PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN E. coli SECARA KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
1
PERNYATAAN MENGENAI TUGAS AKHIR DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Tugas Akhir yang berjudul: “Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkann dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tugas Akhir ini.
Bogor, Januari 2010 Dwi Kusuma Indriani NIM F252050045
2
ABSTRACT DWI KUSUMA INDRIANI. Comparison of Conventional and Rapid Methods for E.coli Testing in Water Sample. Under direction of RATIH DEWANTI-HARIYADI and SUTRISNO KOSWARA. Water is very important in food production, either as raw material for food processing, ice production, or for sanitation purposes. Water for food processing should meet the existing regulation for drinking water quality. According to the Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 the number of Escherichia coli and fecal coliform should be negative per 100 ml sample, consecutively. E. coli testing with conventional MPN methods needs 5-7 days thus it is not appropriate for food products with short expiry date. The aims of this study were to compare the performance of conventional and rapid methods used for testing of E.coli in process water and evaluate the implication of the application of rapid methods in a yogurt industry. The sample used in this study was process water from PT Yummy Food Utama, a yogurt and cheese industry. Total 30 samples of one litre each was taken from the process water tank outlet from 3 different days as a replication. The culture media used for the conventional methods were according to MPN of FDA/BAM and SNI methods. The culture media used for the rapid methods were Fluorocult LMX Broth (MPN), Chromocult Coliform Agar (TVC), and Readycult Coliform 100 (P/A). The result of this study showed that rapid methods reduced the testing time of E.coli from 5-7 days to 1-2 days only with an equal performance to conventional method but more convenience to do since it reduce of tubes and petridishes needed from 195 to 2-15 only. Even the rapid media Fluorocult LMX Broth showed the best recovery rate among other medias tested. Besides, rapid methods application saved the total cost by 71% with Readycult® Coliform 100 and Fluorocult® LMX Broth; 82% with Chromocult® Coliform Agar; and the possibility to increase the production capacity per month by 22%.
Key Words : Escherichia coli, chromogenic fluorogenic, rapid method
3
ABSTRAK DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA Air sangat penting dalam industri pangan, baik untuk bahan baku, pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum sesuai dengan peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. Pengujian E. coli dengan metode APM konvensional memerlukan waktu 5-7 hari karena itu tidak sesuai untuk produk pangan dengan masa pakai yang pendek. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama, suatu pabrik yogurt dan keju. Total 30 sampel masingmasing satu liter diambil dari kran tanki air proses dari 3 hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan adalah media sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Media kultur yang digunakan untuk metode cepat adalah Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), Readycult Coliform 100 (P/A). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode cepat mengurangi waktu pengujian E.coli dari 5-7 hari menjadi hanya 1-2 hari, dengan hasil yang sebanding tetapi lebih mudah dikerjakan karena penggunaan tabung dan cawan petri yang semula 195 buah menjadi hanya 2-15 buah saja. Bahkan media cepat Fluorocult LMX Broth memperlihatkan hasil recovery rate terbaik diantara media yang diuji. Selain itu, penerapan metode cepat dapat menghemat biaya total sampai 71% dengan media Readycult® Coliform 100 dan Fluorocult® LMX Broth; 82% dengan Chromocult® Coliform Agar; dan kemungkinan meningkatkan kapasitas produksi per bulan 22%.
Kata Kunci : Escherichia coli, kromogenik fluorogenik, metode cepat .
4
RINGKASAN DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA Air sangat penting untuk industri pangan, baik untuk bahan baku, bahan pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum menurut peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. E.coli adalah indikator keberadaan patogen enterik maupun tingkat sanitasi suatu proses/produk. Pengujian E.coli secara konvensional menggunakan metode Angka Paling Mungkin memerlukan waktu 5-7 hari. Kebanyakan industri pangan terutama untuk produk pangan dengan masa pakai pendek, memerlukan prosedur pengujian yang cepat dan mudah dilakukan karena jumlah sampel yang sangat banyak. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama dengan produk yogurt dan keju. Total 30 buah sampel masing-masing satu liter diambil dari kran tanki air proses pada tiga hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan untuk metode konvensional sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Metode cepat menggunakan Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), dan Readycult Coliform 100 (P/A). Biakan murni Escherichia coli ATCC 25922 digunakan untuk kontrol positif dan perlakuan cemaran. Penelitian ini menggunakan tiga konsentrasi cemaran bakteri dengan konsentrasi akhir pada sampel adalah 4 cfu/ml (cemaran rendah), 40 cfu/ml (cemaran sedang), dan 80 cfu/ml (cemaran tinggi). Penelitian ini membandingkan kinerja antara metode APM konvensional dengan tiga metode cepat untuk parameter hasil pertumbuhan (recovery rate), total waktu pengujian, dan biaya biaya investasi media awal, biaya laboratorium (dari komponen biaya media per test, tenaga kerja, depresiasi, dan operasional lab), biaya gudang (dari komponen biaya tenaga kerja, depresiasi, dan operasional gudang), dan penghematan yang bisa dilakukan (biaya media, biaya gudang, bunga pinjaman bank, biaya laboratorium). Uji anova dilakukan untuk melihat perbandingan hasil pertumbuhan antara ketiga ulangan yang dilakukan pada hari yang berbeda, antara kedua metode APM dan antara metode APM konvensional dengan ALT cepat. Pembacaan hasil APM konvensional sesuai dengan prosedur FDA/BAM dan SNI dengan tahapan dari uji penduga sampai dengan uji IMVIC. Pada metode cepat Fluorocult LMX Broth dan Readycult Coliform 100 hasil E.coli ditandai dengan warna hijau kebiruan pada media, fluoresensi dibawah lampu UV 366 nm, dan cincin merah dengan penambahan KOVAC’s indol reagent. Metode cepat dengan Chromocult Coliform Agar koloni E. coli berwarna ungu dan terbentuk warna merah bila diteteskan KOVAC’s.
5
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan metode APM, kontrol negatif dan sampel yang tidak dicemari mengandung <1.8 per 100 ml sementara standar air bersih untuk koliform maupun E.coli adalah negatif per 100 ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Dengan konsentrasi bakteri yang sedang dan tinggi metode ini memberikan hasil APM >1600 sehingga tidak mencerminkan nilai sebenarnya. Hasil di kedua metode APM (LST dan LMX) sebanding kecuali konsentrasi bakteri rendah dimana LMX memberikan hasil lebih tinggi, akan tetapi hasil analisis dengan anova menunjukkan tidak ada beda nyata baik antar ulangan dalam perlakuan yang sama maupun antar APM konvensional dan cepat. Kedua metode cepat lainnya yaitu ALT cepat dan P/A cepat juga memberikan hasil yang sama dengan APM konvensional maupun APM cepat. Perhitungan nilai recovery rate untuk ketiga metode kuantitif dari urutan tertinggi adalah media LMX, LST dan CCA dengan nilai 122%, 70%, dan 89%. Readycult tidak dihitung karena memberikan hasil kualitatif, akan tetapi pada dasarnya media yang digunakan adalah LMX. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa total waktu pengujian metode APM konvensional 5-7 hari, memerlukan 195 buah tabung, dan memerlukan dua suhu inkubasi yang berbeda yaitu 35oC dan 44.5oC. Ketiga metode cepat jauh lebih sederhana karena memerlukan total waktu 1-2 hari, memerlukan 15 tabung untuk APM dan 2 cawan untuk ALT, dan inkubasi hanya dilakukan di 35oC. Hasil perhitungan biaya investasi untuk pembelian media awal uji E.coli yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 10.813.000 sedangkan untuk uji koliform dan E.coli sebesar Rp 11.899.000 karena perlu tambahan media BGLB. Ketiga metode cepat yang bisa menguji koliform dan E.coli sekaligus memerlukan investasi media lebih rendah yaitu metode APM cepat Rp 8.119.000, metode ALT cepat Rp 4.978.000 dan investasi terkecil adalah metode P/A cepat Rp 1.309.000. Dari perhitungan biaya media per test maka yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 200.763, metode P/A cepat Rp 60.570, metode APM cepat Rp 57.218, dan yang terkecil metode ALT cepat Rp 7.530. Apabila dilakukan duplo maka biaya per test menjadi dua kali lipat. Apabila hasilnya koliform negatif maka biaya media terendah adalah ALT CCA kemudian APM konvensional, APM cepat dan P/A cepat. Hasil perhitungan biaya laboratorium menunjukkan bahwa ketiga metode cepat memerlukan biaya Rp 84.309 (inkubasi 24 jam) atau Rp 168.619 (inkubasi 48 jam). Metode APM konvensional memerlukan biaya Rp 421.545 (5 hari) atau Rp 590.166 (7 hari). Total biaya gudang pada ketiga metode cepat Rp 186.803 (24 jam) atau Rp 373.607 (48 jam) sementara metode APM konvensional Rp 934.015 (5 hari) atau Rp 1.307.624 (7 hari). Penghematan total biaya yang diperoleh dengan mengganti metode konvensional dengan metode cepat untuk pengujian E.coli dalam air proses di PT Yummy Food Utama dengan model biaya produksi yogurt buah 25 adalah Rp 2.764.778 untuk Readycult®, Rp 2.791.593 untuk Fluorocult® LMX Broth dan Rp 3.189.102 untuk Chromocult® Coliform Agar, sementara kenaikan kapasitas produksi per bulan dengan pemakaian metode cepat adalah 22% atau 22 batch dari 18 batch dengan lima hari kerja seminggu.
Kata Kunci : Escherichia coli, kromogenik fluorogenik, metode cepat
6
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
7
PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN E. coli SECARA KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
Tugas Akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi Teknologi Pangan Pada Program Magister Profesi Teknologi Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
8
Judul Tugas Akhir : Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air Nama : Dwi Kusuma Indriani NIM : F252050045
Disetujui Komisi Pembimbing
Ir. Sutrisno Koswara, MSi Anggota
Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc. Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Magister Profesi Teknologi Pangan
Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc
Tanggal Ujian: 26 Januari 2010
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal Lulus: 26 Januari 2010
9
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tugas Akhir : Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc
10
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat rakhmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Mei 2008 ini adalah ”Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air”. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc. selaku ketua komisi pembimbing dan Ir. Sutrisno Koswara, MSi. sebagai anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan saran. Ucapan terima kasih juga penulis berikan kepada Ibu Dra. Sumaria Sudian Apt. Beserta seluruh staff Bagian Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional atas izin penggunaan laboratorium, masukan dan bimbingan yang diberikan. Disamping itu penghargaan penulis berikan kepada Ibu Ir. Eny Zulaichah, Ibu Ir. Sri Nurfiani, Bapak Zainul Ichwan dan seluruh staff PT Yummy Food Utama atas ijin dalam pengambilan sampel, penggunaan laboratorium dan data pendukung lainnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktur Chemical Division PT Merck Tbk. yang telah memberikan beasiswa serta kelonggaran waktu selama penulis menempuh pendidikan. Yang terakhir ucapan terima kasih kepada ayah serta seluruh keluarga atas segala doa dan dorongannya. Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini jauh dari sempurna, sehingga pada kesempatan ini juga penulis mengharapkan kritik dan saran membangun demi menyempurnaannya. Jauh dalam lubuk hati yang paling dalam, penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2010 Dwi Kusuma Indriani
11
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pati (Jawa Tengah) tanggal 21 Desember 1966 dari Ayah Drs. Soegono dan Ibu S. Haryati BA (Almarhumah). Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 1985 penulis lulus dari SMA Negeri Pati dan pada tahun yang sama pula masuk UGM melalui jalur Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK). Penulis memilih Program Studi Mikrobiologi Hasil Pertanian, Jurusan Ilmu Tanah, Fakultas Pertanian dan lulus pada tahun 1991. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mikrobiologi dasar (1988-1990) dan praktikum mikrobiologi pangan (1989-1990).
Kesempatan untuk melanjutkan ke program
Magister Profesi Teknologi Pangan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor diperoleh pada tahun 2006 dengan beasiswa dari PT Merck Tbk. Penulis bekerja sebagai marketing di PT Merck Tbk. Chemical Division sejak tahun 1994 dengan jabatan terakhir Business Segment Manager for Food and Beverages setelah sebelumnya menjabat sebagai Product Manager for Microbiology Hygiene and Microscopy. Selama bekerja di Merck penulis mendapat banyak pelatihan tentang mikrobiologi, monitoring higiene, HACCP dan mikroskopi baik di dalam maupun di luar negeri. Selain itu terkait dengan posisi di kantor, penulis bertugas memberikan pelatihan, presentasi dan seminar di bidang mikrobiologi. Penulis menjadi anggota Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia, Indonesian Food Analysis Network dan Masyarakat Standardisasi Nasional (MASTAN). Publikasi yang sudah diterbitkan adalah buku Biosafety : Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit, video Biosafety, artikelartikel tentang mikrobiologi dan monitoring higiene di majalah Merckimia dan Foodreview.
12
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiv DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvi 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang .................................................................................... 1.2 Tujuan Penelitian ................................................................................ 1.3 Manfaat Penelitian .............................................................................. 1.4 Hipotesis Penelitian .............................................................................
1 6 6 7
2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan .................................. 8 2.2 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ....................................... 10 2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ..................................... 17 2.4 Media untuk Pengujian Bakteri koliform dan E. coli ....................... 19 2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli ........................................... 27 3 BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 3.2 Bahan dan Alat .................................................................................. 3.3 Metode Penelitian .............................................................................. 3.4 Analisa data........................................................................................
34 34 35 39
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel .......................................... 4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan metode konvensional 4.3 Metode Angka Lempeng Total.......................................................... 4.4 Metode Presence Absence ............................. .................................. 4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan PA ........................................ 4.6 Analisa Ekonomis ..............................................................................
41 41 55 63 68 72
5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan............................................................................................. 81 5.2 Saran .................................................................................................. 83 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 84 LAMPIRAN ........................................................................................................ 89
13
DAFTAR TABEL Halaman 1. Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli dan koli fekal ...........................................................................................
3
2. Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 907/MENKES/SK/VII/2002 .......... 17 3. Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam untuk media deteksi E.coli dan koliform .......................................................... 26 4. Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal ................... 28 5. Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX) ....................................... 46 6. Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal bakteri 400 cfu/100 ml (rendah) ........ .............................................
50
7. Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke LMX Broth dan Readycult® Coliform ............................................................................... 53 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar ... 56 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar ................ 58 10. Karakteristik beberapa bakteri dalam media Chromocult® Coliform Agar ......................................................................................................... 58 11. Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel .......................... 62 12. Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult® Coliform 100 ................................................ 65 13. Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (LST & LMX), Angka Lempeng Total (CCA) dan Presence Absence (RC) ........................................................................................ 70 14. Perhitungan biaya dan lama pengujian lengkap E.coli pada metode Angka Paling Mungkin, Angka Lempeng Total, dan Presence Absence 73 15. Analisa biaya pengujian dan gudang di PT Yummy Food Utama .......... 76 16. Perbandingan biaya total antara APM konvensional dan metode cepat .. 79
14
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni dibawah lampu UV 366 nm ......................................................................
21
2. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni ..................................................
23
3. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen ...................................................................... 24 4. Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin....................................... 28 5. Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult® Coliform Agar (A), Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total............................................................. 30 6. Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi ................... 31 7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100 ............. 32 8. Skema penelitian ........................................................................................... 38 9. Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham ................... 42 10. Koloni bakteri E.coli di Media LEMBA (Levine EMB Agar) ..................... 44 11. Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli ........................................................... 45 12. Pertumbuhan bakteri E.coli (warna hijau) dalam media Fluorocult LMX Broth ............................................................................................................
48
®
13. Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult LMX dengan lampu UV .. 49 14. Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s ......................................................................................... 51 15. Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA .............. 55 16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult Coliform Agar ............................... 59 17. Pembentukan warna cerry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s ............................................................................. 61 18. Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar................................................................................................ 63 19. Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult® Coliform 100 ........... 64 20. Pertumbuhan bakteri koliform di media Readycult® Coliform 100 ............. 67 21. Fluoresensi dan Reaksi Indol dalam media Readycult® Coliform ................ 67
15
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Rancangan percobaan perbandingan metode APM dengan metode cepat untuk pengujian E. coli di sampel air proses ............................................... 89 2. Cara perhitungan konsentrasi awal suspensi bakteri standar dengan metode Angka Lempeng Total .................................................................... 90 3. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin Konvensional ............................. 91 4. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin cepat dengan media Fluorocult LMX Broth ..................................................................................................
92
®
5. Skema Pengujian Angka Lempeng Total Chromocult Coliform Agar ....... 93 6. Skema Pengujian Presence Absence Readycult® Coliform 100 ................... 94 7. Jumlah mikroba ter-recover dalam air proses yang dicemari bakteri E.coli, pada media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan LMX Broth ........................ 95 8. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST)........................................................................ 96 9. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth .................................................................................................. 96 10. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan Fluorocult LMX Broth ..................................... 97 11. Perhitungan Anova Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult® Coliform Agar ......................................................................... 98 12. Tabel Angka Paling Mungkin Bakteri 100 g (ml) Seri 5 Tabung dengan 10, 1 dan 0.1 g (ml) material uji .................................................................... 99 13 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Angka Paling Mungkin ................................................................................ 100 14 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian koliform negatif dengan Metode Angka Paling Mungkin ................................................................... 101 15 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Cepat Angka Lempeng Total, dan Presence Absence .................................. 101 16 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum Peraturan Menteri Kesehatan Kesehatan 416:1990 ................................................................................... 102 17 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum WHO ............................. 102 18 Skema Pembuatan Air Proses di PT Yummy Food Utama ......................... 103
16
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Air sangat penting bagi kehidupan manusia sehari-hari maupun dalam industri pangan. Fungsi utama dari air di industri pangan adalah sebagai bahan baku, untuk pembuatan es, dan untuk fungsi pembersihan (BPOM, 1996; Codex, 2003). Dalam beberapa standar Internasional (Codex, EC dan WHO) maupun standar Nasional (BPOM, Depkes) tentang kualitas air disebutkan bahwa standar kualitas air untuk kebutuhan proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum menurut peraturan yang masih berlaku (BPOM, 1996; Codex, 2003; Depkes, 2002; EC, 1998; WHO, 2004). Codex mengacu pada persyaratan air minum yang dikeluarkan oleh WHO sedangkan CPMB mengacu pada persyaratan air minum sesuai Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 907/2002 yang meliputi persyaratan kimiawi, radioaktifitas, fisik, dan bakteriologis. Persyaratan kimiawi meliputi bahan kimia yang memiliki pengaruh langsung pada kesehatan dan bahan kimia yang kemungkinan dapat menimbulkan keluhan pada konsumen. List bahan kimia yang dipersyaratkan meliputi kelompok bahan-bahan anorganik, organik, pestisida, serta desinfektan dan hasil sampingannya. Jenis bahan kimia yang dapat menimbulkan keluhan lebih sedikit dan umumnya dalam kadar yang lebih rendah daripada kelompok yang berpengaruh langsung pada kesehatan. Persyaratan radioaktifitas adalah kandungan radioaktif air. Persyaratan fisik meliputi warna, rasa dan bau, temperatur, dan kekeruhan. Persyaratan bakteriologis meliputi kandungan Escherichia coli (E.coli) atau koli fekal dan koliform total (Depkes, 2002). Persyaratan bakteriologis dalam Kepmenkes 907/2002 untuk air minum menyebutkan bahwa jumlah E. coli atau koli fekal harus nol per 100 ml sampel. Persyaratan bakteriologis untuk air yang masuk ke sistim distribusi maupun yang ada di dalam sistem distribusi menyebutkan jumlah E. coli atau koli fekal harus nol per 100 ml sampel sedangkan bakteri koliform total harus nol per 100 ml sampel. Dalam Kepmenkes 907/2002 tidak disebutkan metode apa yang harus digunakan untuk pengujian bakteriologis tersebut (Depkes, 2002).
17
Kepmenkes 907/2002 hanya mempersyaratkan pengujian E. coli atau koli fekal dan bakteri koliform dan tidak mempersyaratkan pengujian patogen enterik seperti Salmonella dan bakteri patogen lainnya, karena keberadaannya bisa menjadi indikator kualitas mikrobiologis suatu sampel air minum. Prediksi akan kualitas mikrobiologis suatu produk atau keadaan selama proses produksi menggunakan bakteri indikator memberikan informasi tentang kegagalan proses, kontaminasi paska proses, kontaminasi dari lingkungan, dan kondisi umum tingkat sanitasi dengan cara sederhana, dapat dipercaya dan cepat. Keberadaan koliform fekal (coli fekal) termasuk E.coli di air minum menjadi indikasi bahwa kontaminasi fekal kemungkinan telah terjadi pada air tersebut. Terjadinya kontaminasi fekal menunjukkan resiko adanya bakteri patogen enterik lainnya dalam sampel tersebut. Koliform fekal dan E.coli lebih cocok digunakan untuk indikator kontaminasi fekal daripada koliform karena berasal dari fekal, sedangkan koliform biasa ada yang berasal dari fekal dan ada pula yang dari lingkungan (Pierson and Smoot, 2001). Saat ini penggunaan E. coli sebagai komponen kriteria mikrobiologis suatu produk pangan lebih memberikan keuntungan dari pada penggunaan koliform fekal karena telah tersedianya metode pengujian E. coli secara cepat (Pierson and Smoot, 2001). Penelitian mengenai aplikasi substrat fluorogenik dan kromogenik dalam media (terutama media untuk E.coli dan koliform) dilakukan secara intensif sejak tahun 1980. Hingga saat ini hasil penelitian tersebut memungkinkan dilakukannya pengujian E.coli dan koliform secara cepat, tepat dan sederhana (Manafi, 1996). Media kultur yang saat ini banyak digunakan dalam standar analisa koliform dan E.coli maupun koli fekal (Tabel 1) bisa dikelompokkan menjadi dua, yaitu media konvensional dan media cepat. Media konvensional umumnya berdasar pada proses fermentasi laktosa yang menghasilkan asam dan gas, yang kemudian dikonfirmasi dengan uji biokimia atau uji IMViC. Terbentuknya asam bisa diamati dari perubahan warna indikator yang terkandung dalam media, sedangkan pembentukan gas diamati dengan tabung durham. Media baru yang cepat umumnya berdasar pada deteksi keberadaan ensim spesifik pada suatu bakteri target menggunakan susbtrat fluorogenik dan kromogenik tertentu.
Reaksi
18
tersebut akan memberikan warna tertentu dan atau fluoresensi yang spesifik sehingga bisa dijadikan identifikasi suatu jenis bakteri tertentu. Media berbasis kromogenik dan fluorogenik dapat memberikan hasil yang lebih cepat karena menargetkan pada enzim yang dihasilkan oleh mikroba target.
Pada media
konvensional, hasil diperoleh dengan menunggu sampai terbentuk asam dan gas dari hasil fermentasi oleh enzim yang sudah dihasilkan terlebih dahulu (Manafi, 1996).
Tabel 1 Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli dan koli fekal Jenis Media A 1 Medium * Brilliant Green 2% Bile Broth (BGLB) * EC Broth * Endo Broth MF * Lactose Broth (LB) * Lauryl Sulfate Broth * LSB with MUG ** LMX Broth with MUG ** MacConkey Broth * Presence Absence Broth * Readycult Coliform 100 ** Chromocult® Coliform Agar ** Endo Agar * Lactose TTC Agar w/ Tergitol * Levine EMB Agar * m-Endo Agar LES * m-FC Agar * MacConkey Agar *
Metode Standar *** SMWW, EPA, APHA SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO, USDA, SNI SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO,USDA, SNI SMDP, SMWW, EPA, APHA SMWW, EPA, AOAC, APHA, USDA, EP, USP SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO, USDA, SNI AOAC, BAM, APHA, SMWW, ISO EPA EP SMWW, EPA EPA EPA
Jenis analisa dalam prosedur koliform E.coli koli fekal √ √ √ √ √
√
√ √ √
√
√
√
√ √ √ √
√ √ √ √ √
SMDP, SMWW, APHA ISO
√ √
√ √
SMWW, SNI SMWW, EPA, APHA SMWW, EPA, AOAC SMWW, EPA, EP, USP, AOAC, BAM, APHA APHA, SMDP, IDF, BAM, ISO BAM, APHA
√
√ √
√
√
√
Violet Red Bile Agar * √ √ VRBA with MUG ** √ √ *) Media konvensional **) Media cepat ***) Keterangan dari singkatan nama : International Organization for Standardization (ISO); American Public Health Association (APHA); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA-BAM), Association of Anorganic Chemistry (AOAC); Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (SMWW-APHA); Standard Methods for Examination of Dairy Products (SMDP-APHA); United State Environment Protection Agency (USEPA/EPA); European Pharmacopoeia (EP); United States Pharmacopoeia (USP)
19
CODEX CAC/GL 21 menyebutkan bahwa untuk menentukan kelayakan konsumsi suatu pangan yang sangat mudah rusak atau pangan dengan umur simpan yang pendek, harus dipilih (apabila memungkinkan) metode uji yang dapat memberikan hasil sebelum pangan itu dikonsumsi atau melewati masa umur simpannya. Selain itu juga disebutkan bahwa metode mikrobiologi yang dipilih harus dapat dipertanggung-jawabkan dalam hal kompleksitas, ketersediaan media, peralatan, mudah di-interpretasikan hasilnya, waktu pengujian dan biaya yang diperlukan (Codex, 1997). Pemilihan suatu metode analisa, selain acuan ke suatu metode standar nasional atau internasional, yang juga menjadi faktor sangat penting adalah kemudahan dalam melakukan pengujian, ketelitian hasil, dan kecepatan diperolehnya hasil pemeriksaan. Dalam aplikasi untuk industri pangan, seringkali harga media yang mahal untuk suatu metode uji yang baru bukan menjadi faktor utama. Yang lebih penting dari harga adalah metode yang dapat memberikan hasil yang cepat dan pengerjaannya yang praktis sehingga tidak diperlukan jam kerja dan jumlah pegawai yang banyak untuk mengerjakannya. Selain itu, hasil yang cepat diperoleh akan memberikan banyak implikasi ke penghematan biaya gudang dan kecepatan waktu suatu barang bisa dilepas ke pasar, terutama untuk produk pangan yang berumur pendek. Kebutuhan akan metode uji cepat, khususnya untuk uji E.coli di sampel air minum yang digunakan di industri pengolahan pangan mendorong dilakukannya penelitian ini. Walaupun Kepmenkes 907/2002 sebagai acuan tertinggi kualitas air minum di Indonesia tidak menyebutkan suatu metode uji yang harus digunakan, tetapi beberapa Standar Nasional Indonesia (SNI) masih menyebutkan penggunaan metode Angka Paling Mungkin (APM) untuk uji Koliform dan E.coli. SNI tersebut diantaranya adalah SNI 01–2897–1992 (Cara uji cemaran Mikroba), SNI 01–3553–2006 (Air Minuman Dalam Kemasan), SNI 01–2332-12006 (Cara uji mikrobiologi – Bagian 1: Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada produk perikanan). Pengujian APM SNI menggunakan media Lauryl Sulfate Broth untuk uji penduga Koliform, Brilliant Green Bile Broth untuk uji penguat Koliform, EC Broth untuk uji penduga E.coli, Levine EMB untuk uji penguat E.coli. Dari
20
koloni terduga di media Levine EMB Agar harus dilakukan konfirmasi menggunakan pengecatan gram, pembentukan gas dan uji IMViC untuk yang membutuhkan total waktu pengujian 5-7 hari. Uji SNI untuk E.coli dan Koliform adalah adopsi dari metode FDA-BAM untuk uji yang sama (FDA, 2006). Metode APM adalah metode yang kurang diminati di kebanyakan industri di Indonesia karena membutuhkan waktu pengerjaan, tenaga kerja dan peralatan yang banyak. Beberapa penelitian membuktikan bahwa metode baru yang berbasis kromogenik dan fluorogenik mampu memberikan hasil yang setara atau lebih baik dengan media konvensional, bahkan dengan keuntungan waktu yang lebih cepat dan cara pengerjaan yang lebih mudah (Manafi & Rosmann. 1998; Manafi & Rosmann. 1998; Manafi, 2000, Geissler et al. 2000; Ogden et. al. 1998; WHO, 2002). Dalam deteksi, identifikasi dan perhitungan organisme target, pendekatan konvensional umumnya hanya menggunakan teknik tunggal, sedangkan pendekatan lain bisa menggunakan kombinasi beberapa metode yang berbeda. Salah satu contohnya adalah dalam identifikasi E.coli bisa menggunakan media kromogenik yang hanya membutuhkan waktu sehari, bisa dikombinasikan dengan teknik-teknik lain yaitu fluorogenik, mikroskopis dan laser scanning (WHO, 2002). Benoti, et.al (2002) membandingkan antara metode standar pemeriksaan koliform dan E.coli untuk pemeriksaan susu di Kementerian Pertanian Brazil (MARA - Ministério da Agricultura e Reforma Agrária) dan metode baru yang lebih cepat. Dalam penelitian itu digunakan media Brilliant Green Bile Broth untuk Koliform dan media EC Broth/Tryptone Water untuk E.coli. Kedua media konvensional tersebut dibandingkan dengan media cepat Fluorocult® LMX Broth (Merck) yang bisa digunakan sekaligus untuk koliform maupun E.coli. Dalam penelitian tersebut terbukti bahwa kedua metode tersebut memberikan hasil yang serupa.
Fluorocult® LMX mempunyai keunggulan dibandingkan media
konvensional karena lebih cepat dan lebih mudah dilakukan, sehingga cocok untuk pengujian produk susu dengan masa pakai yang sangat pendek. Dari uraian diatas dapat disimpulkan adanya beberapa aspek yang dapat dipelajari dalam membandingkan metode cepat dan metode konvensional diantaranya :
21
1. Apakah metode cepat dapat memberikan hasil pertumbuhan (growth) yang sama dibandingkan dengan dengan metode konvensional, untuk pemeriksaan E.coli di sampel air proses. 2. Apakah ada perbedaan total hari pengujian antara metode cepat dan metode konvensional untuk pemeriksaan E.coli di sampel air proses. 3. Apakah ada penghematan biaya pengujian laboratorium apabila menggunakan metode cepat. 4. Apakah ada penghematan biaya gudang apabila menggunakan metode cepat. 5. Berapa persen penghematan biaya total pengujian E.coli pada sampel air proses dengan media cepat dibandingkan dengan metode konvensional
1.2 Tujuan Penelitian Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan (recovery rate, waktu pengujian, dan analisis biaya) antara metode konvensional dan cepat untuk analisis E.coli di sampel air.
Perbandingan dilakukan pada kinerja keempat
metode yang diuji terhadap: (1) hasil pertumbuhan E.coli (recovery rate); (2) total waktu pengujian yang diperlukan masing-masing metode; (3) Analisa biaya yang meliputi biaya pembelian media, biaya laboratorium dan biaya gudang untuk penyimpanan barang jadi selama pengujian belum selesai; (4) penghematan yang bisa dilakukan dengan penerapan metode cepat.
1.3 Manfaat Penelitian Dengan hasil penelitian ini diharapkan dapat diperoleh metode alternatif pengujian
E.coli yang optimum dari segi waktu pengujian, biaya pengujian
maupun biaya penyimpanan barang jadi untuk industri pangan yang mempunyai karakteristik produk mudah rusak dan umur pakai pendek, sehingga memerlukan waktu pengujian mikrobiologis yang cepat.
22
1.4 Hipotesis Penelitian Berdasarkan teori yang ada maka dapat dibuat hipotesa bahwa metode cepat pengujian E.coli pada sampel air proses yang menggunakan medium berbasis kromogenik/fluorogenik dapat memberikan: (1) hasil pertumbuhan yang sama dengan medium standar konvensional; (2) metode cepat memerlukan total waktu pengujian yang lebih pendek; (3) penggunaan metode cepat dapat memberikan mengurangi biaya media, biaya laboratorium dan biaya gudang dingin; (4) dapat menghemat biaya secara total .
23
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan
Dalam Pedoman Penerapan Cara Produksi Makanan Yang Baik (CPMB), yang dikeluarkan oleh Badan Pengawasan Obat dan Makanan, fungsi air sebagai bahan baku dalam
proses produksi pangan dibagi menjadi dua jenis. Jenis
pertama adalah air yang digunakan dalam proses pengolahan dan mengalami kontak langsung dengan makanan, misalnya untuk mencuci bahan mentah, merebus makanan, membuat uap untuk mengukus makanan dan lain-lain. Jenis air ini harus memenuhi persyaratan air bersih (BPOM, 1996). Jenis kedua adalah air yang menjadi bagian dari makanan (ingredien) misalnya untuk membuat kaldu, larutan gula, larutan garam dan lain-lain (BPOM, 1996).
Jenis air ini harus
memenuhi persyaratan air minum atau air bersih (BPOM, 1996; Codex, 2003). Selain fungsi air sebagai bahan baku, air dalam proses produksi pangan juga digunakan untuk pembuatan es dan untuk fungsi pembersihan. Air untuk pembuatan es yang akan mengalami kontak langsung dengan makanan dibuat dari air yang memenuhi persyaratan sebagai air minum (BPOM, 1996; Codex, 2003). Air untuk fungsi pembersihan, harus disediakan air dingin dan air panas dengan kualitas air minum (Codex, 2003). Jouve (2000) menyebutkan bahwa air yang digunakan dalam proses produksi harus memiliki kualitas air minum (potable water) dengan kualitas mikrobiologis yang bagus. Dalam EC 98 (1998), yang termasuk di dalam air yang ditujukan untuk konsumsi manusia adalah air untuk minum, memasak, mempersiapkan makanan dan kebutuhan rumah tangga lainnya, serta air untuk kebutuhan produksi makanan. Definisi air bersih menurut CPMB adalah air yang dipergunakan untuk keperluan sehari-hari, yang kualitasnya memenuhi syarat kesehatan sesuai dengan Peraturan Menteri Kesehatan RI no. 416/Menkes/Per/IX/1990 (Permenkes RI No. 416/1990) dan dapat diminum apabila telah dimasak. Air minum menurut CPMB adalah air yang kualitasnya memenuhi persyaratan Permenkes RI no. 416/1990 dan dapat langsung diminum (BPOM, 1996). Sejak tahun 2002, khusus untuk persyaratan air minum, tidak lagi menggunakan Permenkes RI no. 416/1990
24
(Lampiran 16) tetapi diganti dengan Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 907/MENKES/SK/VII/2002 tentang Syarat-syarat dan Pengawasan Kualitas Air Minum seperti pada Tabel 2 (DEPKES, 2002). Definisi air minum menurut Kepmenkes No. 907/2002 adalah air yang didistribusikan melalui pipa untuk keperluan rumah tangga, air yang didistribusikan melalui tangki air, air kemasan, dan air yang digunakan untuk bahan makanan dan minuman yang disajikan kepada masyarakat (DEPKES, 2002). Dalam Codex CAC/RCP 1-1969, Rev.4-2003 tentang pasokan air minum disebutkan bahwa pasokan air minum yang cukup dengan fasilitas yang memadai untuk penyimpanan, distribusi dan kontrol suhu, harus tersedia, apabila diperlukan,untuk memastikan keamanan pangan.
Standar air minum (potable
water) harus mengacu pada edisi terakhir dari WHO Guidelines for Drinking Water Quality, atau standar lain yang lebih tinggi (Codex, 2003).
Definisi air
minum menurut WHO (2004) adalah semua air yang akan digunakan untuk minum maupun air yang masuk dan ada di sistem distribusi air. Kandungan E.coli atau bakteri koliform tahan panas harus negatif per 100 ml sampel air minum. Standar WHO tersebut juga menjadi acuan untuk pembuatan standar kualitas air minum di European Community sesuai dengan Council Directive 98/83/EC tanggal 3 November 1998 tentang Quality of Water Iintended for Human Consumption (EC, 1998). Pembuatan air proses di PT Yummy Food Utama yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini mengalami berbagai tahap perlakuan untuk memenuhi kualitas air minum yang dipersyaratkan Kepmenkes 907. Dalam Lampiran 18 bagan alir untuk tanki 3 terlihat bahwa air baku dilewatkan ke penangkap besi (Fe) dan mangan (Mn), kemudian dinetralkan dengan filter carosek yang juga berfungsi untuk pengatur pH ke 6.5 – 7.5. Selanjutnya adalah penyaringan secara bertahap dengan membran filter ukuran 5µ kemudian 3µ, dan terakhir sterilisasi dengan lampu UV. Pengujian air rutin dilakukan setiap hari Senin dan Rabu pada 7 titik sampling. Selama ini dengan pengujian setiap sangat jarang diperoleh hasil koliform dan E.coli positif dalam air proses tersebut. Pembersihan tanki secara rutin dilakukan setiap dua minggu, kecuali apabila ada kasus koliform positif maka pembersihan diajukan ke hari Sabtu terdekat.
Pembersihan dilakukan
25
dengan mencuci dan menggosok tanki, kemudian mengisi air sampai penuh kembali dan mengalirkan uap panas ke dalam tanki sampai mencapai suhu 95oC. Air yang sudah panas tersebut selain memanaskan tanki kemudian dialirkan juga ke semua sistem distribusi yang ada.
2.2 Bakteri Indikator dalam Air Minum
Pengujian mikrobiologi pada sampel air umumnya dilakukan untuk melihat kemungkinan terjadinya transmisi penyakit-penyakit yang dapat disebarkan oleh air (waterborne desease).
Beberapa mikrooganisme patogen yang mungkin
disebarkan melalui air (waterborne pathogen) adalah bakteri, virus dan parasit intestinal.
Bakteri patogen tersebut antara lain Vibrio cholerae, Shigella
dysentriae,
Salmonella
spp.,
Salmonella
Typhi,
Campylobacter
jejuni.
Escherichia coli patogen (enterohaemorhagik, enterotoksigenik, enteropatogenik, enteroinvasif), Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Burkholderia pseudomallei, non-tuberculous mycobacteria, dan Legionella spp.. Virus yang mungkin ada di air minum antara lain Adenovirus, Norovirus dan Sapovirus, Rotavirus, Enterovirus, Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Reovirus Adenovirus, Hepatitis A virus Hepatitis E virus, Hepatitis A virus, Norwalk like virus, Astrovirus, Calcivirus, Epidemic non A non B hepatitus. Sementara itu parasit intestinal yang mungkin ada di dalam air minum antara lain Cryptosporidium parvum, Giardia lablia, Entamoeba histolytica (Harrigan, 1998; Merck, 2004; WHO, 2006).
Bahaya mikrobiologis lain yang
disebabkan oleh toksin yang diproduksi cyanobacteria (blue-green algae) seperti Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nodularia, Microcystis, Nostoc, dan Clyndrospermum (Harrigan, 1998). Keamanan suatu air minum tidak hanya berhubungan dengan adanya bakteri patogen akibat terjadinya kontaminasi fekal saja tetapi juga bisa berasal dari organisme lain yang tumbuh di sistem perpipaan (dalam jalur distribusi dan penyimpanan) atau yang berasal dari sumber air itu sendiri (WHO, 2006). Idealnya, setiap sampel air minum diuji semua organisme patogen diatas sehingga
26
didapat air minum yang benar-benar sehat. Akan tetapi pengujian patogen pada umumnya memerlukan waktu yang lama, sulit dikerjakan dan memerlukan biaya yang besar sehingga dirasa tidak praktis untuk dilakukan dalam monitoring rutin. Untuk itu diperlukan suatu organisme indikator yang memenuhi kriteria tertentu, sehingga keberadaannya memberikan korelasi yang nyata dengan terjadinya kontaminasi fekal di air tersebut (WHO, 2006). Istilah organisme indikator sebenarnya dapat diaplikasikan ke setiap kelompok organisme (baik secara taksonomik, fisiologis atau ekologis) yang keberadaan ataupun ketidak beradaannya memberikan bukti tak langsung tentang gambaran kondisi sample tersebut dimasa lalu atau gambaran kondisinya saat ini dari suatu hal yang tidak di-investigasi secara langsung. Yang sering digunakan sebagai indikator adalah kelompok koliform sebagai indikasi adanya kontaminasi fekal, walaupun bisa juga digunakan sebagai indikator kurangnya pemanasan pada pangan yang diproses panas (Harrigan, 1998). Istilah organisme indeks (index organism) diusulkan oleh Ingram pada tahun 1977 (Harrigan, 1998) untuk penanda dimana kehadirannya mengindikasikan kemungkinan keberadaan patogen-patogen dari lingkungan yang sama. Istilah organisme penanda (marker organism), yang awalnya digunakan dalam pengujian mikrobiologis air minum, juga sering digunakan dalam pengujian kualitas dimana Escherichia coli telah diketahui menjadi indikasi potensi bahaya dari kemungkinan adanya bakteri patogen intestinal (Harrigan, 1998). Organisme indikator/indeks/marker tersebut secara universal harus ada dalam jumlah besar di feses manusia dan hewan berdarah panas lainnya, harus dapat dideteksi dengan metode yang sederhana dan harus tidak tumbuh di air alami (natural water) (WHO, 2006). Selain itu organisme tersebut juga harus ada pada saat patogen yang dituju ada, jumlahnya harus jauh lebih banyak dari patogen tersebut, dan harus lebih tahan terhadap kondisi lingkungan atau manipulasi proses yang diterima (Harrigan, 1998). Organisme indikator yang umum digunakan untuk indikasi kontaminasi fekal adalah E.coli. Beberapa metode juga menggunakan koliform fekal sebagai alternatif untuk test E.coli (WHO, 2006). Koliform yang pada awalnya digunakan sebagai bakteri indikator tidak selalu mencerminkan telah terjadinya kontaminasi
27
fekal karena sebagian koliform berasal dari alam. Dilain pihak, hasil uji E.coli dan koliform yang negatif bukan jaminan tidak ada patogen dalam sampel tersebut karena protozoa dan virus umumnya lebih tahan terhadap perlakuan klorinasi dari pada koliform. Selain itu, pemilihan jenis bakteri indikator dan metode analisa juga akan berpengaruh terhadap interpretasi hasil, misalnya pemilihan E.coli untuk indikator adalah khusus untuk strain biasa karena E.coli patogen tidak akan terdeteksi dengan metode konvensional (Harrigan, 1998). Keterbatasan tersebut menyebabkan Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) bersama WHO dalam sidangnya di Geneva 24-25 April 2002 memutuskan bahwa ada kebutuhan akan parameter mikrobiologis dan metode yang lebih baik untuk melakukan penilaian keamanan dan monitoring suatu air minum (WHO, 2006). Parameter uji mikrobiologis rutin yang dilakukan untuk sampel air adalah total bakteri heterotrofik (Heterothropic Plate Count), koliform total, koliform fekal (tahan panas), Escherichia coli, Streptococci fekal atau Enterococci faecalis, Clostridia atau Clostridium perfringens (Merck, 2004).
Total bakteri heterotrofik Bakteri yang terdapat di air sebagian besar dapat dikelompokkan dalam tiga tipe yaitu: (a) bakteri akuatik (autochthonous); (b) organisme asli tanah; dan (c)
organisme yang biasanya hidup di pencernanaan manusia dan hewan.
Kebanyakan bakteri perairan adalah Gram negatif (seperti Pseudomonas, Flavobacterium, Cytophaga, Acinetobacter, Chromobacterium), walaupun ada beberapa bakteri Gram positif (seperti Corynebacteria, Micrococcus, Bacillus) yang mungkin ditemukan (Harrigan, 1998). Beberapa bakteri akuatik sangat sulit ditumbuhkan di media biasa kecuali di CPS medium Apabila ditumbuhkan pada medium CPS maka hasilnya akan sepuluh kali lipat daripada pertumbuhan di Nutrient Agar atau Plate Count Agar. Bakteri seperti ini biasanya mempunyai temperature optimal di 25oC atau kurang, dan plate harus diinkubasi sampai 14 hari (Harrigan, 1998). Bakteri yang hidup di tanah bisa terbawa oleh air sehingga masuk ke badan air. Yang termasuk ke golongan ini adalah spesies Bacillus, Sterptomyces,
28
dan anggota Enterobacteriaceae yang saprofitik seperti Enterobacter. Jenis bakteri ini umumnya hidup di temperatur optimal sekitar 25oC dan dapat tumbuh di Nutrient Agar atau Plate Count Agar (Harrigan, 1998). Total bakteri heterotrofik atau Angka Lempeng Total (Total Plate Count) memberikan indikasi keseluruhan dari sumber air tanah, efikasi dari proses pengolahan air, kebersihan, dan kesempurnaan sistem distribusi air dengan mengukur potensi pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah air minum diproses (re-growth/after-growth). Mikroorganisme umumnya akan tumbuh di dalam air dan juga sebagai biofilm pada permukaan-permukaan (pipa, tanki, dll) Jumlah total bakteri yang tinggi pada air minum yang telah diproses mengindikasikan adanya pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah proses dan sebagai indikator tak langsung akan keberhasilan penghilangan patogen selama proses tersebut. Perubahan total bakteri dalam sampel air mengindikasikan perubahan kualitas mikrobiologis air atau kalau terjadi secara tiba-tiba merupakan peringatan dini adanya polusi di sistem proses pengolahan air tersebut, yang memerlukan penyelidikan segera. (Merck, 2004). Harrigan (1998) menyebutkan bahwa kebanyakan, kondisi total bakteri yang tinggi bukan berasal dari fekal atau pencemaran limbah tetapi dari bakteri saprofitik tanah. Walaupun tidak selalu berarti ada patogen akan tetapi total bakteri yang tinggi dapat menyebabkan masalah pada proses pembusukan pangan (food spoilage).
Koliform Pengujian koliform total sudah digunakan sejak lama sebagai indikator kualitas sanitasi secara umum.
Bakteri bersifat aerob dan fakultatif anaerob,
Gram negatif, berbentuk batang, tidak membentuk spora (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Ada yang motil dengan flagella peritrikus, ada yang berfimbria, dan ada yang membentuk kapsul (Supardi dan Sukamto, 1999). Kemampuan membentuk enzim β-galaktosidase dimiliki oleh 94-96% dari bakteri koliform (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Sebagian besar bisa tumbuh dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas dalam waktu 24 jam pada temperatur inkubasi 35-37oC, dengan adanya garam bile atau reagen selektif lainnya (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Pertumbuhan di media agar sederhana : koloni berbentuk sirkuler dengan
29
diameter 1-3 mm, sedikit cembung, permukaan halus, tidak berwarna atau abuabu, jernih. Pada media MacConkey Agar dan Eosin Methylen Blue Agar : koloni yang mampu memfermentasi laktosa akan berwarna merah muda dengan kilap logam. Klebsiella dan Enterobacter membentuk koloni yang lebih besar dan berlendir, sedangkan Proteus membentuk koloni yang menjalar atau swarming (Supardi dan Sukamto, 1999). Koliform umumnya hidup di saluran pencernakan manusia dan hewan berdarah panas, tetapi ada juga yang berasal dari tanah dan air permukaan. Walaupun banyak yang berasal dari fekal tetapi beberapa diantaranya adalah bakteri heterotrofik yang dapat berkembang biak di berbagai jenis lingkungan perairan. Yang termasuk dalam kelompok bakteri koliform adalah Escherichia, Enterobacter, Klebsiella dan Citrobacter (Merck, 2004). Menurut Supardi dan Sukamto (1999) yang termasuk koliform adalah Escherichia coli, Edwarsiella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Arizona, Providentia, Pseudomonas dan basil parakolon. . Keberadaan koliform tidak selalu berasal dari kontaminasi fekal di sumber air akan tetapi mungkin dari pencemaran yang terjadi saat berada di sistem pengolahan air atau distribusi dalam sistem yang tidak baik. Adanya koliform mengindikasikan bahwa kemungkinan air tersebut telah terkontaminasi dengan mikroorganisme yang bisa menyebabkan penyakit.
Pada umumnya koliform
bersifat non-patogen, tetapi pada kondisi khusus juga bisa menyebabkan penyakit, terutama pada orang-orang yang peka (Merck, 2004).
Koliform fekal Koliform fekal atau dikenal juga sebagai bakteri koliform tahan panas adalah bakteri yang dengan adanya garam bile atau reagen selektif lainnya, bisa tumbuh dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas apabila diinkubasi pada temperatur 44 - 45,5oC. Temperatur inkubasi dalam kisaran tersebut adalah faktor yang kritis dan penggunaan penangas air adalah wajib (Harrigan, 1998). Koliform fekal mempunyai probailitas lebih besar berasal dari fekal daripada koliform biasa yang bisa berasal dari fekal atau non fekal (Pierson & Smooth, 2001).
30
Kehadirannya di air minum adalah indikasi kuat bahwa belum lama berselang telah terjadi kontaminasi limbah atau kotoran hewan. Kelompok bakteri yang didominasi oleh Escherichia coli dan galur-galur Klebsiella yang tahan panas ini lebih berkaitan dengan adanya kontaminasi fekal daripada total bakteri koliform, sehingga keberadaannya dalam air minum umumnya tidak bisa diterima (Merck, 2004).
Escherichia coli. Escherichia coli adalah koliform fekal yang memfermentasi laktosa, menghasilkan gas dan asam pada suhu 35-37oC dan 44 - 45.5 oC (meliputi 90% dari E.coli). Sifat biokimia lainnya yang digunakan untuk identifikasi secara konvensional adalah reaksi methyl red positif, reaksi Voges-Proskauer negatif, tidak dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, dan memiliki reaksi indol positif. Pembentukan indol terjadi karena E.coli mempunyai enzim tryptophanase yang dimiliki oleh 99% strain E.coli yang disebut strain E.coli tipe 1 (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Sifat enzim lain yang diketahui adalah yaitu 96% dari strain E.coli mempunyai aktifitas enzim β-D-galaktosidase (GAL) dan enzim β-D-glukuronidase (GUD). Seperti halnya koliform fekal, E.coli dapat dideteksi dengan menumbuhkan pada media selektif cair atau agar pada suhu lebih tinggi (44 atau 45,5oC) menggunakan penangas air (Merck, 2004). Escherichia coli
adalah spesies dari kelompok bakteri koliform yang
biasanya menghuni usus manusia atau hewan berdarah panas. Adanya E.coli di air minum mengindikasikan bahwa belum lama berselang telah terjadi polusi yang berasal dari fekal (air kotor atau kotoran hewan) karena E.coli jarang berkembangbiak di lingkungan perairan (Merck, 2004). Patogen yang lebih tahan terhadap kondisi lingkungan atau teknologi sanitasi mungkin masih ada di air yang telah ditreatment walaupun hasil uji E.coli negatif (Harrigan, 1998; WHO, 2006). Dengan demikian sampel yang terdeteksi positif E.coli belum tentu masih mengandung patogen, sebaliknya apabila di sampel tersebut ada patogen yang lebih tahan terhadap perlakuan selama pemrosesan air daripada
E.coli maka
kemungkinan hasil test E.coli akan negatif.
31
Klasifikasi E.coli dilakukan berdasarkan reaksi biokimia dan serotipenya. Berdasarkan serotipe, E.coli bisa dibedakan atas adanya antigen somatic (O) dan antigen flagelar (H), yaitu enteropathogenic E.coli (EPEC), enterotoxigenic E.coli (ETEC), enteroinvasive E.coli
(EIEC), diffuse-adhering E.coli
(DAEC),
enteroaggregative E.coli (EAEC), dan enterohemorrhargic E.coli (EHEC). Diantara kelompok E.coli penyebab penyakit karena pangan (foodborne illness) dan menyebabkan sakit yang parah adalah EHEC (Meng et.al. 2001). Walaupun E.coli merupakan bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator kontaminasi fekal tetapi kegagalan dalam mendeteksi E.coli tidak selalu berarti bahwa tidak ada patogen enterik di sana (Pierson & Smooth, 2001).
Enterococci. Enterococci spp. adalah bakteri gram positif, katalase negatif, berbentuk cocci, dan biasanya tumbuh pada temperatur 45oC dalam 6,5% NaCl dan pH 9,6 (Merck, 2004). Sumber dari Enterococci adalah material fekal manusia, hewan (berdarah panas maupun dingin) dan tanaman. Enterococci berbeda dari koliform dalam hal ketahanannya terhadap garam (6,5% NaCl) dan relatif tahan terhadap pembekuan. Beberapa Enterococci (Enterococcus faecalis dan E.faecium) juga relatif tahan panas dan mungkin bisa bertahan pada suhu pasteurisasi susu (Pierson & Smooth, 2001). Jumlah Enterococci dalam kotoran manusia lebih sedikit daripada koliform fekal dan E.coli dan jarang ditemukan, sehingga membatasi penggunaannya sebagai bakteri indikator dalam proses air minum. Selain itu Enterococci jarang tumbuh di lingkungan, lebih tahan terhadap berbagai proses perlakuan dan disinfeksi dibandingkan bakteri koliform, coliphage dan virus (Merck, 2004). Di Amerika Serikat Enterococci dapat digunakan sebagai indikator untuk melakukan monitoring kualitas air di area rekreasi pantai karena Enterococci lebih tahan terhadap kadar garam tinggi dibandingkan dengan E.coli. Enterococci adalah indikator efisiensi dari suatu sistem pengolahan air. Enterococci seringkali digunakan sebagai indikator kedua untuk sampling ulangan setelah ditemukan
32
koliform atau E.coli dalam suatu sistem distribusi air. Selain itu Enterococci juga digunakan sebagai indikator dalam monitoring rutin untuk sumber utama air yang baru dibuat atau setelah perbaikan sistem distribusi. Test Enterococci dilakukan untuk mendapatkan data tambahan terhadap karakteristik suatu sistem air alam karena mereka sangat jarang bekembang biak di alam (Merck, 2004). Karena bisa bertahan di peralatan lingkungan proses produksi dalam jangka waktu yang panjang, maka Enterococci bisa juga digunakan untuk mengidentifikasi buruknya kualitas pelaksanaan proses produksi (Pierson & Smooth, 2001).
Clostridia Indikator yang terakhir adalah Clostridia dan Clostridium perfringens yang sesuai untuk indikator survival virus dan kista protozoa di air minum, atau ookista di air minum yang diolah (apabila sampah diduga sebagai sumber kontaminasi). Keduanya tidak direkomendasikan untuk digunakan sebagai parameter rutin dalam pemeriksaan kualitas air karena spora Clostridia dapat terakumulasi dan bertahan dalam waktu yang lama di alam (Merck, 2004). Clostridium perfringens adalah bakteri anaerobik, Gram positif, bentuk batang berspora, berkaspula, dan non motil. Ukuran sel bervariasi tergantung jenis media pertumbuhan, misalnya pada medium yang mengandung glukosa selnya pendek sedang pada media sporulasi yang mengandung pati ukurannya akan lebih panjang. Selain bisa dijadikan indikator, bakteri ini sendiri bersifat patogen terhadap manusia dan hewan karena mampu memproduksi enterotoksin yang bisa menyebabkan diare dan gas gangrene (Labbe, 1992)
2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum Walaupun ada beberapa macam bakteri indikator untuk kualitas bakteriologis air minum, tetapi di Kepmenkes 907/2002 yang mengatur kualitas bakteriologis air minum di Indonesia hanya menggunakan koliform total, E.coli (atau koli fekal). Persyaratan kualitas bakteriologis air minum maupun yang masuk ke sistem distribusi air minum seperti pada Tabel 2, adalah harus bebas bakteri koliform total, E. coli atau koli fekal per 100 ml sampel.
33
Tabel 2 Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 907/MENKES/SK/VII/2002 Satuan
Kadar maksimum yang diperbolehkan
a. Air Minum E. coli atau fecal coli
Jumlah per 100 ml sampel
0
b. Air yang masuk sistem distribusi E. coli atau fecal coli Total Bakteri Koliform
Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel
0 0
c. Air pada sistem distribusi E.coli atau fecal coli Total Bakteri Koliform
Jumlah per 100 ml sampel Jumlah per 100 ml sampel
0 0
Parameter
Sumber: Depkes (2002) Dalam National Drinking Primary Water Standard yang dikeluarkan oleh United States Environmental Protection Agency, USEPA 816-F-01-007 - Office of Water (4606) disebutkan bahwa Maximum Contaminant Level Goal (MCLG) koliform total (termasuk koliform fekal dan E.coli ) dalam sampel air harus nol (zero). Jumlah sampel yang mungkin mengandung koliform total (positif) tidak lebih dari 5% dari total sampel sebulan. Untuk sistem air yang jumlah sampel per bulannya kurang dari 40, maka jumlah sampel yang mungkin positif tidak boleh lebih dari satu dalam sebulan. Setiap sampel yang ada koliform totalnya harus dianalisa untuk E.coli atau koliform fekal, untuk memastikan apakah tercemar material fekal hewan. Dari hasil pemeriksaan lanjutan tersebut mungkin saja ternyata dalam sampel tersebut tidak terkandung E.coli atau koliform fekal. E.coli atau koliform fekal termasuk dalam kelompok koliform total (USEPA, 2001). Dalam WHO Guidelines for Drinking–water Quality (WHO, 2004) disebutkan bahwa adalah tidak mungkin melakukan monitoring air minum untuk setiap mikroba pathogen yang mungkin ada.
Yang paling umum digunakan
sebagai bakteri penanda (marker organism) adalah Escherichia coli dan koliform. Koliform adalah satu kelompok bakteri yang terdiri dari Escherichia (termasuk E. coli), Klebsiella, Citrobacter, dan Enterobacter. Koliform sebagai organisme indikator mengindikasikan adanya sanitasi yang buruk dari air maupun suatu proses produksi. E. coli sebagai organisme indek mengindikasikan adanya potensi bakteri enterik lain penyebab penyakit karena adanya kontaminasi fekal (Merck,
34
2004). Koliform berasal dari lingkungan sedangkan koliform fekal dan E. coli berasal dari kotoran fekal hewan maupun manusia (USEPA, 2001). Standar untuk air minum menurut KEPMENKES 907, Council Directive 98/83/EC maupun WHO adalah kandungan bakteri koliform maupun E. coli harus negatif dalam 100 ml sampel air minum (Depkes, 2002; EC, 1998; dan WHO, 2004).
USEPA (2001) mensyaratkan bahwa dalam satu bulan jumlah sampel
yang positif koliform tidak boleh lebih dari 5% dari total sampel dan untuk system yang jumlah sampelnya kurang dari 40 per bulan maka tidak boleh lebih dari satu sampel yang positif koliform.
Semua sampel yang positif koliform harus
dianalisa E. coli atau koliform fekal (cukup salah satu) untuk menentukan apakah ada pencemaran dari fekal manusia atau hewan.
2.4 Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli Salah satu alasan mengapa koliform total dan E.coli paling banyak digunakan sebagai bakteri indikator adalah karena cara pengujiannya yang relatif mudah dan cepat. Pengujian mikrobiologis mungkin memberikan akurasi hasil yang bervariasi karena pemilihan medium pertumbuhan dan temperatur inkubasi. Disamping itu, kondisi asal dan umur sampel air dapat mempengaruhi spesies yang terisolasi serta jumlahnya (WHO, 2006). Media yang digunakan untuk pengujian koliform dan E. coli bisa media konvensional yang berbasis fermentasi karbohidrat atau media cepat yang berbasis fluorogenik dan/atau kromogenik. Media konvensional pada umumnya berdasarkan pada kemampuan bakteri koliform
dalam
memfermentasi
laktosa
oleh
enzim
ß-D-galactosidase,
menghasilkan asam dan gas. Asam yang terbentuk akan mengubah indikator yang ada dalam media tersebut menjadi warna tertentu, baik pada media maupun pada koloni bakteri. Gas yang terjadi karena fermentasi laktosa akan ditangkap dengan tabung durham pada medium cair atau akan menimbulkan rekahan di media padat. Beberapa reaksi lain yang mungkin timbul (sesuai komposisi medianya) adalah terbentuknya kilap logam (Endo Agar dan EMB agar) atau terjadinya presipitat disekitar koloni pada Violet Red Bile Agar (Manafi, 1996; Merck, 2005). Beberapa media konvensional yang umum digunakan yaitu Lactose Broth (LB), Brilliant Green Bile 2% Broth (BGLB), Lauryl Sulfate Tryptose
35
Broth/Lauryl Tryptose Broth (LST), MacConkey Broth (MCB), MacConkey Agar (MCA), EC Broth/Medium, Violet Red Bile Agar (VRBA), Endo Agar, Eosin Methylen Blue Agar (EMBA), Levine EMB Agar (LEMBA), m-Endo Agar LES, A 1 Medium, dan P-A Broth (APHA, 2005; ISO, 2004; Merck, 2005; USEPA, 2007). Secara umum, penggunaan media konvensional untuk pengujian bakteri indikator masih belum bisa membedakan antara bakteri laktose positif, bakteri kelompok koliform dan bakteri E. coli. Untuk membedakannya diperlukan tahapan identifikasi atau konfirmasi dari koloni terduga yang tumbuh di media agar untuk isolasi. Porses identifikasi tersebut selain memerlukan waktu yang banyak, juga memerlukan beberapa tahapan pengerjaan (Manafi, 1996). Kebutuhan untuk mendapatkan hasil pengujian mikrobiologis secepatnya, terutama untuk produk pangan yang masa pakainya singkat, mendorong berbagai penelitian tentang media yang lebih cepat, praktis dan akurat. Beberapa media baru yang sesuai dengan kebutuhan tersebut sudah mulai diterima dan diakui oleh beberapa Lembaga Internasional seperti APHA, WHO, USEPA, ISO, dan FDA. Umumnya media yang digunakan adalah yang menggunakan enzim spesifik sebagai target penanda suatu mikroorganisme tertentu (APHA, 2005; ISO, 2001; USEPA, 2007, WHO, 2002). Suatu mikroorganisme bisa mempunyai satu atau lebih enzim yang spesifik dan esklusif, yang dapat menggunakan substrat tertentu yang sesuai (misalnya substrat-enzim fluorogenik dan khromogenik). Substrat tersebut dicampurkan kedalam media (cair atau padat) yang dipergunakan untuk menumbuhkan organisme tersebut.
Penemuan substrat tersebut telah memicu
pengembangan sejumlah besar metode untuk identifikasi mikroorganisme, bahkan untuk media isolasi awal. Penambahan substrat-enzim ini ke medium selektif dapat menghilangkan kebutuhan untuk subkultur dan test biokimia lanjutan untuk meyakinkan identitas suatu mikroorganisme tertentu (Manafi, 1996; Manafi, 2000).
36
Media Fluorogenik Media substrat-enzim fluorogenik umumnya mengandung substrat yang spesifik terhadap enzim tertentu (seperti gula atau asam amino) dan fluorogen (seperti 4-methylumbelliferone), yang interaksinya dapat mengubah sinar UV menjadi sinar yang tampak. Sebagian besar enzim-substrat yang sering digunakan adalah coumarin (Manafi, 1996). Substrat methylumbelliferyl bersifat larut air, sangat sensitif dan sangat spesifik. Karena sifatnya yang terpengaruh oleh pH, terdifusi secara kuat ke media padat, dan perlu lampu UV untuk mendeteksi, maka penggunaan substrat in menjadi terbatas. Substrat fluorogenik yang paling umum digunakan adalah MUG atau methylumbelliferyl glucuronidase (Manafi, 2000). Secara umum reaksi yang terjadi pada media fluorogenik tampak pada Gambar 1. Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh di media fluorogenik akan memecah ikatan komplek substrat karbohidrat dengan methylumbelliferron.
Gugus karbohidrat akan dipecah oleh enzim dan gugus
methylumbelliferil akan dilepaskan ke media. Apabila disinari dengan lampu UV panjang gelombang 365 nm atau 366 nm akan tampak sinar fluoresen biru pada media cair atau pada koloni terduga yang tumbuh di media agar (Manafi, 1996; Merck, 2004; APHA, 2005).
Enzim ß-D-Glucurondase
Methyl-umbelliferon Karbohidrat
Enzim Tak Berwarna
Enzim
Sinar UV 366 nm
Fluoresens
i
Media
Gambar 1 Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni dibawah lampu UV 366 nm
37
Media cepat yang dikembangkan dari media konvensional dengan penambahan substrat fluorogenik MUG dapat digunakan untuk menumbuhkan, sekaligus membedakan E.coli dari bakteri lainnya. Contoh pengembangan media konvensional menjadi media cepat fluorogenik dari adalah media VRBA with MUG (APHA, 2005; FDA, 2002) dan media EC Broth with MUG (APHA, 2005). Dalam Manafi (2000) disebutkan jumlah MUG yang ditambahkan ke media konvensional adalah 50 µg/ml (BGLB, LB, ECB, LTB), 100 µg/ml (LTB), 150 µg/ml (MCB), dan 200 µg/ml (VRBA). Beberapa contoh media cair yang menggunakan MUG, yang tersedia secara komersial di pasar adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform, Colilert, Coliquick, dan Colisure (Tabel 3). Selain itu beberapa contoh media konvensional yang sudah mengandung MUG didalamnya adalah Fluorocult® LMX broth, Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult® BRILA Broth, Readycult® Coliform,
Fluorocult® VRBA, Fluorocult® MacConkey Agar,
Fluorocult® E.coli O157:H7 (Merck, 2005).
Media Kromogenik Substrate-enzim kromogenik adalah senyawa-senyawa yang bertindak sebagai substrat terhadap suatu enzim spesifik, dan berubah warna karena kerja dari enzim tersebut. Secara umum, berdasarkan reaksi kimianya, empat kelompok senyawa kromogenik dapat dikenali dan dideskripsikan oleh Manafi pada tahun 1998. Turunan indolil bersifat larut air dan tahan panas sehingga bisa digunakan di media agar. Turunan indolil yang sering digunakan antara lain: 5-bromo-4chloro-3-indolyl (X), 5-bromo-6-chloro-3-indolyl (magenta), atau 6-chloro-3indolyl (salmon), dan semuanya terbukti tidak terdifusi di agar (Manafi, 2000). Manafi (2000) menyebutkan bahwa substrat kromogenik yang sering digunakan adalah ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL (6bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); XGAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ßD-galactopyranoside); XGLUC atau BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-Dglucuronide);
CPRG
(chlorophenol
red
ß-galactopyranoside);
dan
TTC
(Tryphenyl Tetrazolium Chloride).
38
Pada Gambar 2 terlihat reaksi umum dari enzim-substrat pada media kromogenik. Enzim spesifik yang dilepaskan oleh suatu mikroorganisme akan menggunakan karbohidrat dari komplek karbohidrat-indolil yang ada di media sebagai sumber karbon. Dua gugus indolil yang lepas akan saling berikatan, dan dengan adanya oksigen akan membentuk warna tertentu, tergantung jenis indolil dari kromogen yang digunakan. Karena pembentukan warna memerlukan oksigen maka ketersediaan udara yang cukup di botol atau cawan petri menjadi sangat penting (Manafi, 1996; Manafi, 2000).
Enzim ß-D-glucuronidase dan ß-D-galactosidase
Glucuronide dan Galactoside
Karbohidrat
Enzim
Indolyl Tak Berwarna
Enzim
+ O2
ikatan indolyl + O2 warna
Gambar 2 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni. Contoh media kromogenik yang sudah tersedia di pasar adalah yang menggunakan X-GAL sehingga memberikan warna biru (Tabel 3) adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform Medium, EMX Agar, C-EC-MF Agar, Coli ID, Rapid E.coli 2, Coli Complete, ColiBag, Pathogel, dan E.colite. Media kromogenik yang menggunakan ONPG sehingga memberikan warna kuning (Tabel 3) adalah Colilert dan Coliquick. Substrat CRPG memberikan warna merah digunakan pada media Colisure.
Substrat lain yang juga memberikan warna
merah adalah Salmon GAL, dan digunakan pada media Chromocult Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E coli /Coliforms, Coliscan, HiChrom ECC.
39
Media Simultan untuk Koliform dan E.coli Baik koliform maupun E.coli sampai saat ini masih sangat penting sebagai indikator kualitas air dan produk pangan secara umum sehingga akan sangat berguna apabila ada suatu media yang dapat mendeteksi keduanya sekaligus dalam waktu yang bersamaan. Beberapa percobaan telah dilakukan dan metode baru sudah diperkenalkan yaitu yang berdasar pada deteksi enzim ß-Dgalactosidase (ß-GAL) dan enzim ß-D-glucuronidase (GUD) menggunakan substrat fluorogenik dan/atau khromogenik (Manafi & Rosmann, 1998b). Enzim ß-D-galactosidase (ß-GAL) yang dimiliki oleh 98% koliform (Manafi, 1995). Enzim ß-D-glucuronidase (GUD) yang dimiliki oleh 98% E.coli dan 99% E.coli memberikan reaksi indol positif (Manafi, 1995 dan 1996). Akan tetapi ada 3-4% E.coli ternyata memiliki sifat MUG negatif dan GAL positif, misalnya E.coli O157 (Merck, 2005).
Glucuronidase dan Galactosidase
Glucuronide dan galactoside Karbohidrat
Enzim
Indolyl Tak Berwarna
Enzim Chloroindigo
Coliforms dan E.coli
+ Bromochloroindigo
O2
E.coli
X-Gluc dan Salmon GAL (+) E.coli Gambar 3 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen.
40
Media yang digunakan untuk pengujian simultan koliform dan E. coli pada Tabel 3 ada yang mengandung dua macam substrat kromogenik, ada pula yang mengandung kromogenik dan fluorogenik sekaligus.
Untuk media yang
mengandung substrat kromogenik lebih dari satu maka akan tampak dua atau lebih warna koloni yang berbeda untuk jenis bakteri yang berbeda. Contoh dari media tersebut adalah Chromocult® Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E.coli/Coliforms, ColiScan, dan HiChrome ECC (Salmon GAL-merah dan XGLUC-violet); Coli ID dan Rapid E.coli 2 (XGAL-biru dan Salmon Glu-rose violet); dan m-Coliblue (TTC dan XGluc (Manafi, 2000). Contoh reaksi yang terjadi apabila menggunakan dua macam kromogen sekaligus ada pada Gambar 3, yaitu untuk media Chromocult® Coliform Agar. Pada gambar tersebut terlihat dua macam reaksi warna yang terjadi dari peruraian enzim-substrat yaitu merah salmon (dari enzim Galactosidase yang dimiliki oleh koliform dan E.coli) dan hijau torquise (dari enzim Glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli). E.coli menghasilkan kedua macam enzim sehingga akan terjadi warna purple yang merupakan campuran dari merah salmon dan hijau torquise tersebut (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005). Dalam suatu kultur bakteri campuran, warna yang tampak untuk akan ada empat macam, yaitu merah salmon untuk koliform (GAL positif), purple (GAL positif dan GUD positif) untuk E.coli, hijau torquise untuk bakteri dengan sifat GUD
positif
dan
GAL
negatif,
serta
koloni
tak
berwarna
untuk
Enterobacteriaceae lainnya (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005). Kemungkinan kedua adalah media simultan yang menggunakan kombinasi kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Pada media jenis ini maka selain timbul warna spesifik juga muncul fluoresensi apabila dilihat dibawah lampu UV 366 nm. Media simultan yang sudah ada di pasaran antara lain tampak pada Tabel 3, yaitu yang berbentuk media cair, berbentuk media padat, atau juga sistem lain. Yang berbentuk media cair adalah Fluororcult® LMX Broth, Readycult coliforms, ColiLert, Coliquick, Colisure. Yang berbentuk media padat adalah EMX –agar, C-EC-MF-Agar,
Chromocult Coliform Agar,
Coli ID, CHROMagar ECC,
Rapid’ E.coli 2, E.coli/Coliforms, ColiScan, MI-agar, dan HiCrome ECC.
41
Kelompok ketiga adalah yang menggunakan sistem lain yaitu, ColiComplete, ColiBag/Water check, Pathogel, E. colite, m-Coliblue (Manafi, 2000).
Tabel 3 Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam media untuk deteksi E.coli dan koliform Medium Media cair Fluororcult® LMX Broth Readycult Coliform ColiLert Coliquick Colisure Media Padat Fluorocult® Agars TBX Agar Uricult Trio EMX -agar C-EC-MF-Agar Chromocult Coliform Agar Coli ID CHROMagar ECC Rapid’ E.coli 2 E.coli/Coliforms ColiScan MI-agar HiCrome ECC
Substrat a / Warna Koliform
E. coli
XGAL/biru-hijau XGAL/MUG ONPG/kuning ONPG/kuning CPRG/merah
MUG/fluoresen biru MUG/fluoresen biru MUG/fluoresen biru MUG/fluoresen biru MUG/fluoresen biru
Merck (Jerman) Merck (Jerman) IDEXX (USA) Hach (USA IDEXX (USA)
-
MUG/fluoresen biru BCIG/biru
XGAL/biru XGAL/biru SalmonGal/merah
HOQ/hitam MUG/fluoresen biru MUG/fluoresen biru XGLUC/biru-violet
Merck (Jerman) OXOID (UK), Merck (Jerman)) Orion (Finnland) Biotest (Jerman) Biolife (Italy) Merck (Jerman)
XGAL/biru SalmonGal/merah XGAL/biru SalmonGal/merah SalmonGal/merah MUGal/fluoresen biru SalmonGal/merah
SalmonGlu/rose-violet XGLUC/purple SalmonGlu/purple XGLUC/purple XGLUC/purple Indoxyl/biru
bioMerieux (France) Chromagar (France) Sanofi (France) OXOID (UK), MicrologyLab.(USA) Brenner et al. (1993)
XGLUC/biru
Union Carbide (USA)
Manufaktur
Sistem Lain Biocontrol (USA) ColiComplete XGAL/biru MUG/fluoresen biru ColiBag/Water check XGAL/biru-hijau MUG/fluoresen biru Oceta (Kanada) Pathogel XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) E. colite XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) m-Coliblue TTC/merah XGLUC/biru Hach (USA) a) Singkatan: ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside); Salmon-GAL (6-bromo-3-indolylß-D-galactopyranoside); XGAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); CPRG (chlorophenol red ß-galactopyranoside); XGLUC atau BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ßD-glucuronide); MUG (4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide); TTC (Tryphenyl Tetrazolium Chloride); HOQ (Hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide) Sumber : Manafi, 2000
Beberapa aplikasi media kromogenik dan fluorogenik untuk mikrobiologi pangan dan air adalah untuk Enterobacteriaceae, Enterococci, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bifidobacteria dan Lactic acid bacteria, Listeria monocytogenes, dan Bacillus cereus. Yang paling banyak berkembang saat ini adalah media untuk pengujian Enterobacteriaceae yang meliputi media untuk
42
koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan Salmonella (Manafi, 2000).
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli. Empat metode pengujian untuk bakteri koliform dan E.coli yang paling umum dilakukan adalah metode Angka Paling Mungkin (Most Probable Number atau Multiple-tube Fermentation Technique), metode Angka Koliform Total (Total Coliform Count), metode Membrane Filtrasi (Membrane Filtration Technique), atau metode Positif/Negatif (Presence Absence Procedure) melalui fase pendugaan–penegasan (presuptive–confirmed phase) atau test lengkap (APHA, 2005; Merck, 2004). Setiap teknik bisa diaplikasikan dalam keterbatasan spesifikasinya dan dengan memperhatikan tujuan pemeriksaan. Agar dapat memberikan hasil yang valid maka diperlukan penerapan prosedur Quality Control yang ketat (APHA, 2005). Beberapa metode acuan baik nasional maupun internasional menggunakan beberapa metode sekaligus (Tabel 4), sehingga pemakai dapat memilih metode yang cocok dengan jenis sampel dan situasi yang ada di laboratoriumnya. Tabel 4 memberikan contoh beberapa metode pengujian koliform, E.coli dan koli fekal beserta media yang digunakan, menurut referensi ISO, APHA, FDA, SNI, dan USEPA.
USEPA tampaknya lebih cepat mengadopsi teknologi
kromogenik fluorogenik dengan mengakui penggunaan EC-MUG, LMX, Readycult Coliform, dan Chromocult Coliform Agar.
Angka Paling Mungkin Angka Paling Mungkin (APM) atau Most Probable Number (MPN) atau Multiple Tube Technique adalah modifikasi dari Presence Absence Test (P/A). Sampel yang ditambahkan dibagi ke beberapa tabung yang berbeda dengan volume larutan sampel yang sama (Merck, 2005). Seri pengenceran tersebut menghitung perkiraan konsentrasi mikroba dalam sampel sehingga disebut angka paling mungkin (FDA, 2006). APM terutama cocok untuk sampel dengan konsentrasi organisme yang rendah (<100/g), terutama susu dan air, dan untuk
43
pangan yang bahan-bahan yang terkandung di dalamnya mungkin akan mengacaukan akurasi perhitungan koloni (FDA, 2006).
Tabel 4 Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal Metode / Media Metode Angka Paling Mungkin LST => BGLB dan EC Broth LST - MUG Fluorocult LMX, Colilert
Metode Standar *) USEPA, FDA, APHA, SNI USEPA, FDA, APHA USEPA
Koliform
√ √
E.coli
Koli Fekal
√ √ √
√ √ √
Metode Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar TBX Agar VRBA VRBA - MUG
USEPA, AOAC ISO 16649-2:2001 ISO 4832, FDA, APHA FDA, APHA
√ √
√
Metode Membran Filtrasi m-Endo, LES-Endo, mFC, M-1 Chromocult® Coliform Agar,
USEPA, APHA USEPA
√ √
√
√
Metode Presence Absence P-A Broth => BGLB USEPA, APHA √ LST => EC Broth USEPA √ √ A-1 Broth (direct media) APHA √ Readycult Coliform USEPA *) Keterangan dari singkatan nama : International Organization for Standardization (ISO, 2001); American Public Health Association (APHA, 2005); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2002); United State Environment Protection Agency (USEPA, 2007); Standar Nasional Indonesia (SNI)
Hanya mikroorganisme hidup yang terhitung dengan metode APM. Karena bakteri di dalam suatu sampel membentuk rantai yang tidak terpisahkan selama persiapan sampel dan pengenceran, maka APM harus diputuskan sebagai perkiraan growth units (GUs) atau colony-forming units (CFUs), bukan sebagai individu bakteri (FDA, 2006).
Esensi dari metode APM adalah untuk
mengencerkan sampel sampai ke suatu tingkat dimana inokula di dalam tabung akan (kadang kala, tetapi tidak selalu) mengandung organisme hidup (FDA, 2006). Dari jumlah tabung yang ada pertumbuhan pada setiap seri pengenceran yang dihitung akan dibandingkan ke tabel tertentu sesuai dengan jenis seri pengenceran yang dipakai misal 3, 5, 8, dan 10 tabung (FDA, 2006). Apabila kemungkinan jumlah organisme dalam sampel sangat rendah maka jumlah sampel
44
diperbanyak (10 ml atau bahkan 100 ml) kemudian ditambahkan ke medium double strength atau dengan volume yang setara (Harrigan, 1998)
a.Media Lauryl Sulfate Broth (positif = gas dan keruh)
b. Media Fluorocult LMX Broth (positif = warna hijau)
Gambar 4 Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin Media yang umum digunakan untuk APM adalah Lactose Broth (LB) atau Lauryl Sulfate Broth (LSB) untuk uji pendugaan koliform (presumptive coliform). Apabila terjadi gas dan media menjadi keruh di LB/LTB seperti di Gambar 4a, maka dilakukan uji penegasan koliform (confirmed coliform) ke media Brilliant Green Bile 2% Broth (BGLB) dan uji pendugaan E. coli ke media EC Broth. Uji penegasan E. coli dilakukan dengan menginokulasikan tabung EC broth positif ke media Levine EMB Agar. Dari hasil uji penegas yang positif kemudian dilakukan inokulasi ke medium Nutrient Agar (NA) atau Plate Count Agar (PCA) untuk keperluan uji konfirmasi IMVIC (APHA, 2005; FDA, 2006). Beberapa media baru yang digunakan untuk APM adalah media yang mengandung fluorogenik, kromogenik atau keduanya. Beberapa media yang mengandung fluorogenik misalnya EC-MUG (APHA, 2005), Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult® Brilliant Green Lactose Broth (Merck, 2005). Media yang lain mengandung baik fluorogenik dan kromogenik misalnya Fluorocult® LMX Broth. Hasil uji penduga positif apabila terjadi perubahan warna media
45
menjadi hijau kebiruan, yang biasanya mulai dari bagian atas tabung seperti tampak di Gambar 4 b (Manafi, 2000; Merck, 2004).
Angka Lempeng Total. Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC) merupakan metode perhitungan bakteri dengan menggunakan agar. Beberapa media yang umum digunakan dalam ALT adalah Violet Red Bile Agar (VRBA) dan Fluorocult® VRBA. Metode internasional yang menggunakan VRBA antara lain American Public Health Association (APHA), SMDP, International Dairy Federation (IDF), US Food and Drug Administration Bacteriology Analytical Manual (FDA-BAM), International Standardisation Organisation (ISO), (BAM, APHA). Beberapa media kromogenik yang bisa digunakan untuk ALT misalnya Chromocult® Coliform Agar, Chromocult® TBX Agar (APHA, 2005; FDA, 2002; ISO, Merck, 2004). Pada Gambar 5 terlihat pertumbuhan koliform di empat macam media yang berbeda, yaitu Chromocult® Coliform Agar / CCA (A), Violet Red Bile Agar / VRBA (B), ENDO Agar / EA (C), MacConkey Agar / MCA (D). Pada CCA (Gambar 5 A) tampak koloni warna-warni yang membedakan antara koloni koliform warna merah salmon dan E.coli warna purple, sehingga untuk perhitungan total koliform kedua warna tersebut dijumlahkan. Untuk media VRBA (Gambar 5 B) baik koliform dan E.coli semua warnanya sama yaitu koloni merah dengan presipitat disekitar koloni yang berukuran 1-2 mm. Klebsiella yang termasuk golongan koliform dan bakteri Enterococci kadang-kadang tumbuh di VRBA dengan bentuk koloni pink-point. Pada media Endo Agar (Gambar 5 C) koloni koliform dan E.coli juga berwarna sama yaitu merah, hanya untuk E.coli ada kilap logamnya. Media ke empat yaitu MCA koliform dan E.coli yang bersifat positif laktosa akan berwarna merah dikelilingi oleh zone keruh karena presipitasi asam bile sebagai akibat ari penurunan pH (Merck, 2005). Dari keempat media tersebut hanya CCA yang mampu menumbuhkan sekaligus membedakan antara koloni koliform dan E.coli, sehingga bisa digunakan sekaligus sebagai media untuk menumbuhkan, menghitung dan media seletif.
46
A
B
C
D
Gambar 5 Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult® Coliform Agar (A), Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total
Membran Filtrasi Metode membran filtrasi biasanya digunakan untuk kualitas air minum atau air lain yang memiliki kandungan mikroorganisme sangat rendah. Keuntungan penggunaan membran filtrasi adalah volume sampel yang ditest bisa sangat besar sehingga akurasi data lebih besar dari pada metode lain yang sampelnya sangat terbatas.
Media yang direkomendasikan oleh USEPA dan
APHA untuk pengujian ini adalah M-Endo atau LES Endo kemudian di konfirmasi ke LTB dan BGLB untuk Standar Methods SM 9222B,C; MI Medium Standar Methods SM 9222, m-Coliblue, Chromocult Coliform Agar, dan Coliscan (USEPA, 2007; APHA, 2005). Hasil pengujian dengan membran filtrasi tampak pada Gambar 6.
47
Gambar 6 Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi
Kelemahan metode membran filtrasi adalah apabila sampel banyak mengandung partikulat yang nantinya akan tertahan di membran dan berpotensi mengganggu perhitungan koloni. Selain itu metode ini memerlukan investasi beberapa manifold dan pompa vakum untuk pelaksanaannya. Penggunaan jenis membran yang tepat juga akan mempengaruhi hasil karena interaksi antara bahan kimia dari media dengan membran sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri (Ossmer et.al, 1999).
Presence Absence. Metode Presence
Absence (P/A) untuk koliform adalah modifikasi
sederhana dari metode APM. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan satu porsi besar (100 ml) dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi kualitatif, yaitu ada atau tidaknya koliform. Hal ini dijustifikasi oleh teori yang ada bahwa dalam 100 ml sample air minum tidak boleh ada koliform sama sekali. Metode ini juga memungkinkan untuk dilakukannya. Metode P/A membuka kemungkinan untuk dilakukannya screening lanjutan untuk bakteri-bekteri indikator lain (koliform fekal, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas, Streptoccus fekal, dan Clostridium). Kelebihan lain adalah kemampuan dalam menganalisa jumlah sample yang lebih besar per satuan waktu pengujian (APHA, 2005).
48
Inokulasi sampel
Koliform negatif (being atau keruh
Koliform positif (warna hijau kebiruan)
E.coli positif (warna hijau , Fluoresensi positif, indol positif)
Gambar 7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100
Metode P/A umumnya digunakan untuk sampel dengan kualitas mikrobiologis yang sangat bagus dimana keberadaan mikroorganisme mustahil ada atau seharusnya tidak boleh ada, misalnya tidak boleh adanya (negatif) koliform dan E.coli di sampel air minum. Kelemahan dari metode ini adalah apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi (kuantitatif) tentang tingkat kontaminasi yang terjadi. Sensitifitas dari metode ini sangat tergantung pada jumlah sampel yang dianalisa. Untuk air minum umumnya menggunakan sampel 100 ml, sedangkan untuk air minum yang dikemas maka sampel yang digunakan adalah 250 ml (Codex, 2003; WHO, 2002). Studi komparasi dengan metode membran filtrasi mengindikasikan bahwa P/A bisa memaksimalkan deteksi koliform di sample yang mengandung macammacam organisme yang dapat menutupi (overgrow) koloni koliform dan menyulitkan deteksi. Apabila hasilnya positif maka dianjurkan untuk diuji ulang dengan metode kuantitatif untuk menghitung jumlah koliformnya yang akan memberikan indikasi tingkat kontaminasi air (APHA, 2005).
Gambar 7
memberikan contoh metode P/A menggunakan media Readycult Coliform dengan pembacaan hasil yang sama dengan media LMX yaitu warna hijau kebiruan untuk koliform positif, dan E.coli positif warna hijau fluoresensi dan indol (Merck, 2005; Manafi and Rossman, 1998).
49
III. BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan Pengawasan Obat dan Makanan. Waktu penelitian adalah tanggal 12 Mei 2008 sampai dengan 30 Juli 2008. 3.2 Bahan dan Alat Dalam penelitian ini digunakan bahan penelitian berupa air proses yang dari PT Yummy Food Utama. Pengambilan air proses sebanyak 1 liter dilakukan pagi hari dengan 10 botol laboratorium steril ukuran satu liter. Sampel diambil dari kran tanki air proses yang digunakan untuk proses pencucian dan bahan baku produksi yogurt. Sampel air dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN) Badan Pengawasan Obat dan Makanan di Jl. Percetakan Negara No. 23, Jakarta Pusat. Sampel dibawa dalam keadaan dingin menggunakan coolbox dengan icepack..
Larutan Butterfield
Phophat Buffer steril digunakan untuk pembuatan kontrol positif. Sebagai baku mutu bakteri digunakan biakan murni Escherichia coli ATCC 25922 yang disimpan dalam cryobank dan disimpan dalam freezer -20oC. Media dan reagen yang digunakan dibagi menjadi empat kelompok yaitu : (1) media untuk metode pengujian Angka Paling Mungkin (APM) konvensional, (2) media untuk metode pengujian Angka Paling Mungkin (APM) cepat, (3) media untuk metode pengujian Presence Absence cepat, dan (4) media untuk metode pengujian Angka Lempeng Total (ALT) cepat . Kelompok pertama yaitu metode Angka Paling Mungkin (APM) konvensional menggunakan media Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LST) untuk uji penduga Koliform, EC Broth (ECB) untuk uji penduga E.coli, LEVINE EMB Agar (LEMBA) untuk uji penegas E.coli , Nutrient Agar (NA) untuk pembuatan agar miring, MR-VP Broth Base (MRVP) untuk uji methyl red (MR) dan voges preskauer (VP), SIMMONS Citrate Agar untuk uji sitrat, dan Tryptone Water untuk uji indol.
Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi KOVAC’S indole
reagent untuk test indole, pereaksi Methyl Red untuk test MR, dan pereaksi Voges Preskauer untuk test VP. Kelompok kedua yaitu metode APM cepat menggunakan
50
media Fluorocult® LMX Broth. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi KOVAC’S
indole
reagent
untuk
test
indole.
Pengamatan
fluoresensi
menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm. Untuk metode ALT cepat yang merupakan kelompok ketiga digunakan media Chromocult® Coliform Agar (CCA), dan pereaksi KOVAC'S indole reagent untuk mengkonfirmasi pembentukan indol oleh koloni E.coli. Kelompok keempat adalah metode Presence Absence cepat menggunakan media Readycult® Coliforms 100, pereaksi KOVAC'S indole reagent dan lampu UV 366 nm untuk pengujian fluoresensi. Semua media dan pereaksi menggunakan produk Merck KGaA-Germany. Peralatan yang digunakan adalah inkubator 35-37oC, tangas air, otoklaf, kabinet keamanan biologis kelas II, laminar air flow, lemari pendingin, neraca, lampu UV 366 nm, cawan petri, tabung reaksi, gelas beaker, botol laboratori, erlenmeyer, tabung durham, pipet ukur, pipet tetes, jarum inokulasi, jarum ose, dan lampu bunsen.
3.3 Metode Penelitian Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahapan kerja yaitu: (1) persiapan inokulum, (2) persiapan sampel yang di-inokulasi dengan E.coli ATCC 25922, (3) Inkubasi dan pembacaan hasil pertumbuhan, (4) perhitungan hasil. melakukan analisa pertumbuhan, menghitung recovery rate, menghitung waktu analisa, dan menghitung biaya yang digunakan.
3.3.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel Kultur bakteri yang akan dipergunakan diambil dari cryobank dan diremajakan menggunakan media Brain Heart Infusion Broth (BHIB) sebelum digunakan. Untuk perhitungan jumlah sel dalam stok suspensi, satu ml suspensi kultur dari BHIB yang sudah berumur 24 jam dibuat seri pengenceran sampai 10-9 menggunakan Peptone Dilution Fluid (PDF). Dari masing-masing pengenceran diambil satu ml dan ditanam di cawan petri yang berisi Plate Count Agar (PCA) yang telah ditambahkan TTC (Triphenyl Tetrazolium Cloride) 1%, dengan metode cawan tuang. Penambahan TTC dilakukan untuk memudahkan
51
perhitungan koloni karena warna koloni menjadi merah. Sambil menunggu hasil perhitungan, stok suspensi bakteri tersebut disimpan dalam lemari pendingin. Stok suspensi ini selanjutnya akan digunakan untuk melakukan cemaran ke sample air proses maupun pembuatan kontrol positif dengan larutan PDF. Sampel air proses diambil dari PT Yummy Food Utama pada pagi hari dengan menggunakan botol laboratori steril ukuran 1000 ml. Sampel air disiapkan sebanyak 8 botol untuk 4 macam perlakuan dengan masing-masing dua ulangan. Semua sampel dibawa dalam cool box dengan ice pack untuk menjaga agar tetap dingin selama perjalanan ke Laboratorium PPOMN. Pengambilan sampel dan pengujian dilakukan dalam tiga periode yaitu tanggal 18 Mei (sampel 1), 3 Juni (sampel 2), dan 26 Juni 2008 (sampel 3) sesuai dengan tanggal pengujian. Dari 8 botol sampel air proses tersebut 6 botol sampel digunakan untuk perlakuan sampel + cemaran dengan 3 konsentrasi cemaran, masing-masing dua ulangan yaitu S1C dan S2C. Dua botol sampel air proses lainnya digunakan untuk perlakuan sampel tanpa cemaran (dua ulangan S1 dan S2). Sebagai kontrol positif yaitu perlakuan cemaran digunakan larutan PDF steril sebanyak 1 liter dengan dua ulangan yaitu C1 dan C2. Masing-masing ulangan dibuat duplo. Sampel air proses dan larutan PDF steril yang akan dicemari tersebut dituang secara aseptis (di dalam Laminar Air Flow) kedalam tabung erlenmeyer steril ukuran dua liter dan diinokulasi dengan suspensi bakteri standar yang sudah disiapkan. Dalam penelitian ini digunakan tiga konsentrasi bakteri E. coli pada setiap sampel sedemikian rupa sehingga konsentrasi akhir pada sampel yang akan diinokulasikan ke media adalah konsentrasi rendah (< 10 cfu/ml), konsentrasi sedang (10-50 cfu/ml), dan konsentrasi tinggi (50-100 cfu/ml). Untuk membuat sampel ber E.coli rendah (<10 cfu/ml) diambil satu ml dari pengenceran 10-6 dengan konsentrasi bakteri sebesar 4.103 kemudian diinokulasikan ke 1000 ml larutan PDF steril dan 1000 ml sampel air proses, sehingga diperoleh sampel ber E.coli 4 cfu/ml. Dengan cara yang sama dibuat sampel ber E.coli 10-50 cfu/ml dari satu ml dari pengenceran 10-5 dengan konsentrasi sebesar 4.104 cfu/ml sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 40 cfu/ml.
Untuk
membuat sampel ber E.coli 50-100 cfu/ml diambil dua ml dari pengenceran 10-5
52
sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 80 sel/ml. Setelah di gojog sampai homogen, semua jenis sampel diatas tersebut diambil masingmasing 10 ml dan dimasukkan ke tabung steril 20 ml yang sudah disiapkan. Dari perhitungan yang dilakukan saat pembuatan inokulum maka konsentrasi akhir dari sample adalah 4 cfu/ml (rendah), 40 cfu/ml (sedang), dan 80 cfu/ml (tinggi).
3.3.2 Inokulasi sampel Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium untuk membandingkan empat macam metode pengujian bakteri E coli di sampel air. Keempat metode pengujian tersebut adalah metode Angka Paling Mungkin konvensional, metode APM cepat, metode Angka Lempeng Total cepat dan metode Presence Absence cepat. Skema penelitian dan urutan kerja bisa dilihat dalam Gambar 8. Yang pertama adalah analisa APM konvensional yang menjadi standar pengujian Koliform dan E.coli di SNI dan FDA (FDA, 2006; SNI, 1992 dan 2006b). Yang kedua adalah metode APM cepat menggunakan media baru yang mengandung substrat fluorogenik kromogenik yang sudah diakui oleh USEPA (USEPA, 2001 dan 2007).
Kedua metode APM ini menggunakan seri lima
tabung yaitu dengan jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml dengan demikian total sampel yang dianalisa tiap set seri pengenceran adalah 55,5 ml. Sesuai dengan jumlah inokulum/sampel yang digunakan, maka volume media broth yang digunakan untuk jumlah sampel 10 ml adalah 10 ml media broth LST atau LMX double strength. Untuk jumlah sample 1 ml digunakan media 5 ml - single strength dan jumlah sampel 0.1 ml digunakan media 5 ml - single strength (APHA, 2005). Pada metode APM konvensional, apabila didapat hasil positif gas pada media LST setelah inkubasi 48 jam maka dilakukan inokulasi ke media EC Broth. Setelah inkubasi 48 jam di media EC Broth, setiap tabung yang positif gas (terduga E.coli) akan digores ke media Levine EMB Agar. Koloni terduga E.coli adalah koloni warna pink dengan kilap logam.
Beberapa koloni terduga
diperbanyak dengan Nutrient agar miring untuk dilakukan konfirmasi dengan uji IMVIC’s. Pada metode APM cepat dengan media Fluorocult LMX Broth, tabung
53
yang diduga mengandung Koliform (termasuk E. coli) akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan dengan UV lamp 366 nm untuk melihat fluoresensi dan penambahan KOVAC’s untuk melihat cincin merah dari reaksinya dengan indol yang ada.
Suspensi bakteri E. coli dalam Phosphat Buffer steril konsentrasi 0, 4, 40, 80 cfu/ml
Sampel air + suspensi bakteri E. coli konsentrasi 0, 4, 40, 80 cfu/ml
metode konvensional Angka Paling Mungkin
metode cepat Angka Paling Mungkin
metode cepat Presence Absence
Lauryl Sulphate Tryptose Broth (gas +)
Fluorocult LMX Broth
Readycult Coliform 100
*)
Warna media hijau kebiruan, fluoresensi (+), indol (+)
EC Broth (gas +)
Sampel air tanpa penambahan bakteri E. coli
metode cepat Angka Lempeng Total
Chromocult® Coliform Agar
Warna koloni purple/ungu
Indol (+) Levine EMBA (kilap logam pada koloni merah muda) *)
Nutrient Agar miring
hanya untuk sampel ber E.coli rendah dan sampel air proses saja.
Uji IMVIC’s
Gambar 8 Skema penelitian.
Metode ketiga adalah metode Presence Absence menggunakan media kromogenik fluorogenik siap pakai, Readycult® Coliforms 100 (RC) dengan sampel sebesar 100 ml. Botol yang diduga mengandung Koliform (termasuk E. coli) akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan dengan UV lamp 366 nm untuk melihat fluoresensi dan penambahan pereaksi KOVAC’s untuk melihat cincin merah dari reaksinya dengan indol yang ada. Pada metode ini, karena sangat sensitif maka hanya dilakukan untuk sampel air
54
yang tidak dicemari dan sampel yang dicemari E. coli dengan kadar bakteri rendah (4 cfu/ml). Metode keempat adalah metode Angka Lempeng Total menggunakan teknik cawan tuang dengan sampel 1 ml. Media yang digunakan adalah media cepat kromogenik Chromocult® Coliform Agar (CCA). Koloni E. coli pada media CCA akan berwarna ungu. Konfirmasi dilakukan dengan meneteskan pereaksi KOVAC’s pada koloni terduga hingga terbentuk warna merah disekitar koloni
3.4 Analisa Data. Perbandingan antar metode pengujian dilakukan untuk : (1) evaluasi data hasil pengujian; (2) ketepatan hasil perhitungan pertumbuhan (recovery); (3) total waktu (hari kerja) yang diperlukan dihitung dari persiapan media sampai pembacaan hasil; (4) biaya yang dikeluarkan untuk keperluan media pengujian, biaya laboratorium, dan biaya gudang selama produk menunggu hasil uji selesai. Perhitungan biaya menggunakan asumsi biaya yang dikeluarkan oleh PT Yummy Food Utama untuk produk yogurt buah 250 mg. Analisis pertama yaitu evaluasi data pengujian dengan membandingkan hasil pengujian E.coli dari keempat metode yang diuji. Hasil diperbandingkan antara sampel ber E. coli rendah, sedang, tinggi dan sampel yang tidak dicemari. Analisa kedua adalah perhitungan recovery rate media dilakukan untuk melihat seberapa bagus suatu media dalam menumbuhkan sejumlah tertentu bakteri yang diinokulasikan. Jumlah bakteri yang terhitung di sampel positif dibagi dengan jumlah bakteri yang terhitung di kontrol positif (larutan PDF). Rumus recovery rate dapat dilihat dibawah, dimana kontrol positif harus hidup seluruhnya dan sampel negatif bisa positif dan bisa negatif.
% Recovery (R) = (A/C) x 100% A : jumlah bakteri terhitung di sampel positif C : jumlah bakteri terhitung di kontrol positif
55
Analisa ketiga dilakukan untuk melihat total waktu maksimal yang diperlukan untuk melakukan pengujian E.coli pada sampel air dengan asumsi hasilnya positif E.coli.
Waktu inkubasi yang digunakan sebagai perhitungan
adalah 48 jam setiap tahap karena dengan 24 jam beberapa sampel masih negatif. Uji dianggap selesai setelah dilakukan uji konfirmasi pada setiap metodenya. Analisa keempat adalah perhitungan biaya yang dikeluarkan untuk setiap metode pengujian. Biaya yang dihitung adalah (a) biaya investasi pembelian awal semua media yang dibutuhkan dan biaya media per sampel (cost per test) untuk setiap metode sampai ke uji konfirmasi yang disarankan; (b) biaya operasional laboratorium (personel dan peralatan) untuk pengujian E.coli dan (c) biaya gudang yang dikeluarkan karena barang belum dapat dijual sebelum pengujian E.coli selesai dilakukan. Dari semua perhitungan biaya tersebut dihitung penghematan yang dapat dilakukan dengan penggunaan media cepat. Penghematan dihitung dengan mengurangi total biaya yang dikeluarkan apabila menggunakan metode konvensional dengan biaya yang dikeluarkan apabila menggunakan metode cepat.
56
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Persiapan Inokulum Bakteri dan Sampel Untuk persiapan inokulum, bakteri standar yang digunakan adalah E.coli ATCC 25922 dari kultur stok yang disimpan dengan cryobank (MAST Diagnostics) pada freezer -20oC, dengan demikian diharapkan sifat-sifat biokimia bakteri tersebut tidak berubah. Pada tahap penghitungan konsentrasi suspensi bakteri standar digunakan media PCA yang ditambahkan TTC 1% untuk memudahkan pengamatan koloni. TTC memberi warna merah pada koloni yang disebabkan oleh pembentukan zat warna (dye) formazan merah (Merck, 2005). Dari hasil perhitungan matematis diperoleh data konsentrasi sampel yang diinokulasi bakteri E.coli dengan konsentrasi cemaran rendah 4 cfu/ml, cemaran konsentrasi sedang 40 cfu/ml dan cemaran konsentrasi tinggi 80 cfu/ml. Hal ini secara teori telah sesuai dengan standar persiapan cemaran untuk validasi media yaitu rendah <10 cfu/ml, sedang 10-50 cfu/ml dan tinggi 50-100 cfu/ml.
4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan Metode Konvensional Metode APM yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu metode APM konvensional dan metode APM cepat dengan media fluorogenikkromogenik. Metode APM bisa menggunakan seri 3 tabung, seri 5 tabung, seri 8 tabung atau seri 10 tabung (FDA, 2006). USEPA (2001) dan APHA (2005) menggunakan total volume sample 100 ml untuk air minum, bisa dalam bentuk 10 ml x 10 tabung, 20 ml x 5 tabung atau 100 ml x 1 tabung. Untuk air yang bukan air minum maka digunakan APM seri 5 tabung – 3 seri pengenceran dengan jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml. Dalam penelitian ini digunakan seri 5 tabung karena walaupun sampelnya berkualitas air minum tetapi ada dicemari dengan bakteri dalam jumlah yang banyak. Volume media broth yang digunakan adalah 10 ml (double strength), 5 ml (single strength) dan 5 ml (single strength). Penggunaaan double strength pada media 10 ml karena tabung tersebut akan diinokulasi dengan sampel sejumlah 10 ml juga ( APHA, 2005, Merck 2005). Perbandingan antara volume sampel dan
57
volume media akan menentukan konsentrasi media cair yang harus dibuat sehingga konsentrasi akhir diharapkan sesuai dengan kebutuhan bakteri (single strength). Metode APM konvensional dimulai dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST) sebagai uji penduga (presumtive) Koliform.
Media LST ini
mengandung laktosa yang akan difermentasi oleh bakteri Koliform sebagai sumber karbon.
Bakteri Koliform dikenal sebagai bakteri yang dapat
memfermentasi laktosa, menghasilkan gas dan asam (Merck, 2004; Merck, 2005; Harrigan, 1998). Gas yang dihasilkan dari fermentasi tersebut ditampung dalam tabung durham dan terlihat sebagai gelembung yang dapat mengangkat tabung ke atas apabila jumlahnya cukup banyak seperti pada Gambar 9. Adanya gas dalam tabung durham dan kekeruhan media menunjukkan bahwa tabung tersebut diduga positif Koliform (Merck, 2005; Merck, 2004; Harrigan, 1998).
Gambar 9 Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham Dari tabung LST positif tersebut diambil 1 ml dan dikonfirmasikan dengan menginokulasikan ke media kedua untuk uji penguat. Dalam tahap kedua ini biasanya digunakan dua macam media yaitu media Brilliant Green Lactose Bile
58
2% Broth (BGLB) untuk uji Koliform dan media EC Broth untuk uji E.coli. Hasil positif dari kedua media tersebut juga ditandai dengan terbentuknya gas di tabung durham yang merupakan hasil fermentasi laktosa dan kekeruhan media (Harrigan, 1998; Merck, 2004; Merck 2005; SNI, 2006). Dalam penelitian ini karena hanya menguji bakteri E.coli saja maka hanya digunakan media EC Broth sebagai media kedua. Apabila hasil tabung EC Broth positif maka diambil satu ose dan digoreskan ke Levine EMB Agar (LEMBA) untuk uji penegasan. Koloni E.coli di LEMBA memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik, seperti tampak pada Gambar 10 (SNI, 2006). Dalam Manual Microbiology Merck disebutkan bahwa koloni E.coli di LEMBA berdiameter 2-3 mm, kilap logam yang kehijauan dalam cahaya yang dipantulkan dan gelap atau bahkan hitam dibagian tengah dalam cahaya yang diteruskan (Merck, 2005). Enterobacter dalam media LEMBA ini sangat mirip dengan E.coli hanya ukuran koloninya yang lebih besar (4-6 mm), abu-abu kecoklatan dibagian tengah, tanpa kilap logam (Merck, 2005). Karena E.coli tidak selalu memunculkan kilap logam di LEMBA maka apabila kilap logam itu tidak muncul akan susah untuk membedakannya dengan Enterobacter (SNI, 2006).
Adanya kemungkinan kesalahan ini menyebabkan
diperlukannya uji konfirmasi pada koloni terduga dengan uji biokimia (IMViC). Lima koloni terduga digoreskan ke Plate Count Agar miring kemudian diinkubasikan 18-24 jam untuk setiap tabung yang terbukti positif setelah diuji IMViC akan dihitung sebagai tabung positif E.coli (Merck 2005; SNI, 2006). Dalam SNI (2006), selain uji IMViC tersebut dilakukan juga uji pembentukan gas di medium LST dan uji morfologi dengan pengecatan gram. Uji IMViC adalah uji konfirmasi untuk E.coli yang terdiri dari uji Indol, uji Methyl Red (MR), uji Voges Preskouer (VP), dan uji Citrat. Uji indol dilakukan dengan menginokulasikan kultur murni ke media Tryptone Water
yang
mengandung asam amino L-trypthopan. Trypthophan akan dipecah oleh enzim trypthophanase yang dimiliki oleh 99% E.coli menjadi indol yang akan bereaksi membentuk cincin merah pada bagian atas broth bila ditetesi reagen KOVAC’s.
59
Gambar 10 Koloni E.coli dengan kilap logam di Media LEMBA (Levine EMB Agar) Uji MR dan VP dilakukan dengan menginokulasikan kultur murni ke dua tabung kecil yang berisi 5 ml media MR-VP Broth Base. Pada uji MR setelah inkubasi, ditambahkan lima tetes larutan indikator methyl red dan dilihat pembentukan warna merah. Pada uji VP setelah inkubasi ditambahkan 0.6 ml larutan alpha naphtol dan 0.2 ml reagen larutan KOH, warna merah yang terbentuk menunjukkan hasil positif. Uji citrat untuk E.coli menunjukkan hasil negatif yang ditunjukkan oleh warna media agar tetap hijau (Merck, 2005; SNI, 2006). Hasil reaksi IMViC pada bakteri E.coli tampak pada Gambar 11. Pada penelitian ini, jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi rendah adalah 40 sel (pada inokulum 10 ml), 4 sel (pada inokulum 1 ml), dan 0.4 sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi sedang adalah 400 sel (pada inokulum 10 ml), 40 sel (pada inokulum 1 ml), dan 4 sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi tinggi adalah 800 sel (pada inokulum 10 ml), 80 sel (pada inokulum 1 ml), dan 8 sel (pada inokulum 0.1 ml). Dari hasil tersebut terlihat bahwa setelah inkubasi semua tabung akan selalu positif kecuali pada inokulum 0.1 ml pada konsentrasi pengenceran rendah.
60
Indol (+)
MR (+)
VP (-)
Citrat (-)
Gambar 11 Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli
Dalam Tabel 5 (lebih lengkapnya bisa dilihat di Lampiran 7) terlihat bahwa pada konsentrasi bakteri rendah dan sedang masih ada tabung yang negatif tetapi untuk konsentrasi bakteri tinggi semua tabung adalah positif. Hasil AMP sesuai namanya yaitu Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number adalah estimasi dari kisaran yang luas suatu kemungkinan konsentrasi menggunakan seri pengenceran yang diinkubasi pada beberapa pengenceran. Tabel APM yang paling mendekati jumlah sebenarnya dengan tingkat kepercayaan 95% diperbaiki oleh De Man pada tahun 1983 (FDA, 2006). Apabila dilihat dari konsentrasi bakteri rendah adalah 4 sel/ml tetapi setelah dinokulasikan per tabung maka yang berkemungkinan negatif adalah tabung dengan konsentrasi bakteri rendah pada inokulum 0.1 ml. Dalam tabung ini perkiraan jumlah sel adalah 0.4 sel/tabung atau dari setiap 10 tabung yang di inokulasi terdapat 4 tabung positif (minimal berisi satu sel) apabila sel terdistribusi sempurna. Adanya tabung negatif pada pengenceran 0.1 terlihat pada Lampiran 7, baik untuk tabung LST mapun LMX.
61
Tabel 5 Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX) Jenis Media Lauryl Sulphate Tryptose Broth Fluorocult LMX Broth
Ulangan 1 2 3 Rerata 1 2 3 Rerata
Sampel Air Proses <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8
Kontrol positif (cfu/100 ml) Rendah* 240 245 395 293 240 260 295 265
Sedang* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600
Tinggi* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600
Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Rendah* 240 390 150 260 390 390 295 358
Sedang* >1600 920 >1600 >1600 >1600 1600 1600 >1600
Catatan : * Rendah : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Dalam Tabel 5 dan Lampiran 7 terlihat juga bahwa hasil antara LST dan LMX baik di cemaran maupun sampel ber E. coli adalah sebanding kecuali di beberapa perlakuan, terutama di konsentrasi bakteri rendah dimana LMX menunjukkan hasil yang lebih tinggi dari pada LST. Pada ulangan 1 (18 Mei 2008) untuk perlakuan sampel ber E. coli, keseluruhan hasil adalah sama tetapi pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi didapat pada pengujian dengan media LMX (konsentrasi bakteri rendah sampel 2 dan konsentrasi bakteri sedang sampel 1). Pada pengujian kedua (3 Juni 2008) perlakuan cemaran konsentrasi rendah sampel satu, hasil LMX juga menunjukkan angka lebih tinggi dari LST, sedangkan pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi terjadi pada LMX dengan cemaran sedang baik untuk sampel satu dan dua. Hal yang sama juga terjadi pada pengujian ketiga (26 Juni 2008). Pada perlakuan cemaran sedang ada sampel satu, hasil yang lebih tinggi terjadi pada media LMX. Pada perlakuan sampel ber E. coli hasil LMX yang lebih tinggi terjadi pada perlakuan konsentrasi cemaran rendah baik pada sampel satu maupun sampel dua. Di lain pihak, hasil LST yang lebih tinggi dari LMX hanya terjadi pada pengujian ketiga (tanggal 26 Juni 2008) dengan perlakuan dengan konsentrasi bakteri sedang sampel satu, dengan perbedaan hanya satu tabung positif di volume inokulum 0.1 ml. Pada pengamatan 24 jam, secara umum
62
Tinggi* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600
tabung LMX menunjukkan tanda-tanda positif lebih cepat dari pada LST sehingga memungkinkan didapat hasil yang lebih cepat. Pada Lampiran 7 terlihat bahwa hasil pembacaan untuk sampel air semua adalah negatif (kombinasi tabung 000) sehingga didapat hasil <1.8 cfu/100 ml yang merupakan nilai terendah untuk APM yang berarti masih mungkin ada kandungan bakteri Koliform tetapi dibawah 1.8 cfu/100 ml.
Hal ini agak
menyulitkan karena standar air bersih untuk Koliform maupun E.coli adalah 0/100 ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Hal inilah yang menyebabkan metode standar untuk pengujian air minum yang saat ini banyak digunakan adalah bukan metode APM tetapi metode Membran Filtrasi dan metode Presence Absence (APHA, 2005;
EC, 1998; FDA, 2006;
Merck, 2004).
Dengan
menggunakan metode P/A atau membran filtarsi bisa diperoleh hasil yang menyatakan nilai negatif atau nol per 100 ml sampel sesuai standar yang tercantum, karena jumlah sampel yang diuji bisa sampai 100 ml dan limit bawah pembacaan hasil adalah nol cfu atau tidak ada pertumbuhan. Pada perlakuan dengan konsentrasi bakteri tinggi semuanya menunjukkan hasil yang sama yaitu >1600 atau semua tabung positif (kombinasi 555). Hal ini menyulitkan karena tidak didapatkan suatu angka yang pasti yang bisa dibandingkan dengan hasil dari metode lainnya. Untuk konsentrasi tinggi sebenarnya bisa didapat hasil yang angka tertentu (bukan >1600) apabila dilakukan penambahan seri pengenceran sampai diperoleh kombinasi angka tabung positif yang ideal (FDA, 2006).
Kesulitan dari penambahan seri
pengenceran sampai lebih dari tiga tingkat adalah implikasinya terhadap penambahan waktu, peralatan, tenaga, dan media yang sangat berbeda nyata. Apabila dibandingkan dengan jumlah inokulum awal yaitu konsentrasi bakteri rendah (4 cfu/ml), konsentrasi bakteri sedang ( 40 cfu/ml) dan konsentrasi bakteri tinggi (80 cfu/ml) maka hasil yang diperoleh di kedua media LST dan LMX cukup mencerminkan kondisi tersebut. Uji anova (Lampiran 8) yang dilakukan untuk APM LST menunjukkan bahwa F hitung lebih kecil dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5% yang berarti tidak ada perbedaan hasil yang nyata antar sampel yang diambil pada hari yang berbeda dan juga antar perlakuan cemaran dan sampel + cemaran. Hasil untuk
63
APM LMX juga menunjukkan kondisi yang sama dengan APM LST (Lampiran 9).
Dalam hal ini yang bisa dianalisa hanya yang cemaran rendah saja karena
cemaran sedang dan tinggi nilainya sebagian besar bukan berbentuk angka (>1600). Dalam SNI (2006) disebutkan bahwa hasil yang baik dalam APM adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah, contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan di pengenceran yang lebih tinggi, contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil yang negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri).
Dalam penelitian ini hanya dilakukan
pengujian untuk jumlah sampel yang diinokulasikan adalah 10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml saja untuk semua perlakuan karena adanya keterbatasan waktu, tenaga, ketersediaan peralatan dan biaya dalam pengerjaan.
Gambar 12 Pertumbuhan bakteri E. coli (warna hijau) dalam media Fluorocult® LMX Broth Pada perhitungan anova dari pertumbuhan dengan metode APM konvensional maupun cepat tersebut diatas (Lampiran 10), diperoleh hasil F hitung lebih kecil dari F tabel dan P value lebih besar dari 5% baik pada variasi sampel, metoda maupun interaksinya sehingga dapat disimpulkan bahwa hasil dari metode APM LST adalah sebanding dengan APM LMX. Walaupun hasil
64
yang didapat dari kedua metode tersebut sebanding akan tetapi ada beberapa hal lain yang patut menjadi pertimbangan yaitu kemudahan pengerjaan, kemudahan dalam melakukan pengamatan hasil, kecepatan memperoleh hasil akhir test dan kepekaan yang lebih tinggi. Kepekaan dan kemudahan pengamatan terutama terlihat pada konsentrasi bakteri rendah dimana seringkali gelembung gas pada tabung durham agak sulit diamati (pada inkubasi 24 jam). Pada penggunaan media cepat Fluorocult® LMX untuk metode APM cepat, pertumbuhan E. coli ditandai dengan perubahan warna hijau yang dimulai dari dari bagian atas tabung terlihat jauh lebih nyata dan mudah diamati (Gambar 12). Keuntungan lain dari media LMX menurut Manafi (1995), adalah hasil yang dapat diketahui secara langsung dan sekaligus dalam waktu yang sama dan tabung yang sama apakah ada bakteri Koliform maupun E.coli, tanpa perlu uji lanjutan yaitu penegasan Koliform (BGLB), pendugaan E.coli (EC Broth) dan penegasan E.coli (LEMBA). Adanya Koliform dalam LMX ditandai dengan terbentuknya warna hijau kebiruan yang dimulai dari bagian atas media yang tidak hilang apabila dikocok. Semakin lama waktu inkubasi, warna hijau kebiruan akan semakin turun ke dasar tabung dan warna hijau kebiruan akan semakin pekat (Gambar 12).
Gambar 13 Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult® LMX dengan lampu UV.
65
Konfirmasi untuk memastikan koloni tersebut Koliform biasa atau E.coli bisa dilakukan dengan parameter tambahan yaitu fluoresensi dengan lampu UV (Gambar 13) dan pembentukan cincin merah akibat reaksi indol yang dihasilkan E.coli dengan reagen Kovac’s (Gambar 14). Fluoresensi dibawah lampu UV tampak sebagai warna biru pendar yang terang, yang lebih tampak nyata dalam kondisi gelap. Selain itu, dengan penambahan reagen Kovac’s akan terbentuk cincin merah dibagian atas broth Dari kedua media untuk APM yang dianalisa maka media LST memberikan hasil recovery rate untuk sampel ber E.coli yang lebih rendah dari pada media LMX, apabila dibandingkan dengan kontrol positif dengan media yang sama (Tabel 6).
Tabel 6 Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal bakteri 400 cfu/100 ml (rendah) Hasil pengukuran (cfu/100ml) Jenis Media Kontrol positif Lauryl Sulfate Tryptose Broth Fluorocult LMX Broth Chromocult Coliform Agar
293
Recovery Rate sampel ber E.coli
Sampel ber E. coli
dibandingkan kontrol positif
260 358 204
89% 122% 70%
Pada ISO 11133-2 maka recovery rate disebut sebagai productivity yaitu jumlah cfu yang tumbuh di media uji dibagi dengan jumlah cfu yang tumbuh di media general, misal Tryticase Soy Agar atau media general lainnya. Untuk media selektif nilainya harus >50% (ISO, 2002). Pada Tabel 6 nilai recovery rate untuk penelitian ini dihitung berdasarkan pertumbuhan di medium LST dengan perlakuan kontrol positif. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai recovery rate pada perlakuan sampel ber E.coli rendah pada medium LST adalah 89%, LMX 122% dan CCA 70%. Sebenarnya media LMX adalah generasi ketiga dari pengembangan media Lauryl Sulfate Broth, dengan perbaikan komposisi media seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan diketemukannya teknologi fluorogenik dan kemudian kromogenik. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth sudah berkembang
66
menjadi Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, kemudian menjadi Fluorocult® LMX Broth dan terakhir menjadi Readycult® Coliform (Tabel 7).
Gambar 14 Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang diperkenalkan oleh Mallmann dan Darby pada tahun 1941 sebagai media kultur selektif untuk pendugaan bakteri Koliform dan untuk untuk pengkayaan selektif untuk organisme Koliform dalam analisa air. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth juga merupakan media yang sangat umum digunakan dan sampai saat ini masih menjadi acuan dalam berbagai standar Internasional seperti AOAC, BAM, COMPF, EPA, ISO, SMD, SMWW (Merck, 2005). SNI yang mengadaptasi prosedur FDA / BAM dengan sendirinya juga menggunakan media LST ini (SNI, 2006). Pada tahun 1991 Schindler memberikan rekomendasi penggunaan media Fluorocult® Lauryl Sulfate Tryptose Broth dalam Quality Control air mandi (Merck, 2005). Selanjutnya media ini digunakan sebagai standar pengujian oleh German-DIN-Norm 10183 untuk pemeriksaan susu, regulasi § 35 LMBG (01.00/54) untuk pemeriksaan produk pangan, ISO/DIS 11886 - 2.2 (1994) untuk
67
susu dan produk susu, dan selanjutnya the German Badegewässerverordnung (regulations for bathing water) 76/1604 EWG di tahun 1995 (Merck, 2005). Perbaikan yang dilakukan dari media LST ke Fluorocult® LST adalah dengan penambahan L-tryptophan yang memungkinkan dilakukannya pegujian indol sekaligus dan MUG yang memungkinkan dilakukannya pengujian fluoresensi sekaligus seperti pada Gambar 14. Dengan penambahan kedua zat tersebut maka LST yang semula hanya dapat digunakan untuk pendugaan Koliform sekarang bisa juga dilakukan untuk konfirmasi keberadaan E.coli dari sifat fermentasi laktosa berupa pembentukan gas, enzim triptophanase berupa pembentukan indol, dan enzim glucuronidase berupa pembentukan fluoresensi (Manafi, 2000; Merck 2005). Perkembangan selanjutnya adalah modifikasi dari media Fluorocult® Lauryl Sulfate Tryptose Broth menjadi Fluorocult® LMX Broth dengan penambahan substrat kromogenik, sorbitol dan IPTG kedalam media. LMX Broth pertama kali diperkenalkan oleh Manafi dan Kneifel (1989) dan kemudian dimodifikasi oleh Manafi dan Ossmer (1993) dengan memperbaiki penggunaan substrate yang dapat meningkatkan sensitivitas media sekaligus mengurangi keseluruhan waktu inkubasi menjadi hanya 24 jam. Fluorocult® LMX Broth modified mengandung bufer fosfat untuk menggaransi tingkat pertumbuhan yang tinggi bagi bakteri Koliform total. Lauryl Sulfate yang ada sangat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif. Dengan
substrat
kromogenik
X-Gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-
galactopyranoside), yang akan dipecah oleh Koliform dan substrat fluorogenik 4methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (X-Gluc) yang sangat spesifik untuk E.coli. Selain kedua substrat diatas, LMX juga mengandung tryptophan yang akan dipecah oleh E.coli menjadi indol dengan adanya enzim tryptophanase (dimiliki oleh 99% E.coli). Sintesa enzim tersebut diamplifikasi oleh 1-isopropyl-ß-D-1thio-galactopyranoside dengan meningkatkan aktifitas ß-D-galactosidase (Manafi, 1995; Merck, 2005).
Dengan ketiga parameter tersebut maka dimungkinkan
untuk melakukan deteksi total Koliform dan E.coli secara simultan dengan satu macam medium dalam satu tahapan kerja saja (Manafi, 2000; Merck, 2005).
68
Tabel 7 Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke Fluorocult® LMX Broth dan Readycult® Coliform Komposisi Media (g / l) Tryptose Lactose Sodium chloride Dipotassium hydrogenphosphate Potassium dihydrogen phosphate Lauryl Sulfate Sodium Salt L-tryptophan Sorbitol 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-Dgalactopyranoside (X-GAL)
Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST) 20.0 5.0 5.0 2.75 2.75 0.1
Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth 20.0 5.0 5.0 2.75 2.75 0.1 1.0
LMX Broth/ Readycult® Coliform 5.0 0 5.0 2.7 2.0 0.1 1.0 1.0 0.08
0.1
4-methylumbelliferyl-ß-Dglucuronide (MUG)
0.05
1-isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
0.1
Sumber : Manual Microbiology Merck (2005)
Dalam penelitian Manafi (1995), dilakukan pengujian 771 strain bakteri gram negatif dengan LMX broth dimana 98% E.coli yang di isolasi dari air minum adalah positif ß-D-glucuronidase (X-Gluc).
98% dari strain E. coli
memperlihatkan aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal) dan 99% memberikan reaksi indol positif. Augoustinos et al. (1993) dalam Manafi dan Rosmann (1998b) dan Manafi (1991) mengisolasi 95,7% E.coli yang positif GUD (Glucuronidase) dari satu medium MUG dan menemukan strain Shigella (44-58%) dan Salmonella (2029%) yang dapat memproduksi enzim GUD. Alonso et.al (1996) dalam Manafi dan (1998b) menemukan beberapa strain Klebsiella oxytoca, Serratia fonticola and Yersinia intermedia mampu memproduksi GUD. Selain itu juga beberapa strain Flavobacteria, Staphylococci, Streptococci dan Clostridia juga dapat memproduksi
GUD.
Akan
tetapi
pertumbuhan
dari
sebagian
besar
mikroorganisme tersebut dapat dihambat dengan agensia selektif di dalam media atau dengan pengaturan kondisi inkubasi (Manafi, 1995). Rice et. al (1990) meneliti kemungkinan false positive dari penggunaan GUD untuk deteksi E. coli oleh spesies Escherichia yang lain. Dari isolat klinis (CDC) digunakan sebanyak 42 isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii, E. vulneris, dan E. blattae. Dari isolat lingkungan digunakan juga sebanyak 25
69
isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii, E. vulneris, dan E. adecarboxylata. Kesemuannya ditumbuhkan di media EC-MUG, Colilert dan juga di cek kemungkinan sebagai Koliform fekal dengan menumbuhkan di suhu 44.5oC. Dari hasil yang diperoleh ternyata hanya E. coli yang bersifat GUD positif dan fekal Koliform positif,
sedangkan spesies Escherichia yang lain
bersifat GUD negatif dan fekal Koliform negatif sehingga metode ini bisa digunakan untuk mendeteksi E. coli tanpa adanya false positive. Karena tryptophan sudah ada dalam komposisi media LMX broth, maka reaksi indol dapat langsung dilakukan pada media tersebut hanya dengan menambahkan pereaksi KOVAC’s secara langsung di tabung yang sama (Ossmer, 1993; Merck, 2005).
Pereaksi KOVAC’s ditambahkan ke tabung sampai
membentuk lapisan reagen setebal 5 mm di permukaan broth. Apabila lapisan pereaksi berubah menjadi warna merah cerry (cherry red) setelah 1-2 menit (Gambar 14) maka keberadaan E. coli telah terkonfirmasikan (Merck, 2005). Apabila hasil test fluoresensi masih negatif setelah inkubasi 24 jam, maka penambahan pereaksi KOVAC’s untuk pengujian indol tidak boleh dilakukan terlebih dahulu. Inkubasi diteruskan sampai 48 jam kemudian baru dilakukan kembali uji fluoresensi dan indol. Pereaksi KOVAC’s adalah larutan alkoholis yang akan merusak kondisi pertumbuhan di broth tersebut.
Pengujian indol secara simultan dalam satu
tabung yang sama akan sangat memotong hari kerja apabila dibandingkan dengan prosedur konvensional, dimana dari LST positif ke medium EC broth, kemudian ke LEMBA yang selanjutnya koloni terduga di perbanyak ke agar miring untuk uji IMViC. Dalam uji IMViC yang salah satunya adalah uji Indol menggunakan medium Tryptone Water yang kemudian diinkubasi selama 24 jam sebelum ditambahkan pereaksi KOVAC’s. Penggunaan ketiga parameter diatas, yaitu fluorogenik, kromogenik dan indol diketahui dapat meningkatkan sensitifitas, selektifitas media sehingga meminimalkan kemungkinan terjadinya kesalahan (baik kesalahan positif maupun negatif) dalam pengujian Koliform dan E.coli.
70
4.3 Metode Angka Lempeng Total. Di kalangan industri pangan, pengujian E.coli dan total Koliform selain menggunakan metode APM juga banyak menggunakan metode ALT (Cawan tuang) dan membran filtrasi. Berdasarkan pengalaman penulis selama menjadi Product Manager untuk Mikrobiologi di Merck , di Indonesia, metode APM lebih banyak digunakan oleh kalangan institusi pemerintahan atau beberapa industri lokal yang mengacu kepada SNI. Di sebagian besar industri pangan skala menengah ke atas umumnya lebih memilih menggunakan metode angka lempeng total dengan cara cawan tuang (pour plate), karena metode APM dianggap lama dan merepotkan. Adapun media yang paling banyak digunakan di industri pangan di Indonesia untuk uji Koliform adalah Violet Red Bile Agar (VRBA). Media ini juga direkomendasikan oleh ISO, APHA, BAM, IDF-FIL, SMDP (Merck, 2005). Karena banyaknya pertanyaan dari kalangan industri pangan ke penulis tentang perbandingan antara hasil APM dan ALT untuk uji Koliform dan E.coli, maka dalam penelitian ini juga dilakukan perbandingan keduanya. Medium VRBA adalah medium yang diusulkan oleh Davis pada tahun 1951 untuk deteksi dan perhitungan bakteri Koliform termasuk E.coli di air, susu, ice-cream, daging dan bahan pangan lainnya (Merck, 2005). Medium ini sesuai dengan rekomendasi dari American Public Health Association (1992), the International Dairy Federation FIL-IDF (Internationaler Milchwirtschaftsverband 1985), the Institute for Food Technology and Packaging (Institut für Leben-mitteltechnologie und Verpackung) (1974).
Gambar 15 Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA
71
Apabila dilihat dari komposisi media VRBA (Tabel 8) maka pertumbuhan bakteri secara umum didukung oleh adanya peptone from meat, NaCl dan Yeast extract. Sebagai sumber karbohidrat yang utama adalah laktosa yang sekaligus juga menjadi pembeda antara Enterobacteriaceae yang laktosa positif dan negatif. Degradasi laktosa menjadi asam oleh bakteri laktosa positif membuat indikator pH neutral red memberi warna merah pada koloni bakteri tersebut dan menyebabkan presipitasi bile acids membentuk halo kemerahan disekitar koloni. Penghambatan terhadap bakteri gram positif dimungkinkan oleh adanya crystal violet dan bile salts yang kadang justru juga menghambat pertumbuhan bakteri Koliform dan E.coli apabila dalam keadaan sublethal injured / sakit (ISO, 2004; Merck, 2004 & 2005).
Tabel 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar Deskripsi Peptone Yeast Extract Sodium chloride Lactose Neutral Red Bile salt Crystal violet Sodium dihydrogen phospat di-sodium hydrogen phospat Sodium pyruvat Tryptophane Sorbitol Tergitol 7 Chromogenic mixture Agar-agar
VRBA 7.00 (meat) 3.00 5.00 10.00 0.03 1.50 (mixture) 0.002
13.00
Komposisi Media (g / l) CCA* TBX Agar** 3.00 20.00
5.00
1.50 (No.3) 2.20 2.70 1.00 1.00 1.00 0.15 0.40 10.00
0.075 15.00
Total penggunaan media (g/l) 39.53 26.50 36.60 Harga per botol 500g *** Rp. 920.000 Rp. 4.490.000 Rp. 7.555.000 Harga per petri (15 ml) Rp. 1.091 Rp. 3.563 Rp. 8.290 Pembacaan hasil Koliform saja Koliform, E. coli E. coli saja * CCA : Chromocult Coliform Agar ** TBX Agar : Chromocult TBX Agar ***Harga media berdasarkan pada Price List 2009 yang dikeluarkan PT Merck Tbk
Selain itu, media VRBA tidak bisa secara spesifik membedakan antara E.coli, Koliform dengan Enterobacteriaceae lainnya, tetapi hanya membedakan bakteri yang bersifat laktosa positif dan laktosa negatif saja yang semuanya
72
memunculkan warna merah dikelilingi zone presipistasi (Gambar 15). Beberapa strain Klebsiella (yang juga merupakan anggota koliform) dan Enterococci tumbuh sebagai koloni pink dengan ukuran sangat kecil (pin-point) sehingga memungkinkan terjadinya kesalahan pembacaan hasil (Merck, 2005). Kesulitan lain penggunaan media ini apabila mengikuti prosedur ISO 4832:2004 adalah pemanasan media dalam air mendidih tidak boleh lebih dari 2 menit dan media harus digunakan dalam waktu tiga jam setelah dibuat (ISO, 2004). Di lain pihak, ada kebutuhan industri pangan akan media baru yang dapat memberikan hasil yang lebih cepat dan akurat dengan pengerjaan yang mudah. Seperti pada metode APM sebelumnya, penggunaan substrat kromogenik untuk pengujian Koliform dan E.coli juga sudah banyak digunakan dalam media agar, misal media TBX agar untuk ISO 16649:2001 dan Chromocult® Coliform Agar (USEPA, 2007). Pada media TBX, kromogen yang digunakan hanya satu macam dan hanya untuk mendeteksi sifat ß–glucuronidase yang ada di E. coli saja dengan warna koloni hijau (ISO, 2001). Media TBX di Indonesia tidak populer karena peraturan pemerintah maupun perusahaan yang ada di Indonesia pada umumnya menghendaki uji Koliform dan E.coli sekaligus. Media Chromocult® Coliform Agar (CCA) lebih sesuai dan lebih diterima untuk keperluan Indonesia karena bisa mendeteksi keduanya yaitu Koliform berwarna merah salmon sedang E.coli biru tua sampai violet. Pada penelitian ini hanya dilakukan perhitungan Angka Lempeng Total dengan Media CCA saja, tanpa membandingkan dengan VRBA dan TBX karena tujuannya adalah untuk membandingkan metode ALT yang lebih sederhana cara pengerjaannya dengan metode perhitungan APM konvensional.
Dari hasil
perhitungan sampel terlihat bahwa semua sampel yang positif metode APM, baik yang konvensional maupun yang cepat, juga memberikan hasil positif di CCA. Sampel air proses yang tidak dicemari juga memberikan hasil negatif, sama dengan kedua metode APM (Tabel 9). Data tersebut disajikan dalam nilai cfu/100 ml sesuai dengan perhitungan APM yang juga per 100 ml. Dari data Anova untuk perhitungan antara cemaran saja dan sampel + cemaran dalam konsentrasi rendah (Lampiran 11) diperoleh nilai F hitung lebih besar dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5% yang menunjukkan hasil yang tidak beda nyata.
73
Tabel 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar Ulangan
Sampel air proses 0 0 0 0
Kontrol Positif (cfu/100 ml) Rendah* Sedang** Tinggi*** 188 1963 4000 175 1188 2875 150 2000 4350 171 1717 3742
1 2 3 Rerata Catatan : * Rendah : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Rendah* Sedang** Tinggi*** 200 2275 4163 238 1613 3188 175 1838 3600 204 1908 3650
Pada Tabel 10 tampak sifat pertumbuhan beberapa bakteri pada media CCA, didasarkan pada sifat pemecahan substrat salmon-GAL, X-glucuronide dan asam amino tryptophan untuk test indol. Pemecahan substrat Salmon-GAL oleh enzim ß-D-galactosidase yang dimiliki oleh total Koliform (termasuk E.coli) ditandai dengan munculnya warna merah salmon pada koloni. Pemecahan substrat XGlucuronide oleh enzim ß-D-glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli dan beberapa bakteri lainnya ditandai dengan warna biru terang sampai torquoise. Khusus untuk E.coli yang memiliki kedua enzim tersebut akan memecah kedua substrat tersebut menghasilkan gabungan antara warna merah salmon dan torquoise menjadi warna biru gelap sampai violet (Gambar 16). Gram negatif lain yang tidak memiliki kedua macam enzim tersebut tumbuh sebagai koloni tak berwarna (Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b). Tabel 10 Karakteristik beberapa bakteri di media Chromocult® Coliform Agar Test strains
Recovery rate %
Pertumbuhan
Escherichia coli ≥ 70% Bagus / sangat ATCC 11775 bagus Citrobacter freundii > 70% Bagus / sangat ATCC 8090 bagus Escherichia coli > 70% Bagus / sangat DSMZ 502 bagus Salmonella enteritidis Tidak Bagus / sangat ATCC 13076 terbatas bagus Enterococcus faecalis < 0.01 tidak tumbuh ATCC 19433 Sumber : Microbiology Manual Merck (2005)
Warna koloni
SalmonGAL
Indole
+
X– Glucu ronide +
biru gelap - violet merah salmon biru-violet
+
-
-
+
-
+
tak berwarna
-
-
-
+
74
Warna yang timbul pada koloni oleh kromogen tersebut akan tetap stabil untuk beberapa hari, tidak terpengaruh oleh nilai pH, temperatur, atau cahaya. Karena pewarnaan tersebut tidak terdifusi ke agar maka pembedaan masingmasing koloni dimungkinkan dalam media ini, bahkan apabila terjadi pada perhitungan koloni yang tinggi (Merck, 2005) Hasil false negatif pada media kromogenik dimungkinkan terjadi pada strain Escherichia coli yang bersifat ß-glucuronidase negatif, seperti Escherichia coli O157 (ISO, 2001). Dalam Manafi et.al (1991) disebutkan bahwa ada korelasi kuat antara E.coli pembentuk verotoksin dengan sifat ß-glucuronidase negatif sehingga memberikan hasil negatif pada media kromogenik (tidak membentuk koloni hijau) dan fluorogenik (fluoresensi negatif) walaupun dapat tumbuh. Dalam hal aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal), hanya beberapa strain Vibrio metschnikovii, V. vulnificus, Aeromonas hydrophila dan A.sobria memberikan reaksi “false positive” X-Gal (Manafi, 1995; Geissler et al., 2000). Ley et al (1993) menemukan bahwa semua strain Aeromonas, Citrobacter dan Enterobacter yang diisolasi dari air baku (raw water) dalam medium yang mengandung X-Gal bersifat ß-D-galactosidase positif. Sebaliknya, hanya 10-20% saja dari strainstrain tersebut yang menghasilkan warna merah dengan kilap logam pada media m-Endo agar LES.
Gambar 16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult® Coliform Agar (sumber : Merck 2005)
75
Dari total 674 sampel air berklorinasi yang ditanam di m-Endo agar LES dan medium yang mengandung X-Gal, 18 yang negatif di Endo memperlihatkan hasil positif di Medium X-Gal. Dari 50% bakteri yang bersifat ß-D-galactosidase positif, 76% diidentifikasi sebagai Aeromonas hydrophila
(Ley et al, 1993).
Ossmer (1993) juga menyebutkan bahwa X-Gal memberikan hasil yang lebih cepat dan lebih sensitif untuk Koliform total daripada produksi gas dari laktosa. Untuk keperluan konfirmasi koloni E.coli, cukup dengan memberikan satu tetes KOVACS' indole reagent kepada koloni yang berwarna biru gelap sampai violet. Apabila pereaksi tersebut berubah menjadi warna merah cherry (Gambar 17) setelah beberapa detik maka dapat dikonfirmasikan bahwa terjadi pembentukan indol yang memberi kepastian (99%) bahwa koloni tersebut memang E.coli. Kemungkinan untuk melakukan test indol langsung di agar yang sama membuat CCA menjadi unik dan sangat membantu memepercepat uji E.coli (Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b). Media CCA terbukti dalam beberapa penelitian, memang memiliki tingkat akurasi yang tinggi yaitu 94-96% untuk sifat enzimatis GUD positif; 99% untuk sifat indol positif (Manafi, 1991); dan 98% untuk sifat GAL positif (Geissler et al, 2000). Selain itu ada 3-4% strain E.coli yang mempunyai sifat ß-D-glucuronidase negatif, yang akan membentuk koloni tak berwarna misal E.coli O157 atau juga strain yang tidak dapat tumbuh pada temperatur 44 °C misal E. coli 0157:H7 (Merck, 2005). Pendekatan pengujian cepat dengan media kromogenik misal identifikasi Escherichia coli menggunakan one-day cultivation bahkan juga sudah diakui pentingnya oleh WHO sebagai metode alternatif, selain penggunaan probe fluoresense secara mikroskopis dan teknik laser scanning (WHO, 2002). Geissler et.al (2000) membandingkan kinerja dari Fluorocult® LMX Broth, Chromocult® Coliform Agar (CCA) dan Chromocult® Coliform Agar ditambah cefsulodin 10 µg/ml (CCA-CFS) dengan metode standar APM untuk perhitungan Koliform dan E.coli di air pantai untuk rekreasi. Dalam penelitian Geissler ini juga dibuktikan bahwa standar APM konvensional memberikan hasil yang kurang sensitif untuk perhitungan E.coli., walaupun secara statistik tidak ada beda nyata antara LMX, CCA, CCA-CFS dan APM untuk perhitungan E.coli.
76
Gambar 17. Pembentukan warna cherry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s. Di lain pihak penggunaan media CCA-CFS untuk angka lempeng total memberikan hasil yang lebih akurat untuk total Koliform karena gangguan background flora lebih terkurangi. Karena itu kontribusi bakteri ß-galactosidase positif, non Koliform (terutama Aeromonas spp. dan Vibrio spp.) dalam perhitungan angka lempeng total tidak bisa diabaikan begitu saja. Penggunaan larutan PDF sebagai pengencer tanpa penambahan NaCl juga berpotensi menyebabkan kerusakan sel karena bukan larutan yang bersifat isotonis. Selain itu, tidak adanya kandungan peptone dalam cairan pengencer menyebabkan tidak ada efek recovery sehingga sel bakteri yang sublethal injured kemungkinan akan sulit tumbuh. ISO 6887 menganjurkan digunakannya larutan pengencer Maximum Recovery Diluent yang per liternya mengandung 85 g NaCl dan 1 g peptone yang mempunyai efek recovery dari peptone dan isotonik dari NaCl fisiologis sehingga tidak terjadi kerusakan sel pada sampel (Merck, 2005). Pengaruh tersebut juga diduga menjadi sebab dari rendahnya recovery rate media CCA di penelitian ini (Tabel 11) yang seharusnya >70% (Merck, 2005).
77
Tabel 11 Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel Ulangan
Kontrol positif Sedang* 49% 30% 50% 43%
Sampel ber E. coli Rendah* Sedang* Tinggi* 50% 57% 52% 59% 40% 40% 44% 46% 45% 51% 48% 46%
Rendah* Tinggi* 1 47% 50% 2 44% 36% 3 38% 54% Rerata 43% 47% Catatan : * Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml)
Dari komunikasi pribadi dengan Rolf Ossmer (18 Maret 2009) yang mengembangkan Chromocult® Coliform Agar di Laboratorium R&D Merck KGaA di Jerman, seharusnya recovery rate dari media CCA untuk E.coli adalah >70% (70-100%). Rendahnya recovery rate dalam penelitian ini kemungkinan karena sampel tidak terdistribusi dengan baik di cawan petri, yang disebabkan oleh teknik pencampuran sampel dengan media pada metode cawan tuang yang salah. Area berwarna violet di agar (Gambar 18) merupakan indikasi tempat terkumpulnya bakteri, sehingga jumlah koloni yang terpisah secara sempurna menjadi berkurang. Pada metode cawan tuang, koloni yang tumbuh di dekat permukaan agaragar dapat tumbuh dalam dua koloni dengan morfologi yang berbeda, yaitu koloni kecil didalam agar dan koloni yang lebih besar di permukaan agar. Pertumbuhan koloni dipermukaan agar-agar seringkali sangat kuat dengan warna dan ukuran yang atypical. Penyebab dari terbentuknya koloni atypical seperti pada Gambar 18 belum diketahui tetapi mungkin telah terjadi penghambatan pada reaksi enzimatis oleh kombinasi beberapa komponen dari material sampel dengan pertumbuhan yang terjadi di permukaan. Hal ini bisa diatasi dengan melakukan overlayer pada CCA seperti yang banyak direkomendasikan oleh banyak prosedur standar. Pada medium CCA, apabila muncul koloni atypical, maka semua koloni dengan warna violet di tengah koloni atau warna violet yang terdifusi kedalam agar adalah koloni E.coli (Ossmer R 27 Maret 2009, komunikasi pribadi)
78
Gambar 18 Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar. Dalam penelitian ini memang tidak dibandingkan antara metode ALT menggunakan media VRBA dan CCA karena tujuan utama adalah membandingkan antara APM dengan ALT yang dalam hal ini diwakili oleh CCA. Pemilihan CCA sendiri seperti diterangkan diatas adalah karena beberapa keunggulan yang dimiliki CCA seperti ketelitian, kepraktisan dan kecepatan hasil. Penelitian yang membandingkan VRBA dan CCA telah dilakukan oleh Gonzales et.al pada tahun 2003 pada sampel makanan siap saji (ready-to-eat foods). Dari hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa CCA memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan VRBA yaitu hanya memerlukan satu medium untuk mendeteksi Koliform dan E.coli, mengurangi biaya, mengurangi waktu secara nyata, dan mengurangi kecenderungan terjadinya kontaminasi silang dibanding metode-metode lainnya.
4.4 Metode Presence Absence. Untuk sampel air yang sangat bersih seperti air minum atau air proses, yang jumlah bakterinya sangat kecil umumnya dianjurkan untuk menggunakan metode membran filtrasi atau Presence/ Absence dengan jumlah sampel yang cukup besar, misalnya 100 ml. Dengan jumlah sampel yang besar diharap tingkat ketelitian dan sensitifitas uji juga meningkat. Sebenarnya standar mikrobiologis air proses dan
79
air minum menurut Kepmenkes, WHO, FDA, dan USEPA adalah negatif atau nol cfu per 100 ml sampel. Karena itu, untuk pengujian air minum umumnya metode yang disahkan adalah metode membran filtrasi atau P/A yang memiliki tingkat ketelitian lebih tinggi dari pada metode APM dan ALT (Depkes, 2002; WHO, 2004; USEPA, 2007; FDA, 2002). Dalam penelitian ini, metode APM yang sekarang digunakan dalam SNI dan metode ALT yang banyak digunakan di industri dibandingkan dengan metode P/A yang merupakan metode standar untuk pengujian air minum yang digunakan oleh USEPA. Metode membran filtrasi tidak dipilih karena jarang digunakan di Indonesia dan memerlukan pengerjaan yang lebih rumit daripada metode P/A. Metode Presence Absence (P/A) pada penelitian ini menggunakan media siap pakai Readycult® Coliform 100 (RC 100) seperti pada Gambar 20. Media Readycult® Coliform 100 ini merupakan pengembangan dari media LMX Broth (Tabel 7) menjadi bentuk siap pakai untuk metode Presence Absence dengan sampel air sebanyak 100 ml (Manafi and Rosmann, 1998a; Merck, 2005). RC 100 dibuat dari media Fluorocult® LMX Broth sebanyak 1.7 g, dikemas dalam sachet khusus dan disteril dengan cara radiasi (Merck, 2005; Manafi, 2000). Karena media sudah dalam keadaan ditimbang dan steril maka media bisa langsung dituang kedalam botol steril ukuran 250 ml yang sudah diisi dengan 100 ml sampel (Gambar 19). Karena basis medianya sama, maka prinsip kerja media maupun cara pengamatan media RC adalah sama dengan LMX Broth.
Gambar 19 Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult® Coliform 100
80
Metode P/A menggunakan media Readycult® Coliform 100 ini telah disahkan oleh USEPA untuk digunakan dalam pengujian bakteri Koliform maupun E. coli dalam air minum (USEPA, 2007).
Keunggulan metode ini
dibandingkan dengan APM maupun ALT adalah pengerjaannya yang jauh lebih sederhana, cepat dan jumlah sampel yang dites jauh lebih besar daripada metode APM maupun ALT sehingga apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sample akan terdeteksi sebagai positif.
Tabel 12 Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult® Coliform 100 Jenis Media
RC 100
Sampel Air Proses
Rendah
Sedang
Tinggi
Rendah
Sedang
Tinggi
1
negatif
positif
TD
TD
positif
TD
TD
2
negatif
positif
TD
TD
positif
TD
TD
Ulangan
Kontrol positif
Sampel ber E. coli
3 negatif positif TD TD positif TD Catatan : - Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml) - Keterangan : TD = Tidak dilakukan
TD
Dari hasil penelitian terlihat bahwa semua sampel air proses tanpa cemaran adalah negatif dan semua sampel dengan cemaran maupun cemaran saja pada konsentrasi rendah adalah positif (Tabel 12). Pada penelitian ini metode P/A hanya dilakukan untuk konsentrasi rendah saja untuk melihat sensitifitas pada jumlah sel terendah, sedangkan untuk konsentrasi sedang dan tinggi tidak dilakukan karena sudah pasti akan positif hasilnya.
Hasil ini sejalan dengan
kedua metode sebelumnya yaitu APM (dengan LST maupun LMX) dan ALT (dengan CCA), dimana pada sampel air proses saja semua hasilnya negatif sedang pada konsentrasi rendah semua positif dengan nilai cfu yang berbeda-beda. Apabila memang hasil akhir yang diinginkan hanya negatif per 100 ml sampel maka diantara ketiga metode tersebut, metode P/A lah yang paling sesuai karena paling mudah dilakukan, cepat dan dengan hasil yang sebanding dengan metode lain. Manafi and Rosmann (1998a) dalam penelitiannya mendapatkan hasil bahwa Readycult® mendeteksi Koliform dan E.coli secara signifikan pada lebih
81
banyak sampel dalam 24 jam dibandingkan dengan standard Methods. Readycult® menunjukkan hasil false positive untuk Aeromonas spp., yang merupakan waterborne bacteria yang umum.
Deteksi Koliform dan E.coli
dikurangi menjadi total satu hari dibandingkan dengan metode EPA konvensional yang memerlukan 4 hari dan metode DIN yang memerlukan 3 hari. Selain itu juga dibuktikan bahwa sensitifitas Readycult® sama dengan Standard Methods dan bahkan Readycult® dapat menghitung E.coli dan Koliform secara simultan dalam analisis yang sama. Efisiensi dan kecepatan reaksi yang dapat dideteksi membuat media ini sangat bermanfaat dalam test mikrobiologi air rutin (Manafi and Rosmann, 1998a). Pada Gambar 20 tampak berbagai hasil inkubasi media Readycult®. Paling kiri yaitu yang berwarna bening kekuningan adalah pada saat awal inokulasi atau apabila sampelnya steril. Botol yang tengah tampak keruh tetapi tidak berwarna biru kehijauan, yang berarti ada pertumbuhan bakteri tetapi bukan termasuk Koliform. Hasil ini didapat dari inkubasi sampel air proses tanpa cemaran pada tanggal 3 Juni 2008, yang memang di media CCA juga tumbuh koloni tak berwarna cukup banyak. Botol paling kanan keruh dan berwarna biru kehijauan, yang menunjukkan ada pertumbuhan bakteri Koliform (dari perlakuan dengan cemaran E.coli) . Uji konfirmasi lanjutan untuk membedakan E.coli dari bakteri kelompok Koliform lainnya dilakukan dengan melihat fluoresensi dengan lampu UV 366 nm dan pembentukan cincin merah dari reaksi indol dengan pereaksi KOVAC’s (Gambar 21). Keunggulan dan kelemahan media Readycult® dibandingkan dengan media konvensional untuk uji Koliform dan E.coli pada dasarnya sama dengan media Fluorocult® LMX Broth yang telah diterangkan di bagian metode APM LMX. Keunggulan lainnya dari Readycult® adalah kemudahan dalam pengerjaan dan ketelitian yang lebih untuk uji air minum dengan jumlah bakteri Koliform sangat kecil bahkan negatif, karena sampel yang diuji adalah 100 ml dalam satu botol.
82
1. awal inokulasi
2. ada pertumbuhan bukan Koliform
3. positif Koliform
Gambar 20 Pertumbuhan bakteri Koliform di media Readycult® Coliform 100
1
2
Gambar 21 Fluoresensi (1) dan Reaksi Indol (2) dalam media Readycult® Coliform 100. Kemudahan pengerjaan seperti sudah disinggung di bagian inokulasi, terutama karena media sudah dalam dalam bentuk snap siap yang steril (Gambar 19), dengan dua pilihan yaitu untuk keperluan sampel 50 ml atau 100 ml. Dengan bentuk snap siap pakai tersebut proses preparasi media yang konvensionl seperti penimbangan, pelarutan, sampai dengan sterilisasi dan penyimpanan menjadi
83
hilang. Kebutuhan tenaga, peralatan, waktu pembuatan media dan ruang simpan untuk media jadi juga menjadi sangat berkurang.
Prosedur sederhana ini
memungkinkan suatu laboratorium sederhana dengan peralatan dan kompetensi personal minimal, bahkan di lapangan, bisa juga melakukan test rutin monitoring Koliform. Bentuk snap dengan media steril juga memungkinkan dilakukannya pengujian dengan sampel air sebesar 100 ml karena tidak lagi diperlukan air sebagai pelarut dalam proses pembuatan media. Apabila menggunakan media biasa maka untuk melakukan pengujian dengan sampel sebanyak 100 ml diperlukan media sebanyak 50 ml dengan minimal 3 kali resep (3-fold) (Merck, 2005; APHA, 2005). Hal ini tentu akan sangat mengurangi biaya pengujian dibandingkan dengan metode APM atau P/A biasa. Karena metode ini sangat sensitif maka yang diuji hanya sampel tanpa inokulasi dan cemaran yang konsentrasi rendah saja. Jumlah sel akhir per botol adalah 400 sel untuk konsentrasi rendah (Tabel 12) karena jumlah inokulum 4 sel/ ml sedangkan jumlah suspensi cemaran yang digunakan adalah 100 ml. Cemaran konsentrasi sedang dan konsentrasi tinggi tidak diuji karena sudah pasti hasilnya akan positif karena menurut Manafi dan Rosmann (1998a) apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sampel yang akan memberikan hasil positif. Selain untuk deteksi secara simultan Koliform dan E.coli, Readycult Coliform dapat juga digunakan untuk pengkayaan dalam cara deteksi E.coli O157:H7 secara cepat dan mudah di sampel air. E.coli O157:H7 yang diduga ada di sampel yang diinokulasikan ke media RC yang berwarna hijau kebiruan tetapi fluoresensi negatif dan indol positif dikonfirmasi dengan Singlepath E.coli O157 (Bubert et.al, poster)
4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan P/A Apabila keempat metode tersebut kita bandingkan maka akan tampak bahwa metode APM (baik LST maupun LMX) memberikan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode ALT CCA (Tabel 13).
Pada perlakuan sampel
tanpa cemaran, metode APM memberikan hasil < 1,8 /100 ml, metode ALT
84
memberikan hasil 0 cfu/ml dan metode P/A memberikan hasil negatif/100 ml. Hasil ALT terkecil adalah 0 cfu/ml karena tidak dilakukan pengenceran pada sampel tetapi jumlah sampel yang dianalisa hanya 1 ml. Metode P/A memberikan hasil negatif atau 0/100 ml sedangkan metode APM hanya bisa memberikan hasil < 1.8/100 ml. Hal ini karena APM terkecil untuk seri 5 tabung dengan jumlah total sampel 55.5 ml adalah 1.8 cfu/100 ml apabila hasil kombinasi tabung positif 0-0-1 dengan perhitungan sbb (APHA, 2005) : MPN/100 ml = 100 x P / (N x T) 1/2 MPN/100 ml = 100 x 1/ (55.4 x 55.5)1/2 MPN/100 ml = 100/55.45 = 1.8 dimana : P = jumlah tabung positif N = total volume sampel dalam semua tabung negatif (dijumlahkan), ml T = total volume sampel dalam seri pengenceran yang digunakan, ml
Pada sampel dengan penambahan cemaran dengan knsentrasi sedang dan tinggi, maka hasil yang didapat pada metode APM kebanyakan >1600 cfu/100ml sehingga sulit untuk dilakukan analisa pembandingan statistik dan tidak bisa dibuat rerata apabila ada ulangan yang nilainya kurang dari 1600. Metode ALT lebih memungkinkan untuk melakukan analisa statistik dan perhitungan rerata, dengan pengerjaan yang lebih simpel. Metode P/A walau lebih sederhana dalam pengerjaan tetapi hasil yang diperoleh hanya bisa positif atau negatif saja sehingga hanya cocok untuk sampel sangat bersih yang memang diharapkan hasilnya negatif. Dalam APHA (2005) disebutkan bahwa apabila sampel yang diuji dengan metode P/A memberikan hasil positif maka dianjurkan untuk melakukan pengujian ulang untuk menghitung jumlah Koliform karena data kuantitatif dapat menunjukkan tingkat kontaminasi yang terjadi. Metode APM terutama sangat berguna untuk sampel yang konsentrasi organismenya sangat rendah (<100 cfu/g) terutama air, susu dan sampel pangan yang keberadaan partikulat materialnya kemungkinan mengganggu keakurasian
85
perhitungan koloni pada metode ALT (FDA, 2008). Asumsi yang sangat penting untuk mendukung keakurasian metode APM adalah bahwa bakteri – bakteri yang ada terdistribusi secara acak didalam sampel, saling terpisah, tidak membentuk kelompok dan juga tidak saling menempel satu sama lain. Metode ALT biasanya digunakan untuk sampel yang jumlah bakterinya banyak. (FDA, 2008).
Tabel 13 Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (LST & LMX), Angka Lempeng Total (CCA) dan Presence Absence (RC) Jenis Media
LST**
LMX**
CCA**
RC**
Ulangan 1 2 3 Rerata 1 2 3 Rerata 1 2 3 Rerata 1 2 3 Rerata
Sampel Air Proses <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 <1.8 0 0 0 0 negatif negatif negatif negatif
Kontrol positif (cfu/100 ml) Rendah* 240 245 395 293 240 260 295 265 188 175 150 171 positif positif positif positif
Sedang* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 1963 1188 2000 1717 TD*** TD TD TD
Tinggi* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 4000 2875 4350 3742 TD TD TD TD
Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Rendah* 240 390 150 260 390 390 295 358 200 238 175 204 positif positif positif positif
Sedang* >1600 920 >1600 >1600 >1600 1600 1600 >1600 2275 1613 1838 1908 TD TD TD TD
Catatan : * Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml) ** LST (Lauryl Sulfate Broth) LMX (Fluorocult LMX Broth) CCA (Chromocult Coliform Agar) RC (Readycult Coliform 100) *** TD : Tidak dilakukan pengujian
Selain itu apabila dilihat dari jumlah total sampel yang dianalisa maka metode P/A adalah yang paling banyak dengan 100 ml, metode APM 5 tabung dengan 55.5 ml dan metode ALT dengan hanya 1 ml. Dengan demikian ketelitian hasil yang terbaik untuk pengujian air dengan kualitas air minum adalah pada metode P/A dengan sampel 100 ml karena probabilitas keterambilan sel bakteri dalam sampel menjadi jauh lebih besar dari pada metode APM dan ALT. Misalnya, apabila ada 1 sel dalam 100 ml sampel maka dengan metode P/A akan
86
Tinggi* >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 4163 3188 3600 3650 TD TD TD TD
terdeteksi sebagai positif, pada metode APM probabilitas keterambilannya hanya 55.5 % (total sampel 55,5 ml) dan di metode ALT bahkan hanya 1% (total sampel 1 ml). Karena itu beberapa metode referensi pengujian air seperti APHA, FDA, ISO, SNI menggunakan metode P/A atau Membran Filtrasi untuk sampel dengan kelas air minum. Untuk sampel air bersih biasanya digunakan metode APM 5 tabung atau Membran Filtrasi (APHA, 2005; FDA, 2007; ISO, 2001; BSN, 2006). Kelemahan ini juga dibahas oleh Odge et.al (1998) dan beliau menganjurkan untuk menggunakan lebih dari 6 petri atau menggunakan perti dengan diameter 15 cm sehingga jumlah sampel yang diinokulasikan bisa lebih besar dari 1 ml. Apabila dilihat dari kebutuhan inkubator maka keuntungan lain dari media cepat LMX, RC dan CCA untuk pengujian Koliform dan E. coli adalah dalam pengerjaannya hanya memerlukan satu suhu inkubasi yaitu 35oC dibandingkan dengan metode konvensional yang perlu dua suhu inkubasi yaitu 35oC dan 44.5oC. Jumlah tabung dan cawan petri yang lebih sedikit dan tahapan yang hanya satu kali pengerjaan saja memerlukan ruang yang lebih sedikit di inkubator. Salah satu parameter kualitas suatu media pertumbuhan adalah kemampuan dalam menumbuhkan bakteri yang diinginkan. Dalam penelitian ini yang dihitung pada Tabel 6 adalah nilai recovery ratenya untuk perlakuan dengan konsentrasi bakteri rendah karena untuk perlakuan dengan APM pada konsentrasi sedang dan tinggi memberikan hasil perhitungan > 1600 sehingga tidak bisa dihitung. Perhitungan nilai recovery rate dilakukan dengan membandingkan hasil pertumbuhan di sampel ber E.coli dengan kontrol positif (larutan PDF yang dicemari dengan bakteri yang sama). Hasil recovery rate tertinggi adalah pada media LMX (122%), kedua adalah media LST (89%) dan ketiga adalah media CCA (70%). Recovery rate CCA paling rendah dibandingkan dengan media broth lainnya karena bentuknya yang padat berpengaruh terhadap tingkat recovery sel. Menurut Ogden (1997) organisme yang sakit (rusak) lebih menyukai lingkungan yang cair (broth) daripada permukaan padat yang kering (agar). Dari kedua broth yaitu LST dan LMX maka hasil recovery rate LMX lebih tinggi dari LST hal ini karena sumber karbohidrat yang digunakan dalam LMX selain laktosa juga sorbitol dan dua macam substrat kromogenik (Merck, 2005) sehingga mampu memberikan
87
hasil pertumbuhan yang lebih bagus. Keuntungan lain dari CCA dan LMX adalah waktu yang lebih cepat, yaitu 24 jam untuk sampai ke identifikasi / konfirmasi E.coli. Geissler et.al. (2000) melakukan penelitian pengujian secara kuantitatif untuk koliform total dan E. coli di air laut dengan membandingkan metode APM konvensional menggunakan Lauryl Sulfate Broth (LST) dengan metode APM cepat menggunakan LMX Broth dan metode Membran Filtrasi menggunakan Chromocult Coliform Agar (CC) dan CC plus Cefsulodin (CC-CFS). Dalam penelitian tersebut dibuktikan bahwa metode APM konvensional memiliki sensitifitas paling kecil untuk perhitungan E.coli. Keseluruhan hasil untuk E.coli ter-recover menunjukkan bahwa pertumbuhan pada media LMX, CC-CFS, dan CC adalah 1,60; 1,64; dan 1,39 kali lebih banyak dari APM konvensional. Akan tetapi secara statistik, hasil antara LMX, CC, CC-CFS tidak berbeda nyata untuk perhitungan E.coli. Pada media CC-CFS hasilnya lebih kecil daripada media CC karena mengandung cefsulodin yang menyebabkan tingkat penghambatannya lebih besar.
4.6 Analisa Ekonomis Dalam penelitian ini, selain dilihat keunggulan teknis dari masing-masing metode pengujian dan jenis medianya, dilakukan juga analisis ekonomis terhadap keempat metode yang diperbandingkan, yaitu metode APM dengan media LST (cara konvensional), APM dengan media LMX Broth (cara cepat), P/A dengan media Readycult® (cara cepat) dan metode ALT dengan media CCA (cara cepat). Parameter yang diperbandingkan adalah: (1) investasi biaya yang dikeluarkan untuk pembelian pertama kali set media dan reagen yang dibutuhkan, (2) harga per test (apabila dilakukan secara single maupun duplo), (3) perbandingan biaya metode cepat terhadap metode konvensional, (4) total hari yang diperlukan untuk pengujian (minimal dan maksimal), dan (5)
jumlah petri dan tabung yang
diperlukan selama pengujian. Keseluruhan data tersebut tersaji pada Tabel 14. Perhitungan
tersebut dilakukan
berdasar asumsi
bahwa
sampel positif
mengandung E.coli sehingga perlu dilakukan pengujian secara lengkap sampai ke tahap konfirmasi untuk 2 koloni terduga. Khusus untuk metode APM LST, selain
88
perhitungan lengkap juga dilakukan perhitungan untuk sampel yang Koliform negatif sehingga pengujian berhenti pada tahap tersebut. Parameter ekonomis pertama adalah besarnya biaya yang dikeluarkan untuk pembelian media pada saat awal pengujian yang dihitung berdasarkan harga price list media Merck tahun 2009 yang dikeluarkan oleh PT. Merck Tbk. (Tabel 14). Dari keempat metode tersebut tampak bahwa biaya investasi media terbesar adalah untuk metode APM konvensional karena harus membeli enam macam media yaitu LST, EC, LEMBA, Tryptone Water, MR-VP Base Broth, Simon Citrate, dan tiga macam reagen yaitu KOVAC’s, MR dan VP. Tabel 14 Perhitungan biaya dan lama pengujian lengkap E.coli pada metode Angka Paling Mungkin, Angka Lempeng Total, dan Presence Absence. Metode Analisa APM LST 1) sampel E.coli positif APM LST 2) sampel Koliform negatif APM LMX 3)
Investasi media (Rp) 10.813.000
Harga /test (Rp) Single Duplo 200.763 401.526
% biaya 100%
Total hari min max 5 7
10.813.000
9.676
19.352
5%
2
4
8.119.000
57.218
114.436
29%
1
2
ALT CCA 4)
4.978.000
7.530
15.059
4%
1
2
P/A Readycult 5)
1.309.000
60.570
121.140
30%
1
2
Jumlah alat gelas 195 tabung 15 tabung 15 tabung 2 petri 1 botol
Keterangan : 1. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST) untuk sampel yang positif E.coli 2. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST untuk sampel yang negatif Koliform 3. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth (LMX) untuk sampel yang positif E.coli 4. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar untuk sampel yang positif E.coli 5. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100 untuk sampel yang positif E.coli
Total investasi untuk Metode APM konvensional untuk pemeriksaan lengkap E.coli adalah Rp 10.813.000,-. Apabila uji Koliform juga dilakukan maka ada tambahan biaya investasi sebesar Rp 1.086.000,- untuk pembelian media Brilliant Green Bile 2% Broth sebagai uji penguat Koliform setelah positif gas di LST.
Dengan demikian, total investasi media dan reagen untuk uji
Koliform dan E.coli dengan metode APM konvensional adalah Rp 11.899.000,-. Yang kedua adalah metode APM cepat LMX yaitu sebesar Rp 8.119.000,-. Yang
89
ketiga adalah metode ALT CCA yaitu sebesar Rp 4.978.000,- dan terakhir yang paling murah investasinya adalah metode P/A yaitu sebesar Rp 1.309.000,-. Metode P/A memang terlihat paling kecil biaya pembelian media awalnya karena satu pak hanya untuk 20 test. Ketiga metode cepat tersebut sekaligus untuk pengujian Kolifom dan E.coli. Apabila dilihat dari jumlah investasi yang diperlukan untuk pembelian media dan keterbatasan masa pakai suatu media maka untuk jumlah pengujian sedikit dan tidak rutin, metode yang memerlukan jumlah media sedikit dan investasi kecil akan lebih menguntungkan. Hal ini karena media dan reagen tidak kadaluwarsa atau rusak sebelum habis digunakan.
Perhitungan lengkap dari
masing-masing media ada di Lampiran 13, 14 dan 15. Pada Tabel 14 juga bisa dilihat perhitungan harga per test untuk pengujian single maupun duplo. Dari hasil perhitungan untuk pengujian single terlihat bahwa metode APM konvensional (LST) yaitu Rp 200.763,- ternyata juga paling mahal karena memerlukan banyak media dengan banyak tahapan. Harga per test termahal kedua adalah Readycult® Coliform yaitu Rp 60.570,- atau hanya 30% dari biaya APM konvensional LST. Selanjutnya (ketig-=a) adalah APM LMX sebesar Rp 57.218,- atau 29% dari biaya APM konvensional LST. Metode ALT dengan CCA ternyata paling murah yaitu hanya Rp 7.530,- per test nya atau hanya 4% dari harga per test APM konvensional LST. Apabila setiap sampel dilakukan test duplo maka harga per test dikalikan dua seperti tampak pada Tabel 14, dan selisih harga antar metode menjadi semakin besar yaitu Rp 401.526,- untuk APM konvensional LST, Rp 121.140,- untuk Readycult, Rp 114.436,- untuk APM LMX dan untuk ALT CCA hanya sebesar Rp 15.059,-. Perhitungan total hari yang diperlukan untuk pengujian (lengkap sampai tahap konfirmasi E.coli) didasarkan atas jumlah minimum dan maksimum hari yang diperlukan. Perbedaan antara minimum dan maksimum total hari pengujian in terjadi karena apabila pada inkubasi 24 jam hasil pembacaan masih negatif maka harus diperpanjang menjadi 48 jam. Dari data di Tabel 15 tampak sekali perbedaan antara metode APM LST (konvensional) yang memerlukan waktu pengujian 5-7 hari dengan metode cepat (APM LMX, Readycult® dan ALT CCA) yang hanya memerlukan waktu 1-2 hari saja. Total waktu pengujian sangat besar
90
pengaruhnya di industri karena berkaitan dengan waktu untuk melepas barang ke pasar.
Semakin lama waktu pengujian akan semakin lama pula waktu barang
tertahan di gudang. Lamanya barang tertahan di gudang akan berpengaruh langsung ke kapasitas gudang yang diperlukan dan perputaran cash flow perusahaan. Dari sisi kebutuhan peralatan gelas yaitu tabung dan cawan petri, tampak dalam Tabel 14 bahwa metode APM LST memerlukan jumlah peralatan gelas sangat banyak. Jumlah 195 tabung dan cawan petri untuk APM LST sudah dibatasi dengan melakukan hanya tiga seri pengenceran yaitu 100, 10-1, dan 10-2. Sampel langsung dinokulasikan dengan jumlah ml yang berbeda untuk tiap tabung (10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml) sehingga menghemat tabung. Kelemahannya adalah pada konsentrasi cemaran sedang dan tinggi hasilnya tidak bisa dihitung secara statistik karena hanya menyebutkan nilai >1600. Uji konfirmasi E.coli hanya dilakukan pada dua koloni terduga sehingga penggunaan tabung dan cawan petri bisa dikurangi. Jumlah peralatan akan bertambah secara nyata lebih dari 195 buah apabila jumlah pengenceran bertambah dan koloni yang dikonfirmasi juga bertambah menjadi 5 koloni tiap tabung positif. Hal ini juga akan berimplikasi langsung terhadap penambahan analis laboratorium, beban kerja di lab, jumlah inkubator dan peralatan penunjang lainnya. Penggunaan metode cepat sangat memotong jumlah tabung dan petri yang diperlukan dengan sangat nyata dari 195 tabung menjadi hanya 16 tabung untuk metode APM LMX dan bahkan hanya perlu dua cawan petri untuk metode ALT CCA dan satu botol untuk metode P/A (Tabel 14). Hal ini juga akan berimplikasi langsung terhadap pengurangan beban kerja di lab,
jumlah inkubator dan
peralatan penunjang lainnya. Penelitian yang dilakukan oleh Ogden et.al pada tahun 1998 telah membandingkan metode APM konvensional dengan beberapa metode cepat untuk sampel kerang. Dalam penelitian tersebut dibuktikan bahwa metode cepat dengan Chromocult bisa memberikan hasil pengujian E.coli dalam waktu 48 jam (dalam kenyataannya hasil biasanya diperoleh dalam 24 jam). Sebagai pembandingnya, metode APM memberikan hasil dalam 3-4 hari.
91
Tabel 15 Analisa biaya pengujian dan gudang di PT Yummy Food Utama A. Biaya Listrik Bulanan (Rp 27.000.000) % Asumsi 55% Bagian Produksi 5% Kantor 10% Bagian Laboratorium 30% Bagian Gudang (chiller)
Nilai total 27,000,000 27,000,000 27,000,000 27,000,000
Nilai Akhir/bulan 14,850,000 1,350,000 2,700,000 8,100,000
B. Nilai Barang (4 batch = 16 trolley)
Asumsi/Trolley
Satuan
Yogurt buah Blackberry 125 g Yogurt buah Strawberry 125 g Yogurt buah Manggo 125 g Yogurt buah Guava 125 g Total Nilai Barang per hari produksi
8000 8000 8000 8000
Nilai satuan 4,500 4,500 4,300 4,200
Nilai Akhir/batch 36,000,000 36,000,000 34,400,000 33,600,000 140,000,000
C. Biaya Gudang (Chiller)
Asumsi
Satuan
Gaji Karyawan/bulan 4 Investasi bangunan dan alat gudang 1 Biaya operasional lain-lain/bulan 1 Biaya listrik gudang-chiller (dari tabel biaya listrik) 1 Total biaya gudang per hari Biaya gudang/trolley/hari (maksimum 65 trolley)
Biaya satuan
Biaya harian
1,500,000 400,000,000 2,000,000
200,000 222,222 66,667
8,100,000
270,000 758,889 11,675
D.Biaya Laboratorium
Deskripsi
Per Bulan
Harian (7 parameter)
Harian (E.coli saja)
Biaya Tetap Belanja pegawai 383,333 54,762 11,500,000 Biaya Listrik 90,000 12,857 2,700,000 Penyusutan asset Lab 111,111 15,873 3,333,333 Biaya kalibrasi alat 5,721 817 171,643 Biaya operasional lain-lain/bulan 66,667 9,524 2,000,000 Total Biaya Tetap 590,166 84,309 19,704,976 Keterangan : 6. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST) untuk sampel yang positif E.coli 7. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST untuk sampel yang negatif Koliform 8. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth (LMX) untuk sampel yang positif E.coli 9. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar untuk sampel yang positif E.coli 10. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100 untuk sampel yang positif E.coli
92
Biaya medium Chromocult yang digunakan di proyek tersebut kira-kira seperempat dari biaya APM. Akan tetapi kepastian besarnya biaya metode APM sangat tergantung kepada berapa banyaknya tabung yang tercatat positif dan memerlukan analisis lebih lanjut. Ogden juga menyebutkan bahwa keuntungan lain dari Chromocult adalah penggunaan inkubator yang hanya 37oC sedangkan APM untuk E.coli juga perlu extra waterbath 44oC. Selain biaya pembelian media pengujian, selanjutnya dihitung pula biaya listrik bulanan (Tabel 15 A) dan nilai barang (Tabel 15 B). Perhitungan biaya listrik dilakukan dengan asumsi bahwa dari total rata-rata biaya listrik per bulan sebesar Rp 27.000.000,- dibagi menjadi 55% produksi,
5% untuk kantor, 10%
untuk Laboratorium dan 30% untuk gudang (chiller). Walaupun PT. Yummy memiliki banyak varian keju dan yogurt, perhitungan nilai barang dalam penelitian ini dilakukan hanya untuk produksi yogurt buah empat rasa kemasan 125g. Harga satuan yogurt buah bervariasi tergantung rasa, yaitu blackberry Rp 4500, strawberry Rp 4500, manggo Rp 4300, dan yang termurah adalah guava Rp 4200. Apabila dalam satu hari dibuat setiap rasa satu batch maka total nilai produk jadi per hari adalah Rp 140.000.000.(Tabel 15 B). Produksi per batch adalah 1000 kg dengan berat per kemasan adalah 125g, dengan demikian dalam satu batch produksi diperoleh 8000 kemasan. Kapasitas satu trolley adalah 2400 kemasan sehingga untuk satu batch diperlukan 4 buah trolley. Karena dalam satu hari diproduksi 4 batch maka kebutuhan trolley per hari adalah 16 buah. Kapasitas gudang chiller di PT Yummy adalah 65 trolley sehingga apabila total biaya gudang per hari Rp 758.889,- maka biaya gudang per trolley per hari adalah Rp 11.675,- (Tabel 15 C). Biaya per trolley tersebut dihitung dari jumlah komponen biaya utama untuk gudang (gaji empat orang karyawan, penyusutan investasi, operasional, listrik) dibagi kapasitas gudang chiller sebanyak 65 trolley. Dengan kapasitas gudang chiller hanya 65 trolley maka dalam waktu 4 hari produksi saja gudang chiller tersebut sudah penuh.
Selain itu, karakteristik
produk yogurt yang mempunyai masa simpan pendek menyebabkan produk harus secepat mungkin di release ke pasar. Pengujian yang cepat akan sangat membantu efisiensi gudang sehingga kapasitas gudang tidak perlu ditambah.
93
Apabila di Tabel 14 biaya laboratorium dihitung untuk pemakaian media, maka di Tabel 15 D biaya laboratorium dihitung sebagai biaya operasional yang meliputi gaji pegawai sebanyak 3 orang, listrik, penyusutan peralatan lab, kalibrasi alat dan biaya operasional lain-lain. Dalam sehari laboratorium PT Yummy melakukan pengujian 7 parameter uji, salah satunya adalah E.coli dan Koliform. Biaya harian untuk pengujian E.coli adalah Ro 84.309 yang diperoleh dari total biaya bulanan operasional lab sebesar Rp 19.704.97 dibagi untuk 7 parameter pengujian. Hasil dari perhitungan di Tabel 15 akan digunakanuntuk menghitung perbandingan biaya total masing-masing metode dan penghematan yang bisa diperoleh dengan menerapkan metode cepat. Perbandingan total biaya laboratorium dan gudang untuk tiap metode akan dipengaruhi oleh biaya media yang digunakan, jumlah hari yang diperlukan suatu metode yang mempengaruhi lama penyimpanan di gudang. Dalam perhitungan di Tabel 16 digunakan asumsi produksi sehari 4 batch (nilai total Rp 140.000.000); biaya gudang per hari Rp 186.803; bunga bank 15% dan kapasitas gudang adalah untuk 4 hari produksi masing-masing 4 batch. Dari Tabel 16, total biaya maksimal yang dikeluarkan untuk pengujian dengan metode APM konvensional adalah Rp 3.906.632 dengan total waktu pengujian 7 hari apabila pembacaan hasil setiap tahapan dilakukan dalam waktu 48 jam dan total biaya minimal adalah Rp 3.364.406 apabila tiap tahapan hanya perlu 24 jam. Apabila Koliform negatif
dalam waktu 48 jam maka hanya
diperlukan biaya Rp 734.703. Koliform negatif berarti hanya memerlukan pengujian dengan media LST saja. Metode APM cepat dengan media LMX hanya memerlukan 29% dari keseluruhan biaya APM LST untuk 48 jam inkubasi di tiap tahapan dan 23% biaya apabila tiap tahapan dalam waktu 24 jam sudah positif.
Penghematan yang bisa dilakukan apabila menggunakan APM LMX
adalah Rp 2.578.014 - Rp 2.791.593 per produksi (4 batch). Apabila hasilnya ternyata Koliform negatif (hanya tahap uji LST) maka APM LMX lebih mahal Rp 380.336,- tetapi dengan ketelitian lebih tinggi dan kemungkinan kesalahan lebih rendah.
94
Tabel 16. Perbandingan biaya total antara APM konvensional dan metode cepat
1)
Metode APM Konvensional Biaya gudang total (E.coli positif) Bunga bank - kredit modal kerja Biaya Media (duplo) Biaya Laboratorium Total Biaya
= = = = =
Maksimal Hari 7 hari 7 hari 4 batch 7 hari 7 hari
Setiap tahap 48 Setiap tahap jam (Rp) 24 jam (Rp) 1,307,624 934,017 402,740 402,740 1,606,102 1,606,102 590,166 421,547 3,906,632 3,364,406
E .coli neg dalam 48 jam (Rp) 373,607 115,068 77,409 168,619 734,703
2)
Metode Cepat APM LMX Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari Biaya Media (duplo) = 4 batch Biaya Laboratorium = 2 hari Total Biaya = 2 hari % biaya dibanding APM Konvensional Penghematan dibanding APM Konvensional
373,607 115,068 457,745 168,619 1,115,039 29% -2,791,593
186,803 57,534 457,745 84,309 786,392 23% -2,578,014
373,607 115,068 457,745 168,619 1,115,039
373,607 115,068 60,236 168,619 717,530 18% -3,189,102
186,803 57,534 60,236 84,309 388,883 12% -2,975,523
373,607 115,068 60,236 168,619 717,530
373,607 115,068 484,560 168,619 1,141,854 29% -2,764,778
186,803 57,534 484,560 84,309 813,207 24% -2,551,199
373,607 115,068 484,560 168,619 1,141,854
380,336
3)
Metode Cepat ALT CCA Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari Biaya Media (duplo) = 4 batch Biaya Laboratorium = 2 hari Total Biaya = 2 hari % biaya dibanding APM Konvensional Penghematan dibanding APM Konvensional
-17,173
4)
Metode Cepat P/A Readycult Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari Biaya Media (duplo) = 4 batch Biaya Laboratorium = 2 hari Total Biaya = 2 hari % biaya dibanding APM Konvensional Penghematan dibanding APM Konvensional
407,151
Asumsi : 1. Nilai jual produk/hari produksi (4 batch) : Rp 140.000.000 2. Biaya gudang/hari kerja (4 batch = 16 trolley) : Rp 186.803 3. Bunga bank kredit modal kerja : 15% / tahun 4. Kapasitas gudang 65 trolley setara dengan 4 hari kerja @ 4 batch. Keterangan : 1. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST) 2. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth 3. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar 4. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100
Penggunaan CCA memerlukan biaya yang jauh lebih murah daripada APM LST konvensional yaitu 18% (Rp 717.530) dari biaya untuk inkubasi tiap tahapan 48 jam dan 12% (Rp 388.883) untuk inkubasi 24 jam (Tabel 16). Penghematan yang dilakukan dengan penggunaan CCA adalah Rp 3.189.102 untuk 48 jam dan
95
Rp 2.975.523 untuk 24 jam. Apabila sampelnya Koliform negatif maka masih lebih hemat Rp 17.173 dibandingkan dengan APM konvensional dengan keuntungan tambahan yaitu lebih spesifik terhadap Koliform dan E.coli dan lebih sensitif terhadap sel yang sublethal injured. Apabila dibandingkan dengan metode APM LST, maka metode cepat P/A Readycult® selain hanya perlu waktu maksimal dua hari kerja, biaya yang diperlukan hanya 29% (Rp 1.141.854) dari metode APM konvensional untuk pembacaan hasil tiap tahapan 48 jam inkubasi dan 24% (Rp 813.207) untuk yang 24 jam inkubasi. Apabila ternyata sampel tersebut Koliform negatif maka biaya total menjadi lebih mahal Rp 407.151, dibandingkan dengan metode konvensional yang hanya perlu media LST saja dengan waktu yang sama dua hari. Walaupun biaya (apabila Koliformnya negatif) lebih tinggi dibandingkan dengan APM konvensional, akan tetapi keuntungan lain dari metode P/A dibandingkan dengan APM konvensional adalah pengerjaannya yang cepat dan mudah serta ketelitiannya yang lebih tinggi karena mengunakan 100 ml sampel. Manfaat lain yang bisa diperoleh apabila menggunakan salah satu dari metode cepat yang hanya memerlukan waktu maksimal dua hari pengerjaan untuk analisa Koliform dan E.coli sekaligus, adalah release produk yang lebih cepat. Apabila dengan metode APM konvensional tiap batch memerlukan alokasi tempat di gudang selama tujuh hari
maka dengan metode cepat hanya memerlukan
alokasi tempat selama dua hari saja. Apabila menggunakan pengujian APM konvensional yang memerlukan waktu 7 hari kerja maka dalam seminggu (dengan 5 hari kerja) hanya bisa melakukan 4 hari produksi (18 batch per bulan) dengan nilai total Rp 2.520.000.000. Apabila menggunakan metode cepat yang hanya memerlukan 2 hari kerja maka dalam sebulan bisa diproduksi 22 batch dengan nilai Rp 3.080.000.000 yang berarti peningkatan kapasitas produksi sebesar 22%.
96
V. SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan Hasil penelitian menunjukkan bahwa recovery rate dari urutan yang paling tinggi adalah media Fluorocult LMX broth (122% ), Lauryl Sulfate Tryptose Broth (89%), dan Chromocult Coliform Agar (70%). Media Readycult tidak dapat diperbandingkan karena bersifat kualitatif, akan tetapi formula media Readycult sama dengan media Fluorocult LMX Broth. Hasil perhitungan anova menunjukkan hasil yang sebanding antara metode APM konvensional dengan metode cepat sehingga metode cepat dapat menggantikan metode konvensional. Ketiga metode cepat memerlukan 1-2 hari (dengan kebutuhan 15 tabung untuk LMX, 2 cawan petri untuk CCA dan 1 botol untuk Readycult), sedangkan metode APM konvensional memerlukan waktu 5-7 hari (dengan kebutuhan tabung dan cawan petri sampai 195 buah). Jumlah hari kerja dan peralatan yang diperlukan mencerminkan kemudahan pengerjaan dan kecepatan mendapatkan hasil, sehingga bisa disimpulkan bahwa urutan dari yang paling mudah, adalah (1) metode Presence Absence menggunakan Readycult®, (2) metode Angka Lempeng Total dengan Chromocult® Coliform Agar, (3) metode Angka Paling Mungkin cepat dan (4) terakhir yang paling sulit adalah metode Angka Paling Mungkin dengan metode konvensional. Biaya investasi metode APM konvensional (Rp 10.813.000 untuk E.coli saja dan Rp 11.899.000 untuk koliform dan E.coli), kemudian metode APM cepat (Rp 8.119.000), metode
ALT cepat (Rp 4.978.000) dan investasi terkecil adalah
metode P/A cepat (Rp 1.309.000). Dari perhitungan biaya pengujian E.coli per test (single dan duplo) maka dapat disimpulkan bahwa yang terbesar adalah untuk metode APM konvensional (Rp 200.763 dan Rp 401.526), selanjutnya adalah metode P/A cepat (Rp 60.570 dan Rp 121.140), kemudian metode APM cepat (Rp 57.218 dan Rp 114.436), dan biaya terkecil adalah metode ALT cepat (Rp 7.530 dan Rp 15.059). Apabila ternyata sampel tersebut negatif koliform maka harga per test metode APM konvensional masih jauh lebih murah (Rp 9.676 dan Rp 19.352) daripada APM cepat dan metode P/A, dan sedikit lebih mahal daripada metode ALT cepat.
Apabila hasilnya selalu koliform negatif maka metode
97
konvensional masih lebih murah daripada metode cepat tetapi dengan recovery rate yang lebih rendah. Total biaya laboratorium ketiga metode cepat adalah Rp 84.309 (untuk inkubasi 24 jam) dan Rp 168.619 (48 jam), sementara APM konvensional Rp 421.545 (5 hari) dan Rp 590.166 (7 hari). Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan metode cepat akan menghemat biaya laboratorium. Total biaya gudang ketiga metode cepat adalah Rp 186.803 (24 jam) dan Rp 373.607 (48 jam), sementara APM konvensional Rp 934.015 (5 hari) dan Rp 1.307.624 (7 hari). Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan metode cepat akan menghemat biaya gudang karena produk bisa keluar untuk dipasarkan lebih cepat. Penghematan total biaya yang diperoleh dengan mengganti metode APM konvensional ke metode cepat dari urutan terendah adalah Rp 2.764.778 untuk Readycult®, Rp 2.791.593 untuk Fluorocult® LMX Broth dan Rp 3.189.102 untuk Chromocult® Coliform Agar. Kenaikan kapasitas produksi per bulan dengan pemakaian metode cepat adalah 22% atau 22 batch dari 18 batch dengan lima hari kerja seminggu. Kesimpulan umum dari penelitian ini adalah metode cepat yang menggunakan medium Fluorocult LMX broth, Chromocult Coliform Agar dan Readycult Coliform 100 terbukti dapat memberikan hasil yang sebanding dengan metode APM konvensional dalam pengujian E.coli di air proses PT. Yummy Food Utama dengan waktu analisa yang lebih cepat dan prosedur kerja yang lebih sederhana. Selain itu penggunaan metode cepat dapat digunakan untuk pengujian koliform dan E.coli sekaligus. Penggunaan metode cepat (dengan model pembiayaan di PT. Yummy Food Utama untuk jenis produk yogurt buah ukuran 125 g) terbukti dapat memberikan penghematan biaya investasi media, biaya laboratorium, biaya gudang dan mampu memberikan penghematan biaya total serta dapat meningkatkan kapasitas produksi.
98
5.2 Saran 1. Untuk penelitian lanjutan disarankan untuk menambah seri pengenceran pada sampel dengan cemaran sedang dan tinggi terutama untuk metode Angka Paling Mungkin sehingga diperoleh angka yang lebih kecil dari 1600 cfu/100ml. 2. Perlu dilakukan uji yang sama untuk jenis sampel air minum dan sampel produk pangan lainnya yang kemungkinan kandungan E.coli dan koliform dalam sampel positif, sehingga bisa lebih mencerminkan perbedaan kemampuan media dalam menangkap strain liar bakteri. 3. Karena hasil dari metode APM konvensional untuk uji E.coli yang digunakan oleh SNI ternyata tidak bisa memberikan hasil negatif per 100 ml seperti yang dipersyaratkan oleh Kepmenkes No 907 maka perlu dilakukan pengkajian ulang. 4. Perlu dilakukan kaji ulang untuk prosedur SNI pengujian E.coli dan koliform untuk memberi peluang metode cepat yang lebih sesuai dengan keperluan industri pangan.
99
DAFTAR PUSTAKA
[APHA] American Public Health Association. 2005. Standard Methods for The Examination of Water & Wastewater. Centennial Edition. Washington. Beloti, Vanerli, M AF Barros, M.P. Nunes, E. H. Walter de Santana, L.A. Nero, J.A. de Souza, 2002, Use of Readycult – LMX for Enumeration of Total Coliform and Escherichia Coli in Milk. Braz. J. Microbiol. 33:49-52 [BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 1996. Pedoman Penerapan Produksi Makanan Yang Baik (CPMB). Direktorat Pengawasan Makanan dan Minuman. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan R.I. [BSN], Badan Standardisasi Nasional . 2006. Air Minum Dalam Kemasan. Dewan Standardisasi Nasional. Departemen Perindustrian. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–3553–2006. ICS 67.160.20. Bubert, A, G. Paive, T. Smith, and M. Buelte, 2003. Rapid and simple detection of E.coli O157:H7 in water samples. Poster. [Codex] Codex Alimentarius Comission. 1997. Principles for the Establishment and Application of Microbiological Criteria for Foods. CAC/GL 21. [Codex] Codex Alimentarius Comission. 2003. Recommended International Code of Practice General Principles of Food Hygiene. CAC/RCP 1-1969, Rev. 4-2003. [DEPKES] Departemen Kesehatan. 2002. Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 907/MENKES/SK/VII/2002 Tentang Syarat-Syarat dan Pengawasan Kualitas Air. Menteri Kesehatan Republik Indonesia. [EC] European Community. 1998. Council Directive 98/83/EC of 3 November 1998 on The Quality of Water Intended for Human Consumption. Official Journal of the european Communities. http://eur-lex-europa.eu/LexUri Serv/LexUriServ.do?uri=CELEX:31998L0083:EN:NOT. 8 Oktober 2007. [FDA] United States Food and Drug Administration. 2002. Bacteriological Analytical Manual Online September 2002, Chapter 4, Enumeration of Escherichia coli and the Coliform bacteria. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html [8 November 2007] [FDA] United States Food and Drug Administration. 2006. Bacteriological Analytical Manual Online February. 2006, Most Probable Number from Serial Dilution. USFDA/CFSAN-BAM-Appendix 2. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4.html [8 November 2007]
100
Feldsine, P, C. Abeyta, and W.H. Andrews. 2002. AOAC International Methods Committee. Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiology. Official Methods of Analysis. Journal of AOAC International 85:1187-1200. Geissler, K, M. Manafi, I. Amoros, and J.L. Alonso, 2000, Quantitative Determination of Total Coliform and Escherichia coli in Marine Waters with Chromogenic and Fluorogenic Media. Appl. Environ.Microbiol. 88:280-285. Gonzales, R.D., L.M. Tamagnini, P.D. Olmos, G.B. de Sousa. 2003. Evaluation of a Chromogenic Medium for Total Coliforms and Escherichia coli Determination in Ready-to-eat Foods. Journal of Food Microbiology 20:601-604. Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd ed. Academic Press. San Diego [ISO]. International Organization for Standardization. 2001. ISO 166492:2001(E). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs — Horizontal Method for The Enumeration of ß-glucuronidase-positive Escherichia coli —Part 2: Colony-Count Technique at 44 °C using 5bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide. ISO. Geneva. [ISO]. International Organization for Standardization. 2002. ISO 111332:2002(E). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffsv-Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media. ISO. Geneva. [ISO]. International Organization for Standardization. 2003. ISO 16140:2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs – Protocol for The Validation of Alternative Methods. ISO. Geneva [ISO]. International Organization for Standardization. 2004. ISO 4832: 2004. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method for The Enumeration of Coliforms - Colony Count Technique. ISO. Geneva. Jouve, Jean-Louis. 2000. Good Manufacturing Practice, HACCP, and Quality System. Di dalam:. Lund, B.M., Baird-Parker, T.C., and Gould, G.W. Editor. The Microbiological Safety and Quality of Food Volume IV Chapter 58, pp 1627-1655. Aspen Publisher Inc. Maryland. Labbe, R., 1992. Clostridium perfringens. Di dalam: Doyle, M.P. Editor. Foodborne Bacterial Pathogens, Marcel Dekker, New York
101
Ley, A.N., Barr, S., Fredenburgh, D., Taylor, M. and Walker, N. (1993) Use of 5bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside for Tthe Iisolation of ßD-galactosidase-positive Bacteria from Municipal Water Supplies. Abstract. Can. J. Microbiol. 39, p. 821-825. Manafi, M, W. Kneifel, S. Bascomb. 1991. Fluorogenic and Chromogenic Substrates Used in Bacterial Diagnostics. Microbiological Reviews. American Society for Microbiology, Sept 1991. Vol 55. No. 3, p. 335-348 Manafi, M. (1995). New Medium for The Simultaneous Detection of Total Coliforms and E. coli in Water. 95th Annual Meet. Am. Soc. Microbiol. 1995, American Society for Microbiology, Washington, DC. Abstr.P-43, P. 389. Manafi, M. (1996). Fluorogenic and Chromogenic Enzyme Substrates in Culture Media and Identification Tests. Int. J. Food Microbiol 31:45-58. Manafi. M. dan H. Rosmann. 1998a. An Evaluation of Readycult System for Detection of Total Coliform and E. coli in Water. 98th American Society for Microbiology, Atlanta, 17-21 May 1998. Manafi. M. dan H. Rosmann. 1998b. An Evaluation of a New Chromogenic / Flourogenic Microbiology Media System for Detection of Total Coliforms and E.coli in Water. Hygiene Institute, University of Vienna, Kinderspitalgasse 15, A-1095, Vienna, Austria. Manafi. M. 2000. New Development in Chromogenic and Fluorogenic Culture Media. Int. J. Food Microbiol 60:205-218. [Merck] Merck KGaA. 2004. Water : Microbiological Examination. Germany [Merck] Merck KGaA. 2005. Merck Microbiology Manual. 12th Edition. Germany Ogden, I.D., G.C. Brown, S. Gallacher, P.H. Gartwaite, M. Gennari, M. P. Gonzales, L.B. Jorgensen, B.T. Lunestad, M. MacRae, M.C. Nunes, A.C. Petersen, J.T.Rosnes, J. Vliegenthart. 1998. An interlaboratory study to find an alternative to the MPN technique for enumerating Escherichia coli in shellfish. Int. J. Food Microbiol 40:57-64. Ossmer, R., 1993, Simultaneous Detection of Total Coliforms and E.coli Fluorocult LMX-Broth. - 15th International Symposium/FOOD MICRO 1993. The International Committee on Food Microbiology and Hygiene, Bingen/Rhine. Ossmer, R., Schmidt, W., Mende, U., 1999. Chromocult Coliform Agar – Influence of Membran Filter Quality on Performance. XVII Congresso de la Sociedad, Granada.
102
Pierson, M.D dan L. M. Smooth. 2001. Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. Di dalam: Doyle, M.P., L.R. Beuchat, T.J. Mont ville. Editor. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers, 2nd.Ed. Chapter 4. pp. 71-87. ASM Press, Washington DC. Rice, E.W., Allen, M.J., Brenner, D.J. and Edberg, S.C. (1991) Assay for ßGlucuronidase in Species of The genus Escherichia and Its Application for Drinking Water Analysis. Appl. Environ.Microbiol. 57:592-593 Robinson, R.K, 2002, Dairy Microbiology Handbook, Third edition, John Wiley and Sons, Inc., New York [SNI]. 1992. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–2897–1992. Cara Uji Cemaran Mikroba. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta. [SNI]. 2006a. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–3553–2006. Air Minuman Dalam Kemasan. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta. [SNI]. 2006b. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–2332-1-2006. Cara Uji Mikrobiologi – Bagian 1: Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada Produk Perikanan. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta. Supardi, I., Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan. Penerbit Alumni. Bandung. [USEPA] United States Environmental Protection Agency. 2001. EPA 816-F-01007. National Primary Drinking Water. Office of Water (4604). http://www.epa.gov/safewater. [8 November 2007] [USEPA] United States Environmental Protection Agency. 2007. Ground Water & Drinking Water: Approved Methods for Microorganisms. http://www.epa.gov/safewater/methods/rules_micro.html. [24 September 2007] [WHO] World Health Organization. 2002. Heterotrophic Plate Count Measurement in Drinking Water Safety Management. Assessing Microbial Safety of Drinking Water: Improving Approach and Methods. World Health Organization Sustainable Development and Healthy Environments and Organization for Economic Co-operation and Development. IWA Publishing. Geneva. [WHO] World Health Organization. 2006. Guidelines for Drinking-Water Quality, 3rd Ed. Volume 1. Microbial Aspects. Chapter 7:121-144. Geneva. http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/gdwq3rev/en/ [7 Mei 2008].
103
[WSL] WSL Consultants Pty Ltd. 2004. Comparative Trials of Enzyme Substrate Technologies in Drinking Water Supplies. Draft report. Victoria. Australia.
104
LAMPIRAN Lampiran 1 Rancangan percobaan perbandingan metode APM dengan metode cepat untuk pengujian E. coli di sampel air proses No. Metode*) Test
Media
Kontrol Positif**) Rendah Sedang Tinggi
Air Proses + cemaran**) Tanpa Rendah Sedang Tinggi
1 2 3 4
APM-LST APM-LST APM-LST APM-LST
Lauryl Sulfate Broth Lauryl Sulfate Broth Lauryl Sulfate Broth Lauryl Sulfate Broth
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 2 3 4
APM-LMX APM-LMX APM-LMX APM-LMX
Fluorocult LMX Broth Fluorocult LMX Broth Fluorocult LMX Broth Fluorocult LMX Broth
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 2 3 4
ALT ALT ALT ALT
C. Coliform Agar (CCA) C. Coliform Agar (CCA) C. Coliform Agar (CCA) C. Coliform Agar (CCA)
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
1 2 3 4
P/A P/A P/A P/A
Readycult Coliform 100 Readycult Coliform 100 Readycult Coliform 100 Readycult Coliform 100
1 1 1 1
TD***) TD TD TD
TD TD TD TD
1 1 1 1
1 1 1 1
TD TD TD TD
TD TD TD TD
Keterangan : *) APM-LST (Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth), APM-LMX (Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth), ALT (Angka Paling Mungkin), P/A (Presence Absence) **) Cemaran Rendah (4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml), Tinggi (80 cfu/ml), Tanpa (sample tanpa cemaran. ***) TD (Tidak ditest)
105
Lampiran 2 Cara perhitungan konsentrasi awal suspensi bakteri standar dengan metode Angka Lempeng Total
Sampel yang dicemari
106
Lampiran 3 Skema Pengujian Angka Paling Mungkin Konvensional.
107
Lampiran 4 Skema Pengujian Angka Paling Mungkin cepat dengan media Fluorocult LMX Broth.
108
Lampiran 5 Skema Pengujian Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar.
109
Lampiran 6 Skema Pengujian Presence Absence Readycult® Coliform 100
110
Lampiran 7 Jumlah mikroba ter-recover dalam air proses yang dicemari bakteri E.coli, pada media Lauryl Sulfate Broth dan LMX Broth
No
D eskripsi
Jenis Kode Media
P em bacaan Tabung / Nilai AP M akhir Tanggal Inoku Rendah Sedang Tinggi lasi Tabung APM Tabung APM Tabung APM 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >1600 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >1600 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >1600 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >1600
1 2 3 4
Cemaran Cemaran Cemaran Cemaran
LST LST LMX LMX
C 1-1 C 2-1 C 1-1 C 2-1
5 6 7 8
Cemaran Cemaran Cemaran Cemaran
LST LST LMX LMX
C 1-2 C 2-2 C 1-2 C 2-2
03-Jun 03-Jun 03-Jun 03-Jun
532 551 541 551
140 350 170 350
554 555 554 555
1600 >1600 1600 >1600
555 555 555 555
>1600 >1600 >1600 >1600
9 10 11 12
Cemaran Cemaran Cemaran Cemaran
LST LST LMX LMX
C 1-3 C 2-3 C 1-3 C 2-3
26-Jun 26-Jun 26-Jun 26-Jun
550 550 550 551
240 350 240 350
553 555 555 555
920 >1600 >1600 >1600
555 555 555 555
>1600 >1600 >1600 >1600
1 2 3 4
Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran
LST LST LMX LMX
S1C-1 S2C-1 S1C-1 S2C-1
18 Mei 18 Mei 18 Mei 18 Mei
550 550 550 552
240 240 240 540
554 555 555 555
1600 >1600 >1600 >1600
555 555 555 555
>1600 >1600 >1600 >1600
6 5 7 8
Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran
LST LST LMX LMX
S1C-2 S2C-2 S1C-2 S2C-2
03-Jun 03-Jun 03-Jun 03-Jun
550 552 552 550
240 540 540 240
553 553 555 554
920 920 >1600 1600
555 555 555 555
>1600 >1600 >1600 >1600
9 10 11 12
Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran Sampel+Cemaran
LST LST LMX LMX
S1C-3 S2C-3 S1C-3 S2C-3
26-Jun 26-Jun 26-Jun 26-Jun
541 540 551 550
170 130 350 240
554 555 554 554
1600 >1600 1600 1600
555 555 555 555
>1600 >1600 >1600 >1600
13 14 15 16
Sampel Sampel Sampel Sampel
Air Air Air Air
LST LST LMX LMX
S1-1 S2-1 S1-1 S2-1
18 Mei 18 Mei 18 Mei 18 Mei
000 000 000 000
< 1.8 < 1.8 < 1.8 < 1.8
17 18 19 20
Sampel Sampel Sampel Sampel
Air Air Air Air
LST LST LMX LMX
S1-1 S2-1 S1-1 S2-1
03-Jun 03-Jun 03-Jun 03-Jun
000 000 000 000
< 1.8 < 1.8 LST keruh gas (-) < 1.8 < 1.8 LMX keruh warna (-)
21 22 23 24
Sampel Sampel Sampel Sampel
Air Air Air Air
LST LST LMX LMX
S1-1 S2-1 S1-1 S2-1
26-Jun 26-Jun 26-Jun 26-Jun
000 000 000 000
< 1.8 < 1.8 < 1.8 < 1.8
Catatan : Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml)
111
Lampiran 8 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST) Jenis Media LST
Tanggal Cemaran Sampel + Cemaran Rendah Inokulasi Rendah 18 Mei 240 240 03 Juni 245 390 26 Juni 395 150
Anova: Two-Factor Without Replication (LST - 3 sampling - dua perlakuan) SUMMARY Count Sum Average Variance Row 1 2 480 240 0 Row 2 2 635 317.5 10512.5 Row 3 2 545 272.5 30012.5
Column 1 Column 2 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total
3 3
880 780
SS 6,058.33 1,666.67 38,858.33
df 2.00 1.00 2.00
46,583.33
5.00
293.3333333 7758.3333 260 14700
MS 3,029.17 1,666.67 19,429.17
F P-value F crit 0.16 0.87 19.00 0.09 0.80 18.51
Lampiran 9 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth Jenis Media LMX
Tanggal Cemaran Sampel + Cemaran Inokulasi Rendah Rendah 18 Mei 240 390 03 Juni 260 390 26 Juni 295 295
Anova: Two-Factor Without Replication (LMX - 3 sampling - dua perlakuan) SUMMARY Count Sum Average Variance Row 1 2 630 315 11250 Row 2 2 650 325 8450 Row 3 2 590 295 0
Column 1 Column 2
3 3
ANOVA SS Source of Variation Rows 933.33 Columns 13,066.67 Error 6,633.33 Total
20,633.33
795 1075
df 2.00 1.00 2.00
265 775 358.3333333 3008.333
MS 466.67 13,066.67 3,316.67
F P-value F crit 0.14 0.88 19.00 3.94 0.19 18.51
5.00
112
Lampiran 10 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan Fluorocult LMX Broth Cemaran 240 245 395 240 260 295
Jenis Media LST
LMX
Sampel + Cemaran 240 390 150 390 390 295
Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY
Cemaran
Sampel + Cemaran
Total
LST
Count Sum Average Variance
3.00 880.00 293.33 7,758.33
3.00 780.00 260.00 14,700.00
6.00 1,660.00 276.67 9,316.67
3.00 795.00 265.00 775.00
3.00 1,075.00 358.33 3,008.33
6.00 1,870.00 311.67 4,126.67
6.00 1,675.00 279.17 3,654.17
6.00 1,855.00 309.17 9,984.17
LMX
Count Sum Average Variance Total
Count Sum Average Variance
ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within
SS 3,675.00 2,700.00 12,033.33 52,483.33
Total
70,891.67
df 1.00 1.00 1.00 8.00
MS 3,675.00 2,700.00 12,033.33 6,560.42
F 0.56 0.41 1.83
P-value F crit 0.48 5.32 0.54 5.32 0.21 5.32
11.00
113
Lampiran 11 Perhitungan Anova Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult® Coliform Agar
Jenis Media CCA
Tanggal Cemaran Sampel + Cemaran Inokulasi Rendah Rendah 18 Mei 188 200 03 Juni 175 238 26 Juni 150 175
Anova: Two-Factor Without Replication (CCA - 3 sampling - dua perlakuan) SUMMARY Count Sum Average Variance Row 1 2 387.5 193.75 78.125 Row 2 2 412.5 206.25 1953.125 Row 3 2 325 162.5 312.5
Column 1 Column 2 ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total
3 3
512.5 612.5
SS 2,031.25 1,666.67 677.08
df 2.00 1.00 2.00
4,375.00
5.00
170.8333333 364.58333 204.1666667 989.58333
MS 1,015.63 1,666.67 338.54
F P-value F crit 3.00 0.25 19.00 4.92 0.16 18.51
114
Lampiran 12. Tabel Angka Paling Mungkin Bakteri 100 g (ml) Seri 5 Tabung dengan 10, 1 dan 0.1 g (ml) material uji Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 000 <1.8 100 2 200 4.5 300 7.8 400 13 500 23 001 1.8 101 4 201 6.8 301 11 401 17 501 31 002 3.6 102 6 202 9.1 302 13 402 21 502 43 003 5.4 103 8 203 12 303 16 403 25 503 58 004 7.2 104 10 204 14 304 20 404 30 504 76 005 9 105 12 205 16 305 23 405 36 505 95 010 1.8 110 4 210 6.8 310 11 410 17 510 33 011 3.6 111 6.1 211 9.2 311 14 411 21 511 46 012 5.5 112 8.1 212 12 312 17 412 26 512 64 013 7.3 113 10 213 14 313 20 413 31 513 84 014 9.1 114 12 214 17 314 23 414 36 514 110 015 11 115 14 215 19 315 27 415 42 515 130 020 3.7 120 6.1 220 9.3 320 14 420 22 520 49 021 5.5 121 8.2 221 12 321 17 421 26 521 70 022 7.4 122 10 222 14 322 20 422 32 522 95 023 9.2 123 12 223 17 323 24 423 38 523 120 024 11 124 15 224 19 324 27 424 44 524 150 025 13 125 17 225 22 325 31 425 50 525 180 030 5.6 130 8.3 230 12 330 17 430 27 530 79 031 7.4 131 10 231 14 331 21 431 33 531 110 032 9.3 132 13 232 17 332 24 432 39 532 140 033 11 133 15 233 20 333 28 433 45 533 180 034 13 134 17 234 22 334 31 434 52 534 210 035 15 135 19 235 25 335 35 435 59 535 250 040 7.5 140 11 240 15 340 21 440 34 540 130 041 9.4 141 13 241 17 341 24 441 40 541 170 042 11 142 15 242 20 342 28 442 47 542 220 043 13 143 17 243 23 343 32 443 54 543 280 044 15 144 19 244 25 344 36 444 62 544 350 045 17 145 22 245 28 345 40 445 69 545 440 050 9.4 150 13 250 17 350 25 450 41 550 240 051 11 151 15 251 20 351 29 451 48 551 350 052 13 152 17 252 17 352 32 452 56 552 540 053 15 153 19 253 26 353 37 453 64 553 920 054 17 154 22 254 29 354 41 454 72 554 1600 055 19 155 24 255 32 355 45 455 81 555 >1600
* jumlah tabung positif dengan masing-masing menggunakan 3 volume.
115
117
Lampiranl 13 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Angka Paling Mungkin. No
Metode Pengujian E.coli
Pack
1 LST (Double Strength) 500 g LST (Single Strength) 500 g 2 EC Broth (single strength) 500 g 3 LEVINE EMB Agar 500 g 4 Nutrient Agar (agar miring) 500 g 5 MR-VP Broth Base (MR) 500 g MR-VP Broth Base (VP) 500 g 6 SIMMONS Citrate Agar 500 g 7 Tryptone Water 500 g 8 KOVAC'S indole reagent 100 ml 9 Reagent MR 100 ml 10 Ragent VP 100 ml Total Biaya / test Total Biaya / test (duplo)
1 LMX (Double Strength) 500 g LMX (Single Strength) 500 g 2 KOVAC'S indole reagent 100 ml Total Biaya / test Total Biaya / test (duplo)
Investasi media
906,000 1,076,000 1,686,000 1,221,000 1,105,000 1,799,000 1,556,000 488,000 488,000 488,000 10,813,000
7,631,000 488,000 8,119,000
g/l media
71.2 35.6 37.0 36.0 20.0 17.0 17.0 22.3 15.0
34.0 17.0
Rp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
Metode APM LST (seri 5 tabung) 129 10 1,290 5 65 5 323 10 80 10 796 15 121 15 1,821 15 49 8 391 30 38 5 188 30 38 5 188 30 80 5 401 30 47 5 233 30 4,880 0.25 1,220 30 4,880 0.25 1,220 30 4,880 0.25 1,220 30 285
Metode APM LMX (seri 5 tabung) 519 10 5,189 5 259 5 1,297 10 4,880 0.25 1,220 15 30
Rp/test
6,451 3,225 11,944 27,313 11,722 5,636 5,636 12,035 7,002 36,600 36,600 36,600 200,763 401,526
25,945 12,973 18,300 57,218 114,436
Total hari
Jumlah Tabung
min
max
1
2
1 1 1
2 1 1
1
1
5 10 15 15 30 30 30 30 30
5 10
7 7
195 390
1
2
5 10
1 2
2 2
15 30
Asumsi
semua tabung positif semua tabung positif semua tabung positif 2 koloni terduga/petri gores ke NA miring dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC dikonfirmasi IMVIC
tabung positif tabung positif tabung positif
116
117
Lampiran 14 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian Koliform negatif dengan Metode Angka Paling Mungkin No
Metode Pengujian E.coli
Pack
1 LST (Double Strength) 500 g LST (Single Strength) 500 g Total Biaya / test Total Biaya / test (duplo)
Investasi media
g/l media
Rp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
Rp/test
Metode APM LST (seri 5 tabung) bila koliform negatif 71.2 129 10 1,290 5 6,451 35.6 65 5 323 10 3,225 906,000 15 9,676 19,352 906,000
Total hari min
max
1
2
1 2
2 2
Jumlah Tabung
5 10 15 30
Asumsi
semua tabung negatif semua tabung negatif
Lampiran 15 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Cepat Angka Lempeng Total, dan Presence Absence. No
Metode Pengujian E.coli
Pack
Investasi media
1 Readycult Coliforms 100 20 test 2 KOVAC'S indole reagent 100 ml Total Biaya / test Total Biaya / test (duplo)
821,000 488,000 1,309,000
1 Chromocult Coliform Agar 500 g 2 KOVAC'S indole reagent 100 ml Total Biaya / test Total Biaya / test (duplo)
4,490,000 488,000 4,978,000
g/l media
Rp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
Metode P/A - Readycult Coliform 100 41,050 1 4,880 2 9,760 2 3
26.5
Metode ALT Chromocult Coliform Agar 238 15 3,570 2 4,880 0.02 98 4 6
Rp/test
41,050 19,520 60,570 121,140
7,139 390 7,530 15,059
Total hari min
max
1
2
1 2
2 2
1
2
1 2
2 2
Jumlah Tabung
1
Asumsi
Botol positif Botol positif
1 2
2
duplo 2 koloni terduga
2 4
117
Lampiran 16 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum Menurut Peraturan Menteri Kesehatan 416:1990 No
Parameter
Satuan
Kadar maksimum yang diperbolehkan
1
Koliform Tinja
Jumlah per 100 ml
0
2
Total Koliform
Jumlah per 100 ml
0
Keterangan
95% dari sampel yang diperiksa selama setahun. Kadang-kadang boleh ada 3 per 100 ml sampel air tetapi tidak berturut-turut
Sumber : Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor : 416/MENKES/SK
Lampiran 17 Nilai Pedoman untuk Verifikasi Kualitas Mikrobiologi Air Organisme Semua air yang ditujukan untuk langsung diminum E.coli atau bakteri koliform tahan panas
Air proses yang masuk ke sistim distribusi E.coli atau bakteri koliform tahan panas Bakteri koliform total Air proses didalam ke sistim distribusi E.coli atau bakteri koliform tahan panas Bakteri koliform total
Nilai Pedoman Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample
Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample
Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Dalam hal suplai dalam jumlah besar dimana cukup sampel yang dianalisa, tidak boleh ada dalam 95% sample yang diambil selama tiap periode 12 bulan
Sumber : World Health Organization. 2006. Guidelines for Drinking-Water Quality, 3rd Ed Vol 1 Recommendations WHO, Geneva, 2004
117
Lampiran 18 Skema Pembuatan Air Proses di PT Yummy Food Utama
Sampel diambil dari tanki 3 yang digunakan untuk proses produksi dan pencucian areal produksi
