Nové p ístupy v detekci DNA a protein
DNA je makromolekula ú astnící se klí ových biologických proces Její poškození má za následek: — mutace a aberace — rakovinu — metabolické poruchy — které vrozené vady — neurodegenerativní onemocn ní — predispozice k civiliza ním chorobám
Mohou elektrochemické metody p isp t ke studiu protein a nukleových kyselin?
Originální polarograf J. Heyrovského a M. Shikaty (1924)
Prof. Jaroslav Heyrovský
Obrovský rozmach elektrochemických metod nejen ve studiu anorganických a organických látek, ale také v elektrochemické analýze biomakromolekul, p edevším nukleových kyselin a protein .
Nobelova cena za objev polarografie (1959)
Pro elektrochemické metody? — nízká cena — rychlé zpracování — jednoduchá obsluha — malé nároky na energii — edpoklady pro miniaturizaci
Pevné elektrody (uhlíkové a kovové): — uhlíkové — CPE (carbon paste electrode - pastová uhlíková elektroda) – vyrobená ze sm si práškového grafitu (70%) a minerálního oleje (30%) + event. další p ím si — GCE (glassy carbon electrode) –skelný uhlík — PGE (pyrolytic graphit electrode) — SPE (screen printed electrode) — kovové — Au, Ag, Cu — elektrody s modifikovaným povrchem - rtu ový film, lipidová membrána) — amalgámové elektrody – k m ení se využívá amalgámu kovu se rtutí; Ag, Cu
Rtu ové elektrody: — DME (dropping mercury electrode) – polarografie • výhoda: velmi jemný povrch, který je snadno definovatelný, nukleová kyselina je adsorbovaná p i velkém potenciálovém rozsahu, • nevýhoda: velké nároky na objem analytu (1 – 2 ml) — HMDE (hanging mercury drop electrode) – voltametrie Celý experiment probíhá na jedné kapce, možnost akumulace na elektrod a použití transferových metod
Detekce nukleových kyselin
Strategie detekce hybridizace DNA — Jednopovrchová strategie – hybridiza ní a detek ní krok probíhají na stejném (elektrodovém) povrchu — Dvoupovrchová strategie – oba kroky odd leny — možnost nezávisle optimalizovat jednotlivé kroky — snadná separace analytu od složek reak ní sm si — snadná adaptovatelnost pro jednotlivé analytické ely
cells
complementary NA strand
specific antibody
biotinylated ss ODN
antigen (protein)
antibody biotinylated duplex ODN
streptavidin
protein G protein A
DNA- binding protein Co
oligo(dT)n
cobalt chelate
specific antibody
His-tagged protein N
Co N
NA strand with (A)n stretch
N
N
electrode
Elektrochemická detekce tripletových opakování v DNA
Další aplikace v v elektrochemické detekci DNA — Detekce poškození DNA — Hybridizace DNA — Stanovení koncentrace DNA — Konforma ní zm ny DNA — Vývoj DNA biosenzor
Detekce protein Oxida ní signály
Katalytické signály
Oxida ní signály tyrosinu a tryptofanu Streptavidin (1 mg/mL)
Brdi kova reakce
Peak H
Alpha-synuclein (40 mg/mL)
Metalothionein (100 ng/mL)
A140C mutant
-0.8
190
electrolyte
-0.7
0,6
0,7
0,8
140
dt/dE (s/V)
Y
1 mA
A140C mutant
-0.6
Výška píku (µA)
Signál proteinu
W
Co
-0.5
-0.4
90
-0.3
0,9
-0.2
Potenciál (V)
40
-0.1
0 -0.68
-10 -0.88
-1.08
Potenciál (V)
-1.28
-1.48
-1,70
-1,75
Potenciál (V)
-1,80
Alpha-synuclein je 14 kDa protein, který je ve velké mí e exprimován v r zných ástech
mozku, a který se ú astní patofyziologie n kterých neurodegenerativních onemocn ní. P i t chto onemocn ních postupn zanikají n které populace nervových bun k, což je spojeno s velmi vážnými psychickými a neurologickými p íznaky. Projevují se ztrátou pam ti a rozumových schopností, poruchami chování, asto i halucinacemi, bludy a celkovým úpadkem osobnosti. Neurologické projevy se týkají p edevším správné koordinace a ízení pohybu a e i. B
Substantia nigra Transverzální ez st edním mozkem, kde je dob e viditelná substantia nigra
Zúžená substantia nigra, jak ji m žeme vid t u Parkinsonovy choroby
V nativní form je alpha – synuclein nestrukturovaný (angl. unfolded) a svou fibrilární strukturu získává teprve až agregací.
E
Amfipatická oblast
Centrální doména
Kyselá oblast
Agregace alpha-synucleinu Abnormální protein (Agregát)
Normální protein (Monomer)
A
Protofibrily
Póry
Jak? Neurodegenerace a onemocn ní
B
Amyloidní fibrily
Faktory, které urychlují agregaci alpha-synucleinu: P ítomnost mutací - A30P, A53T a E46K mutované proteiny vytvá í fibrilární struktury rychleji než wt protein. Zkrácené „verze protein “ (truncation) - zkrácený alpha-synuclein, který obsahuje pouze 120 resp. 108 aminokyselin je mnohem více náchyln jší k tvorb filament in vitro než celý (full-length) protein. Koncentrace proteinu. Interakce s ionty, p ípadn s jinými látkami. P ídavek malého množství agregátu alpha-synucleinu k nativní form tohoto proteinu.
CD spektroskopie
Atomová silová mikroskopie A
15
3 týdny agregovaný alphaalpha-synuclein
10
[θ] (103 deg cm2 dmol-1)
5
0
-5
B
-10 -15
Nativní Nativní alphaalpha-synuclein
-20 -25 195
205
215
225
235
Vlnová délka (nm)
245
255
Uhlíková elektroda
Rtu ová elektroda 2000
150 nM AS
1800
250 nM AS
190
1600
Výška píku (nA)
dt/dE (s/V)
1400 1200 1000 800 600 400
140
90
40
200 0 -200 -1.76
-1.73
-1.7
-10 0.65
0.7
0.75
0.8
Potenciál (V)
£ r
Nativní alpha-synuclein (bez agregace) 24 hodin agregovaný alpha-synuclein 80 hodin agregovaný alpha-synuclein
0.85
0.9
0.95
1
[θ] (103 deg cm2 dmol-1)
B
0.8
1950
0.6 Výška píku
Normalizovaná fluorescence
A
0.4
0h 48 h
24 h 72 h
1450
20
0h 3 týdny
10 0 -10 -20 -30 195
950
C
215 235 Vlnová délka (nm)
450 -50 -1.76
-1.74
-1.72
-1.7
-1.68
Potenciál (V)
0.2
0
-0.2 0
50
100
150
as (h)
200
250
255
Protein MutS je termostabilní molekula jejíž velikost se pohybuje kolem 90 kDa. Je sou ástí tzv. MMR systému (systém oprav chybného párování bází) a hraje velmi významnou úlohu v repara ním systému DNA u prokaryotických i eukaryotických bun k, kde rozpoznává nespárované nebo nesprávn párované báze v dvoušroubovici DNA.
Homology proteinu MutS m žeme nalézt tém ve všech organismech. Eukaryotické genomy obsahují n kolikanásobné mutS homologní (msh) geny a s výjimkou mitochondriálního proteinu MSH1, tvo í všechny ostatní eukaryotické proteiny MutS heterodimery. Systém opravy chybného párování bází u savc je v mnoha ohledech stejný jako u bakterií.
Protein MutS m že být využit pro detekci bodových mutací in vitro
Hybridizace
A
B
K emu je dobrá elektrochemie? MAGNET
Perfect duplex 1. 5´bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG – 3´ 2. 3´ -AAA CTC CAC GCA CAA ACA CGG ACA GGA CCC – 5´ GT mismatch 1. 5´bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG – 3´ 2. 3´ -AAA CTC CAC GTA CAA ACA CGG ACA GGA CCC – 5´
GT mismatch s inserce jednoho thyminu 1. 5´bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG – 3´ 2. 3´ -AAA CTC CAC GTA CAA ACA CGG ACA GGA CCC – 5´ T Inserce jednoho thyminu 1. 5´bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG – 3´ 2. 3´ -AAA CTC CAC GCA CAA ACA CGG ACAGGA CCC – 5´ T
CPE
HMDE
Srovnání r zných typ duplex (1) Samotné STV-kuli ky
(2) Perfect duplex
(3) T insert
(4) GT mismatch
Výška píku (%)
(5) GT mismatch + T insert (vedle sebe) (6) GT mismatch + T insert (vzdálený) 0
20
40
60
80
100
