Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)
Kromatográfiás módszerek osztályba sorolása
2
Elúciós technika • A mintabevitel ún. dugószerűen történik • A mozgófázis a kromatogram kifejlesztése alatt folyamatosan áramlik az állófázis fölött • A mozgófázis szorpciója kisebb mértékű, mint a legkevésbé kötődő mintakomponensé
3
Az elválasztás alapegyenlete
𝑁 𝛼−1 𝑘 𝑅𝑠 = ∗ ∗ 4 𝛼 𝑘+1
4
Az elválasztás alapegyenlete I. α 𝑁 𝛼−1 𝑘 𝑅𝑠 = ∗ ∗ 4 𝛼 𝑘+1 𝐿 𝑁= > 1000 𝐻 𝛼>1 1 < 𝑘 < 10
𝐶𝑚
𝐶𝑠1 𝑘1 = 𝐶𝑚1 𝐶𝑠2 𝑘2 = 𝐶𝑚2
𝛼=
𝑘2 𝑘1
𝐶𝑠 5
Van-Deemter egyenlet
𝐵 𝐻 =𝐴+ +𝐶∗𝑢 𝑢
𝐶 = 𝐶𝑚 + 𝐶𝑠
6
A Van Deemter egyenlet jelentése I.
Töltet sűrűsége szemcseátmérő Töltet homogenitása szűk szemcseátmérő eloszlás
7
A Van Deemter egyenlet jelentése II.
8
A Van Deemter egyenlet jelentése III. CM: mozgófázisból az állófázis felé történő anyagátadás ellenállása
CS: az állófázisból a mozgófázis felé történő anyagátadás ellenállása 9
10
11
• Mozgófázissal szemben támasztott követelmények – – – – – –
Az oldószer polaritása a módszernek megfelelő Kis viszkozitás Megfelelő UV-fény áteresztés Megfelelő tisztaságú Nem toxikus Nem túl illékony
• Állófázissal szemben támasztott követelmények – – – – –
Kémiailag ellenálló Nyomástűrő Kis szemcseátmérő, kis szemcseátmérő eloszlás Energetikailag homogén felület Mikropórusmentes 12
A készülék részei I. 1
1
3
4
2
1: Nagynyomású szivattyú 2: Injektor 3: Kolonna 4: Detektor
2 : http://trends.directindustry.com/perkinelmer-inc/project-14711-131045.html
13
A készülék részei II. – Nagynyomású szivattyú
14
A készülék részei II. – Mintaadagoló
Rotor forgatás 60°
15
A készülék részei III. – Kolonna
16
A készülék részei IV. – Detektor/1. UV detektor
Alkalmazás: kettős kötés, delokalizált elektronrsz.
17
A készülék részei IV. – Detektor/2. PDA detektor
18
A készülék részei IV. – Detektor/3. PDA detektor
19
A készülék részei IV. – Detektor/4. Fluoreszcens detektor
Alkalmazás: konjugált elektronrsz. többgyűrűs aromás vegyületek
20
A készülék részei IV. – Detektor/5. • Elektrokémiai detektor • Vezetőképesség mérésén alapuló detektorok • Törésmutató különbség mérésén alapuló detektor (RI)
21
A készülék részei IV. – Detektor/6. HPLC-MS
LC
IF
IA
ID
Nagy vákuum (10-4 Pa)
IF: ionforrás IA: ionanalizátor ID: iondetektor
Pl. ESI – electrospray ionizáció GC
IF
IA
ID
Nagy vákuum (10-4 Pa)
22
Folyadékkromatografálhatóság feltételei • Oldani tudjuk a mozgófázisban a vegyületet vagy vegyületeket • Oldás közben ne történjen kémiai átalakulás • Az oldhatóság mértéke megfeleljen a detektálás megszabta követelményeknek
23
Folyadékkromatográfiás módok Hőmérséklet alapján:
Nyomás alapján: Nyomásesés:
HPLC Max.400bar
Mozgófázis áramlási 0,01-10ml/min sebesség: Kolonna hossza: 10-25cm
UHPLC 1000-1200bar 0,01-2ml/min 3-10cm
Kolonna belső átmérője:
4,6 mm vagy a felett
Szemcseátmérő:
3-10µm
Detektor cella térfogata:
10µl
0,5-1,5µl
10-20Hz
60-100Hz
Detektor adatfelvételi sebessége:
HTLC
2,1 mm 3µm alatt
• 60°C feletti termosztálási hőmérséklet • Nagy T kis η kisebb Δp • Kolonnahossz: 5-10cm • Kolonna belső átmérő: 2,1mm • Detektor cella térfogata: 0,5-1,5µl • Detektor adatfelvételi sebessége: 60-100Hz
24
Folyadékkromatográfiás módszerek • Az álló- és a mozgófázis minősége alapján
Egymáshoz viszonyított polaritás!
25
Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC) Állófázis Poláris felületű Mechanikailag stabil Mikropórusmentes --->szilikagél alumínium-oxid módosított szilikagél
Mozgófázis Apoláris Kis viszkozitású Jó UV-fény áteresztőképességű Nem túl illékony Kevésbé toxikus Apoláris szénhidrogén+poláris modifikátor: Szénhidrogének Klórozott szénhidrogének Éterek Észtrek Alkoholok Szelektivitás
Alkalmazás: Közepesen poláris vegyületek elválasztása – szerves vegyületek izomerei, kiv. Enantiomerek Növényvédőszer maradványok
Eluenserősség 26
Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP-HPLC) Állófázis Apoláris felületű Mechanikailag stabil Mikropórusmentes Módosított szilikagél Sztirol-divinil-benzol alapú töltet Szén alapú töltet
Alkalmazás: Apoláris vegyületek elválasztása PAH, fenolok, növényvédőszer maradványok
Mozgófázis Poláris Kis viszkozitású Jó UV-fény áteresztőképességű Nem túl illékony Kevésbé toxikus Víz+szerves oldószer Metanol EluensAcetonitril erősség Etanol Izopropanol Tetrahidrofurán
pH kontroll! 27
Egyéb folyadékkromatográfiás módszerek • Fordított fázisú ionpár kromatográfia – Állófázis: apolárisan módosított szilikagél – Mozgófázis: poláris mozgófázis+ionpárképző – Alkalmazás: ionos vagy könnyen ionizálható vegyületek
• Méretkizárásos kromatográfia – Állófázis: – Mozgófázis: víz/szerves oldószerek – Alkalmazás: polimer molekulák
• Ionkromatográfia – Állófázis: ioncserélő (anion-/kationcserélő) – Mozgófázis: szerves oldószert tartalmazó pufferek – Alkalmazás: szervetlen ionok meghatározása
28
Elválasztás tervezése • • • •
Milyen közegben stabil? Mekkora a molekula tömege? Milyen a polaritása? logP, pKa Kromatográfiás módszer kiválasztása, eluens meghatározása Optimálás
29
Környezetvédelmi analitikai alkalmazások/1. • Fenol és klórfenol tartalmú szennyvizek vizsgálata
30
Környezetvédelmi analitikai alkalmazások/2. • Többgyűrűs szénhidrogének meghatározása környezeti mintákban – Figyelembe kell venni: • Vegyületek apolárisak • Fluoreszcensen aktívak • Kis koncentrációjuk is ártalmas • Lebegő szemcséken adszorbeálódnak
31
