Přehled stanovení lipofilních vitaminů v potravinách a krmivech Michal Douša, Ecochem a.s., Dolejškova 3, 182 00 Praha, E-mail:
[email protected] Summary The determination of fat-soluble vitamins (not counting vitamin K) in the animal feeds and foods includes several consecutive steps: sample preparation, alkaline hydrolysis of sample, extraction of vitamins from saponified matrix, cleanup of extract and HPLC separation. Vitamins are chemically unstable and its biological activity decreases in the presence of hydro peroxides, air, light, moisture, mineral acids, heavy metals and additional oxidants. All operations with vitamin solutions and vitamin-containing materials should be carried out in subdued light and as far as possible in low actinic amber glassware. All the above-mentioned factors are the reason of high value of interlaboratory standard deviation of determination of fat-soluble vitamins. The samples of animal feeds containing fat-soluble vitamins must be protected from direct sunlight, excessive heat, and too moisture during transport, storing and sample preparation in the laboratory. Distribution of the different forms of vitamins in feeds and foods is not uniform as for size and fortified feed has the tendency to separate or agglomerate during handling. In face of the present facts the sample procedure has to be modified - the size of aggregated sample would be greater than the usual. The analytical method would not miniaturize by using smaller sample weight and volumes. The saponification is routinely used to extract fat-soluble vitamins from feeds. The fatsoluble vitamins are not extracted quantitatively from fortified feed and food with only organic solvent. The coating must be firstly penetrated by treatment with alkali and this is one of the reasons for the use of alkaline hydrolysis in the analysis of feeds and foods. All vitamin esters and hydroxylated xanthophylls are converted to the alcohol (retinol, tocopherol), fats (lipids and phospholipids) are converted to salt of fat acids (soaps) and glycerol and a large number of nature pigments, antioxidants and others substances are converted to water-soluble substances. Soaps can be separated from the fat-soluble vitamins by extraction with organics solvent. Alkali hydrolysis is carried out by ethanolic KOH in presence of antioxidants under reflux in the special hydrolysis apparatus at 70 °C and operating time is 30 minutes. The amount of alcoholic KOH solution required is dependent on the fat content in sample. A rough guide is to use 5 ml of 60 % aqueous KOH and 15 ml of alcohol per 1 g of fat in sample. During hydrolysis is introduced a slow stream of nitrogen into the saponification flask and so is the medium saturated and present vitamins are protected against aerial oxidation during boiling. Vitamin A and vitamin D are 1
stable in presence of alkali and conversely is unstable in presence of acids, which are promoters of its isomerization. ). This problem can be solved by cold saponification (overnight) at ambient temperature. The extraction with organic solvent is one of the larges sources of errors in fat-soluble vitamin analysis and also one of the most costly and laborious steps. The carotenoids, fat-soluble vitamins, sterols, etc., which constitute the unsaponifiable matter, are extractable from the saponification digest by liquid-liquid extraction using water-immiscible organics solvents. The fatty acids (exactly their salts) and glycerol are not extractable under alkaline conditions. Recently, fat-soluble vitamins are extracted with various hydrocarbon organics solvents, e.g. diethylether, petrol ether or hexane. Fat-soluble vitamins are readily extracted by hexane from aqueous ethanol on addition of water. The ethanol-water-soap mixture in the digest tends to behave similarly to a hydrocarbon solvent, decreasing the affinity of the fat-soluble vitamins to the organics phase (distribution constant is too much low). In the case, the addition of water has less effect and the efficiency of extraction with hexane is poor. The advantage of HPLC method is separation of fat-soluble vitamins from the other components of matrix which are extracted to non-polar solvents and therefore it is not necessary the clean up of crude extract. For the separation of fat-soluble vitamins can be used the normal and reverse phase. Advantages of reversed-phase systems to normal-phase chromatography include following: less sensitivity to changes in retention time due to presence of water; more stable to small changes in mobile phase composition; more quickly equilibrated to mobile phase composition changes, permitting use of gradients and capability of resolving compounds with a wide range of polarities. The sequence of separations of vitamins is depended on used stationary phase. The spectrofotometric, fluorimetric or electrochemical detector can be used for the detection of fat-soluble vitamins.
1. Úvod K lipofilním vitaminům se řadíme všechny účinné formy vitaminu A, vitaminu E, vitaminu D a vitaminu K. Fyzikálně chemické vlastnosti těchto vitaminů již byly dostatečně popsány a nejsou předmětem této přednášky. Za zmínku stojí jen jejich charakteristická vlastnost a to je rozpustnost v tucích a nepolárních (hexan, diethylether, chlorované uhlovodíky) a středně polárních rozpouštědlech (alkoholy, acetonitril, tetrahydrofuran). Analýze těchto látek
2
v potravinách a krmivech bylo věnováno stovky publikací ve vědeckých časopisech, přesto není analytika těchto vitaminů vůbec jednoduchá a neexistují zcela jednoznačné postupy stanovení. 2. Metody stanovení Mezi největší úskalí analytiky lipofilních vitaminů patří: a) distribuce vitaminů ve zkušebním vzorku (zejména u vitaminu A); b) přítomnost několika forem vitaminů (vitamerů) a previtaminů ve vzorku (zejména u vitaminu E, u kterých je možná tvorba až 8 polohových isomerů tokoferolů a tokotrienolů); c) nízké obsahy vitaminů ve vzorku (zejména u vitaminu D a K); d) chemická labilita všech těchto vitaminů (citlivé vůči vzdušné oxidaci, fotolabilita, teplota)1,2 a případné ztráty během analýzy (isomerace) a konečně nízká výtěžnost při extrakci těchto vitaminů. Vzhledem k výše uvedenému výčtu se používají v současné době v analytice vitaminů téměř výhradně separační metody, zejména technika HPLC. Proto dále budu diskutovat pouze možné zdroje chyb analytiky lipofilních vitaminů a jejich eliminace na co nejmenší míru. 2.1 Příprava extraktu 2.1.1 Hydrolýza Při analýze vitaminu A,D a E se používá k převedení vitaminů do roztoku výhradně alkalická hydrolýza a to buď za tepla nebo za studena. Alkalickou hydrolýzou dochází k uvolnění vitaminů A z jeho obdukovaných forem, estery všech forem vitaminů jsou přeměněny na alkoholy, tuky (glyceridy a fosfolipidy) jsou hydrolyzovány na volné mastné kyseliny a glycerol, které mohou být separovány od vitaminů extrakcí organickými rozpouštědly.3 Velké množství přítomných přírodních barviv (xanthofilly, karotenoidy) a steroly jsou převáděny na ve vodě rozpustné frakce těchto látek. Na druhé straně však hydrolýzou ztrácíme přehled o přítomnosti původních forem vitaminů a stanoví se pouze suma volných alkoholů. Byly učiněny pokusy o enzymatickou hydrolýzu,
4,5
alkoholýzu6 nebo přímou extrakci,7,8,9 ale tyto postupy
dosahují velmi malé výtěžnosti a nejsou obecně použitelné pro všechny vzorky. K zamezení ztrátám vitaminů během alkalické hydrolýzy se používají antioxidační činidla,10,11 nebo se reakční směs probublává dusíkem nebo kombinací obojího. Alternativou k hydrolýze za tepla je hydrolýza za studena. Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým nebo methanolickým roztokem hydroxidu draselného po dobu 12-16 hodin za nepřístupu světla na rotační třepačce. Výhodou studené hydrolýzy je ta, že nedochází k isomeraci jednotlivých forem vitaminů (vitamin A a D) nebo je potlačena na minimum. Další výhodou je možnost použití větší navážky vzorku a tudíž snížit směrodatnou odchylku stanovení vlivem nehomogenity zkušebního vzorku. 3
Při hydrolýze vitaminu D je nutné řešit problém fotolability vitaminu D a jeho snadné oxidace vzdušným kyslíkem. Konečně je nutno uvést rovněž přechod vitaminu D na příslušný previtamin, kdy dochází k ustavení rovnováhy mezi cholekalciferolem a prekalciferolem3, resp. ergokalciferolem a prekalciferolem2 vlivem isomerace. Isomerace vitaminu D na jeho previtamin je katalyzována zejména zvýšenou teplotou při alkalické hydrolýze.12 Aktuální obsah vitaminu D zůstává konstantní pouze v případě, že rovnováha mezi vitaminem D a prekalciferolem je o
ustálena a je-li teplota menší než 20 C, kdy rychlost isomerace je zanedbatelná. Proto se tento problém řeší studenou alkalickou hydrolýzou po dobu 12 až 16 hodin (přes noc) za laboratorní teploty.13 Vitamin K je velmi nestabilní v alkalickém prostředí a rychle se rozkládá a proto se alkalická hydrolýza při stanovení vitaminu K nepoužívá. Používá se většinou přímé extrakce nepolárními nebo středně polárními rozpouštědly. Výběr rozpouštědla závisí pak výhradně na matrici vzorku. Dobrou alternativou k alkalické hydrolýze je kyselá hydrolýza s následnou enzymatickou hydrolýzou triglyceridů lipásou, která byla při stanovení vitaminu K často aplikována.14,15,16 Nejvíce se používá při stanovení vitaminu K přímá extrakce různými organickými rozpouštědly: petrolether – diethylether (1+1) po předchozí srážení proteinů ethanolem,17 dichlormethan – isooktan (2+1) po předchozím promícháním matrice s koncentrovaným roztokem hydroxidu amonného a methanolem,18 nebo přímá extrakce roztokem chloroform – methanol (2+1)19 nebo chloroform – 2-propanol20 nebo směs 2-propanolu a n-hexanu.21 Nejčastěji používaným rozpouštědlem pro přímou extrakci vitaminu K je nhexan, který byl použit k extrakci vitaminu K z olejů a margarinů.22 V případě zeleniny a obilovin se používá extrakce chloroformem a methanolem,23 acetonem a n-hexanem.24 Ke zvýšení polarity n-hexanu byl dále použit methanol, 2-propanol, aceton nebo ethanol.25,26 2.1.2 Extrakce a přečištění extraktu Vitaminy jsou extrahovány ze zmýdelněných vzorků různými rozpouštědly, ale nejčastěji diethyletherem, petroletherem nebo uhlovodíky jako n-hexan. Extrakce vitaminů je jeden z nejdražších, nejpracnějších kroků a zdrojem největších chyb při analýzách lipofilních vitaminů. Ačkoli technika extrakce měla dlouhou historii, bylo vypracováno několik průkazných modelů k hledání optimálních poměrů při extrakci. Jako organická rozpouštědla se používají diethylether,27 petrolether,28 n-hexan, diisopropylether - petrolether,29 10 % octan ethylnatý v nhexanu.30
4
Z extrakčních pokusů vyplývá, že retinol je snadno extrahován do n-hexanu z vodnoethanolického roztoku s přídavky vody. V případě přítomnosti tuku dochází k hydrolýze tuku na soli mastných kyselin (mýdla) a pak směs voda-ethanol-mýdlo se chová jako uhlovodíkové rozpouštědlo a konkuruje tak organickému rozpouštědlu, dochází ke snížení výtěžku extrakce. Snižování obsahu ethanolu přídavkem vody do extrakčního prostředí není již tak účinné. Účinnost extrakce n-hexanem, zkoušena na modelových extrakčních podmínkách, je ovlivněna koncentrací mastných kyselin v hydrolyzátu, jejich obsah proto musí být kontrolován. Neúspěch v analýze vitaminů je tedy limitován obsahem mastných kyselin (obsahu tuku ve vzorku) a koncentrací ethanolu v hydrolyzátu pře vlastní extrakcí.31 Vliv obsahu tuku v hydrolyzátu na výtěžek extrakce vitaminu A je ukázán na obrázku č.1 (cit.32). Abychom dosáhly vysokých výtěžků vitaminu A a vitaminu E ze zmýdelněné matrice do organického rozpouštědla, je nutné dodržet přesně koncentraci ethanolu ve vodné fázi mezi 30 a 40 % (cit.33). Pro vitamin D je optimální koncentrace ethanolu okolo 50 %, výtěžek extrakce pro vitamin K není příliš závislý na objemovém zlomku ethanolu. Závislost výtěžku extrakce vitaminu A, D, K a Edo n-hexanu na objemovém zlomku ethanolu v extrakční směsi je ukázána na obrázku č. 2, 3, 4 a 5. Za přítomnosti mýdel protřepáváním organické a vodno-ethanolické fáze dochází ke vzniku emulzí, zejména za absence alkoholu a pak jsou promývací kroky složité,34 tvorba emulze se pak
Výtěžnost, %
potlačuje přídavkem neutrálních solí do reakčního prostředí (chlorid sodný).
0,85 0,75 0,65 0,55 0,45 0,05
0,25
0,45
0,65
0,85
1,05
1,25
obsah tuku v extraktu, g Obrázek č. 1 Závislost výtěžku extrakce retinolu na obsahu tuku v extrakčním prostředí do hexanu (pro dvě koncentrační hladiny retinolu; - 2 800 m.j./l, { - 7 300 m.j./l )
5
Výtěžnost, %
1
0,8
0,6
0,4
0,2 0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
ϕ, ethanol
Obrázek č. 2 Závislost výtěžku extrakce retinolu na objemovém zlomku ϕ ethanolu v extrakčním prostředí do hexanu (pro tři koncentrační hladiny vitaminu A; - 2 800 m.j./l, { 7 300 m.j./l, - 15 000 m.j./l)
Výtěžnost, %
1,00
0,90
0,80
0,70 0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
ϕ, ΕtΟΗ
Obrázek č. 3 Závislost výtěžku extrakce ergocalciferolu (0,5 mg/l) na objemovém zlomku ϕ ethanolu v extrakčním prostředí do hexanu. 6
Výtěžnost, %
1,05
1,00
0,95 0
0,1
0,2
0,3 ϕ, EtOH
Obrázek č. 4 Závislost výtěžku extrakce vitaminu K1 (4,8 mg/l) na objemovém zlomku ϕ ethanolu v extrakčním prostředí do hexanu. Hrubý extrakt vitaminů K nemůže být použit k přímé analýze na HPLC protože obsahy vitaminů jsou mnohonásobně nižší než obsahy přítomných lipofilních sloučenin v extraktu. Proto se musí zařadit přečištění extraktu. Byly popsány metody SPE, semipreparativní HPLC35 a enzymatická hydrolýza triglyceridů lipásou, 36,37,38 přičemž je za tento krok možné zařadit ještě jednu z předcházejících technik přečištění. Při SPE39 i semipreparativní technice se většinou využívá kombinace normální a reverzní fáze, čímž je zaručeno dokonalé odstranění lipidů.
Výtěžnost, R
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
ϕ, ethanolu
Obrázek č. 5 Závislost výtěžku extrakce α-tokoferolu na objemovém zlomku ϕ ethanolu v extrakčním prostředí do hexanu (pro dvě koncentrační hladiny α-tokoferolu; - 10,5 mg/l, U- 22,2 mg/l) 7
2.1.3 Analytická koncovka stanovení 2.1.3.1 Vitamin A K separaci vitamerů A se může použít jak separace na normální fázi tak separace na reverzní fázi. Separace na normální fázi, nejčastěji silikagelu, umožňuje separaci až šesti cis- trans isomerů vitaminu A (11,13-di-cis-, 13-cis-, 11-cis-, 9,13-di-cis, 9-cis a all-trans-retinolu).40 Jako mobilní fáze se používá nepolární rozpouštědlo, nejčastěji n-hexan nebo cyklohexan, s přídavkem polárního solventu (2-propanol, ethanol). Separace isomerů vitaminu A na silikagelu za použití mobilní fáze n-hexanu byla již optimalizována a k modifikaci mobilní fáze byly použity methylenchlorid, isopropylether a chloroform.41 Silikagel jako sorbent neadsorbuje příliš silně glyceridy a mastné kyseliny a kolona může být po každé analýze promyta 25 % octanem ethylnatým v n-hexanu.42 Problém deaktivace silikagelu, adsorpcí polárních látek z extraktu, se může úspěšně vyřešit předřazením předkolony se stejnou náplní jako má analytická kolona. Při separaci na reverzní fázi se používá jako stacionární fáze nejčastěji oktadecyl (C18) a různě modifikované mobilní fáze methanol/voda nebo acetonitril/voda. Separace na reverzní fázi má určitá omezení - nedochází k separaci cis-trans - isomerů vitaminu A a stanoví se suma obsahu obou isomerů. Různé metody stanovení používají pouze různé rozměry analytických kolon a modifikované mobilní fáze.43,44,45 K detekci retinolu mohou být použity všechny tři typy detekce v HPLC - spektrofotometrický, fluorescenční a elektrochemický detektor. Při spektrofotometrické detekci je absorpční maximum retinolu a jeho esterů 325 nm a mez detekce se pohybuje kolem 2 ng.46 Většina lipidů mám maximum absorpce pod 220 nm, konjugované mastné kyseliny mají maximum absorpce 230-235 nm (dieny) a 260-280 nm (trieny).47 Glyceridy a steroly mají maximum absorpce při 265-266 nm, ale jejich absorpční koeficienty jsou poměrně nízké. Fluorescenční excitační spektra retinolu a jeho esterů korespondují s absorpčními spektry a maximum se pohybuje mezi 324-328 nm; emisní maximum se pohybuje od 470 do 490 nm48 a detekční limit je 0,5 ng. Elektrochemická amperometrická detekce retinolu je méně selektivní než detekce spektrofotometrická, detekční limity jsou srovnatelné.49 2.1.3.2 Vitamin E K separaci vitaminů se může použít jak separace na normální fázi tak separace na reverzní fázi. Separace tokoferolů na reverzní fázi je limitována separací β a γ tokoferolů, kdy nedochází k jejich separaci. Při separaci na normální fázi může být separováno až 9 tokoferolů a 8
tokotrienolů v isokratickém módu n-hexan – tetrahydrofuran (99,5+0,5),50,51 n-hexan – diethylether (95+5)27 nebo n-hexan – 1,4-dioxan (97+3).52 Za běžných podmínek separace na normální fázi je pořadí separace následující: α-tokoferol, α-tokotrienol, β-tokoferol, γ-tokoferol,
β-tokotrienol, γ-tokotrienol, δ-tokoferol a δ-tokotrienol. Na reverzní fázi se separují tokoferoly v pořadí: δ-tokotrienol, (γ+β)-tokotrienol, αtokotrienol, δ-tokoferol, (γ+β)-tokoferol a α-tokoferol. Je zřejmé, že na reverzní fázi nedochází k separaci γ- a β- tokoferolu a γ- a β- tokotrienolu. Separace těchto kritických tokoferolů a tokotrienolů bylo pak dosaženo na polymerní koloně.53 Absorpční maxima tokoferolů se pohybují od 292 do 298 nm a detekční limity se pohybují od 50 do 130 ng.54 Fluorescenční detekce je ve srovnání se spektrofotometrickou detekcí citlivější a detekční limity jsou o jeden řád nižší.27 Excitační a emisní maximum volného alkoholu tokoferolu je 295 nm respektive 330 nm.55 Fluorescenční výtěžky analogů tokoferolů silně závisí na použitém solventu a polární solventy (methanol, acetonitril, diethylether) poskytují vyšší fluorescenční výtěžky ve srovnání s n-hexanem. Fluorescenční odezvy příslušných tokotrienolů jsou velmi podobné a ke kalibraci nejsou potřebné standardy a vyhodnocení se provádí na příslušné tokoferoly. V případě použití chlorovaných uhlovodíků je pak fluorescence zanedbatelná.56 Fluorescenční výtěžky esterů analogů tokoferolů jsou velmi nízké a α-tokoferolacetát vykazuje 0,5 % hodnotu ve srovnání s α-tokoferolem. Tokoferol acetát vykazuje excitační a emisní maxima 285 nm resp. 310 nm. Elektrochemická detekce tokoferolu je 20 krát citlivější než fluorimetrická detekce,57 ale nemůže být použita k detekci esterů tokoferolu z důvodu absence hydroxylové skupiny. Tokoferoly jsou oxidovatelné na uhlíkové elektrodě při potenciálu + 0,7 V (proti Ag/AgCl referenční elektrodě) a to v obou módech v reverzním módu přímo, v normálním módu po přídavku soli do mobilní fáze nebo postkolonovém přídavku elektrolytu do mobilní fáze, nejčastěji 0,1 M chlorečnanu sodného v solventu ethanol – methanol.58 2.1.3.3 Vitamin D Stanovení vitaminu D představuje komplikovaný chromatografický problém, jehož podstata spočívá ve velmi nízkém obsahu tohoto vitaminu v potravinách a krmivech. Druhý problém stanovení vitaminu D v krmivech je nutnost separace vitaminu D od přítomných sterolů, karotenoidů, vitaminů a dalších přítomných látek, které jsou ve značném přebytku. Proto se používají různé předseparační techniky - srážení sterolů digitoninem,59 adsorpční kolonová chromatografie na oxidu hlinitém,60 technika SPE na silikagelu61 nebo reverzní fázi.28
9
Vlivem alkalické hydrolýzy dochází k isomeraci vitaminu D. Při separaci vitaminu D na normální i reverzní fázi dochází k separaci obou previtaminů od svých vitaminů,62 ale na normální fázi nedochází k separaci vitaminu D2 a vitaminu D3. Pořadí separace previtaminů, vitaminů a provitaminů D na reverzní fázi C18 je následující: previtamin D2, vitamin D2, previtamin D3, vitamin D2, provitamin D2, provitamin D3.63 K vyřešení tohoto problému bylo navrženo přidávat aditiva (dusičnan stříbrný) do mobilní fáze64 nebo jednoduše separovat oba vitaminy na reverzní fázi. Přestože dochází k separaci vitaminu a previtaminu D, celkový obsah vitaminu D nelze určit pouhým součtem obou obsahu vitaminu a previtaminu. Někteří autoři se pokoušeli exaktně popsat isomeraci vitaminu D na previtamin za podmínek teplé alkalické hydrolýzy a došli k závěru, že poměr previtaminu a vitaminu D zůstává konstantní za konstantních podmínek hydrolýzy, ale tento poměr se mění vlivem matrice a musí se zavádět určité korekční faktory.65 Tento problém se obchází isomerací previtaminu D a vitaminu D na isotachysterol, který se pak separuje jako jediný pík příslušného vitaminu. Isomerace vitaminu D se provádí chloridem antimonitým.66 Zvýšení účinnosti isomerace se dosáhne o
použitím nasyceného roztoku chlorovodíku v butanolu při teplotě 5 C.67 Isotachysterol je pak kvantifikován při vlnové délce 301 nm, což je výhodnější, protože ve většině případech odpadají spektrální interference na analytické koloně. Absorpční maximum isotachysterolu je 288 nm, ale přesto se volí vlnová délka detekce 301 nm právě kvůli již výš uvedeným spektrálním interferencím. Poměr hodnot absorbancí při 288 nm a 301 nm je 1,3, což se může s výhodou použít ke kontrole čistoty píku. Separace isotachysterolu vitaminu D2 a isotachysterolu D3 probíhá na koloně s reverzní fází C18 (4,6 x 25 cm, 5 µm) s mobilní fází acetonitril – methanol (90+10). Všechny výše uvedené problémy při analýze vitaminu D se řeší použitím off-line multidimensionální HPLC metody, kdy se použije semipreparativní kolona s normální fází k frakcionaci vitaminu D. Frakce vitaminu D je podrobena dalšímu přečištění na silikagelu a následně po odpaření k suchu, rozpuštění v příslušném rozpouštědle, separaci a kvantifikaci na reverzní fázi.68 Off-line multidimensionální HPLC metody stanovení vitaminu D v různých matricích byly modifikovány mnoha autory.33,69,70,71,72,73 Chromatogram separace vitaminu D3 v premixech doplňkových látek je ukázán na obrázku č. 6.
10
Obrázek č. 6 Semipreparace vitaminu D2 a D3 na koloně Semiprep Silica 300x7,8 mm, mobilní fáze 1,5 % 2-propanolu v cyklohexanu. Analytická kolona - NovaPak C18 250x4,6 mm, mobilní fáze acetonitril–methanol (50+50). Vzorek premixu, obsah vitaminu D3 125 000 m.j./kg, vitamin D2 použit jako vnitřní standard. 2.1.3.4 Vitamin K K separaci vitaminu K se používá jak normální tak reverzní fáze. Na normální fázi dochází k separaci cis- a trans-phylloquinonu od příslušných menaquinonů (MK-4 až MK-10), ale nedochází k separaci jednotlivých menaquinonů.74,75 K separaci isomerů cis- a transphylloquinonu na silikagelu se musí zvolit poněkud odlišná mobilní fáze – isooktan – dichlormethan - 2-propanol (70+30+0,02).18 Vzhledem k silné retenci vitaminu K na reverzní fázi se musí používat jako mobilní fáze samotná organická rozpouštědla (methanol nebo acetonitril) nebo tato rozpouštědla s přídavkem dichlormethanu: methanol-dichlormethan (80+20),76,77 nebo methanol – dichlormethan (90+10).36,38 V případě elektrochemické detekce se musí zvýšit vodivost mobilní fáze přídavkem vody nebo pufru: methanol – 2,5 mM octanový pufr (99+1).78 UV detekce je použitelná při stanovení vitaminu K pouze v případě fortifikovaných matric vitaminem K při 248 nm nebo 270 nm, protože molární absorpční koeficient vitaminů K je nízký. Mez detekce se pohybuje pouze okolo 1 ng v nástřiku. 11
S úspěchem může být použita elektrochemická detekce, která je selektivnější proti UV detekci a rovněž mez stanovitelnosti je daleko nižší. První aplikace využívali redukce chinonu na hydrochinon, ale tento systém je velmi citlivý k přítomnému kyslíku v mobilní fázi.21 Tento problém byl vyřešen zavedením tzv. duálního elektrodového systému. Na první elektrodě je chinon redukován na hydrochinon a tento hydrochinon je bezprostředně oxidován na chinon na druhé elektrodě a měří se výsledný proud. Hlavní výhodou tohoto systému je, že eliminuje vliv přítomného kyslíku v systému. Zvýšení citlivosti detekce se dosahuje zařazením guard cely za chromatografické čerpadlo, čímž dochází k odstranění kovových iontů jejich oxidací.79 Mez detekce se pohybuje okolo 50 pg v nástřiku. Mobilní fáze musí obsahovat určité množství vody nebo alkoholu ke zvýšení vodivosti mobilní fáze jako elektrolytu,16 nebo neutrální soli: acetonitril – dichlormethan – 25mM NaClO4 (95+5+5). Jako pracovní elektroda k detekci byla použita argentchloridová elektroda při pracovním potenciálu - 1,1 V (proti SKE). Pro velmi nízké hladiny vitaminu K byla použita velmi selektivní fluorimetrická detekce hydronaphtochinonu po předchozí redukci chinonu. K redukci vitaminu K se používají tři způsoby redukce – chemická redukce,80 redukce elektrochemická81,82 nebo fotochemická redukce.83 Elektrochemická redukce se uskutečňuje zařazením elektrochemického detektoru jako postkolonový reaktor. Na fluorescenční výtěžky má malý vliv průtok mobilní fáze a koncentrace elektrolytu v mobilní fázi, naopak složení mobilní fáze ovlivňuje selektivitu i citlivost detekce. Mez detekce se pohybuje pod 25 pg v nástřiku. Tento způsob redukce není příliš reprodukovatelný z důvodu pasivace elektrody v systému.84 Fotochemická degradace vitamerů K je založena na ozáření silným světlem, přičemž jedním z reakčních produktů je hydrochinon. Publikované hodnoty meze detekce jsou 150 pg vitaminu K v nástřiku.85 3. Závěr Při stanovení lipofilních vitaminů můžeme identifikovat systematické pozitivní i negativní chyby, které je možno generalizovat bez ohledu na použitou analytickou koncovku.86 Pozitivní chyby jsou spojené většinou s použitými standardy a to nízkou výtěžností při extrakci standardu do příslušného rozpouštědla (zejména vitamin A a vitamin E) a použití degradovaného standardu vitaminu (vitaminy K). Z těchto důvodů je nutné kontrolovat vždy kalibrační roztoky vitaminů, nejlépe spektrofotometricky na základě molárních absorpčních koeficientů vitaminů % nebo A11cm .
Obsahy komerčně dodávaných standardů vitaminu A se pohybují od 50 % do 140 % rel. vzhledem k jejich aproximovaným hodnotám. Proto se přesná koncentrace roztoku standardu 12
vitaminu A musí stanovit po jeho zmýdelnění a extrakci do organického rozpouštědla spektrofotometricky s maximem mezi 324 nm až 327 nm. Koncentrace retinolu cA v m.j./g se vypočítá podle vzorce:
c A = 10 7 .
A.V .R % 0,3. A11cm .m
Pro výpočet koncentrace tokoforelu cE platí obdobná rovnice:
c E = 10 3.
A.V .R % A11cm .m
kde A absorbance roztoku retinolu resp. tokoferolu, V je objem extraktu v organickém % rozpouštědle v l, m je navážka příslušného standardu v g. Hodnoty A11cm jsou tabelovány a
závisí na použitém rozpouštědle. Obdobně je možné postupovat pro ostatní vitaminy. K negativním chybám přispívá zejména: úprava vzorku mletím, drcením nebo nedokonalou homogenizací, ztráty při alkalické hydrolýze (isomerace, rozklad), nízká výtěžnost při extrakci vitaminů kapalina-kapalina a rozklad vitaminů při dalších operacích – odpařování k suchu, rozpouštění. Tabulka č. 1 Přehled stanovení vitaminu A a vitaminu E Analyt
Matrice
HPLC kolona
Mobilní fáze
Detekce
Citace
Retinol palmitát
mléko
LiChrosorb Si-60
hexan-diethylether, (98+2)
UV 325 nm
42
celkový vitamin A
potraviny
µBondapak C18
methanol-voda, (90+10); 1 ml/min
UV 325 nm
87
celkový vitamin A
potraviny, krmiva
µBondapak C18
acetonitril-methanol-octan ethylnatý, (88+10+2); 1 ml/min
UV 313 nm
88
celkový vitamin A
margarín, máslo
Vydac 201 TP C18
acetonitril-voda, (65+35); 1 ml/min
UV 328 nm
89
celkový vitamin A
krmiva
hexan-chloroform, (3+2); 1 ml/min
FLD 330/470 nm (exc./em.)
90
celkový vitamin A
krmiva
methanol-voda, (98+2); 1 ml/min
UV 325 nm
91
celkový vitamin A
margarin
LiChrosorb Si-60
hexan-dioxan, (92+8)
FLD 330/480 nm (exc./em.)
92
Palmitát a acetát retinolu
sušené mléko
µPorasil
hexan-CH2Cl3, (92+8)
UV 313 nm nebo
8
FLD 340/450 nm (exc./em.)
13
Tabulka č. 1 Přehled stanovení vitaminu A a vitaminu E - pokračování
retinol, tokoferol
krmiva pro hlodavce
LC-CN
hexan – 2-PrOH – octová kyselina (99+1+0,02)
UV 325/292 nm
93
α-TA
krmiva
Nucleosil C18
methanol – voda (96+4)
FLD 290/330 nm (ex./em.)
94
α-,β-,γ-,δtokoferol,
potraviny
LiChrosorb Si-60
0,2 % 2-PrOH nebo 5 % diethylether v 50 % hexanu nasyceném vodou
FLD 290/330 nm (ex./em.)
95
α-,β-,γ-,δtokoferol
krmiva
Si-60
n-hexan s přídavkem 0,08
UV 250/284 nm
96
α-,γ-,δtokoferol, α-TA
krmivo pro ryby
Hypersil ODS
methanol – voda (96+4)
UV 292 nm
97
celkový αtokoferol
krmiva
LiChrosorb Si-60
0,1 % 2-PrOH v hexanu
FLD 296/326 nm (ex./em.)
98
α-,β-,γ-,δtokoferol, α-,β-,γtokotrieno l
rýžové otruby
Supelcosil LC-Si
isooktan-octan ethylnatýkyselina octová-2,2dimethoxypropan, (98,15+0,9+0,85+0,1)
FLD 290/330 nm (ex./em.)
99
α-,(β +γ),δtokoferol
potraviny
Zorbax ODS
methanol-dichlormethan obsahující 0,001 % triethylaminu-methanol, (700+300+50)
FLD 290/330 nm (ex./em.)
100
α-,β-,γtokotrieno l
% 2-propanolu
FLD 280290/330-335 nm (IS α-tokol)
Poznámka: IS – interní standard, TA – tokoferol acetát
Tabulka č. 2 Přehled stanovení vitaminu D a vitaminu K Analyt Vitamin D 2 , D3
Matrice Krmivo Premixy
Semipreparativní HPLC převedení na isotachysterol 10M HCl v butanolu (5 oC)
Analytická HPLC SupelcoSil LC-18, 5µm, 25x0,46 cm; acetonitril-methanol (90+10); UV 301 nm
Citace
Vitamin D3, pre-D3
Krmivo pro ryby
101
Vitamin D3
mléko
Vitamin D2 nebo D3
margarin, tuky a oleje
Radial-Pak cartridge - Resolve Silica hexan-2-PrOH, (99+1); UV 265 nm LiChrosorb Si-60 7µm, 25x0,46 cm; hexan-2-PrOH-tetrahydrofuran, (98+1+1); UV 264 nm
dvě kolony v sérii: HC ODS/PAH; 25x0,46 cm LC-18, 5µm; 15x0,46 cm; acetonitril-methanol-voda (74+18+8) Radial-Pak cartridge - Resolve C18 methanol-tetrahydrofuran-voda, (93+2+5); UV 265 nm ChromSphere C18 acetonitril-CHCl3-methanol, (91+6+3); UV 264 nm
67
102
73
14
Tabulka č. 2 Přehled stanovení vitaminu D a vitaminu K - pokračování Vitamin D3
margarin, olej, mléko
Vitamin D3
dětská výživa
Vitamin D2 nebo D3
dětská výživa
Vitamin D2 nebo D3
sušené odtučněné mléko
Partisil PAC; CH2Cl2; UV 254 nm
K3
premixy a krmiva
premixy a krmiva
K3
Polygosil 60 5µm, 30x0,8 cm; isooktan-chloroformtetrahydrofuran - isobutanol, (94+3+2+1); UV 254 nm Polygosil 60 5µm, 25x0,8 cm; isooktan-isobutanol, (99+1); UV 265 nm
Vydac 201 TP54 C18 acetonitril-methanol-CHCl3, (82+12+6); UV 264 nm Hypersil ODS (dvě kolony zapojené v sérii) methanol; UV 265 nm Radial-Pak cartridge - Resolve C18 (dvě kolony zapojené v sérii) methanol-tetrahydrofuran-voda, (92+2+6); UV 254 a 280 nm (dual) LiChrosorb-NH2 CH2Cl2-hexan-2-PrOH, (50+50+0,2); UV 264 nm LiChrosorb Si 60 5 µm, 250x3,2 mm
103
104
61
105 106
THF-hexan (5+95) nebo chloroform - hexan (4+96); UV 251 nm ODS-Hypersil 5 µm , 250x4,6 mm
107
Ethanol-voda (6+4) FL: Ex.:325, Em.: 425 nm po postkolonové redukci borohydridem sodným
K3
K3
premixy a krmiva
premixy a krmiva
LiChrosorb Si 60 5 µm, 250x4,0 mm
108
CH2Cl2 (1,8 ml/min); UV 251 nm Supelcosil LC-18, 5 µm, 250x4,0 mm
109
methanol - voda (75+25) FL Ex.:325, Em.: 425 nm po postkolonové redukci
K1, K2, K3
K3
premixy a krmiva
krmivo pro krysy
LiChrosorb Si 60 5 µm, 250x4,0 mm
110
hexan - CH2Cl2 (1,0 ml/min); UV 264 nm µBondapak C18 10 µm, 150x3,9 mm
111
acetonitril - 25 mM NaClO4 (90+10); ECD, Ag -0,75 V (SKE)
Phylloquin on
sojový olej
Phylloquin on
potraviny
Supelcosil LC-18
15
methanol-acetonitril-voda, (88110+2); UV 270 nm Partisil-5-Silica
Spherisorb-5 C8
50 % voda saturovaná CH2Cl2/hexan, (15+85); UV 254 nm
methanol+50 mM octanový pufr pH 3,0 (97+3) obsahující 0,1 mM EDTA;
112
coulometrická detekce (redoxní mód), porézní grafitová elektroda, - 1,5 V
Vysvětlivky: A - po převedení vitaminu D na isotachysterol
Literatura
1
Steuerle H.: Z. Lebensmittel- Unters.u.-Forsch. 181, 400, (1985).
15
2
Dann W.J.: Biochem.J. 26, 666 (1932).
3
Coley M.L.:J. Agric. 37, 742 (1954).
4
Bui M.H.: J.Assoc.Off. Anal.Chem. 70, 802 (1987).
5
Barnett S.A., Frick L.W., Baine H.M.: Anal. Chem. 52, 610 (1980).
6
Glass R.L.: Lipids 6, 919 (1971).
7
Desai I.D.: Vitamin E. A Comprehensive Treatise (L.J. Machlin ed.), strana 67, Marcel Dekker, New York 1980.
8
Woollard D.C., Woollard G.A.: N.Z.J. Dairy Sci. Technol. 16, 99 (1981).
9
Blott A. D., Woollard D. C.: J. Micronutr. Anal. 2, 259 (1986).
10
DeVries J.W., Egberg D.C., Heroff J.C.: Liquid Chromatographic Analysis of Food and Beverages, strana 477 , Vol.2 (G.Charalambous, edice.) Academic Press, New York (1979).
11
VDLUFA (Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten), kapitola 13.1.2., Methodenbuch Band III, 2.Erg. 1988.
12
Hanewald K.H., Mulder F.J., Keuning K.J.: J. Pharm. Sci. 57, 1308 (1968).
13
Thompson J.N., Maxwell W.B., Abbe M.L.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 60, 998 (1977).
14
Bueno M.P., Villalobos M.C.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 66, 1063 (1983).
15
Zonta F., Stancher B.: J. Chromatogr. 329, 257 (1985).
16
Isshiki H., Suzuki Y., Yonekubo A., Hasegawa H., Yamamoto Y.: J. Dairy Sci. 71, 627 (1988).
17
Manes J.D., Fluckiger H.B., Schneider D.L.: J. Agric. Food Chem. 20, 1130 (1972).
18
Hwang S.-M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 684 (1985).
19
Haroon Y., Shearer M.J., Rahim S., Gunn W.G., McEnery G., Barkhan P.: J. Nutr. 112, 1105 (1982).
20
Landen W.O., Eitenmiller R.R., Soliman A.M.: J. Food Comp. Anal. 2, 140 (1989).
21
Canfield L.M., Hopkinson J.M.: J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 8, 430 (1989).
22
Ferland G.: Nutr. Rev. 56, 223 (1998).
23
Jakob E., Elmadfa I.: Food Chem. 56, 87 (1996).
24
Gijsbers B.L.M.G., Jie K.-S. G., Vermeer C.: Br. J. Nutr. 76, 223 (1996).
25
Schurgers L.J., Geleijnse J.M., Grobbee D.E., Pols H.A.P., Hofman A., Witteman J.C.M., Vermeer C.: Journal of Nutritional and Environmental Medicine 9, 115 (1999).
26
Udagawa M., Nakazoe J.-I., Murai T.: Comp. Biochem. Physiol. 106B, 297 (1993).
27
Thompson J.N., Hatina G.: J.Liquid Chromatogr. 2, 237 (1979).
28
Reynolds S.L., Judd H.J.: Analyst 109, 489 (1984).
29
Indyk H.E.: Analyst 113, 1217 (1988).
30
Ueda T., Igarashi O.: J. Micronut. Anal. 3, 185 (1987).
31
Thompson J.N.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 69, 728 (1986).
32
Nepublikované výsledky autora.
33
Thompson J.N., Hatina G., Maxwell W.B., Duval S.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, 624 (1982).
34
Mulder F.J.: Recl.Trav. Chim. Pays Bas 73, 626 (1954).
35
Haroon Y., Shearer M.J., Rahim S., Gunn W.G., McEnery G., Barkhan P.: J. Nutr. 112, 1105 (1982).
36
Cook K.K., Mitchell G.V., Grundel E., Rader J.I.: Food Chem. 67, 79 (1999).
37
Indyk H.E., Woollard D.C.: Analyst. 122, 465 (1997).
38
Indyk H.E., Woollard D.C.: J. AOAC Int. 83, 121 (2000).
39
Davidson K.W., Booth S.L., Dolinokowski G.G., Sadowski J.A.: J. Agric. Food Chem. 44, 980 (1996).
16
40
Stancher B., Zonta F.: J. Chromatogr. 287, 353 (1984).
41
Landers G.M., Olson J.A.: J. Chromatogr. 291, 51 (1984).
42
Thompson J.N., Hatina G., Maxwell W.B.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63, 894 (1980).
43
Santoro M.I.R.M, Magalhaes J.F., Hackmann E.R.M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, 619 (1982).
44
Rueckemann H.: Z. Lebensm.-Unters. -Forsch. 173, 113 (1981).
45
Faugere J. G.: Ann. Falsif. Expert. Chim. Toxicol. 79, 293 (1986).
46
Bhat P.V., Sunderesan P.R.: CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 20, 197 (1988).
47
Gunstone F.D., Norris F.A.: Lipids in Foods. Chemistry, Biochemistry and Technology, Pergamon Press, Oxford 1983.
48
Collins C.A., Chow C.K.: J. Chromatogr. 317, 349 (1984).
49
MacCrehan W.A., Schönberger E.: Clin. Chem. 33, 1585 (1987).
50
Cavins J.F., Inglett G.E.: Cereal Chem. 51, 605 (1974).
51
Taylor P., Barnes P.: Chem. Ind. 20, 722 (1981).
52
Anal. Methods-Comm. Analyst. 116, 421 (1991).
53
Strohschein S., Pursch M., Lubda D., Albert K.: Anal. Chem. 70, 13 (1998).
54
Abe K., Yuguchi Y., Katsui G.: J. Nutr. Sci. Vitaminol 21, 183 (1975).
55
Duggan D.E., Bowman R.L., Brodie B.B., Udenfriend S.: Archs Biochem. Biophys. 68, 1 (1957).
56
Thompson J.N., Erdody P., Maxwell W.B.: Anal. Biochem. 50, 267 (1972).
57
Ueda T., Igarashi O.: J. Micronut. Anal. 1, 31 (1985).
58
Hiroshima O., Ikenoya S., Ohmae M., Kawabe K.: Chem. Pharm. Bull. 29, 451 (1981).
59
Muniz J.F. , Wehr C.T., Wehr H.M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 65, 791 (1982).
60
Wickroski A.F., McLean L.A.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67, 62 (1984).
61
Indyk H., Woollard D.C.: J. Micronut. Anal. 1, 121 (1985).
62
DeVries J.W., Zeeman J., Esser R.J.E., Borsje B., Mulder F.J.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 62, 129 (1989).
63
Zonta F., Stancher B., Bielawny J.: J. Chromatogr. 246, 105 (1982).
64
Tscherne R.J., Capitano G.: J. Chromatogr. 136, 337 (1977).
65
Vanhaelen-Fastre R., Vanhaelen M.: Steroid Analysis by HPLC. Recent Aplications, Marcel Dekker, New York 1981.
66
Agarwal V.K.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 71, 19 (1988).
67
Agarwal V.K.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 75, 812 (1992).
68
Takeuchi A., Okano T., Tsugama N., Katayama M., Mimura Y., Kobayashi T.: Micronut. Anal. 4, 193 (1988).
69
Takeuchi A., Okano T., Teraoka S, Murakami Y., Kobayashi T.: J. Nutr. Sci. Vitaminol 30, 11 (1984).
70
Okano T., Takeuchi A., Kobayashi T.: J. Nutr. Sci. Vitaminol 27, 539 (1981) .
71
Sertl D.C., Molitor B.E.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 177 (1985).
72
van Niekerk P.J., Smit S.C.C.: J. Amer. Oil. Chem. Soc. 57, 417 (1980).
73
Rychener M., Walter P.: Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 76, 112 (1985).
74
Haroon Y., Shearer M.J., Barkhan P.: J. Chromatogr. 200, 293 (1980).
75
Haroon Y., Shearer M.J., Barkhan P.: J. Chromatogr. 206, 333 (1981).
76
Ferland G., Sadowski J.A.: J. Agric. Food. Chem. 40, 1869 (1992).
77
Ferland G., Sadowski J.A.: J. Agric. Food. Chem. 40,1874 (1992).
78
Zamarreno M.M.D., Perez A.S., Perez M.C.G., Moro M.A.F., Mendez J.H.: Analyst. 120, 2489 (1995).
79
Hart J.P., Shearer M.J., McCarthy P.T.: Analyst. 110, 1181 (1985).
17
80
Haroon Y., Bacon D.S., Sadowski J.A.: J. Chromatogr. 384, 383 (1987).
81
Langenberg J.P., Tjaden U.R.: J. Chromatogr. 305, 61 (1984).
82
Haroon Y., Schubert C.A.W., Hauschka P.V.: J. Chromatogr. Sci. 22, 89 (1984).
83
Indyk H.: J. Micronutr. Anal. 4, 61 (1988).
84
Moussa F., Dufour L., Didry J.R., Aymard P.: Clin. Chem. 35, 874 (1989).
85
Lefevere M.F., Frei R.W., Scholten A.H.M.T., Brinkman U.A.Th.: Chromatographia. 15, 459 (1982).
86
Thiex N., Smallidge R., Beine R.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 79, 1269 (1996).
87
Brubacher G., Müller-Mulot W., Southgate A.T.: Methods for Determination of Vitamins in Food, Elsevier, Londýn, Velká Británie 1985.
88
Tee E.-S., Lim C.-L.: Food Chem. 45, 289 (1992).
89
Egberg D.C., Heroff J.C., Potter R.H.: J. Agric. Food Chem. 25, 1127 (1977).
90
Thorpe V. A.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 73, 463 (1990).
91
VDLUFA (Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs und Forschungsanstalten), kapitola 13.1.2., Methodenbuch Band III, 2.Erg. 1988.
92
van Niekerk P.J., Smit S.C.C.: J. Amer. Oil. Chem. Soc. 57, 417 (1980).
93
Rushing L. G., Cooper W. M., Thompson H. C.: J. Agric. Food Chem. 39, 296 (1991).
94
Ruperez F. J., Barbas C., Castro M., Herrera E.: J. Chromatogr. 839, 93 (1999).
95
Thompson J.N., Hatina G.: J.Liquid Chromatogr. 2, 237 (1979).
96
Blott A. D., Woollard D. C.: J. Micronutr. Anal. 2, 259 (1986).
97
Huo J.Z., Nelis H.J., Lavens P., Sorgeloos P., De Leenheer A.P.: J. Chromatogr. B 724, 249 (1999).
98
Manz U., Philipp K.: Int. J. Vitam. Nutr.Res. 51, 342 (1981).
99
Shin T.-S., Godber J.S.: J. Am. Oil Chem. Soc. 70, 1289 (1993).
100
Hogarty C.J., Ang C., Eitenmiller R.R.: J. Food Comp. Anal. 2, 200 (1989).
101
Scott K.C., Latshaw J.D.: Anim. Feed. Sci. Tech. 47, 99 (1994).
102
Kurmann A., Indyk H.: Food Chem. 50, 75 (1994).
103
Johnsson H., Halén B., Hessel H., Nyman A., Thorzell K.: Int. J. Vitam. Nutr. Res. 59, 262 (1989).
104
Konings E.J.M.: Neth. Milk. Dairy J. 48, 31 (1994).
105
Cohen H., Wakeford B.: J.Assoc.Off.Anal.Chem. 63, 1163 (1980).
106
Manz U., Maurer R.: Int. J. Vit. Nutr. Res. 52, 248 (1982).
107
Speek A.J., Schrijver J., Schreurs W.H.P.: J. Chromatogr. 301, 441 (1984).
108
Laffi R., Marchetti S., Marchetti M.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 826 (1988).
109
Billedeau S.M.: J. Chromatogr. 472, 371 (1989).
110
White S.: Anal. Proc. 30, 266 (1993).
111
Schneiderman M.A., Sharma A.K., Locke D.C.: J. Chromatogr. Sci. 26, 458 (1988).
112
Shearer M.J., v knize Encyclopaedia of Food Science, Food Technology and Nutrition, Vol. 7, Academic Press, Londýn, Velká Británie 1993.
18
