PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE
Tenkovrstvá chromatografie je technika pro identifikaci a separaci směsi organických látek •Identifikace složek směsi (nutné použít standard) •analysa frakcí sbíraných během purifikace •analysa čistoty látek
•Při TLC se látky ze směsi rozdělují mezi adsorbent (stacionární fáze, obvykle silikagel, SiO2) a solvent (mobilní fáze), která proudí skrz adsorbent
Uspořádání tenkovrstvé a papírové chromatografie Vzestupné
Sestupné
mobilní fáze vzlíná stacionární fází TLC – látky rozpuštěné v mobilní fázi putují TLC deskou složky směsi putují rozdílnou rychlostí, která záleží na intermolekulárních silách mezi látkou a silikagelem stacionární fáze a látkou a složkami mobilní fáze http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU/
stacionární fáze SiO2 je velmi polární - silné dipól-dipól interakce, vodíkové můstky čím polárnější analyt, tím silnější vazba se stacionární fází, tím menší rychlost mobilní fáze relativně nepolární – silné Londonovy síly, dipól-dipól interakce, vodíkové můstky nepolární analyt interaguje se stacionární méně silně než s mobilní fází – putuje rychleji
Charakterizace separece RF , i =
dm di
ui um di dm
ui d = i um d m
rychlost skvrny i-tého analytu rychlost (čela) mobilní fáze vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu vzdálenost čela mobilní fáze od startu
Co nám říká hodnota Rf? o
o
o
Rf hodnoty lze použít k usnadnění identifikace látky v porovnání se standardy Rf hodnota není fyzikální konstanta, mělo by být provedeno srovnání pouze skvrny na stejné desce za stejnou dobu Dvě látky, které mají stejnou hodnotu Rf mohou být totožné; ty, které mají různé hodnoty Rf nejsou totožné
Typ látky málo polární
alkany alkeny etery
polárnější látky se váží silněji na stacionární fázi
aromáty aldehydy a ketony alkoholy aminy organické kyseliny nejvíce polární
soli
rozpouštědlo málo polární
hexany tetrachlormethan toluen chloroform diethyleter ethylacetát aceton
nejvíce polární
methanol kys. octová voda
eluční síla běžných rozpouštědel
Detekce •barevný produkt – SUPR ☺ •UV – (látky které světélkují pod UV světlem) •vizualizace postřikem s vhodným chemickým činidlem (ninhydrin, H2SO4, KMnO4, I2)
Aplikace dělení aminokyselin, vitamínů, alkaloidů, uhlovodíků, nukleotidů, potravinářských barviv, cukrů, …
“Flash” chromatografie
„Flash“ chromatografie – použití pro purifikaci nízkomolekulárních přírodních látek a produktů organických synthes
mobilní fáze: - dvou a vícesložkové systemy běžná rozpouštědla: •dichloromethan/hexan •ether/hexan •hexan/ethylacetát •dichloromethan/methanol •ethanol •chloroform/ethanol •chloroform/aceton
pro odhad retence na koloně: CV =1/Rf CV - objem mobilní fáze potřebný k eluci komponenty vztažený na objem kolony Rf - hodnota retence na TLC desce
Základní zásady Na začátek zařadit metody: •s vysokou kapacitou •velkým výtěžkem •nízké rozlišení
Později metody s: vysokým rozlišením dostačujícím výtěžkem kapacita méně významná
Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku) Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími
Příklady •Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí •Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí •Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence odstranění fragmentů a komplexů
Nevhodné kombinace •Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok
dialýza, ultrafiltrace)
Sledování průběhu separace Metoda
Koncentrace bílkovin [mg/ml]
Objem
buněčný extrakt
0,8
50
1000
25
-
100 %
(NH4)2SO4
2,5
10
850
34
1,4
85 %
HIC
2,5
6
600
40
1,6
60 %
dialysa
2,2
6,5
550
1,6
55 %
40
50 %
[ml]
Celková aktivita [U]
Specifická aktivita [U/mg]
Stupeň přečištění
Výtěžek [%]
39 IEX
0,2
3
500
1000
Sledování průběhu separace Metoda
Koncentrace bílkovin [mg/ml]
Objem
Celková aktivita [U]
buněčný extrakt
258,1
20
4000
(NH4)2SO4
118,1
9
4053
HIC
57,5
6
3565
GPC
19,3
2
2565
[ml]
Metoda
Koncentrace bílkovin [mg/ml]
Objem [ml]
Celková aktivita [U]
buněčný extrakt
258,1
20
4000
(NH4)2SO4
118,1
HIC GPC
Specifická aktivita [U/mg]
Stupeň přečištění
[%] -
0,77
57,5 19,3
9 6 2
Výtěžek
100
4053 3,81
4,9
101
10,33
13,3
89
66,45
85,8
64
3565 2565
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mM maltosy a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 °C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na2CO3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 °C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm3.cm-1.mol-1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mM maltosy a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 °C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na2CO3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 °C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm3.cm-1.mol-1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Stanovení koncentrace bílkovin
Kjeldahlova metoda – stanovení N2 • Mineralizace vzorku – převedení organického dusíku na NH4+ • Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody
UV spektrofotometrie
UV spektrofotometrie • 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů • 180 - 230 nm – peptidová vazba Výhody - nedestruktivní metoda
VIS spektrofotometrie • Přídavek činidla → barevný derivát • Destruktivní metoda • Nutná kalibrační závislost
Biuretová metoda Princip : Cu2+ vytváří v silně alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidové vazby
Cu2+
Měření : 540 – 560 nm 1-10 mg/ml
Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Tyr, Trp, Cys Měření : 720-750 nm 5-250 µg/ml
Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm 1-1000 µg/ml
BCA metoda Meření : 562 nm 0,4-100 µg/ml
Ninhydrinová metoda Měření: 575 nm
Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu (fluorescamin) na bílkovinu → měření vzniklé fluorescence Měření: 390/475 nm 10 ng
Stanovení koncentrace DNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti
Metoda s diaminobenzoovou kyselinou Měření: depurinace + DABA Měření: 420 nm 25 µg
Metoda s difenylaminem Měření: depurinace + DPA Měření: 595 nm 25 µg
Fluorescenční metody •Ethidiumbromid •4`,6`-diamidino-2-phenylindol (DAPI) •2-(2-[4-hydroxyphenyl]-6-benzimidazolyl)-6- (1-methyl-4piperazyl)benzimidazol trihydrochlorid (Hoechst 33258)
Stanovení koncentrace RNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti 1 OD260 = 40 µg/ml ssRNA A230:260:280 ~1:2:1
Metoda s orcinolem Princip: depurinace + reakce s orcinolem Měření: 660 nm
