yang mengandung promotor polyhedrin dan sebagian segmen upstream DNA AcMNPV, multiple cloning site, terminator polihedrin dan daerah signal poliadenilasi, serta sebagian segmen downstream DNA AcMNPV. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin telah di delesi. Segmen upstream dan downstream AcMNPV menyediakan daerah untuk rekombinasi homolog dengan AcMNPV. Gen yang diinginkan di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan kemudian dipropagasi ke E. coli (Gambar 8). Kemudian sel serangga dalam kultur di ko-transfeksi dengan DNA AcMNPV dan vektor transfer yang membawa gen yang diklon. Selama proses transfeksi, terjadi peristiwa double crossover dan gen yang diklon dengan promotor dan terminator polyhedrin terintegrasi ke DNA AcMNPV. Virion yang tidak memiliki gen polyhedrin menghasilkan zona yang berbeda pada lisis sel (plak negatif) yang merupakan rekombinan Baculovirus.
Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus (AcMVPV). Gen asing diinsersikan ke multiple cloning site (MCS) yang berada diantara promotor gen polyhedrin (Pp) dan urutan terminasi transkripsi polyhedrin (Pt). Urutan 5’ AcMNPV DNA dan 3’AcMNPV DNA menyediakan urutan untuk integrasi unit ekspresi melalui rekombinasi homolog ke genom AcMNPV. Jika gen lacZ E. coli yang mengkode β-galaktosidase diinsersikan pada promotor baculovirus yang di-on kan selama fasa awal sampai akhir siklus litik, dan menjadi bagian dari DNA yang diinkorporasikan ke genom baculovirus, maka plak rekombinan akan menjadi biru, bila ke dalam
24
medium ditambahkan substrat untuk β-galaktosidase. Penambahan siklus infeksi terhadap plak negatif akan meningkatkan konsentrasi virus rekombinan. Protein heterolog dipanen 4 sampai 5 hari setelah sel serangga terinfeksi.
Sistem
ekspresi
baculovirus
ini
telah
digunakan
untuk
memproduksi lebih dari 500 protein heterolog. 5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus. Linearisasi dari genom AcMNPV sebelum transfeksi ke sel serangga, meningkatkan
frekuensi
plak
rekombinan.
Prosedur
sederhana
ini
menurunkan jumlah plak non-rekombinan, karena linearisasi genom baculovirus mengurangi ketidak efektifan dan double crossover antara DNA AcMNPV linear dengan vektor transfer sirkular. Untuk menjamin proses linearisasi terjadi secara konsisten, sisi restriksi Bsu31 telah diinsersikan kedalam gen polyhedrin dari genom AcMNPV wild type. Pada kondisi ini sekitar 30% plak mengandung baculovirus rekombinan.
5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga. Sistem yang memungkinkan untuk melakukan semua manipulasi genetik untuk menghasilkan vektor ekspresi baculovirus dalam E. coli juga telah dikembangkan. Dalam kasus ini transfeksi sel serangga hanya dibutuhkan untuk produksi protein heterolog. Plasmid E. coli dikonstruksi dimana suatu segmen DNA diapit oleh urutan DNA yang berada diluar ujung 5’ dan 3’ gen polyhedrin. Urutan DNA pada segmen ini mengandung gen resistensi kanamycin, sisi integrasi (sisi pengikatan) yang diinsersikan ke gen LacZ tanpa merusak fungsinya dan ORI E. coli. Plasmid dan DNA AcMNPV dimasukkan ke E. coli, setelah terjadi peristiwa rekombinasi, DNA antara segmen AcMNPV terintegrasi ke genom AcMNPV tanpa kehilangan gen polyhedrin. Double crossover antara plasmid E. coli dan genom AcMNPV membentuk DNA single sirkular yang dapat dipertahankan di E. coli sebagai plasmid, setelah transfeksi ke sel inang serangga, akan langsung
25
memproduksi baculovirus. Shuttle vektor baculovirus E. coli-sel serangga ini disebut bacmid.
Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan. Plasmid E. Coli digabungkan ke genom AcMNPV dengan cara double crossover antara segmen DNA (5’ dan 3’) yang mengapit gen polyhedrin untuk membentuk suttle vektor yang dapat bereplikasi di E. Coli dan di sel serangga. Dalam prakteknya hampir semua sistem ekspresi prokariot dan eukariot membawa satu kopi gen yang diklon. Ekspresi simultan dari dua atau lebih gen yang diklon akan membentuk protein multimer yang fungsional. Pada suatu studi sejumlah gen dari virus bluetongue (BTV) sukses diinsersikan ke vektor baculovirus, sehingga terbentuk vektor dengan tujuh gen insersi. Sistem ini ditest dengan vektor yang membawa empat protein BTV. Ekspresi dari gen ini menghasilkan partikel yang secara struktur mirip dengan virus pada siklus perakitan. Virus-like partikel ini diinjeksikan ke domba dan menghasilkan antibodi terhadap protein BTV yang bertahan untuk waktu lama. Dalam studi yang lain, antibodi manusia dan elemen antibodi di produksi dari vektor dua gen dengan urutan pengkode kombinasi variasi rantai immunoglobulin ringan dan berat.
5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga. Sel serangga tidak rutin menambahkan galaktosa atau terminal asam sialat ke N-link glikoprotein. Konsekuensinya sistem baculovirus tidak dapat digunakan untuk memproduksi sejumlah gliprotein mamalia. Untuk
26
mengatasi kekurangan ini, sel serangga yang stabil diintegrasi dengan gen α-2,6-sialiltransferase dan vektor kloning baculovirus diintegrasi dengan gen β-1,4 glaktotransferase mamalia, dibawah kontrol promotor early-stage. Pada kondisi uji, sistem ini mensintesis N-link glikan dengan galaktosa dan asam sialat. Dalam beberapa kasus, protein heterolog juga tidak diproses dengan tepat dari prekursor inaktif yang besar menjadi bentuk aktif dalam sel serangga. Sel mamalia mengandung sejumlah enzim pemroses protein (proprotein konvertase). cDNA untuk salah satu enzim ini, yaitu furin, telah diklon kedalam vektor ekspresi baculovirus dibawah kontrol promotor polyhedrin dan dikotransfeksi ke sel serangga dengan vektor ekspresi baculovirus lain dengan urutan untuk preproprotein yang normalnya tidak diproses oleh sel serangga. Pada kondisi ini terjadi konversi penuh menjadi protein aktif.
6. Sistem ekspresi untuk sel mamalia. Sistem ekspresi sel mamalia penting untuk produksi protein heterolog dengan modifikasi pascatranslasi yang lengkap. Sejumlah sel telah dikembangkan untuk tujuan ini. Contohnya sel yang diambil dari ginjal monyet hijau dari Afrika (COS), sel ginjal bayi hamster (BHK), dan sel ginjal embrio manusia (HEK-239), digunakan untuk mempercepat ekspresi gen dan mempercepat produksi sejumlah kecil protein heterolog, atau untuk mengetahui integritas dari konstruksi selama pengembangan vektor. Sel Chinnese hamster ovary (CHO) telah umum digunakan untuk ekspresi gen jangka panjang dan untuk produksi protein jumlah banyak. Sejauh ini telah ratusan vektor ekspresi mamalia yang dikembangkan, dan semuanya tidak berbeda dalam disainnya. Vektor ekspresi mamalia mengandung origin of replication eukariot, biasanya dari virus binatang, seperti simian virus 40 (SV40). Urutan promotor yang menjalankan gen yang diklon dan gen marker seleksi, dan
27
urutan terminasi transkripsi (signal poliadenilasi) harus dari eukariot dan secara teratur diambil dari virus lain (cytomegalovirus, SV40, virus herpes simpleks) atau gen mamalia (β-actin, metallothionein, thymin kinase, bovine growth hormone). Promotor konstitutif yang kuat dan signal poliadenilasi dibutuhkan.
Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia. Multiple cloning site (MCS) dan selectable marker gene (SMG) berada dibawah kontrol promotor (p), poliadenilasi (pa), dan terminasi transkripsi (TT) untuk eukariot. Intron (I) mempercepat produksi protein heterolog. Promotor yang dapat diinduksi sering digunakan bila sintesis secara kontinu dari protein heterolog bersifat toksid terhadap sel inang. Ekspresi dari gen yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan menempatkan urutan intron antara promotor dan sisi kloning dari konstruksi transkripsi (cassette). Intron hibrida yang terdiri dari bagian donor dan sisi akseptor dari dua gen yang berbeda cukup efektif untuk berbagai sel. Urutan yang dibutuhkan untuk seleksi dan propagasi dari vektor ekspresi mamalia dalam E. coli diambil dari vektor kloning E. coli seperti pBR322. Untuk mendapatkan hasil yang baik, maka gen yang akan diklon ditambah dengan urutan kontrol translasi. Inisiasi translasi pada eukariot tingkat tinggi tergantung pada urutan spesifik nukleotida disekitar kodon start
(AUG)
yang
disebut
dengan
urutan
Kozak,
yaitu:
CC(AatauG)CCAUGG. Urutan Kozak biasanya diikuti oleh urutan signal yang memfasilitasi sekresi, urutan protein (tag) untuk memudahkan purifikasi protein heterolog, dan urutan pemotongan proteolitik sehingga tag dapat dibuang dari protein heterolog. Kodon stop ditambahkan untuk
28
meyakinkan bahwa translasi terjadi pada lokasi yang tepat. Sedangkan urutan yang mengandung 5’ dan 3’ untranslated region (UTR) penting untuk efisiensi translasi dan kestabilan mRNA. Sintetik 5’ dan 3’ UTR atau dari gen β-globin manusia digunakan pada vektor ekspresi mamalia. Vektor ekspresi sel mamalia pada umumnya membawa satu gen yang mengkode polipeptida fungsional. Bentuk aktif dari beberapa protein komersial mengandung dua rantai protein yang berbeda. Contohnya, hormon tyhroid manusia merupakan dua rantai polipeptida (heterodimer), hemoglobin, dan antibodi merupakan tetramer dengan dua copy masingmasing subunit (yaitu α2β2 dan H2L2). Gen atau cDNA dari masing-masing subunit dapat diklon, disintesis dan masing-masing subunit dipurifikasi secara terpisah, dan kemudian semua rantai polipeptida digabung dalam tabung reaksi. Namun, hanya sedikit protein multi-rantai yang dapat dirakit in vitro. Sebaliknya perakitan in vivo dari protein dimer atau tetramer cukup efisien. Sehingga sejumlah strategi telah dikembangkan untuk produksi dua rekombinan protein dalam sel yang sama. Dua vektor ekspresi mamalia, masing-masing dengan gen atau cDNA untuk satu subunit dan gen penyeleksi yang berbeda, dapat dikotransfeksi ke sel inang. Sel yang ditransfeksi diperlakukan dengan kedua agen penyeleksi, dan sel yang bertahan hidup membawa kedua vektor. Dua jenis sistem vektor telah sukses digunakan untuk memproduksi protein rekombinan dimer dan tetramer. Namun sering ditemui salah satu vektor bisa hilang, dan dua vektor jarang dipertahankan dengan jumlah copy yang sama, sehingga kedua subunit protein diproduksi dengan jumlah yang berbeda, dan mengurangi jumlah produk akhir. Untuk mengatasi masalah ini,
vektor
tunggal
yang
membawa
dua
gen
yang
diklon
telah
dikembangkan. Kedua gen ditempatkan dibawah kontrol promotor dan signal poliadenilasi yang indipenden (double cassette vector). Alternatif lain, untuk meyakinkan bahwa sejumlah protein rekombinan yang sama disintesis, vektor (vektor bicistronik) dikonstruksi dengan dua gen yang
29
diklon terpisah satu dengan yang lain oleh urutan DNA yang mengandung sisi pemasukan internal ribosom (IRES= internal ribosomal entry site). IRES ditemukan pada genom virus mamalia, dan menyebabkan terjadinya translasi simultan dari protein yang berbeda pada mulekul mRNA policistronik. Transkripsi dari konstruksi ”gen a-IRES-gen b” dikontrol oleh satu promotor dan signal poliadenilasi. Pada kondisi ini ”dua gen” tunggal (bicistronik) ditranskripsi dan translasi berlangsung dari ujung 5’ mRNA untuk memproduksi rantai pertama (rantai a) dan didalam elemen IRES memproduksi rantai kedua (rantai b). Biasanya, konstruksi vektor ekspresi mamalia memakan waktu lama dan membutuhkan usaha yang gigih untuk mendapatkan produksi protein yang optimum.
Gambar 11. Vektor ekspresi bicistronik. Gen yang diklon (gen a dan gen b) mengkode subunit protein dimer (ab). Masing-masing gen diinsersikan ke vektor pada dua sisi urutan IRES. Kedua gen tersebut dan IRES ditranskripsi di bawah kontrol satu promotor, urutan poliadenilasi dan terminasi transkripsi eukariot.
30
6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia. Beberapa skema seleksi telah di disain yang fungsinya tidak hanya untuk identifikasi sel yang mengalami transfeksi, juga untuk meningkatkan produksi protein heterolog melalui amplifikasi jumlah copy vektor ekspresi. Sistem dihidrofolat reduktase methotrexate (DHFR-MTX) termasuk ke dalam kategori
ini.
DHFR
mengkatalisis
reduksi
dihidrofolat
menjadi
tetrahidrofolat, yang dibutuhkan untuk produksi purin. MTX merupakan inhibitor kompetitif dari DHFR. Sensitifitas MTX dapat diatasi jika sel memproduksi DHFR berlebih. Bila konsentrasi MTX meningkat dalam jangka waktu tertentu, gen DHFR dalam kultur sel akan diperbanyak. Pada protokol standar DHFR-MTX, sel defisien DHFR ditransfeksi dengan vektor ekspresi yang membawa gen DHFR sebagai marker seleksi dan kemudian sel diperlakukan dengan MTX. Setelah seleksi awal terhadap sel yang mengalami transfeksi, konsentrasi MTX ditingkatkan, sehingga sel dengan jumlah copy tinggi vektor dapat diseleksi. Cara seleksi yang lain adalah menggunakan sistem glutamin sintetase-metionin sulfoximin (GS-MSX). GS terlibat dalam sintesis glutamin, yang digunakan pada sintesis protein, produksi purin dan pyrimidin, dan proses penting lain. MSX secara irreversibel menghambat GS. Sel yang ditransfeksi dengan vektor yang membawa gen GS, reristan terhadap efek toksik dari MSX dan memiliki suplai aktif GS yang cukup untuk proliferasi sel. Setelah seleksi dengan MSX, sel yang memproduksi protein heterolog dengan level tinggi biasanya memiliki vektor ekspresi tidak lebih dari 10 copy. Sejumlah protein untuk penelitian dan terapi telah diproduksi dengan sistem ini, termasuk dua antibodi yang telah digunakan untuk terapi manusia. Gen pengkode rantai berat dan ringan dari monoklonal antibodi diklon menggunakan dua promotor yang kuat dan gen GS dijalankan oleh promotor-medium pada vektor ekspresi. Monoklonal antibodi ini telah digunakan untuk terapi manusia dan tidak terdapat rejeksi organ.
31
Sebagai kesimpulan vektor ekspresi mamalia efektif dan serbaguna sebagai vektor untuk ekspresi protein eukariot lain. Namun produksi skala industri protein rekombinan oleh sel mamalia yang direkayasa menjadi cukup mahal. Sebagai konsekuensinya sistem ekspresi yang tidak terlalu mahal lebih disukai walaupun protein rekombinan penting yang autentik hanya dapat diperoleh dari sel mamalia.
32
DAFTAR PUSTAKA Ansari, A., V. C. Emery. 1998. Baculoviruses, 219-233. Dalam R. Rabley and J. M. Walker (ed.) Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc., Totowa, N.J. Barnes, L. M., C. M. Bentley, and A. J. Dickson. 2000. Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NSO expression system. Cytotechnology 32: 109-123. Cregg, J. M. 1999. Expression in the methylotropic yeast Pichia pastoris, 157191. Dalam J. Fernandez and J. P. Hoeffler (ed.) Gene Expression Systems: Using nature for the Art of Expression. Academic Press, Inc., San Diego, Calif. Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163173. Geisse, S., and H. P. Kocher. 1999. Protein expression in mamalian and insect cells, Methods Enzymol. 306:19-42. Invitrogen, A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris, 2004. California. 7-10. Robinson, A. S., Hines, V., Wittrup, K. D. 1994. Protein disulphide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology. 12, 381-384 Schultz, L. D., Markus, H. Z., Hofmann, K. J., Montgomery, D. L., Dunwiddier, C. T., Kniskern, P. J., Freedman, R. B., Ellis, R. W., Tuite, M. F. 1994. Using molecular genetic to improve the production of recombinant proteins by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 148-157 Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824 Tuite, M.F. and Freedman, R.B. 1994, Improving secretion of recombinant proteins from yeast and mammalian cells; rational of empirical design? Trends in Biotechnology.
33
