DNA čipy • Zařízení pro detekci specifické sekvence bází v molekule DNA nebo RNA • DNA čip je tvořen maticí detekčních míst (microarray) • Detekční místa jsou obvykle tvořena gelem s imobilizovaným receptorem – ssDNA (denaturovaná jednořetězcová DNA) • V analyzovaném vzorku jsou přivedeny fluorescenčně značené ssDNA (ligandy) • V případě komplementarity ligandu a receptoru proběhne hybridizace a stabilní dsDNA (dvouřetězcová DNA) je vytvořena v detekčním místě • Po odmytí nenavázané ssDNA, může být provedena fluorescenční detekce. Strana 1
Princip DNA čipu- schéma Typický fluorescenční obraz DNA čipu po hybridizaci
Strana 2
DNA čipy • DNA čipy vykazují extrémní specifitu, která je závislá na počtu párů bází (pb) ve vzniklém komplexu ligand-receptor (~ 4n, kde n je počet pb). • Charakteristický rozměr detekčních míst bývá v mm, což umožňuje vytváření obrovských matic detekčních míst (fotolitografie, microspotting, inject printing). • Na jednom DNA čipu mohou být vázány všechny sekvence DNA kódující nějaký gen určitého organizmu (cca desítky tisíc míst) • DNA čipy jsou využívány pro detekci genetických poruch (mutací), identifikaci osob (DNA fingerprint), detekci přítomnosti virových nebo bakteriálních infekcí, zjišťování nejúčinnějšího léčebného postupu u závažných onemocnění (personal therapy) Strana 3
Microarrays (mikromaticové systémy) - Původně studie exprese genů (mRNA profily) - Nyní k celé řadě aplikací: transcriptional profiling, genotyping, comparative genomic hybridization, epigenetic analysis
- Limitace difusí: targety musí difundovat z jádra tekutiny k detekčním polím D(DNA)~ 10-12 až 10-13 m2/s (inkubace trvá hodiny) - Zkrácení difusního času: 1. integrace mikromaticového pole s mikrokanálem a recirkulace (vysoký poměr povrch/objem, vyšší počet oligonukleotidů k funkcionalizaci) 2. konvektivní míchání: v mikrofluidice dosti neefektivní Pe okolo 100 (zlepšení přestupu hmoty se škáluje s Pe1/3 což odpovídá přibližně jednomu řádu)
Přednáška #12
Strana 4
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
Přednáška #12
Strana 5
DNA čipy • Pod detekčním místem (gelem) bývá umístěna elektroda • Vložené elektrické pole urychluje transport DNA ze vzorku k detekčnímu místu vlivem elektroforetické migrace • Analýzu na čipu tak lze urychlit z hodin na minuty • Zapojením vybraných elektrod je možné složky vzorku usměrňovat (adresovat) pouze ke zvoleným detekčním místům • Vzhledem k univerzálnosti interakce ssDNA-ssDNA a její vysoké specificitě, je již mnoho DNA čipů dodáváno komerčně Strana 6
Příklady komerčních DNA čipů DNA čip firmy Nanogen se 100 testovacími místy s uloženými mikroelektrodami pro adresování.
DNA čip s možností adresování standardního připojení k řídící jednotce.
Typická čtečka signálu DNA čipů
Strana 7
Na DNA čipu může být umístěn celý genom libovolného organizmu DNA čip – Escherichia coli 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 5500 transkriptů Affymetrix, Inc. DNA čip – Drosophila melanogaster (octomilka) 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 18500 transkriptů Affymetrix, Inc. DNA čip – Myš 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 39000 transkriptů Affymetrix, Inc.
DNA čip – Člověk 18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm Sledování exprese až 47000 transkriptů Affymetrix, Inc. Strana 8
Příklady komerčních DNA čipů • Vzhledem k vysoké specificitě hybridizační reakce lze princip DNA čipů použít např. ke zvýšení bezpečnosti různých čipových karet • Každá sekvence DNA je spojena se specifickým signálem elektronického čipu karty. Tento signál může být identifikován pomocí čtecího zařízení s komplementárním signálem.
Strana 9
Chemické a biochemické interakce Při interakci jedné nebo několika chemických komponent (reaktantů) může dojít k jejich chemické přeměně za vzniku produktů. Chemická přeměna probíhá za přítomnosti nebo bez přítomnosti katalyzátorů, které se přímo účastní transformace a snižují její aktivační energii.
Reaktanty
katalyzátor
Produkty
V biochemických reakcích dochází velmi často při interakci ligandu a receptoru ke tvorbě ligandreceptorového komplexu a/nebo jeho zpětné disociaci
Ligand + Receptor
Komplex Strana 10
Uspořádání chemické interakce • Homogenní – všechny reaktanty i katalyzátor jsou v jedné fázi, obvykle kapalné – například kompetitivní imunoanalýza v roztoku Ag (aq) + Ab (aq)
C (aq)
• Heterogenní – jeden nebo více reaktantů nebo katalyzátor je umístěn v jiné fázi než ostatní reaktanty – například heterogenní imunoanalýza s antigenem nebo protilátkou vázanou na pevný nosič Ag (s) + Ab (aq)
Strana 11
C (s)
Heterogenní biochemické reakce Heterogenní uspořádání je obvyklé u všech vysoce paralelizovaných aplikací – DNA čipů nebo různých proteinových čipů. Jeden z reaktantů – receptor je imobilizován buď na povrchu pevné fáze nebo v gelové vrstvě. Receptorem může být antigen, protilátka, proteinové ligandy a receptory (GF, EGFR), jiné proteiny, ssDNA, RNA atd. Rozpoznávání se děje na základě specifity komplementární interakce mezi antigenem a protilátkou, ssDNA-ssDNA, enzymem a substrátem atd. Zatímco DNA čipy obsahují velké množství vazných míst (až desítky tisíc), u proteinů Strana to 12 bývají obvykle jednotky až desítky.
Protilátky
http://www.highlands.edu/academics/divisions/scipe/biology/faculty/harnden/2122/notes/immune.htm
hemaglutinace
http://en.wikipedia.org/wiki/Blood_type
Přednáška #12
Strana 14
Proteinové čipy • Interakce mezi dvěma komplementárními proteiny nebo proteinem a molekulou nebílkovinné povahy • Proteiny jsou velmi rozmanité molekuly – – – – – –
proteiny, lipoproteiny, glykoproteiny fibrilární a globulární hydrofilní nebo hydrofóbní charakter povrchu isoelektrický bod, celkový elektrický náboj protilátky, antigeny, enzymy, receptory, ligandy, substráty řádové rozdíly v molekulární hmotnosti
• Specificita nebývá absolutní, enzym je schopen zpracovávat více substrátů, protilátky se mohou vázat na více antigenů (epitopů) Strana 15
Proteinové čipy • Z uvedených vlastností plyne, že žádný proteinový čip nemůže být tak univerzální a specifický jako DNA čipy • Přístup ke konstrukci proteinového čipu také není univerzální, protože každá aplikace vyžaduje zvláštní přístup, což je determinováno charakterem zkoumaného proteinového systému • Obvykle není vyžadován vysoký stupeň paralelizace (jedno až několik desítek detekčních míst) • Typickým příkladem může být čip pro paralelní detekci několika antigenů spjatých s různými infekčními chorobami Strana 16
Proteinové čipy • Proteinové čipy mají řádově menší charakteristické rozměry než klasické systémy pro detekci proteinů (např. ELISA destičky) – – – – –
řádové snížení doby analýzy (např. rychlá diagnostika) snížení spotřeby proteinových reaktantů (cena) přenositelnost systému (k pacientovy, na místo analýzy) snadnější paralelizace reprodukovatelnější reakční podmínky (přesné dávkování, lepší homogenizace vzorku, …)
• Protože proteinové čipy nejsou masově rozšířené – chybí univerzální porty – ceny analýz jsou podstatně dražší než v klasických systémech, protože pořizovací náklady na detektory, obslužné zařízení i samotné čipy jsou obrovské – čipy jsou vyráběny v malých sériích – výhody proteinových čipů nepronikly mezi odbornou veřejnost Strana 17
Jamkové destičky
ELISA in a microfluidic chip
fluorescein di-b-D-galactopyranoside (FDG) – nefluoreskující substrát Ultrasensitive microfluidic solid-phase ELISA using an actuatable microwell-patterned PDMS chip, Lab Chip, 2013, 13, 4190
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání Kompetitivní imunoanalytické stanovení teofylinu v homogenním uspořádání. Dávkování reaktantů a manipulace s roztoky je založena na elektroosmotickém transportu.Teofylin ze vzorku (5) a známé množství značeného teofylinu (6) jsou nejprve smíchány. Poté jsou inkubovány s omezeným množstvím protilátky (7). Vznikají komplexy značeného a neznačeného teofylinu s protilátkou a zůstává část nespotřebovaného značeného teofylinu. Značený teofylin a značený teofylin v komplexu jsou následně na základě různé elektroforetické mobility odděleny v separačním kanále a jejich množství je Teofylin: lék k léčbě nemocí dýchacího ústrojí detekováno. Strana 20
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání
Kalibrační křivka – relativní poměr značeného teofylinu volného a v komplexu vypovídá o koncentraci neznačeného teofylinu ve vzorku.
Míchání a inkubace
Separace
Strana 21
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání
Vysoce integrované šestikanálové zařízení pro paralelní imunoanalýzu v homogenním uspořádání. Zařízení obsahuje pouze jeden fluorescenční detektor. Separace komplexu a značeného antigenu se provádí na základě rozdílných elektroforetických mobilit. Využit elektroosmotický transport roztoků. Strana 22
Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi
Reakční komora
Zařízení kombinuje následující procesy: imobilizace proteinu, inkubace, proplachování, detekce a regenerace. Transport je uskutečněn výhradně elektrokineticky.
Heterogenní stanovení IgG ze vzorku vazbou na imobilizovaný Protein A Strana 23
Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi
Fluorescenční detekce vázané protilátky
Kvantifikace signálu v elektroosmotickém biosenzoru – kalibrační křivka
Strana 24
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG
Experimentální mikročip testovaný pro přímou a sendvičovou detekci lidských IgG na Proteinu A. Protein A je imobilizován na stěně zařízení. Vzorek je přiveden v roztoku. Doba inkubace je 5 minut. Paralelizace kanálů umožňuje sestavení kalibračních křivek nebo paralelní detekci různých vzorků. Strana 25
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG Intenzita fluorescenčního zabarvení v konkrétním kanále po vymytí zbytku vzorku vypovídá o koncentraci imobilizovaného komplexu PA-hIgG nebo PA-hIgGgIgG a tedy i o původní koncentraci IgG v analyzovaném vzorku.
Strana 26
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG Analýzou intenzity fluorescenčního signálu je možno získat kalibrační křivky mikrofluidního zařízení. Z nich lze pomocí matematického modelu určit rovnovážné a kinetické konstanty vazby ligand-receptor. Rychlostní konstanta kon Ab Ag C
Rovnovážná konstanta
K d koff kon
Strana 27
Imobilizovaný Protein A a lidské IgG v roztoku kon = 5.5 m3mol-1s-1 Kd 3×10-6 mol m-3
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek Mikročip z polydimethylsiloxanu (PDMS) Vynikající optické vlastnosti, snadná výroba Hydrofobní charakter povrchu
Dvoukroková detekce myších protilátek mIgG hIgG
glutardialdehyde
mIgG
FITC-gIgG
Strana 28
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek Měřen profil fluorescenční emise napříč čipem
Schéma detekční aparatury Zařízení obsahuje excitační laser a fotonásobič Strana 29
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek
Výsledkem je kalibrační závislost intenzity fluorescenčního signálu na koncentraci myších protilátek ve vzorku
Strana 30
Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic
Sendvičová heterogenní imunoanalýza – stanovení CEA (carcinoembryonic antigen) při diagnostice rakoviny. Mikrofluidní zařízení obsahuje mikročástice s imobilizovanou Ab proti CEA. CEA ze vzorku se váže na protilátku. Na vzniklý komplex se váží protilátky proti CEA a dále zlatem značené protilátky proti CEA Strana 31může být detekován. protilátkám. Komplex obsahující zlaté částice
Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic
Zařízení obsahuje lože mikročástic. Úniku mikročástic je zabráněno zúžením kanálku. Roztoky obsahující analyty jsou dávkovány tlakem řízenou konvekcí. Zařízení je schopno zpracovávat paralelně několik vzorků. Strana 32
Příklad komerčních proteinových čipů Kompaktní analyzátor Sandia fluorescenčně značených proteinových toxinů – nM koncentrace
Modrý diodový laser excituje fluorescenční značku proteinů
Jádrem analyzátoru je mikrofluidní čip fungující na principu kapilární elektroforézy
Transport vzorků je realizován elektrokineticky
Strana 33
Průtoková cytometrie
Metoda slouží k identifikaci a kvantifikaci specifických buněk – třídění buněk Typické aplikace – detekce rakovinných buněk v krvy, detekce mikroorganizmů Buňky se pohybují v sérii kanálkem a specifické buňky (například značené fluoreskující protilátkou) jsou opticky detekovány 34
Průtokový cytometr v mikrofluidním čipu
Chen HT, Wang YN, MICROFLUIDICS AND NANOFLUIDICS 6, 529-537, 2009
35
FACS - fluorescence activated cell sorting
http://www.thoughtyoumayask.com/picsbtqq/fluorescence-activated-cell-sorting/2
Přednáška #12
Strana 36
Elektrostatický dezintegrátor buněk Krátkodobé pulsy (50 ms) silného elektrického pole (1×107 Vm-1) dezintegrují buněčnou membránu/stěnu
Carlos de la Rosa et al, IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL ENGINEERING, VOL. 55, NO. 10, OCTOBER 2008
37
Dielektroforéza v AC elektrickém poli • • • • • • • •
Dielektroforetická síla působí částice dielektrika v nehomogenním elektrickém poli Jedná se o interakci časově proměnného elektrického pole (AC) a parciálního náboje molekul nebo částic dielektrika (dipólu) Částice nemusí nést celkový elektrický náboj Velikost dielektroforetické síly závisí na tvaru částice, elektrických vlastnostech částic a okolního kapalného média, frekvenci AC elektrického pole Dielektroforetická síla nezávisí na polaritě elektrického pole Částice jsou vtahovány do oblastí s nejvyšší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta vyšší (jsou lépe polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média (pozitivní dielektroforéza) Částice jsou vtahovány do oblastí s nejnižší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta nižší (jsou hůře polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média Vysoce selektivní metoda pro manipulaci a separaci mikro a nanočástic, buněk atd.
Přednáška #12
Strana 38
Dielektroforéza v mikročipu - příklad
• Separování a koncentrování směsi kvasinek a polystyrénových mikročástic • Buňky – malé, světlé • Polystyrénové mikročástice – velké, tmavé
(Zhou et al., 2005)
Přednáška #12
Strana 39
Dielektroforéza - princip • • • •
Frekvenčně závislá – pozorovatelná až při velmi vysokých frekvencích (reorientace dipólů) Lépe (rychleji) jsou polarizovány dielektrika s větší dielektrickou konstantou Tato více polarizovaná dielektrika jsou vtahovány do oblasti větších intenzit elektrického pole (pozitivní dielektroforéza) Částice více polarizované vytlačují z těchto míst částice méně polarizované (negativní dielektroforéza)
+
d d+
d d+
Přednáška #12
Strana 40
Dielektroforéza – celková síla působící na kulovou částici • Pro malé frekvence je Clausius-Mossotiho faktor (člen v závorce záporný) • Pro vyšší frekvence je kladný * * p m DEP 3 Erms 2 F 2r m * 2 * m p g k* k i 2f
Strana 41
Detektor červených krvinek založený na dielektroforéze
Minerick et al. Electrophoresis (2003).
Strana 42
• Ve AC elektrickém poli se částice s odlišnou dielektrickou konstantou než má nosný elektrolyt koncentrují v místech největší nebo nejmenší intenzity elektrického pole. • Buňky jsou také odpuzovány z povrchu elektrod vlivem elektrodové polarizace interagující s polarizací buněčné membrány.
Kombinovaný AC elektroosmotický mísič a dielektroforetický koncentrátor • Systém dvou soustředných elektrod na které je vloženo AC elektrické pole. • Tangenciální coulombovskou silou je ke středu centrální elektrody strháván elektrický náboj tvořený polarizací elektrody. • Pohybující se náboj strhává tekutinu, která proudí tangenciálně ke středu elektrody a poté normálovým směrem od elektrody. • Dochází tak k promíchávání roztoku. • Nad středem centrální elektrody jsou potom dielektroforetickou silou selektivně zachytávány molekuly DNA.
Strana 43
Detektor bakterií založený na elektroosmotickém transportu ve střídavém elektrickém poli
Zachycení Escherichia coli ve stagnantních bodech elektrod. Wu et al. Microfluid Nanofluid (2005).
Strana 44
• Páry ko-planárních elektrod. • AC zdroj vytváří časově proměnné elektrické pole. • Vlivem tangenciální složky elektrického pole dochází ke tvorbě vírů. • Nad určitým místem elektrod vzniká stagnantní bod s nulovou tangenciální coulombovskou silou a bez pohybu tekutiny, kde jsou zachycovány částice – buňky.
