NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé
teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.
HPLC FELÉPÍTÉSE
Horváth Csaba 1930-2004
Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesztésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Horváth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t megalapozó elméleti közleményére csaknem ezer citálást kapott, ez az elválasztástudomány legtöbbször idézett munkája.
OLDÓSZEREK
Üveg, vagy műanyag edények. Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O2 eltávolítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés; - vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.
SZIVATTYÚK
Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Pulzáláscsillapító
Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis 2, membrán – hexánnal töltve 1
2
Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél). Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus).
1. 2.
GRADIENSKÉPZŐ elúció – változatlan
Izokratikus összetételű mozgófázis Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrásszerű változtatása. Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés Nagy nyomású keverő – pumpa utáni keverés
Mintainjektáló rendszer
1.
2.
Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 μl Fajtái: Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).
Kézi injektálás
Automata mintaadagoló
Loop méret alapján Mikro: 0,06 µL - 0,500 µL Analitikai: 1,0 µL - 500,0 µL (5-100 µL) Preparatív: 100 µL - 10 mL
OSZLOP
Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. 2 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m2/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmérőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens).
Holt térfogat (Extra-column volume)
Csúcsszélesedést okoz (injektor után). Keverőedény effektus. Male nut
Holt térfogat
Tube
Tökéletes illeszkedés
Rossz csatlakozás 18
van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok esetén
Áramlási sebesség ml/min
NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. 1.Szilikagél 2.Aluminium-oxid 3.Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez 500-1000-red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.
Módosított szilikagél
Szabad szilanol csoport (gyenge sav) Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.
Módosított szilikagél
Mozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófázist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása dp tR N P Δp = LFηφ (μm) (min) (bar) ᴨr2 dp2 5 30 25,000 19 L = oszlop hossza 3 18 42,000 87 F = térfogati áramlási sebesség 1.5 9 83,000 700 η = viszkozitás φ = az oszlop porozitására jellemző tag r = oszlop sugara; dp = átlagos szemcseméret
Alkalmazás, előnyök, hátrányok
Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok) Víz érzékeny vegyületek analízise Kis viszkozítású eluens – nagyobb áramlási sebesség (buborék képződés problémája) Hosszú ekvilibrálási idők, retenciós idők szórása n
FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis 1) Módosított szilikagél 2) Szerves polimer alapú állófázisok 3) Szén alapú állófázisok
Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).
Savas hidrolízis helye
OH Si
OH + Cl
OH
OH
CH3 Si
CH3
C18H37
Si
O
CH3 Si
-HCl
OH
C18H37
CH3
Szabad szilanol csoport
monomer polimer
Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosítás
A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálatlan marad. Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = 10-11 Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.
dp
Fajlagos felület
Szén tartalom
Å
m2/g
m/m %
Hypersil C4 (e)
300
50
2.0
Supelcosil C8 (e)
100
170
8.5
Spherisorb C8
80
220
6.0
Spherisorb C18
80
220
12.0
Prodigy C18
150
310
18.7
Inertsil C18
150
320
18.5
Hypersil C8
120
170
7.0
Hypersil C18 (e)
120
170
10.0
Selectosil C18
300
110
7.0
NÉV
Mozgófázis
Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol
Funkciós csoportok polaritása: C-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OH Oldószer
Oldószer erősség (ε) NORMÁL!
Viszkozitás (cP)
UV cut-off (nm)
Hexán
0
0,33
200
Széntetraklorid
0,14
0,97
263
Kloroform
0,31
0,57
245
Diklórmetán
0,32
0,44
235
Tetrahidrofurán
0,35
0,55
215
Dietil-éter
0,29
0,23
215
Etilacetát
0,45
0,45
260
Dioxán
0,49
1,54
215
Acetonitril
0,50
0,37
190
2-propanol
0,63
2,3
210
Metanol
0,73
0,60
205
Víz
>1,00
1
-
Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere
Gradiens elució A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul. Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Izokratikus elució
Gradiens elució
Gradiens programozás
pH gradiens, aminosavak enantioszelektív elválasztására
OPA–IBLC (a) and OPA–IBDC (b)
HILIC - Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography
Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (HILIC) Poláris állofázis – Víz-acetonitril mozgó fázis Magas víztartalmú állófázis, ami poláris (NP) Acetonitril az eluensben (RP), kompatibilis az MS-el Nagyon poláris, ionizálható vegyületek elválasztása (IC)
HILIC állófázisok
Kis szénatomszámú karbonsavak, poláris és semleges gyógyszerek, szénhidrátok, peptidek
Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekben Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek
VR = vizsgált komponens retenciós térfogata V0 = holt térfogat G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiája x = szerves módosító móltörtje G el. = eluens adszorpciós energiája (~ oldószererősség) Ha x nő →Vr csökken Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.
Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében CH2
CH3
n
O C
CH2
n
CH3
O HO
C O
CH2
n
CH3
Szénatom szám
A pH szerepe az elválasztásban Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. 2) Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálódnak 3) Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: 1) pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása 2) Ionpárképzés 3) Ioncsere kromatográfia 1)
Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
RCOOH RCOO-/RCOOH
pKa RCOO-
A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására
tailing
Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
R-NH2
R-NH3+/R-NH2
pKb
R-NH3+
A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására Bázikus antihisztaminok (pH=11 !!!)
A pH hatása fordított fázisú elválasztásra Amitryptiline
Naproxen
Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC)
A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. Anionos ionpárképző
Kationos ionpárképző
Alkil-szulfonsavak
Tetrabutil-ammónium sók
D- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium sók
Alkil-szulfátok
Dodecil-oktil-dimetilammónium sók
Surfactants - conventional low molecular weight dispersing agents.
C18 állófázis
Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése
N+
[Molekula ION]
-
Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek
Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő).
Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc).
Szerves módosító típusa és mennyisége.
Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása).
Idegen só koncentrációja.
A hőmérséklet hatása az elválasztásra
H = 2 λdp + 2γDm + 8 k df2 u u π2 (1+k)2 Ds
