Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére Tuboly Eszter Sebészeti Műtéttani Intézet
Az alternatívák szükségessége • Élő modellek kiváltása – – – –
Társadalmi megítélés, az igény egyre nő Szervezeti fellépések Törvényi szabályozás Költségek, ellenőrzés
• 2013. 03.11-étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését – SEURAT-1 (50 millió €)
• In vitro modellek előnyei – – – –
Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség Sokszor szükségesek a publikáláshoz Időmegtakarítás, elemszám
• Hátrányok – – – –
Nem feltétlenül költséghatékonyabb Nem igazán életszerű Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma) Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem alkalmas
A 3 R: Russell and Burch
• Replacement • Reduction • Refinement
A helyettesítés egyre hatékonyabb
Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére
• Csak kémiai komponensek • Szöveti homogenizátum, izolált organellum • Ex vivo kísérletek • Sejt-és szövetkultúrák • Mesterségesen növesztett szövetek, szervek • Invazív beavatkozás helyett kezelés
• Biokémiai tesztek • Immunkémiai technikák (bakteriális toxinok azonosítására) • Szerv, szövet vagy sejtkultúrák (biokémiai kutatások céljára) • Mikroorganizmusok (karcinogén ill. mutagén anyagok tesztelésére) • Magasabbrendű növények • Néhány metazoa parazita • Komputer szimulációs modellek
Sejttenyésztés • • • • • • • • • •
1907 óta létező technika ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás – Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin Társaságok, sejt-és szövetbankok Izolált-és mai napig fenntartott sejtvonalak (HeLa) Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése (gyógyszergyártás) Gén-és biotechnológia alappillére (klónozás) Rákkutatás (nanotechnológia) Őssejt-és génterápia (etikai kérdések) Szintetikus biológia (mesterséges szervek, programozott sejtek) Virológia (vakcinák készítése)
Vizsgálati lehetőségek • Az adott sejt életfolyamatainak nyomonkövetése (sejtanalízis) • sejt-sejt kölcsönhatások, a sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok) • a sejtek különböző kémiai anyagokra adott válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés) • különböző sejteredetű fehérje termékek előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára • Sejttenyészetek eredete: • szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")
Sejttenyészetek típusai Primer tenyészetek:
Sejtvonalak:
• • •
embrionális ill. felnőtt szövetből korlátozott ideig tarthatók fenn élettartamuk véges (hetek, néhány hónap)
•
•
előnyük: –
•
a sejtek nem tekinthetők módosított ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri.
hátrányuk: – –
a kultúrák korlátozott élettartama minden egyes preparátum kicsit eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk.
• • • •
abnormális, gyakran transzformált sejtek homogén sejtpopuláció élettartamuk korlátlan Leggyakrabban rákkutatási célok Könnyebb velük dolgozni, már nem kell izolálni
Ami nélkül nem megy… • Laminaris fülke • HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális – A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik – veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas
• Vertikális – A levegő felülről lefelé áramlik – veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a legalkalmasabb
• CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom) • Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp
• Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés) • Steril öltözet • UV-védelem • Speciális tenyésztőedények • Saját eszközök • Vízfürdő, hűtőszekrény • 70%-os alkohol • Dezinficiens
• Speciális tápfolyadék (médium) • Ionikus homeosztázis • Vitaminok, kofaktorok, fémek • Fehérjék, lipidek • Energia • Szérum • Bakteriocid-fungicid koktél
• A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk: • Kollagen (kötőszöveti fehérje) • Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék) • Laminin (heteromer glycoprotein) • Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos polimer) • Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) • A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz adott szuplementumok: • Foetal bovine vagy calf serum • Növekedési faktorok • Insulin
Alkalmas sejttípusok • Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek • Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam • Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek • Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek • Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek • Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)
Sejtkultúra megválasztása • Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus, sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt • Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok • neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg hibridómák, transzformált sejtek • Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés üteme különböző • A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)
• Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter) • Mosás, szűrés • Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban • Sejtszámolás időről-időre (ePetri) • Minden típus esetén szükséges a rendszer kititrálása • Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra • Passzálás • Viabilitási-tesztek • Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)
A sejttenyésztő rémálma… Befertőződés • Kémiai anyagok által (lejárt médium) • Biológiai ágensek: baktériumok, gomba (mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk) • Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus aktivitást jelez a pH változása • Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és mikrobiológiai vizsgálatot kérni • Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket • Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol • Félévente speciális takarítás ajánlott
Őssejtek tulajdonságai • • •
•
•
képesek folyamatosan osztódni differenciálódás nélkül stabil, diploid kromoszómakészletük van külső hatásokra differenciálódhatnak és képesek transzdifferenciálódni is, ez azt jelenti, hogy például a vérképző őssejtek képesek más ekto vagy endodermális sejttípussá alakulni, vagyis akár pluripotens is lehet telomeráz enzim megakadályozza a rövidülést – képes megnyújtani a kromoszómák végét: ennek az enzimnek az aktivitás az őssejtekben az idővel csökken, és az osztódással is majdnem halhatatlanok – az oxidatív folyamatok, genomiális DNS halmozódó mutációi, helyreállító mechanizmusok károsodása miatt ők is „öregszenek”
Honnan kaphatunk őssejteket? In vitro megtermékenyítés után fel nem használt embriók – akár totipotens Elvetélt magzatokból – ivarmirigyekből Szövetekből – korlátozott differenciálódási képességűek • vérképző őssejtek - csontvelőben találhatóak, felszíni markereik alapján megtalálhatóak és izolálhatóak • mezenchima őssejtek-köldökzsinór – Egyházi engedély
• • • •
idegi őssejtek - az agykamrákat bélelő hámrétegben található izom őssejteket - valószínűleg az izomrostokhoz szorosan kötődő ún. kísérő (szatellita) sejtek között Alig jelölődnek meg Hoechst 33342-es nevű fluoreszcens festékkel Áramlási citométer segítségével izolálhatóak
Szövettenyésztés • Sejtek szövetekként történő növesztése egy speciális vázon (scaffold) • Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját • Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt terápia • Fontos az immunrendszer válaszának minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek • Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk) • Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)
Scaffold • Hálózatos polymer, különböző anyagokból készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid) • Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni • Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját • Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet • Megengedi a sejtek migrációját
Egy ideális scaffold… • • • • • • • • • •
3D Keresztkötéseket tartalmaz Pórusokat tartalmaz Biológiailag lebontható Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a felszínén Bírja a mechanikai terhelést Biokompatibilis Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat Hozzáférhető Nagyüzemben gyártható
Leggyakoribb típusok • Polymerek – Kollagén – Laminin – Fibrin – Decellularized matrix (szív)
• Kristályos anyagok – Hydroxyapatite – Kálcium-foszfát – Bioglass
Elkopott porcok helyettesítése
– Porcsejtek – Kollagén váz – Nem igényel kiterjedt érhálózatot
Csontnövesztés • Őssejtek csontsejtekké történő differenciálódásával – A parancs növekedési faktor függő
• Nem szabad túl nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént
3D Calcium- scaffold
Bőrnövesztés • Kollagén-kitozán, vagy hialuronsav scaffold • Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg • Égési sérülteknél siker
Cukorbetegek ß-sejtjeinek pótlása In vivo Islet of Langerhans in pancreas
Mesterséges véredények • By-pass műtéteknél használatos
http://popularmechanics.com/popmec h/sci/tech/9805TUMDOM.html
Szív regenerációja • Szívizomsejt, véredények • Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes • Természetes scaffold (decellularized matrix) • Sokféle sejttípus, bonyolult terület
Lehetőségek májbetegeknek
Bioprinting • Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem) • Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele • Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket, több rétegben, körben is (3D) • 2 nyomtatófejet használ: sejtek nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása • Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít • Véredények by-pass műtétekhez • Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása, bőrpótlás, mint rutin kezelés
Skingun
In vitro meat
Köszönöm szépen!!!
