Nieuwe ontwikkeling voor het bepalen van de biodiversiteit en ecologische kwaliteit.
Marco Jaspers Holger Cremer Timme Donders Frank Schuren
Noodzaak: Europese Kaderrichtlijn Water Monitoring, onderhoud en verbetering van de ecologische kwaliteit van oppervlaktewateren verplicht Behoefte aan een krachtig en betrouwbaar instrument
Gebaseerd op de samenstelling van indicator organismen
2
Doel van het Hydrochip project Ontwikkeling van een op DNA gebaseerd meetsysteem waarmee snel de samenstelling van de diatomeeën populatie kan worden vastgesteld om op die manier de ecologische kwaliteit te kunnen vaststellen.
3
Detectie van Waterorganismen via DNA Markergen (b.v. toxine, 16S)
DNA
EXTRACTIE GENERIEKE PCR
MASS SEQUENCING
ENKELSTRENGS MAKEN
HYBRIDISATIE (BINDING) Mass Sequencing: Generiek Inzicht in Populatie
Chip
DNA Chip: - Generiek - Inzicht in Populatie
Voorbeeld van een research chip
Frank Schuren
Op zoek naar Markers: Open approach
Onbevooroordeeld , niet gebaseerd op bestaande kennis. Focus op biodiversiteit en nieuwe markers
Monsters geselecteerd op basis van diversiteit DNA isolatie gevolgd door mass sequencing 18s analysis for eukaryotes 16s analysis for prokaryotes
DNA targets Eukaryoten (waaronder diatomeeën en meeste algen): 18s rRNA gen: aanwezig in alle eukaryoten, sterk geconserveerd, veel gebruikt voor taxonomie
Prokaryoten (bacteriën): 16s rRNA gen: aanwezig in alle bacteriën, sterk geconserveerd, veel gebruikt voor taxonomie, interessant voor blauwalgen
Frank Schuren
Flora analysis by 454 pyrosequencing Characteristics Next generation sequencing technique 105-106 individual sequence runs in 10 hours! Short sequence tags: 16s rDNA hypervariable regions
Advantages: Provides very good view on composition complex flora Probes based on relevant sequence data
8
Frank Schuren
Sampling diverse locations
Frank Schuren
Biodiversity at phylum level 2414 09 837 55 6 4 3027 01 33733 52312 9 36 85472 1 4193 0 162 192 262 789
901
1299 8406
1514
Bacillario p h y ta(1 0 0 ) To tal
D ik ary a(1 0 0 ) To tal
D in o p h y ceae(1 0 0 ) To tal
Ch ry s o p h y ceae(1 0 0 ) To tal
O o m y cetes (1 0 0 ) To tal
P X _clad e(9 9 ) To tal
Cry p to m o n ad ales (1 0 0 ) To tal
G lo m ero m y co ta(1 0 0 ) To tal
Rap h id o p h y ceae(1 0 0 ) To tal
S y n u ro p h y ceae(1 0 0 ) To tal
Eu s tigm ato p h y ceae(1 0 0 ) To tal
Ch ry s o p h y ceae(9 6 ) To tal
Cn id aria(1 0 0 ) To tal
D ik ary a(9 8 ) To tal
P in gu io p h y ceae(9 8 ) To tal
Ch ry s o p h y ceae(9 5 ) To tal
D ik ary a(9 7 ) To tal
P o rifera(1 0 0 ) To tal
P X _clad e(1 0 0 ) To tal
Cilio p h o ra(1 0 0 ) To tal
P o rifera(8 7 ) To tal
Rap h id o p h y ceae(9 3 ) To tal
S y n u ro p h y ceae(9 6 ) To tal
G lo m ero m y co ta(9 5 ) To tal
A p ico m p lexa(1 0 0 ) To tal
G lo m ero m y co ta(9 3 ) To tal
P erk in s ea(1 0 0 ) To tal
Ch ry s o p h y ceae(8 9 ) To tal
P o rifera(6 3 ) To tal
P o rifera(8 8 ) To tal
Ch ry s o p h y ceae(8 6 ) To tal
Rap h id o p h y ceae(7 2 ) To tal
A rth ro p o d a(1 0 0 ) To tal
Cilio p h o ra(8 4 ) To tal
Bacillario p h y ta(6 1 ) To tal
P erk in s ea(8 0 ) To tal
S trep to p h y ta(1 0 0 ) To tal
S y n u ro p h y ceae(6 1 ) To tal
Eu s tigm ato p h y ceae(7 5 ) To tal
S y n u ro p h y ceae(7 5 ) To tal
Frank Schuren
Most abundant diatom sequences Organism blast x
Watertype M31 Waterlocatie HC-DEK-
M08 HC-ETE-
R06 HC-GAL-
M12 HC-GER-
R04 HC-HEI-
M01 M27 HC-TEW- HC-TPN-
M27 HC-TPZ-
M27 HC-TPZ-
M07b HC-VEC-
x x Grand Total Synedra ulna Total Gomphonema affine Total Cocconeis pediculus Total Stephanodiscus hantzschii Total Cyclotella meneghiniana Total Cyclotella cf. scaldensis G1W11 Total Navicula radiosa Total uncultured eukaryote Total Peridinium foliaceum endosymbiont Total Nitzschia thermalis Total Thalassiosira pseudonana Total Achnanthidium minutissimum Total Thalassiosira guillardii Total Encyonema minutum Total Synedra acus Total Nitzschia palea Total Cyclotella sp. CCMP331 Total uncultured diatom Total Navicula cryptocephala Total Planothidium lanceolatum Total Cymatopleura elliptica Total Eunotia implicata Total Nitzschia sigma Total
1_A4_HC- 1_A6_HC- 1_A9_HC- 1_A11_HC 1_B4_HC- 1_C2_HC- 1_C6_HC- 1_C8_HC- 1_C9_HC- 1_C10_HC sample ID DEK-01.4 ETE-01.1 GAL-02.4 -GER-01.1 HEI-01.1 TEW-02.6 TPN-02.4 TPZ-02.4 TPZ-03.4 -VEC-03.4 clusterseqs o4391 o4392 o4393 o4394 o4396 o4397 o4398 o4399 o4400 o4401 15683 240 324 361 32 454 588 645 64 92 1373 4068 7 2 2 9 402 44 16 3 0 2 2112 3 253 35 0 8 6 13 5 0 22 1435 0 0 15 0 0 0 4 0 0 1274 1389 0 18 2 0 0 13 0 0 6 0 1276 0 12 0 3 4 1 0 3 0 0 1042 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 924 0 0 2 4 0 337 515 27 34 3 535 3 1 60 5 0 2 4 0 5 6 298 0 0 0 0 0 49 0 0 14 2 223 177 0 0 0 0 0 0 0 0 0 222 12 1 1 0 0 1 0 0 0 0 166 0 0 6 0 0 3 38 0 5 3 137 0 0 2 0 0 0 0 3 4 1 123 7 0 0 0 0 2 0 0 0 0 123 0 0 0 0 2 14 0 0 3 2 100 0 8 0 0 0 4 0 0 4 0 92 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 83 0 0 26 0 5 3 11 0 0 21 77 0 0 1 1 2 7 0 0 3 0 73 0 0 55 1 0 0 0 0 0 0 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0
Frank Schuren
Samenvatting Open Approach • Biodiversiteit kan door sequencing in kaart worden gebracht • Vooral op phylum niveau • Geen makkelijke link naar soorten • Heel veel nieuwe sequenties: hoe hier mee om te gaan?
• De technologie is relatief duur en arbeidsintensief: nog geen routine
Frank Schuren
Searching for Markers: Closed approach To be able to compare results from molecular and microscopical analyses linking both datasets is essential
For most indicator organisms currently no reliable DNA sequences available in databases!
Unfortunately collecting living diatoms is not a standard approach as it is for many other living organisms.
Therefore alternative approaches have been evaluated (culturing, single-cell analysis)
Frank Schuren
Attempts into experimental hydrobiology Culturing diatoms is not trivial Little expertise available, nearly no publications/books Expertise not present in NL, but is present in Gent
Collaboration started with Wim Vijvermans and Pieter van Ormelingen, UGent technician TNO visited Gent for few days
After some initial problems culturing started to work
Frank Schuren
Experiences culturing diatoms Culturing diatoms is feasible Protocols are available for certain well-studied genera Growth is slow In our experience obtaining a diverse collection of species is
very difficult: some species are encountered all the time, whereas many others get easily lost Considering the amount of time and effort in relation to the outcome we decided to quit this path
Frank Schuren
Micromanipulator for single-cell analysis
Frank Schuren
Some examples
Frank Schuren
Approach used
• Pick single diatoms with micromanipulator • Put cell in eppendorf cup and perform PCR amplification of specific gene fragment • Perform a second nested PCR reaction to obtain sufficient material for sequencing • Sequence analysis through Sanger sequencing • Collect diatom from samples • Embed single diatom • Perform species determination through microscopy • Link DNA-sequence to species name
Frank Schuren
Results single-cell analysis • • • • • • • • •
The good news is: it worked! The bad news is: it is very laborious and success rate is low Complex protocol with failures at each step: Capillary size/diatom size Getting diatom out of capillary into eppendorf cup Obtaining PCR product Retrieving diatoms Orientation embedded diatoms Ability to determinate single valves
• In total 600 DNA –sequences were determined!
Frank Schuren
Wish list Herman van Dam: 150 most abundant species in NL Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
%monster s 67,33 64,11 70,95 46,92 35,39 37,55 50,73 38,07 42,39 38,07 8,91 32,92 24,60 27,28 23,39 19,17 29,85 20,09 10,05 34,71
gemiddelde abundantie (%) 15,25 9,73 4,84 2,62 2,62 2,18 1,81 1,78 1,64 1,56 1,48 1,41 1,17 1,14 1,14 0,95 0,93 0,88 0,88 0,86
cumulatieve abundantie (%) 15,25 24,98 29,81 32,44 35,06 37,24 39,05 40,83 42,47 44,03 45,51 46,92 48,09 49,23 50,36 51,32 52,25 53,13 54,01 54,87
Taxon Achnanthidium minutissimum Cocconeis placentula s.l. Gomphonema parvulum Rhoicosphenia abbreviata Eunotia bilunaris Nitzschia paleacea Nitzschia palea Gomphonema olivaceum Navicula gregaria Eolimna minima Eunotia exigua [1] Amphora pediculus Melosira varians Nitzschia frustulum Diatoma tenuis Fragilaria famelica Tabularia tabulata-groep Fragilaria capucina s.l. Tabellaria flocculosa Navicula cryptotenella
zout zoet zeer licht brak zoet zeer licht brak zeer zoet zoet zoet zoet zeer licht brak zoet zeer zoet zoet zoet zeer licht brak zeer licht brak zeer licht brak licht brak zoet zeer zoet zoet
Frank Schuren
Hydrochip analyses • In 2010 and 2011 several hundreds of samples were analyzed by microscopy and Hydrochip analysis • Because of differences in species coverage direct comparison of results was not yet possible • Molecular analysis shows species not detected by microscopy and vice versa • To enable comparison of data we turned to an ecological parameter comparison: trophy calculation
Frank Schuren
Comparison results after translation to eutrophy level phytoplankton
phytobenthos
Frank Schuren
Current situation Translation of data to ecological parameters works reasonably well (except for oligotrophic samples for which indicator species sequences are lacking) Current research chip is translated to routine chip containing about 150 reliable probes
Implementation of technology will be part of new EU-Life project which most likely will start later this year
In this project we want to make the translation from prototype to implementation (Vitens)
Van Diatomee naar Ecologische Kwaliteit Sample preparation
DNA Isolatie
PCR, DNA labelling Binding op chip
Trofiegraad
Vertaalslag Data Analyse 24
HYDROCHIP
Frank Schuren
Toekomst: Opschaling naar verschillende type indicatororganismen mogelijk
Naast diatomeeën Waterplanten Macro evertebraten Blauwalgen
Meerdere indicatoren geven mogelijk een gedetailleerder beeld van de ecologische kwaliteit
Verdere toekomst: Lab on a Chip Automatisering en miniaturisering van: - monstervoorbewerking - DNA isolatie en labelling - DNA binding op chip en detectie - Analyse en interpretatie
Mogelijkheid tot online monitoring van waterkwaliteit
Voordelen Hydrochip in de toekomst: Objectiever want gestandaardiseerde en op termijn geautomatiseerde methode Analyse van groot aantal relevante organismen in ecosysteem
Snel resultaat: dus snel sturing op basis van analyse resultaten mogelijk Intensievere analyses mogelijk (meer tijdstippen,
meer locaties etc) Goedkoper dan huidige analyses
Partners: STOWA: Bas vd Wal, Tessa vd Wijngaart TNO: Frank Schuren, Holger Cremer, Timme Donders, Jordy Coolen, Jolanda Kool, Heleen Koolmees, Marco Jaspers Vitens: Bendert de Graaf, Mark Kiestra, Adrie Atsma, Wouter v Delft Hoogheemraadschap Hollands Noorderkwartier Gert van Ee Waternet Ron vd Oost 29
30
31
Van researchchip naar eerste praktijkchip
32
DNA bindingspatroon (Legionella chip)
33
Toekomst: Opschaling in aantal samples mogelijk
Frank Schuren
Comparison current and new approach
Workflow Samples
array development
array development and analysis
DNA isolation
DNA isolation sample analysis
array development
Microbial flora analysis by 454 sequencing
Automated selection microarray probes
multi-well chip printing microtiter format DNA isolation and labeling
multi-well hybridization scan results for data interpretation
Data analysis and interpretation 37
analysis
38
6,0
Habitat type hydrochip
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0 0,0
1,0
2,0 3,0 4,0 Habitat type microscopy
5,0
6,0
Frank Schuren
Additional results for free: Cyanobacteria
Frank Schuren
Cyanobacteria abundance during the season
