POSISI FILOGENETIK KURA-KURA Carettochelys insculpta (REPTILIA: TESTUDINATA)
Oleh: Cynthia Savitri Puspa G34101070
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005
ABSTRAK CYNTHIA SAVITRI PUSPA. Posisi Filogenetik Kura-kura Carettochelys insculpta (Reptilia: Testudinata). Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan RIKA RAFFIUDIN. Carettochelys insculpta merupakan kura-kura air tawar endemik di daerah Papua bagian selatan dan Australia utara. Hingga saat ini posisi filogenetik C. insculpta belum jelas. Sebagian besar hasil penelitian menunjukkan bahwa C. insculpta berkerabat dekat dengan famili Trionychidae, tetapi beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa C. insculpta tidak berkerabat dekat dengan famili tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis posisi filogenetik C. insculpta dalam ordo Testudinata dengan menggunakan urutan nukleotida 12S rRNA, 16S rRNA, dan gabungan kedua gen tersebut. Sampel DNA diambil dari tiga individu C. insculpta yang berbeda. Dua spesies yang digunakan sebagai outgroup adalah Alligator mississippiensis dan Iguana iguana. Analisis filogenetik dilakukan dengan metode Neighbor-Joining dengan model tes Felsenstein 1981 (F81). Pohon filogenetik hasil analisis gen 12S rRNA bersifat politomi, sedangkan hasil analisis filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA dan gabungan 12S rRNA dan 16S rRNA menunjukkan bahwa C. insculpta berada diantara famili Cheloniidae dan Trionychidae.
ABSTRACT CYNTHIA SAVITRI PUSPA. Phylogenetic Position of Carettochelys insculpta Turtles (Reptilia: Testudinata). Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and RIKA RAFFIUDIN. Carettochelys insculpta is an endemic freshwater turtle of southern Papua and northern Australia. Phylogenetic position of this turtle is remain unresolved until now. Most of the research conducted show close relationships of C. insculpta and members of Trionychidae family. However, some of the research show distance between C. insculpta and members of Trionychidae family. This research is conducted to analyze phylogenetic relationship between C. insculpta and other members of Testudinata using 12S rRNA, 16S rRNA, and both gene as markers. DNA samples were obtained from three different organisms of C. insculpta. Two species used as outgroups were Alligator mississippiensis and Iguana iguana. Phylogenetic analysis was carried out using Neighbor-Joining method with Felsenstein 1981 (F81) modeltest. A polytomy tree of Testudinata was produced by using 12S rRNA gene. However, analysis using 16S rRNA and both genes as markers confirmed that C. insculpta was located between the Chelonidae and the Trionychidae family.
POSISI FILOGENETIK KURA-KURA Carettochelys insculpta (REPTILIA: TESTUDINATA)
Skripsi Sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada Departemen Biologi IPB
Oleh: Cynthia Savitri Puspa G34101070
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005
Judul Nama NIM
: POSISI FILOGENETIK KURA-KURA Carettochelys insculpta (REPTILIA: TESTUDINATA) : Cynthia Savitri Puspa : G 34101070
Menyetujui, Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Achmad Farajallah, MSi. NIP.131878947
Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. NIP. 131999583
Mengetahui, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS. NIP. 131473999
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 13 Juli 1983 dari pasangan Andi Soerjono Gondo dan Theresia Lianto. Penulis adalah putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMUK Sang Timur Jakarta dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru pada tahun yang sama. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar, Genetika Dasar, Botani Umum, dan Vertebrata untuk S1 pada tahun ajaran 2004/2005. Penulis juga pernah melakukan Praktik Lapang di Rumah Sakit Kanker Dharmais Jakarta selama 5 minggu dengan judul Deteksi Dini Kanker Payudara dan Kanker Leher Rahim di Rumah Sakit Kanker Dharmais.
PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa untuk berkat dan rahmat yang telah dilimpahkanNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan dengan baik. Karya ilmiah ini mengambil topik analisis filogenetik Carettochelys insculpta berdasarkan data molekular. Pemilihan topik ini diharapkan dapat menambah khasanah pengetahuan tentang sumber daya alam Indonesia. Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Bapak Achmad Farajallah dan Ibu Rika Raffiudin selaku pembimbing yang telah banyak memberikan ilmu, bimbingan, masukkan, dan dorongan kepada penulis, juga kepada Pak Adi dan Mba Tini, serta seluruh dosen dan staf Laboratorium Zoologi lainnya atas segala bantuan dan dukungan yang diberikan. Ungkapan terima kasih lainnya penulis sampaikan kepada Ibu Anja Meryandini selaku wakil dari Departemen Biologi yang telah bersedia menguji dan memberikan masukkan kepada penulis untuk memperbaiki karya ilmiah ini. Pada kesempatan ini penulis juga ingin mengucapkan terima kasih kepada drh. Suswanto dari Praktek Dokter Hewan Bersama Cucu Sajuti, Bp. Budi dan drh. Muchlis dari Pusat Penyelamatan Satwa Cikananga (Sukabumi), dan Ibu Irma Kawulur MSi. dari Universitas Papua yang telah banyak membantu penulis dalam pengambilan sampel. Ungkapan terima kasih yang tulus juga penulis sampaikan untuk kedua orang tua dan kakak tercinta, juga kepada Pak Jaya, Bu Mala, Pak Andre, Bu Eli, Pak Adi, Bu Cindy, dan Samuel untuk semua kasih sayang, perhatian, doa, dukungan, dorongan, dan motivasi yang telah diberikan kepada penulis untuk segera menyelesaikan karya ilmiah ini. Selain itu, terima kasih juga kepada Bambang, Beum Fonger, Beum Edi, Beum Andrew, Kak Cahya, Ae, Evi, Suryo, Ratna, Udit, Anne (2), Deris, Duti, Fitri, Ati, Trio, Deri, Made, Ambar, Dinie, dan teman-teman Abiola lainnya yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, juga kepada Kak Berry, Kak Cung, Kak Andre, Mba Kanthi, Mba Ani, Mba Dika, Mba Ine, dan semua pihak yang telah banyak memberikan masukkan dan bantuannya baik moril maupun material. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2005
Cynthia Savitri Puspa
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR................................................................................................................... vi DAFTAR TABEL ......................................................................................................................
vi
PENDAHULUAN Latar Belakang.................................................................................................................. Tujuan ............................................................................................................................... Waktu dan Tempat............................................................................................................
1 1 1
BAHAN DAN METODE Pengambilan Sampel......................................................................................................... Ekstraksi dan Isolasi DNA................................................................................................ Amplifikasi dan Pengurutan Nukleotida DNA ................................................................. Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis Filogenetik.......................................................
1 1 2 2
HASIL Hasil Amplifikasi dan Pengurutan Nukleotida ................................................................. Posisi Filogenetik C. insculpta .........................................................................................
2 3
PEMBAHASAN..........................................................................................................................
3
KESIMPULAN ...........................................................................................................................
4
DAFTAR PUSTAKA..................................................................................................................
4
LAMPIRAN ................................................................................................................................
8
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Karapas (a) dan plastron (b) C. insculpta.................................................................................. 5 2 Posisi primer AF05, AF06, dan AF08 pada genom mitokondria Dogania subplana ............... 5 3 Pita DNA C. insculpta hasil amplifikasi dengan pasangan primer AF05-AF08 (a) dan AF06-AF08 (b) ......................................................................................................................... 5 4 Pohon filogenetik hasil rekonstruksi berdasarkan data urutan nukleotida 12S rRNA (a), 16S rRNA (b), dan data urutan nukleotida gabungan (c) menggunakan metode NJ dengan model tes F81............................................................................................................................ 6
DAFTAR TABEL Halaman 1 Spesies ingroup dan outgroup yang digunakan sebagai pembanding dalam analisis filogenetik ................................................................................................................................. 7 2 Komposisi nukleotida untuk masing-masing sampel C. insculpta............................................ 7 3 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan metode F81 dan rasio transisi terhadap transversi (ts/tv) (di atas diagonal) berdasarkan gen 12S rRNA (a), 16S rRNA (b), dan gabungan kedua gen tersebut (c) antar anggota ordo Testudines dan outgroup ....................... 7
POSISI FILOGENETIK KURA-KURA Carettochelys insculpta (REPTILIA: TESTUDINATA)1 Cynthia Savitri Puspa, Achmad Farajallah dan Rika Raffiudin Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor Jalan Pajajaran Bogor 16144
ABSTRAK Carettochelys insculpta merupakan kura-kura air tawar endemik di daerah Papua bagian selatan dan Australia utara. Hingga saat ini posisi filogenetik C. insculpta belum jelas. Sebagian besar hasil penelitian menunjukkan bahwa C. insculpta berkerabat dekat dengan famili Trionychidae, tetapi beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa C. insculpta tidak berkerabat dekat dengan famili tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis posisi filogenetik C. insculpta dalam ordo Testudinata dengan menggunakan karakter 12S rRNA, 16S rRNA, dan gabungan kedua gen tersebut. Sampel DNA diambil dari tiga individu C. insculpta yang berbeda. Dua spesies yang digunakan sebagai outgroup adalah Alligator mississippiensis dan Iguana iguana. Analisis filogenetik dilakukan dengan metode Neighbor-Joining dengan model tes Felsenstein 1981 (F81). Pohon filogenetik hasil analisis gen 12S rRNA bersifat politomi, sedangkan hasil analisis filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA dan gabungan 12S rRNA dan 16S rRNA menunjukkan bahwa C. insculpta berada diantara famili Cheloniidae dan Trionychidae.
ABSTRACT Carettochelys insculpta is an endemic freshwater turtle of southern Papua and northern Australia. Phylogenetic position of this turtle is remain unresolved until now. Most of the research conducted show close relationships of C. insculpta and members of Trionychidae family. However, some of the research show distance between C. insculpta and members of Trionychidae family. This research is conducted to analyze phylogenetic relationship between C. insculpta and other members of Testudinata using 12S rRNA, 16S rRNA, and both gene as markers. DNA samples were obtained from three different organisms of C. insculpta. Two species used as outgroups were Alligator mississippiensis and Iguana iguana. Phylogenetic analysis was carried out using Neighbor-Joining method with Felsenstein 1981 (F81) modeltest. A polytomy tree of Testudinata was produced by using 12S rRNA gene. However, analysis using 16S rRNA and both genes as markers confirmed that C. insculpta was located between the Chelonidae and the Trionychidae family.
1
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi, Fakultas MIPA IPB tahun 2005
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Ordo Testudinata atau kura-kura moderen adalah kelompok kura-kura yang masih ada dan hidup hingga saat ini. Kura-kura moderen memiliki dua subordo yang dibedakan menurut metode retraksi (penarikan) kepalanya, yaitu Pleurodira dan Cryptodira. Tulang leher Pleurodira bergerak lateral sehingga dapat ditekuk dan ditarik ke samping. Tulang leher Cryptodira bergerak vertikal sehingga dapat ditarik masuk ke dalam tempurungnya. Subordo Cryptodira dapat dibagi menjadi tiga superfamili, yaitu Trionychoidea (Kinosternidae, Dermatemydidae, Carettochelyidae, Trionychidae), Chelonioidea (Dermochelyidae, Platysternidae, Cheloniidae), dan Testudinoidea (Chelydridae, Emydidae, Testudinidae). Subordo Pleurodira dapat dibagi menjadi dua famili yaitu, Pelomedusidae dan Chelidae (Gaffney 1975 dan Iverson 1992). Carettochelys insculpta adalah kura-kura air tawar anggota tunggal famili Carettochelyidae. Karakteristik khusus yang membedakan C. insculpta dengan kura-kura air tawar lain adalah lempeng epidermal menyatu dengan tulang di bawahnya (Gambar 1). Spesies ini merupakan hewan endemik di daerah Australia utara dan Papua bagian selatan (Papua dan Papua Nugini) (Bargeron 1997). Hingga saat ini posisi filogenetik C. insculpta dalam ordo Testudinata masih menjadi perdebatan (Frair 1985, Meylan 1988). Sejak penemuannya, C. insculpta dianggap berkerabat dekat dengan famili Trionychidae (Boulenger 1889 dan Pritchard 1967 dalam Meylan 1987). Namun hasil penelitian Chkhikvadze (1970) dalam Meylan (1987) berdasarkan anatomi cangkang, menunjukkan bahwa famili Carettochelyidae tidak berkerabat dekat dengan famili Trionychidae. Hasil uji imunologi (Chen et al. 1980), serologi (Frair 1985), dan hasil penelitian Fujita et al. (2004) yang menggunakan intron dari gen penyandi protein 35 (R35) mendukung pernyataan adanya hubungan kekerabatan yang erat antara C. insculpta dengan famili Trionychidae, dan menempatkan klad (clade) ini sekerabat dengan semua anggota subordo Cryptodira moderen lainnya. Genom mitokondria (mtDNA) merupakan salah satu penanda yang dapat digunakan dalam analisis filogenetik di antara kelompok besar vertebrata (Zardoya dan Meyer 1998), termasuk kura-kura (Caccone et al. 1999;
Engstrom et al. 2004). Hal ini disebabkan karena mtDNA berukuran kecil, diwariskan secara maternal, dan mempunyai laju mutasi yang relatif cepat dibanding DNA inti. Meskipun demikian, gen-gen dalam mtDNA memiliki laju evolusi yang berbeda-beda. Evolusi tRNA dan rRNA mitokondria relatif lambat jika dibandingkan dengan gen lainnya, karena itu tRNA dan rRNA mitokondria banyak digunakan untuk mempelajari hubungan filogenetik pada tingkat interspesies (Randi 2000). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis posisi filogenetik C. insculpta dalam ordo Testudinata dengan menggunakan karakter 12S rRNA, 16S rRNA, dan gabungan kedua gen tersebut. Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret sampai Juli 2005 di Laboratorium Zoologi Gunung Gede Departemen Biologi FMIPA IPB.
BAHAN DAN METODE Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan adalah epitel mulut, otot paha dan darah dari tiga individu C. insculpta yang berbeda. Epitel mulut diambil dari C. insculpta pasien drh. Suswanto dari Prakter Dokter Hewan Bersama Cucu Sajuti Jakarta. Epitel mulut kemudian disimpan dalam bufer pelisis (NaCl 10 mM, Tris-HCl 20 mM, EDTA 0.1 mM, SDS 0.5%) sebelum diekstraksi lebih lanjut. Otot paha diambil dari spesimen beku C. insculpta koleksi Pusat Penyelamatan Satwa Cikananga (PPSC) Sukabumi dan disimpan dalam etanol 70% dalam bufer TE (Tris-HCl 20 mM, EDTA 20mM, pH 8.00). Darah diambil dari C. insculpta asal Papua koleksi Ibu Irma Kawulur MSi. (Universitas Papua, Indonesia) menggunakan siring berheparin langsung ke posisi jantung dari bagian ventral tubuh. Sekitar 100 µl darah dijadikan sumber sel untuk ekstraksi DNA dan sisanya diawetkan dalam alkohol 70% dalam bufer TE dan disimpan di Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor dengan kode C(d)-01. Ekstraksi dan Isolasi DNA Ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan mengikuti Farajallah (2002). Setelah alkohol pengawet dibuang dan diganti dengan bufer
2
Sodium Tris-EDTA (STE) 1x (NaCl 10 mM, Tris-HCl 20 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.00), sampel otot dipotong-potong sampai halus dan dilisis dengan menggunakan Sarkosil-EDTA (SE) 3% dan proteinase K 0.25 mg/ml. Sampel jaringan epitel mulut dan sampel darah disuspensikan dalam STE 1x dan dilisis dengan Sodium Dodesil Sulfat (SDS) 1% dan proteinase K 0.375 mg/ml. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 55o C dan dikocok pelan selama 3 jam. DNA dipisahkan dari bahan organik lain dengan menggunakan metode ekstraksi fenol, yaitu dengan menambahkan NaCl 5 M 1/10 x volume, larutan fenol 1x volume, dan campuran kloroform : isoamil-alkohol (24:1) 1x volume. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam sambil dikocok pelan. Setelah fase fenol dipisahkan dengan sentrifuse 8000 rpm selama 5 menit, fase air yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung baru, dan ditambahkan NaCl 5 M sebanyak 1/10 x volume dan etanol absolut sebanyak 2x volume untuk mengendapkan DNA. Campuran diinkubasi pada suhu 4o C yang diinapkan semalaman. DNA diendapkan dengan disentrifuse pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Sisa garam dicuci dengan etanol 70% dan diuapkan dalam ruang vakum kemudian endapan DNA disuspensikan dalam bufer TE 80%. Amplifikasi dan Pengurutan Nukleotida DNA Amplifikasi ruas DNA dilakukan menggunakan primer AF05 dan AF08, serta primer internal AF06 (Gambar 2) yang didesain berdasarkan hasil alignment ruas gen 12S rRNA sampai 16S rRNA dari beberapa spesies amfibi dan reptil yang diperoleh dari GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Primer internal AF06 digunakan untuk menguji ketepatan proses amplifikasi yang dilakukan sebelumnya. Jika hasil amplifikasi pertama sesuai dengan target, maka proses amplifikasi dengan menggunakan primer internal AF06-AF08 akan menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 1000 bp. Amplifikasi dilakukan menggunakan mesin Thermocycler TaKaRa MP4. Amplifikasi DNA dilakukan dengan suhu denaturasi awal 94°C selama 5 menit, kemudian dilakukan sebanyak 30 siklus dengan suhu denaturasi 94°C-1 menit, suhu penempelan 50°C-2 menit dan suhu pemanjangan 70°C-2 menit, dan diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 70°C-10 menit. Komposisi 50 µl pereaksi PCR adalah
sampel DNA 10-100 ng, 1.7 unit TaqGold beserta sistim bufernya, dNTP 1.6 mM, MgCl2 2 mM, DMSO 4%, dan primer forward dan reverse masing-masing 1 pmol. Produk hasil PCR kemudian diperiksa dengan metode polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) dan diikuti dengan pewarnaan perak (Tegelstrom 1986). Produk PCR yang berupa pita tunggal dikirim ke fasilitas pengurutan nukleotida untuk dimurnikan dan dijadikan sampel dalam reaksi pengurutan nukleotida menggunakan mesin ABI Prism 3100. Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis Filogenetik Urutan nukleotida diedit secara manual menggunakan program Genetyx Win versi 4.0.1 (Genetyx software, Jepang) berdasarkan pada elektroferogram hasil pengurutan nukleotida. Urutan nukleotida dari semua sampel kemudian di-alignment dengan urutan nukleotida dari beberapa spesies yang terdapat di GeneBank (Tabel 1). Proses alignment dilakukan menggunakan program ClustalW 3.0. (Thompson et al. 1994), kemudian diedit secara manual. Komposisi nukleotida, tipe substitusi, dan rasio substitusi transisi dan transversi (ts/tv) dihitung menggunakan program MEGA 3.0 (Kumar et al. 2001). Penghitungan jarak genetik dan konstruksi pohon filogenetik dilakukan menggunakan program PAUP * Version 4.0b10 for Macintosh (PPC) (Swofford 2002) dengan metode Neighbor-Joining, model tes F81 (Felsenstein 1981). Analisis bootstrap seratus kali dilakukan untuk menguji kestabilan posisi filogenetik dari klad tertentu pada pohon filogenetik yang dihasilkan.
HASIL Hasil Amplifikasi dan Pengurutan Nukleotida Pasangan primer AF05-AF08 menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 3). Hal ini sesuai dengan panjang fragmen DNA yang diperkirakan saat mendesain primer berdasarkan urutan nukleotida Dogania subplana dari famili Trionychidae, yaitu 1475 bp (Farajallah 2002). Hasil pengujian menggunakan primer internal AF06-AF08 berukuran sekitar 1000 bp (Gambar 3). Hal ini menunjukkan bahwa hasil amplifikasi tersebut berasal dari mtDNA yang menjadi target amplifikasi.
3
Proses pengurutan nukleotida menghasilkan urutan nukleotida dengan panjang bervariasi, yaitu 1342 nt untuk C. insculpta PPSC dan 1330 nt untuk C. insculpta Jakarta dan C. insculpta Papua. Urutan nukleotida ini terdiri atas tiga domain, yaitu 12S rRNA (440-452 nt), tRNA Val (70 nt), dan 16S rRNA (820 nt). Persentase nukleotida T = 20.9%; C = 22.8-23.1%; A = 40.3-40.6%; dan G = 15.7-15.8% (Tabel 2). Posisi Filogenetik C. insculpta Analisis filogenetik dilakukan menggunakan hasil alignment urutan nukleotida 12S rRNA, 16S rRNA, dan gabungan keduanya (Lampiran 1). Jarak genetik dari gen 12S rRNA berkisar antara 00.424 sedangkan jarak genetik dari gen 16S rRNA dan gabungan kedua gen tersebut berturut-turut berkisar antara 0-0.438 dan 00.425 (Tabel 3). Tipe substitusi transisi didominasi oleh perubahan nukleotida sitosin menjadi timin atau sebaliknya (56.53%). Ratarata rasio transisi terhadap transversi (ts/tv) untuk gen 12S rRNA, 16S rRNA, dan gabungan kedua gen tersebut, secara berturutturut adalah 1.060, 1.196, dan 1.148. Posisi filogenetik C. insculpta berdasarkan urutan nukleotida gen 12S rRNA membentuk politomi dengan kelompok Cryptodira, Pelomedusidae, dan Chelidae (Gambar 4a), sedangkan berdasarkan urutan nukleotida 16S rRNA dan urutan nukleotida gabungan, C. insculpta terletak diantara famili Cheloniidae dan famili Trionychidae (Gambar 4b dan 4c).
PEMBAHASAN Komposisi nukleotida hasil amplifikasi ketiga individu C. insculpta menunjukkan bahwa hasil amplifikasi didominasi oleh nukleotida adenin dan timin dengan perbandingan A/T dan G/C = 60:40. Rasio transisi dan transversi (ts/tv) rRNA mtDNA berkisar antara 1.060 hingga 1.196. Hal ini menunjukkan bahwa substitusi transversi lebih jarang terjadi dibanding susbtitusi transisi. Jika laju substitusi ini dihitung untuk keseluruhan mtDNA, maka rasio ts/tv bisa mencapai 20 kali atau lebih (Randi 2000), tetapi rasio ts/tv cenderung mendekati 1 untuk ruas-ruas gen yang tidak menyandikan protein (Kumar et al. 2001). Rasio ts/tv lebih dari satu ditemukan juga pada daerah 12S rRNA dan 16S rRNA dari empat spesies kurakura Madagaskar (Caccone et al. 1999) dan dari beberapa spesies Iguania dari famili Agamidae (Honda et al. 2000).
Hasil rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan urutan nukleotida 16S rRNA dan gabungan 12S rRNA dan 16S rRNA menunjukkan bahwa C. insculpta sekerabat dengan anggota famili Trionychidae. Posisi filogenetik C. insculpta berdasarkan kedua data ini berada diantara anggota famili Cheloniidae dan Trionychidae. Hal ini didukung pula oleh beberapa hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya. Bickham et al. (1983), berdasarkan data karyologi, mengelompokkan Carettochelidae dan Trionychidae sekerabat dengan Cryptodira lainnya. Hubungan kekerabatan yang erat dari kedua famili ini juga ditunjang data osteologis hasil penelitian Meylan (1987) yang menunjukkan adanya 10 karakter morfologi (3 karakter cangkang, 4 karakter tengkorak/cranial dan 3 karakter rahang bawah dan nonshell postcrania) yang hanya dimiliki oleh anggota famili Carettochelyidae dan Trionychidae dan lima karakter yang hanya dimiliki oleh anggota famili Carettochelyidae, Trionychidae dan famili Cheloniidae. Sebelum berbagai informasi posisi filogeni banyak dikemukakan, Strauch (1890) dalam Meylan (1987) menganggap Carettochelys sebagai mata rantai yang hilang antara Trionychidae dan Cheloniidae. Hasil uji serologis menunjukkan adanya kesamaan protein darah yang tinggi antara Carettochelys dengan Pelochelys, Trionyx, dan Lissemys yang merupakan anggota dari famili Trionychidae. Kesamaan protein darah terendah terdapat antara Carettochelys dengan Pelomedusa (Frair 1985). Posisi filogenetik C. insculpta berdasarkan urutan nukleotida gen 12S rRNA membentuk politomi dengan kelompok Cryptodira, Pelomedusidae, dan Chelidae (Gambar 4a). Politomi dapat mengindikasikan dua kondisi yang berbeda, yaitu semua keturunan berevolusi pada saat yang bersamaan (politomi keras) atau hubungan filogenetik tidak pasti (politomi lunak). Pada umumnya politomi dianggap sebagai politomi lunak. Politomi pada pohon 12S rRNA ini dapat disebabkan karena domain 12S rRNA merupakan domain yang mengandung pola (TAN) x n sehingga menimbulkan kendala pada proses aligning. Kendala dalam proses aligning juga tercermin dari rasio ts/tv dari gen 12S rRNA. Meski rata-rata rasio ts/tv gen 12S rRNA hampir sama dengan rata-rata rasio ts/tv gen 16S rRNA, tetapi rasio ts/tv gen 12S rRNA memiliki keragaman yang lebih tinggi (0.376). Hal ini membuktikan bahwa urutan nukleotida 12S rRNA kurang informatif untuk
4
digunakan dalam analisis filogenetik dibandingkan dengan urutan nukleotida 16S rRNA maupun urutan nukleotida gabungan keduanya.
KESIMPULAN Analisis filogenetik berdasarkan gen 12S rRNA menghasilkan pohon yang bersifat politomi, sedangkan analisis filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA dan gabungan gen 12S rRNA dan 16S rRNA menempatkan C. insculpta berada dalam kelompok yang sama dengan famili Trionychidae dan famili Cheloniidae.
SARAN Gen 12S rRNA sebaiknya tidak digunakan sebagai penanda dalam analisis filogenetik C. insculpta karena dapat menyebabkan kekeliruan saat interpretasi data.
DAFTAR PUSTAKA Bargeron M. 1997. The Pig-nosed Turtle, Carettochelys insculpta. Tortuga Gazette 33(3): 1-2. Bickham JW, Bull JJ, Legler JM. 1983. Karyotypes and evolutionary relationships of the trionychid turtles. Cytologia 48:177183. Caccone A, Amato G, Gratry OC, Behler J, dan Powell JR. 1999. A molecular phylogeny of four endangered madagascar tortoises based on mtDNA sequences. Mol Phyl Evol 12: 1-9. Chen BY, Mao SH, dan Ling YH. 1980. Evolutionary relationships of turtles suggested by immunological crossreactivity of albumins. Comp Biochem Physiol 66B: 421-425. Engstrom TN, Shaffer HB, McCord WP. 2004. Multiple data sets, high homoplasy, and the phylogeny of softshell turtles (Testudines: Trionychidae). Syst Biol 53: 693–710. Farajallah A. 2002. Karakterisasi genom mitokondria labi-labi, Dogania subplana (Trionychidae, Testudines, Reptilia) [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: A maximum likelihood approach. J Mol Evol 17: 368-376.
Frair W. 1985. The enigmatic plateless river turtle, Carettochelys, in serological survey. J Herpetol 19:515-523. Fujita MK, Engstrom TN, Starkey DE, Shaffer HB. 2004. Turtle phylogeny: Insights from a novel nuclear intron. Mol Phyl Evol 31:1031–1040. Gaffney ES. 1975. A Phylogeny and Classification of the Higher Categories of Turtles. Bull Am Mus Nat Hist 155: 387436. Honda M, Ota H, Kobayashi M, Nabhitabhata J, Yong HS, Sengoku S, dan Hikida T. 2000. Phylogenetic relationship of the family Agamidae (Reptilia: Iguania) inferred from mitochondrial DNA Sequences. Zool Sci 17: 527-537. Iverson JB. 1992. A Revised Checklist with Distribution Maps of the Turtles of the World. Indiana: Earlham College. Kumar S, Tamura K, Nei M. 2001. Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) V. 3.0. New York: Oxford Univ Pr. Meylan PA. 1987. The phylogenetic relationships of soft-shelled turtles (family Trionychidae). Bull Am Mus Nat Hist 108: 1-101. Meylan PA. 1988. Peltochelys dollo and the relationships among the genera of Carettochelyidae (Testudines: Reptilia). Herpetologica 44: 440-450. Randi E. 2000. Mitochondrial DNA. Di dalam: Baker AJ, ed. Molecular Methods in Ecology. Oxford: Blackwell Sci Ltd. Swofford DL. 2002. PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods) 4.0 Beta. Massachusetts: Sinauer Associates, Inc. Pub. Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural population: An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7: 226-229. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673-4680. Zardoya R dan Meyer A. 1998. Complete mitochondrial genome suggest diapsid affinity of turtles. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14226- 14231.
5
(a)
(b)
Gambar 1 Karapas (a) dan plastron (b) C. insculpta
Keterangan : AF05 = 5’-ACT ggg ATT AgA TAC CCC ACT AT AF06 = 5’-ACA CAC CgC CCg TCA CCC TCT TC AF08 = 5’-ATg TTT TTg gTA AAC Agg Cg Gambar 2 Posisi primer AF05, AF06, dan AF08 pada genom mitokondria Dogania subplana (Farajallah 2002)
1500
Ci Papua
Ci Papua
Ci Jakarta
Ci PPSC
(a)
1000
(b)
Gambar 3 Pita DNA C. insculpta hasil amplifikasi parsial gen 12S rRNA sampai 16S rRNA dengan pasangan primer AF05-AF08 (a) dan AF06-AF08 (b). M = marker.
6
Chinemys – Emydidae (Batagurinae) Chelonia -- Cheloniidae
79 100 51
Chrysemis – Emydidae (Emydinae) Dogania Pelodiscus
100
Trionychidae
Emydura -- Chelidae
100
Pelomedusa -- Pelomedusidae 68 100
65
Ci PPSC Ci papua Ci jkt
Carettochelyidae Alligator -- Crocodylidae
Iguana -- Iguanidae
0.1
(a) Dogania
100
Trionychidae
Pelodiscus 80
83 100
Ci jkt
Carettochelyidae
Ci papua Ci PPSC
83
Chelonia -- Cheloniidae
95
Chinemys – Emydidae (Batagurinae)
71
Chrysemis – Emydidae (Emydinae) Emydura -- Chelidae
84
80
Pelomedusa -- Pelomedusidae Alligator -- Crocodylidae Iguana -- Iguanidae
0.1
(b) Dogania
100
Pelodiscus 73
51 100
84
Trionychidae
Ci jkt Ci papua
Carettochelyidae
Ci PPSC Chelonia -- Cheloniidae
100 61
Chinemys – Emydidae (Batagurinae) Chrysemis – Emydidae (Emydinae)
89
Emydura -- Chelidae
83
Pelomedusa -- Pelomedusidae Alligator -- Crocodylidae Iguana -- Iguanidae
0.1
(c) Gambar 4 Pohon filogenetik hasil rekonstruksi berdasarkan data urutan nukleotida 12S rRNA (a), 16S rRNA (b), dan data urutan nukleotida gabungan (c) menggunakan metode NJ dengan model tes F81. Nomor di atas percabangan menunjukkan nilai bootstrap 100x.
7
Tabel 1 Spesies ingroup dan outgroup yang digunakan sebagai pembanding dalam analisis filogenetik Spesies
Famili
Subordo
No. Acc.
Dogania subplana Pelodiscus sinensis Chelonia mydas Chrysemis picta Chinemys reevesi Pelomedusa subrufa Emydura subglobosa Alligator mississippiensis* Iguana iguana*
Trionychidae Trionychidae Cheloniidae Emydidae Emydidae Pelomedusidae Chelidae Crocodylidae Iguanidae
Cryptodira Cryptodira Cryptodira Cryptodira Cryptodira Pleurodira Pleurodira -
AF366350 AY687385 AB012104 AF069423 AY676201 AF039066 unpub. data Y13113 AJ278511
Keterangan : * = outgroup Tabel 2 Komposisi nukleotida untuk masing-masing sampel C. insculpta Komposisi Nukleotida (%) T(U) C A G
Sampel Ci Jakarta Ci Papua Ci PPSC Rata-rata
20.9 20.9 20.9 20.9
22.8 22.8 23.1 22.9
40.6 40.5 40.3 40.47
Jumlah nukleotida
15.7 15.8 15.7 15.73
1330 1330 1342 1334
Tabel 3 Jarak genetik (di bawah diagonal) menggunakan model tes F81 dan rasio transisi terhadap transversi (ts/tv) (di atas diagonal) berdasarkan gen 12S rRNA (a), 16S rRNA (b), dan gabungan kedua gen tersebut (c) antar anggota ordo Testudines dan outgroup (a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dogania Pelodisc Ci PPSC Ci jkt Ci papua Chinemys Chrys Chelonia Emydura Pelomed A miss Iguana
1 0.116 0.219 0.216 0.216 0.232 0.195 0.228 0.283 0.246 0.386 0.307
2 31/12 0.199 0.195 0.195 0.210 0.196 0.202 0.256 0.206 0.384 0.292
3 36/39 29/41 0.002 0.002 0.232 0.250 0.233 0.243 0.254 0.374 0.284
4 36/38 29/40 0/1 0.000 0.228 0.246 0.230 0.240 0.250 0.370 0.280
5 36/38 29/40 0/1 0/0 0.228 0.246 0.230 0.240 0.250 0.370 0.280
6 44/34 38/35 42/37 42/36 42/36 0.124 0.105 0.261 0.280 0.393 0.313
7 41/26 34/35 44/41 44/40 44/40 24/21 0.121 0.230 0.282 0.393 0.307
8 48/29 37/34 48/32 48/31 48/31 29/10 29/16 0.241 0.284 0.417 0.291
9 46/46 41/45 41/42 41/41 41/41 42/45 33/46 42/40 0.259 0.417 0.312
10 37/45 29/42 37/48 37/47 37/47 47/45 47/46 52/41 42/44 0.424 0.282
11 61/58 57/63 65/53 65/52 65/52 65/57 63/58 69/58 66/61 64/64 0.400
12 49/47 49/44 43/48 43/47 43/47 51/48 51/46 52/41 48/51 47/44 63/58 -
(b) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dogania Pelodisc Ci PPSC Ci jkt Ci papua Chinemys Chrys Chelonia Emydura Pelomed A miss Iguana
1 0.146 0.222 0.220 0.220 0.223 0.206 0.222 0.280 0.324 0.382 0.410
2 72/31 0.222 0.222 0.222 0.179 0.189 0.215 0.252 0.282 0.323 0.418
3 74/73 82/63 0.001 0.001 0.230 0.222 0.201 0.255 0.288 0.366 0.382
4 73/73 82/63 1/0 0.000 0.230 0.222 0.201 0.255 0.290 0.365 0.382
5 73/73 82/63 1/0 0/0 0.231 0.222 0.201 0.256 0.290 0.366 0.382
6 85/63 78/44 81/70 81/70 81/70 0.128 0.140 0.216 0.265 0.364 0.345
7 80/59 83/45 79/68 79/68 79/68 62/30 0.134 0.204 0.269 0.341 0.358
8 87/61 92/51 71/64 71/64 71/64 70/29 62/34 0.200 0.256 0.350 0.341
9 100/79 94/68 91/75 91/75 91/75 81/64 77/62 68/67 0.223 0.362 0.360
10 108/86 98/75 96/81 97/81 97/81 88/80 90/79 80/81 86/61 0.365 0.426
11 113/105 98/93 102/110 102/110 102/110 108/103 105/98 102/104 101/110 110/97 0.438
12 123/104 133/95 120/98 120/98 120/98 106/95 111/96 109/89 108/100 131/103 123/114 -
(c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dogania Pelodisc Ci PPSC Ci jkt Ci papua Chinemys Chrys Chelonia Emydura Pelomed A miss Iguana
1 0.135 0.221 0.219 0.219 0.226 0.202 0.224 0.281 0.295 0.383 0.373
2 103/43 0.214 0.212 0.212 0.190 0.191 0.210 0.252 0.254 0.344 0.371
3 110/112 111/104 0.002 0.002 0.230 0.231 0.212 0.251 0.276 0.368 0.347
4 109/111 111/103 1/1 0.000 0.229 0.230 0.211 0.250 0.276 0.367 0.345
5 109/111 111/103 1/1 0/0 0.229 0.230 0.211 0.250 0.276 0.367 0.345
6 129/97 116/79 123/107 123/106 123/106 0.126 0.128 0.230 0.270 0.374 0.334
7 121/85 117/80 123/109 123/108 123/108 86/51 0.129 0.213 0.273 0.358 0.340
8 135/90 129/85 119/96 119/95 119/95 99/39 91/50 0.213 0.265 0.373 0.324
9 146/125 135/113 132/117 132/116 132/116 123/109 110/108 110/107 0.234 0.380 0.344
10 145/131 127/117 133/129 134/128 134/128 135/125 137/125 132/122 128/105 0.384 0.373
11 174/163 155/156 167/163 167/162 167/162 173/160 168/156 171/162 167/171 174/161 0.425
12 172/151 182/139 163/146 163/145 163/145 157/143 162/142 161/130 156/151 178/147 186/172 -
8 Lampiran 1 Situs variabel hasil alignment gen 12S rRNA dan 16S rRNA dari 10 individu anggota ordo Testudinata. Angka di atas urutan nukleotida dibaca vertikal menunjukkan posisi nukleotida di bawahnya. Tanda – menunjukkan gap dan tanda . menunjukkan nukleotida yang sama dengan nukleotida pada baris pertama Gen 12S_rRNA 1111222233 0347123502 -AGTTAACTA T.T.....A. T.T.....AT T.T.....AT T.T.....AT T.T.....AC T.T.C...A. T.T.....AC TGT.....AT T.TG.T..AC C.T.C.GA.. C.T.....A.
3333444444 3789034568 ATTACTCTTT ..C....C.. C.C....C.. C.C....C.. C.C....C.. C.C.....C. C.C.....C. T.CG....C. C.C.GC..CC .....C.C.. CCG..C...A ......T...
5555555666 1234568013 CAATC-ACCA ...CT-.... .T.ATA.... .T.ATA.... .T.ATA.... .....-C... T..-.-.... ...A.-..T. .C.---.... .-.-TC.... .T.CT-.T.G .GCAT-....
7777788888 0678902345 AA-CAGCTAC ..-....... G.-...T... G.-...T... G.-...T... ..C...T... ..C...T... ..C....... TCA.G.T... GTAA..TC.. GGCA...CGT GGC..AT...
8899999999 7801234678 TTTAAAAAC...G...T.C..G-....C..G-....C..G-....CC.G-.GG.C..G..GG-T CC.G-.GG.C C.CT-..GA...G...-.T CC.TTG.GGA CC.G--.GGC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
111111111 9000000011 9012567801 A-AAGTAACT .-........ .T.......C .T.......C .T.......C .TT......A .C.......A .C.......A GC.C.....A .-.......A .AC.ACGC.G CC......TA
1111111111 1111122222 2578901234 CCGCC-CAGA .T..T-ATT. ....TA..TC ....TA..TC ....TA..TC ATA.T-A.A. A.ATA-T.A. ATA..-T.A. ...TT-T.C. AT..T-ACT. ....TCA.CC ...TT--TA.
1111111111 2222333445 5678124393 CAGCACAATT .....A...C .....A.... .....A.... .....A.... --.T...... .CAT...... ..AT.T.... ..A..TG..C ....GA.C.C G.....C.CC ..A..AC...
1111111111 5555566667 4678901790 ATTAAGAAAA .......... TC..G..... TC..G..... TC..G..... T..G...... ...G...... .C.G...... .-.G...... .-..G.GTT. .-C...G..G .-...A..CG
1111111111 8889999999 5790123456 C-TAACAGTA .-...T..A. .TCC.A..A. .TCC.A..A. .TCC.A..A. .-..CT..A. .-C.CT..A. .-.TCT..A. .-C.CT..A. .-A..T..A. .CAC.TGTAG T--..T.TA.
1122222222 9900000000 8901234567 T--AACCACA .TA......G .--.C.A..G .--.C.A..G .--.C.A..G .AA.TTT..G .AAC..TCAC .AA--....G .--.T....G .--.TT...G AAT.TT..AC A---CA...G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2222222222 0111111112 9012345783 AACAGAACAA .......T.. .TAT...TT. .TAT...TT. .TAT...TT. ..AG...T.. G.A....T.. ..GGAG.... C.A...G.CG -.....C.T. G.G..CCT.. C.A..TG...
2222222222 2222223333 4567890123 TATGACCTGA C.CAGT..AG C.A.T.T.A. C.A.T.T.A. C.A.T.T.A. ..A.T..CA..-.TT.A...G.T..CA....GA.CT. C.G.GA..A. ..CAGGACTG CCA.CA..AG
2222222222 3334445555 4560190678 ATTAAGTATT ......C... C-ACC.C... C-ACC.C... C-ACC.C... --CT..C.CC --CT..C.C. --CC..C.C. --AT..CTG. --.TT.CTC. TCACC.C.C. ---GCA.GA.
2222222222 5666666667 9013456890 AAGATA-AGA G.....-... G.AGC.-... G.AGC.-... G.AGC.-... GG.TC.T.AT GG..C.-... GGA.C.-C.. G.AGC.-... ......-.A. GG..AG-.AT --A.C.A.A.
2222222222 7777777788 1234567934 ACTTAATTAA G.CC.....G GT.C.....T GT.C.....T GT.C.....T ..CCG...-T G.CC.....C G.CC....-C G.CC.CA.CT G.C..TA..C ..C..G.G-T .....TC..C
2222222222 8888999999 5689013456 CGACCTAGGT .......... A.CT...... A.CT...... A.CT...... ..T....... ..T....... ..T....... ...T..G.AC ..C...G.AC ..TAAC.A.. .CCT..GA.C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2233333333 9900122222 7801914678 GCCACAAC-........CA ATTCTC..AA ATT.TC..AA ATT.TC..AA ....TC.A-....T..TAT ....TC.AAA ....TCG-AA AA..TC.TAA ..T.TCG--....TC.---
3333333333 2333333333 9023456789 --ATAATTAA AC.AT...T. AC.CC.AC.. AC.CC.AC.. AC.CC.AC.. -T..CCAACC CA.CC.A... TT.CCTAAT. AC.AC.AC.. --C....C.. --CCC.AC.. --C...AAC.
3333333333 4444444455 0123456803 ACTGT--ATC ..C..--... ..-..--... ..-..--... ..-..--... .TCA.T-..A ..CA.--..A ..CA.--..A T..A.--..A C.CC.T-C.A .A..CCC.C. CACC.ATC..
3333333333 5555556666 4567890145 ACCCCAC-AA ...TT.TC.C ..-..CAA.. ..-..CAA.. ..-..CAA.. C..A..AC.. C.-AT.AC.. C.-AT.AC.. C.A..CTC.C TTAA..AA.C .GG.ACAATG ..TAACAT-T
3333333333 6666777778 6789012680 ATAAA-CTGG .C...-.... .AT..TA.A. .AT..TA.A. .AT..TA.A. .C...-..A. .....A..A. .C...-T.A. .AC.TAG.A. .....AGGAA T.GGGCA... .CT..-A.A.
3344444444 8900001112 1412361583 TATGTCGCTC C......T.. C......T.A C......T.A C......T.A C..AC..T.A C..AC....A C..AC..T.A CT.C...T.A C......T.A A.C......A CTC.CTATCA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4444 2222 4567 TA-..-CCCCCCCCCC.TT ..TC.T..C..CC C.TC.A-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dogania Pelodiscus Ci_PPSC Ci_jkt Ci_papua Chinemys Chrysemis Chelonia Emydura Pelomedusa Alligator Iguana
9 Gen 16S_rRNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4444444444 3334444444 4890123579 G-AACTCCGT .-..TCTT.. TTCCAC.-.. TTCCAC.-.. TTCCAC.-.. .-C.AC.-.C .-..A..-.C .-C.A..-.C .A..AC.-.C .G.CA.A-.C --------AC --------AC
4444444444 5555556666 1346780123 ACCACCGT-A GTT..TAC-. ....T.ACC. ....T.ACC. ....T.ACC. ....-AACA. G.-..AACA. .....A-CT. ..-..TACT. -T--.T-CT. -T-T.T.CCC .A-..T.CCC
4444444444 6666667777 4567890236 TCAACCCACA .-........ -A...A.... -A...A.... -A...A.... AA...TT... .A.C....-. CA...T..T. -AT.TT.... -ATCTT.C.C .-.C.T.-.T --...T--.T
4444444444 7888888888 9012456789 CTA-AT-ATT .C.T..-... ...-..T..A ...-..T..A ...-..T..A .A.-.CC..C .A.-..C..A AA.-..A..C TA.T.CC..C TA.C.CC-.C T.C-.C-..G .CC-G.CCCC
4444444445 9999999990 0123456790 --CCAC--C--T-.TT----.T..CT.T --.T..CT.T --.T..CT.T --...TC----.T..C----.T..C--AA.T..C-TT-TT..--.C C-TT.AT-.CC..C.CCT-
5555555555 0000111222 4578237234 A-T-CTACTA .-C-.....C .---...AGC .---...AGC .---...AGC .-C-.C.T.C .A.T.C.T..-C-...T.G-C-...A..-C-T..A..C.C.C.-..---.-C-.G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
5555555555 2333333344 6234568958 CTAA-TCATA T...-..TCG ....ACTT.. ....ACTT.. ....ACTT.. .C.--.TT.. .C.--.T... .C.--..T.. ..TG-.T... -...-ATT.. T...CATT.T .CGG-A.-G.
5555555555 5555566666 1456901345 TTAGAAGATT CC........ A......... A......... A......... C......... .......GAA C.......CA A.......CC A......... CA....T..A C.CACGT..A
5555555555 6677777888 8901267012 AC--AAAAAT ..--...... ..TC...T.. ..TC...T.. ..TC...T.. GT--TG.... ..--.G.G.. .T--TGC... ..T--G.T.. .TT-.G.CC. .TC-.GC..C .TCTTGCT..
5555566666 8888900001 4789725685 TAATTAA-A....CG.-.GG..CG.A.GG..CG.A.GG..CG.A.G...CG.G.AG.CCG.G.AG.CCGTG.A..CCG.G.AG.CCG.GCGT.ACG.A.T G.GCCG.C.A
6666666666 1122233333 8968901237 CTTAAATTCG A.C..C.CT. TA-----C.A TA-----C.A TA-----C.A .A.CTCACT. .A-C-CACT. .A.CTGACT. .ACCCCAC.. TA.CTCAC.. AA---CA-T. .A----A-..
6666666666 3344445555 8913461456 C-AAATAATT .C...-.G.. TG.C....C. TG.C....C. TG.C....C. .CT..-.... .AT..-.... .CC..-.... .A...-.... .C...-...T-..CC..CC T-C.CCG.C-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6666666666 5666777788 9056234913 CTTGCTTCTA AC..T.CT.. AC..T..T.. AC..T..T.. AC..T..T.. TC.AT..... .C.ATC.... .C.A...... AC..T..A.. AC..T..... .C.CT.C..G ACC.....C.
6666666677 8889999900 5680235801 TTGCGATTCC .....-C.A. ...T.-CCT. ...T.-CCT. ...T.-CCT. .....-C..T ..A..-CCAT ..AT.-CC.T ...T.-C..T .....-C.A. ...AACCCA. CC.A.-A.-T
7777777777 0000011111 2356901246 -TAGAAGAAA -......... -C.....C.. -C.....C.. -C.....C.. AC......CC -......... -C.....C.. TC......G. AGGA..A... -.G...A... AC..CGCCC.
7777777777 1122222222 7903456789 CAATTTAATA .G......A. ......GT.. ......GT.. ......GT.. ....C.G.AC ....C...AC ....C.G.AC ....A.G.G. T..CCCCTCC TT..CAC.C. ..CCC.GTAT
7777777777 3333445555 0579120123 CCATAGCTTA .A......C. TA.C...... TA.C...... TA.C...... .A.C...... .A.C...... TA.C...... TA........ .A.CGAT... AA..G...A. .ATC...CAT
7777777777 5555666666 4568023578 AAGCGAACTC .....C.T.A .G.A.CT... .G.A.CT... .G.A.CT... .....CG... .....C.T.. .....C.T.. T.A..TTTA. ....ATTTG. CTA..T.-.T C..T.CGT--
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
7777777777 6777777888 9035689014 CCTAACTACC ATC......A AT-GG...TA AT-GG...TA AT-GG...TA A--.G....A A.-.G...-A A.-.G...-A A--G...T.A A--..T...A T--G....-A A--G..C.-A
7777778888 8889990001 5690275790 CTATTGATAC A........T AAG.....GA AAG.....GA AAG.....GA A.G.....GA A.G.....GA A.G.....GA A-G.....GA A.G.....GA .C-C...CGG -CG.CAG.GG
8888888888 1111111222 1235679123 AAGGCTCAAG ...C..T... ..AC.C.... ..AC.C.... ..AC.C.... ...C..A... .G.C..A... ...C..A... ...CT.A... G..C.CT..A ...CTA.T.. .CAT..A-G.
8888888888 2233444445 7869145780 AGTTACGCCA ..G..GA... ..G.CGA.TG ..G.CGA.TG ..G.CGA.TG ..G..GA.TG .AG.TGA.TG ..G..GC.TG .AG..GA.T. ..GA.GAT.. .AG.CGA... C.G.CGA.TG
8888888888 5666667777 1267890345 GTTCAATTAG .......A.. ..C....AC. ..C....AC. ..C....AC. .......A.. .......AT. .......A.. .....GGA.. .......A.. .C.TGGAAT. C.CTG..ATA
8888888888 7788888899 7902357812 GGTAGCCACC .A..A..... AAC.AT...T AAC.AT...T AAC.AT...T AT..AT...T A...AT...T AA.TAT...T AAA.AT.T.T AAATAT.T.T AC.TAT.CTG AC..ATT.TT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
8888899999 9999900000 5678902345 AACA-C-CAA ....AT-T.. ..T.T.ATC. ..T.T.ATC. ..T.T.ATC. ...CTT-T.. ..TTTT-T.. ....C.-T.. ..TCC.-T.. ..TCG.-..C ..TTCTCT.. GG.--.-...
9999999999 0001111112 7892356891 AAA-ATAATG ...-.C..A. .GG--A..CC .GG--A...C .GG--A...C ...-CCC.A. ...-.CT.A. ...-.AT.A. .G.--A..A. CC.TGAG.CT.C--A.GA. .GGG.AG.--
9999999999 2222222233 2345678901 -TTA---CAT -...---A.A C...AGC..A C...AGC..A C...AGC..A --..--AA.A C...CCAA.A --..C-TT.A T.C.CCC..A TA.GCCC.T. GA..----.G CCC.A-C.T.
9999999999 3333344444 4678901456 GCAAATTAGG .-........ .G......A. .G......A. .G......A. .A..G...A. .A..G...A. .G......A. .G.G.C..A. .G......A. .AG....CAT--.GCC.AA
9999999999 4455555556 8902467890 GTATCATTAG .CT....... TATA...... TATA...... TATA...... T.T.....G. TAT.....G. TAT....CGA .AT.TG.AG. .CTC..CCGA .CT.T..AGA .CT.....G.
9999999999 6677777777 3901235789 TCAAATGAAC .......... ..T......A ..T......A ..T......A ..C......A ..C......A .TC.G....A ..C..CAT.A A.CG...G.A .TCT..ATG. ..CG......
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 9999999990 8889999990 0451237890 ATATAAATGA .......C.. .A...-.... .A...-.... .A...-.... .......C.G .C......AG .C.......G .A.A..-.AG GA.C.-...G .CT.CCC.T. .A..G.G.AG
1111111111 0000000000 0000000111 3456789012 -GAAAAGACA -..T..A.T. -.GC..AG.. -.GC..AG.. -.GC..AG.. -..C..A.T. -..C..A... -..C..A... GA....ATTT -A.CC.ACT. -.GT..TC.. AA.C.G..-.
1111111111 0000000000 1111122222 3456701234 CACTACAA-TC.A....TT A-.A....CA-.A....CA-.A....CT-TA.-..TA .-.A.-..TA T-TC.-..CA T.TAC-..-TG.A.-..CT TC.C.TTCCT .CTCC..CCT
1111111111 0000000000 2222333333 5678012368 -AACCAAAGG T....T.CA. C...A-C.A. C...A-C.A. C...A-C.A. C...A.CCA. A...A-CCA. TT.TA-CCA. T..TACC.A. T..-AT-.A. CGG-A-CT.. T..---CCAA
1111111111 0000000000 4455556666 0135781356 TTCACCAGAA CC........ C...A..... C...A..... C...A..... C.T....... ....T..... ...GT...G. C...TT.T.. C.T.TTGT-. C...-..-.. C.A.AT.CCT
1111111111 0000000000 7777788888 1378901234 CATCAAT-CC ....C.C-.T ......AAA......AAA......AAA..C.CCCC.. .....CCATT .....C.AA. T..A.--A.. T....-.AT...T..CT.. .CAA.CCAA.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1111111111 0000001111 8899990000 8927890346 C-CTATTC-T-......---......T--......T--......T.CTC....-T T-T.....-T --......-T TAT....T-TC-...C----A..CC.AC ---.CCC-AC
1111111111 1111111111 0001111111 7890123456 ATACTCTAC...A.T...CC.--..G.A CC.--..G.A CC.--..G.A .A.A.T.TTT .A.ACT.TTA CA.-.T.TT.A.A.T..TC .AC..T.G.C .A.--TCGAA CGCAC.C.AC
1111111111 1111111111 1222222233 9023678902 CCTCAAAAAA T.....C........C........C........C..T.CT.-C..T.C...T..T.C...C..T.CT..CCTC TTC...C.-C -.CT.TC.TTTCTCTCCCC
1111111111 1111111111 3333344445 3567813482 CCTGACTTCC .........T A...GT..TA A...GT..TA A...GT..TA TT....C..T ......C... TT...T..T. T....T.... AT...T...T A.CA...C.A ..CAG.C.TA
1111111111 1111111111 5555666667 3456126782 AAAAAGCTTC .......CA. .C......A. .C......A. .C......A. T...G...A. CCC.....A. C.......AT C.C...T.A. T.CC...CA. .CCC.AT.-. ..C.......
1111111111 1111111111 7778999999 5895123456 ATGCGAAATA .....--.C. ....A-CT-. ....A-CT-. ....A-CT-. ......T.-. .....G..-. ..A...C.-. ..T.TT..-. ..T.--..-. ...T--..CG GCT.---.-.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1111111111 1112222222 9990000001 7890567890 AACCTCC-TA ...T.TTA.. C....AAT.G C....AAT.G C....AAT.G ...T.A-ACG ...T.T-GCG ...T.A-A.G ...T.A-A-G CT.T-A-ACG .CTTCT-T.G C..T..--.G
1111111111 2222222222 1111122222 2346802345 GCTGTTAATC ..C....... ..A.CCG... ..A.CCG... ..A.CCG... .......G.. .......... ..C.C..... AT........ A.....CG.T .TC.C.C... A.-A....A.
1111111111 2222222222 2223333334 7890126890 G-AACATAA.-....C...T....-C..T....-C..T....-C.A-....C..T-..T.CG.T-..T.C...-CCT.CG..-TT..-G.A C-T...CCC.C..TG-C.T
1111111111 2222222222 4444555666 3569078012 TCTTTAAC-A ........-T .....G..-.....G..-.....G..-...C....-. ........-. .......T-. .......TA. .....G.--. .TA...G.GC C..AA.G--.
1111111111 2222222222 6666666777 3456789235 -C--CATAAA -.--T...G. -T--T..-.. -T--T..-.. -T--T..-.. -.-CTC.... ATACT..G.. TTA-T-.... A.-TT..GG. A--TT..CCTTCCT.CCCC ----..C-C.
1111111111 2222222222 7778888889 6782345790 C-AGCAC-AA .-.AT.T-.. .A.AG.A-T. .A.AG.A-T. .A.AG.A-T. .-.A..TT.. .-.A...T.. .C.AT..-.. .A.AA..-T. .A.A...-.. .CCA-.--.. T-.A.C.CTT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1111111111 2222223333 9999990000 1246892378 ACCAATA-TA ..T....-.. ..T....AC. ..T....AC. ..T....AC. ...CC..GCT .A.C...-.. ..TC...AC. ..ATC..GA. ..A....-A. ..A..G.GCT C..C..T-C.
1111111111 3333333333 1112333334 3451457890 ACTAGCTAA........GG .T.C..C.T.T.C..C.T.T.C..C.T......C.C......C.C......C.T....ATC-GC ..C..TCTGC...A.C.-.....TCTC-
1111 3333 4444 1234 ACAA .T.. ..T. ..T. ..T. .T.. GT.. .... .... ..C. ...G .A..
