Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis

Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis

Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce:

Autor:

RNDr. Miloš Dendis

Petra Doleželová Brno, duben 2010

Jméno a příjmení autora: Petra Doleţelová Název bakalářské práce: Molekulární diagnostika Chlamydia trachomatis Pracoviště: RNDr. Zdeněk Čecháček, s.r.o., sérologická laboratoř, Brno GeneProof a.s., Brno Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miloš Dendis Rok obhajoby bakalářské práce: 2010

Souhrn Chlamydia trachomatis je nejvýznamnějším a nejčastějším původcem sexuálně přenosných onemocnění ve vyspělých zemích, hlavní příčinou slepoty (trachom) a

venerického

onemocnění

lymfogranuloma

venerum.

Průkaz

nukleové

kyseliny

C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Klíčovým krokem diagnostického procesu je účinná izolace DNA. Bakalářská práce si klade za cíl srovnat účinnost, sensitivitu a variabilitu manuální izolace nukleových kyselin s izolací automatickou. Obě metody byly testovány na sériově ředěné koncentrační řadě pozitivního vzorku s následnou detekcí DNA C. trachomatis metodou real-time PCR. Přestoţe automatická izolace vykazovala niţší účinnost izolace DNA z klinického materiálu, umoţňovala především z důvodu většího zakoncentrování vzorku během izolačního procesu, srovnatelnou sensitivitu vyšetření. Klíčová slova Chlamydia trachomatis, infekce, diagnostika, izolace DNA, real-time PCR

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Miloše Dendise a v seznamu literatury jsem uvedla všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Brně dne 29. 4. 2010

…………………………………. Petra Doleželová

Děkuji RNDr. Miloši Dendisovi za odborné vedení, cenné informace a pomoc při vypracování bakalářské práce. Děkuji Ing. Josefu Bednářovi, Ph.D. z Fakulty strojního inţenýrství VUT v Brně za statistické zpracování experimentálních dat, MUDr. Zuzaně Medkové, Ph.D. za zapůjčení odborné literatury. Dále děkuji RNDr. Zdeňku Čecháčkovi a celému týmu jeho laboratoře za podporu a trpělivost. Velký dík patří mým rodičům, mému synovi a partnerovi, kteří mi byli velkou oporou a zdrojem energie.

I. TEORETICKÁ ČÁST 1

Úvod ....................................................................................................................................7

2

Mikrobiologie .....................................................................................................................8 2.1

Taxonomie....................................................................................................................8

2.2 Chlamydia trachomatis ..............................................................................................10 2.2.1 Morfologie ..............................................................................................................11 2.2.2 Ţivotní cyklus .........................................................................................................11 2.2.3 Charakteristika antigenních struktur.......................................................................12 2.2.4 Sérotypy a patogenita .............................................................................................13 2.2.5 Struktura genomu ...................................................................................................13 3

Patogeneze a klinický význam onemocnění ..................................................................15 3.1 Infekce vyvolané sérotypy D-K .................................................................................15 3.1.1 Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u ţen ...................................................15 3.1.2 Peripatální přenos infekce z matky na dítě .............................................................16 3.1.3 Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u muţů ................................................16 3.1.4 Konjuktivitida u dospělých.....................................................................................16 3.1.5 Riziko vzniku karcinomu děloţního hrdla .............................................................17 3.2 Endemické nákazy .....................................................................................................17 3.2.1 Trachom ..................................................................................................................17 3.2.2 Lymfogranuloma venerum ......................................................................................18

4

Epidemiologie a prevalence sérotypy D-K ....................................................................19

5

Imunologie ........................................................................................................................20

6

7

5.1

Imunitní odpověď hostitelského organismu ...............................................................20

5.2

Imunopatologie ..........................................................................................................20

5.3

Individuální imunitní reakce ......................................................................................21

Prevence a terapie............................................................................................................22 6.1

Primární a sekundární prevence .................................................................................22

6.2

Volba vhodné diagnostiky..........................................................................................22

6.3

Otázka vakcinace .......................................................................................................22

6.4

Terapie........................................................................................................................23

Laboratorní diagnostika .................................................................................................24 7.1 Nepřímá diagnostika ..................................................................................................24 7.1.1 Nepřímá imunofluorescence ...................................................................................24

7.1.2 ELISA .....................................................................................................................24 7.1.3 Western blot............................................................................................................25 7.2 Přímá diagnostika .......................................................................................................25 7.2.1 Kultivace na tkáňové kultuře ..................................................................................25 7.2.2 Metody detekce antigenu ........................................................................................26 7.3 Molekulárně biologické metody ................................................................................26 7.3.1 Metody bez amplifikace .........................................................................................26 7.3.2 Amplifikační metody ..............................................................................................27 7.3.2.1 LCR (Ligase Chain Reaction) .........................................................................27 7.3.2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................................................27 8

Správná laboratorní diagnostika PCR C. trachomatis .................................................30 8.1 Preanalytická fáze ......................................................................................................30 8.1.1 Typy klinických materiálů a technika odběru ........................................................30 8.2 Analytická fáze...........................................................................................................31 8.2.1 Kontrola kvality diagnostického procesu ...............................................................31 8.2.1.1 Vnitřní kontrola kvality (VKK) ......................................................................31 8.2.1.1.1 Kontrola falešně pozitivních výsledků .......................................................31 8.2.1.1.2 Kontrola falešně negativních výsledků .......................................................32 8.2.1.2 Externí kontrola kvality (EKK) .......................................................................32

9

Cíl bakalářské práce........................................................................................................33

II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 10 Materiál a metody............................................................................................................34 10.1 Struktura experimentu ................................................................................................34 10.1.1 Účel testu ............................................................................................................34 10.1.2 Schéma experimentu ...........................................................................................34 10.2

Příprava koncentrační řady pozitivního vzorku .........................................................35

10.3 Izolace DNA...............................................................................................................36 10.3.1 Manuální izolace DNA .......................................................................................36 10.3.2 Automatická izolace DNA ..................................................................................37 10.4

Detekce DNA C. trachomatis metodou real-time PCR .............................................38

10.5 Kvantifikace DNA C. trachomatis .............................................................................39 10.5.1 Příprava kalibrační řady ......................................................................................39 10.5.2 Stanovení koncentrace DNA ..............................................................................40 10.6

Statistické vyhodnocení .............................................................................................40

11 Výsledky a diskuse ...........................................................................................................41 11.1

Porovnání účinnosti manuální a automatické izolace ................................................41

11.2

Srovnání celkové sensitivity vyšetření .......................................................................44

11.3

Srovnání variability izolací ........................................................................................48

11.4

Kříţová kontaminace izolačního procesu ..................................................................50

12 Závěr .................................................................................................................................51 Seznam zkratek .......................................................................................................................52 Seznam použité literatury ......................................................................................................55

I. TEORETICKÁ ČÁST 1 Úvod Chlamydia trachomatis je obligátní lidský patogen s unikátním ţivotním cyklem. Jedná se o intracelulárního parazita, který je energeticky závislý na hostitelských buňkách. Je schopen infikovat epitel urogenitálního traktu, rekta, nasopharyngu a očních spojivek. Infekce jsou příčinou celé řady onemocnění (uretritida, cervicitida, lymfogranuloma venerum, konjuktivitida, prostatitida a trachom). C. trachomatis se svými sérotypy D-K patří na celém světě k nejčastějším sexuálně přenášeným agens, které způsobuje infekce urogenitálního traktu a očí. Infekce jsou charakterizovány převáţně asymptomatickým průběhem a klinicky se manifestují aţ v období těţkého zánětlivého procesu. Závaţná jsou zejména postiţení reprodukčních orgánů s následkem infertility u obou pohlaví. Prevence infekcí je moţná zavedením screeningu s přesně stanovenými kriterii u ţen a muţů v rizikových skupinách. Správná diagnostika je základním předpokladem účinné terapie. Laboratorní diagnostika akutních chlamydiových infekcí je obtíţná, především pro nízkou citlivost kultivačních metod nebo detekce antigenu. Sérologická diagnostika má malou výpovědní hodnotu. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Pro svou vysokou citlivost a specificitu jsou preferovány především amplifikační metody průkazu nukleových kyselin C. trachomatis zaloţené na polymerázové řetězové reakci (PCR).

7

2 Mikrobiologie Chlamydie jsou výjimečné mikroorganismy dříve povaţované za prvoky či velké viry. Po průkazu buněčné stěny byly zařazeny ke gramnegativním bakteriím s tím rozdílem, ţe jejich buněčná stěna neobsahuje peptidoglykan (kyselinu muramovou), ale lipidy. Jedná se o intracelulární parazity, kteří ke svým metabolickým procesům vyuţívají energii z napadené hostitelské buňky (Greenwood, et al., 1999; Mašata et al., 2001).

2.1 Taxonomie Do r. 1999 čeleď Chlamydiaceae zahrnovala jediný rod Chlamydia se čtyřmi klasifikovanými druhy: Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chlamydia pecorum Na základě molekulárně biologické analýzy 16sRNA a 23sRNA byla čeled´ Chlamydiaceae přerozdělena na dva rody (Obr. 1) Chlamydia a Chlamydophila (Mahony et al., 2003; Bush a Everett, 2001). V humánní medicíně jsou významné Chlamydia trachomatis a Chlamydophila pneumoniae (Tab. 1). Chlamydia trachomatis je nejvýznamnější a nejčastější původce sexuálně přenosných onemocnění, trachomu a klasického venerického onemocnění lymfogranuloma venerum. Chlamydophila pneumoniae má primární afinitu k respiračnímu traktu. Chlamydophila psittaci je zvířecí patogen (původce orntiózy) přenosný na člověka (Bednář et al., 1996; Votava et al., 2003).

8

Obr. 1. Schéma nové a původní klasifikace chlamýdií (Bush a Everett, 2001).

9

Tab. 1. Charakteristika jednotlivých species chlamýdií (upraveno dle Jarčuška et al., 2009). Charakteristika

C. pneumoniae

C. trachomatis

C. psittaci

Přirozený hostitel

člověk

člověk

ptáci a drobní savci

Hlavní onemocnění

pneumonie bronchitida

trachom lymfogranuloma venerum STD infekce novorozenců

psitakóza, ornitóza placentitida

Počet sérovarů Tvar EB v elektronovém mikroskopu Druhově specifické antigeny v MOMP Inaktivace specifických antigenů metanolem Potřeba lyzinu pro ţivotní cyklus DNA homologie s C.pneumoniae AR39

1

18

méně neţ 10

nepravidelně oválný

kulatý

kulatý

nepřítomny

přítomny

přítomny

ANO

NE

NE

NE

ANO

ANO

94-100%

méně neţ 5%

méně neţ 10%

Citlivost na makrolidy a tetracykliny

ANO

ANO

ANO

Citlivost na sulfonamidy

NE

ANO

NE

2.2 Chlamydia trachomatis Byla pozorována mikroskopicky I. Halbestaedterem a S. von Prowazekem v r. 1907 jako buněčná inkluze ve stěru ze spojivkového vaku u trachomu. V r. 1909 Fritsch, Hofstetter a Linder prokázali sexuální přenos mezi muţem a ţenou a mezi infikovanou matkou a novorozencem (Šimko et al., 1999). Vyizolovat C. trachomatis z uretry se podařilo Jonesovi

et al., r. 1959. Jako původce STD (pohlavně přenosných chorob) ve vyspělých zemích, byla C. trachomatis označena v r. 1975 J. T. Graystonem a S.T.Wangem a v r.1978 J.Schachterem (Matoušková a Hanuš, 2009). Její sérotypy D-K představují více neţ 50% všech urogenitálních nákaz (Votava et al., 2003). C. trachomatis je obligátně intracelulární parazit patogenní pouze pro člověka. Obsahuje DNA i RNA. Jako prokaryotický organismus syntetizuje bílkoviny a nukleové kyseliny vlastními ribozomy a enzymy. Není vybaven vlastním systémem pro tvorbu ATP (adenosintrifosfát) a proto k metabolickým procesům vyuţívá ATP napadené hostitelské buňky (Mašata et al., 2001). 10

2.2.1 Morfologie Chlamydie v závislosti na růstovém cyklu existují ve dvou rozdílných morfologických formách. Malé infekční EB (elementární tělísko, 250-400 nm) a větší neinfekční RB (retikulární tělísko, 800-1200 nm)(Förstl et al., 2004). Elementární tělíska Jádro EB tvoří kondenzovaná DNA. Před negativními vlivy extracelulárního prostředí je EB chráněno rigidní buněčnou stěnou s četnými disulfidickými vazbami v hlavním komplexu vnějších membránových proteinů (Major Outer Membrane Protein – MOMP), který je základním druhově specifickým antigenem a vyuţívá se v metodách laboratorní diagnostiky (Medková et al., 2001; Mašata, 2001). Retikulární tělíska RB je neinfekční, osmoticky fragilní a intenzivně dělící se struktura s difúzně rozptýlenou DNA (usnadnění transkripce a translace). Cylindrické struktury v buněčné membráně RB v místě styku s endosomem umoţňují příjem ţivin z cytoplazmy hostitelské buňky (Votava et al., 2003).

2.2.2 Životní cyklus Ţivotní cyklus s rozmnoţováním je unikátní a zcela odlišný od jiných mikroorganismů (Obr. 2)(Bednář et al., 1996). Extracelulárně se chlamydie vyskytují ve formě infekčního, metabolicky inaktivního EB (elementárního tělíska). Průnik EB do buňky je zprostředkován přes receptor endocytosou. Schopnost zamezit fúzi endosomu s lysosomem chrání intracelulární chlamydie před baktericidními účinky lysosomů hostitelské buňky. Za několik hodin po infikování buňky se EBs přemění v metabolicky aktivní neinfekční RBs (retikulární tělíska), která se v endosomu binárně dělí v následujících 16-24 hodinách, přičemţ energeticky vyčerpávají hostitelské buňky. Endosom se zvětšuje a můţe být viditelný ve světelném mikroskopu jako intracelulární inkluse (inklusní tělísko). Nově vzniklá RBs zpět kondenzují na EBs, která se uvolní do okolí rozpadem infikované hostitelské buňky. Tímto končí růstový cyklus chlamydií, jehoţ délka je 48-72 hodin. Vyloučená EBs infikují další vnímavé buňky (Votava et al., 2003). Pokud vypuzuje napadená buňka dlouhodobě EBs exocytosou do okolí 11

a nedojde k apoptóze, je moţný rozvoj permanentní buněčné infekce (tzv. perzistentní formy). Tyto formy přeţívají intracelulárně aţ několik let a nedochází k jejich dělení. Mají schopnost se přeměnit zpět do aktivních RBs (Pinkavová a Koliba, 2007).

Obr. 2. Vývojový cyklus C.trachomatis v ideálních podmínkách (převzato z www.chlamydicae.com ).

2.2.3 Charakteristika antigenních struktur Antigenní struktura chlamydií je sloţitá. Společným znakem je rodově specifický povrchový lipopolysacharidový antigen (LPS). Proteinové antigeny vnější membrány (MOMP) reprezentují základní druhově a typově specifické antigeny (Mahony et al., 2003). LPS povrchový lipopolysacharid patří k endotoxinům gramnegativních bakterií. Specifická chemická struktura molekuly, která je sloţena z hydrofobní, lipidové a hydrofilní polysacharidové části, odlišuje LPS chlamydií od LPS jiných gramnegativních bakterií. Proto má niţší endotoxinovou aktivitu, která vede k mírnému, ale trvalému zánětu. LPS je významným aktivátorem makrofágů a lymfocytů (Greenwood et al., 1999; Tobias, et al., 1999). MOMP (Major Outer Membrane Protein) je komplex druhově specifických imunologicky dominantních antigenů vnější membrány. Plní funkci chlamydiového adhesinu a můţe ovlivnit propustnost buněčné stěny. Protilátky proti tomuto komplexu se povaţují za 12

protektivní a jsou diagnosticky významné (Bednář et al., 1996; Teislerová a Ţampachová 2007). MIP (Macrofage Infectivity Potentiator) je typický faktor virulence intracelulárních patogenů. Jde o membránový protein, který je přítomen na RBs i EBs, umoţňuje chlamydiím přeţívat v makrofázích a podpořit vznik perzistentní infekce (Lundemose et al., 1992; Teislerová a Ţampachová 2007). cHSP60 (chlamydiový protein tepelného šoku) je imunogenní, má vliv na poškození tkáně při chronické infekci (autoimunitní zánět, navozený mechanismem zkříţené reaktivity s hHSP, protoţe cHSP vykazuje 48% homologii s lidským hHSP). Přítomnost lokálních endocervikálních protilátek proti cHSP a hHSP souvisí s poruchami reprodukce u ţen (Medková, 2004). Obecně HSP (Heat Shock Protein-protein tepelného šoku) patří k fylogeneticky starým proteinům s fyziologickou funkcí chaperonů, exprimovaných prokaryoty

i

eukaryotickými

organismy

ve

stresových

podmínkách

(Teislerová

a Ţampachová, 2007).

2.2.4 Sérotypy a patogenita Typově specifické proteinové antigeny na povrchu EBs rozdělují C. trachomatis na 18 sérotypů s různou patogenitou. Sérotypy A, B, Ba a C jsou příčinou trachomu. Sérotypy L1, L2, L2a a L3 způsobují lymfogranuloma venerum. Sérotypy D-K jsou původci očních a urogenitálních infekcí (Bednář et al., 1996; Votava et al., 2003).

2.2.5 Struktura genomu Genom chlamydií patří k nejmenším v říši bakterií. DNA Chlamydia trachomatis je tvořena nukleoidem o molekulové hmotnosti 7 x 108. Bakteriální chromosom čítá 1,042,519 bp a kóduje cca 875 proteinů (Kalman et al., 1999). 98% kmenů C. trachomatis obsahuje extrachromosomální DNA, tzv. kryptický plasmid. Byly však také popsány vzácné kmeny bez plasmidů a to u sérotypů L2, D a E (Peterson et al., 1990). Kryptický plasmid nese geny pouze pro svoji existenci, má velikost 7,493 bp a vyskytuje se v počtu aţ 10 kopií na genom (Pickett et al., 2005). Analýza polymorfismu genomové a plasmidové DNA různých kmenů C. trachomatis ukázala, ţe fylogeneze genomu je velmi pevně vázána s fylogenezí kryptického plasmidu. 13

Tento jev ukazuje, ţe kryptický plasmid se nechová jako mobilní element a jeho horizontální přenos mezi kmeny je velmi vzácný (Seth-Smith et al., 2009). Kryptický plasmid je oblíbeným cílem molekulárně diagnostických metod. Větší počet plasmidů v přepočtu na 1 genom umoţňuje, v porovnání s diagnostickými metodami zacílenými na genomovou DNA, mnohem vyšší sensitivitu vyšetření. Diagnostika infekce C. trachomatis zaloţené na detekci kryptického plasmidu nese riziko falešně negativních výsledků v případě infekcí kmeny bez plasmidů. Proto některé diagnostické soupravy (Qiagen, GeneProof) vyuţívají simultánní detekce kryptického plasmidu a genomové DNA. Dalším problémem je zacílení detekce DNA plasmidu do vhodné sekvence. Např. CDS2 kódující sekvence kryptického plasmidu je vysoce konzervativní a tudíţ vhodná pro detekci (Seth-Smith et al., 2009). Zacílení diagnostické metody do variabilní oblasti plasmidu můţe vést k falešně negativním výsledkům a rozšíření takto unikajícího kmene v populaci. V roce 2006 byl ve Švédsku popsán nový kmen C. trachomatis patřící k sérotypu E (Ripa et al., 2006; Herrmann et al., 2008). Tento kmen nese kryptický plasmid s charakteristickou delecí o velikosti 377 bp (Ripa et al., 2007). Selhání diagnostických metod zacílených do této deletované oblasti kryptického plasmidu vedlo k signifikantnímu rozšíření tohoto nového kmene C. trachomatis, přičemţ v některých oblastech Švédska infekce tímto kmenem dosahuje 20 – 64% všech infekcí C. trachomatis (Herrmann et al., 2008).

14

3 Patogeneze a klinický význam onemocnění 3.1 Infekce vyvolané sérotypy D-K Antigenní výbava chlamydií a schopnost intracelulárního přeţívání v napadených buňkách má za následek často bezpříznakový průběh urogenitální infekce, s kolísavou zánětlivou aktivitou a významnou fibroprodukcí. Klinická manifestace bývá opoţděná a dostaví se aţ v důsledku morfologické a funkční změny orgánové tkáně (Tab. 2)(Medková, 2004; Pinkavová a Koliba, 2007). Výsledkem jsou mnohdy závaţná postiţení reprodukčních orgánů u obou pohlaví (Toršová, 2004). Tab. 2. Projevy infekce C. trachomatis v dospělosti (Medková, 2004). Muži

Ženy

uretritis

cervicitis

prostatitis

endometritis

epididymitis

salpingitis

proctitis

periadnexitis

perihepatitis (Fitz-Hugh-Curtisův syndrom)

uretritis perihepatitis(Fitz-Hugh-Curtisův syndrom)

arthritis: Reiterův syndrom infekční arthritis reaktivní postinfekční arthritis

arthritis: infekční arthritis reaktivní postinfekční arthritis (Reiterův syndrom zřídka)

conjuktivitis

conjuktivitis proctitis

3.1.1 Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u žen U ţen chlamydie infikují buňky jednořadého cylindrického epitelu děloţního čípku. Dochází k rozvoji mukopurulentní cervicitidy (Pinkavová a Koliba, 2007). Aţ 10% neléčených infekcí vyústí v endometritidu nebo salpingitidu, které se manifestují nepravidelným děloţním krvácením, abdominálními a pánevními bolestmi (PID). Tyto symptomy vedou k závaţným komplikacím v reprodukci, mimoděloţnímu těhotenství i k tubární sterilitě (Toršová, 2004). 20-70% chlamydiových infekcí děloţního hrdla je vysoce rizikovým faktorem pro vyvolání předčasného porodu. Intracelulární zánět stimuluje lokální tvorbu prostaglandinů E 15

a F, které ovlivňují mechanismus vedoucí k předčasným kontrakcím dělohy. Moţnost přechodu infekce na plodové obaly je rizikem ruptury s odtokem plodové vody. Matkám s chlamydiovou infekcí se aţ v 60% mohou narodit děti s nízkou porodní hmotností (Toršová, 2004).

3.1.2 Peripatální přenos infekce z matky na dítě Infekce v oblasti čípku se cca v 50-70% přenáší během porodu na novorozence. U 18-50% dětí se vyvine konjuktivitida, u 15-20% je kolonizován nosohltan a v 5-20% vzniká atypická pneumonie (Pinkavová a Koliba, 2007). Chlamydiová infekce oka se u novorozence vyvíjí nejčastěji 5. -14. den po porodu. Závaţné komplikace (zjizvení spojivky či rohovky) jsou vzácné. K rozvoji chlamydiové pneumonie dojde mezi 2. -19. týdnem ţivota s nespecifickými klinickými symptomy. U neléčených dětí můţe infekce dlouhodobě perzistovat a vyústit v chronickou obstrukční pulmonální nemoc nebo v astma. Novorozenci infikovaných matek mají často kolonizován i genitální trakt (Pinkavová a Koliba, 2007). Byla popsána i těţká diseminovaná infekce novorozence s pozitivní DNA C. trachomatis v moči a v likvoru (Medková et al., 2001).

3.1.3 Klinický obraz sexuálně přenosné infekce u mužů U muţů chlamydie infikují epitel močové trubice se vznikem uretritidy a dysurie. Ve 3050% probíhá zánět asymptomaticky (Pinkavová a Koliba, 2007). Průnikem do oblasti varlete a nadvarlete mohou chlamydie způsobit obstrukci chámovodů (Black, 1997). Při postiţení parenchymu varlat jsou pozorovány změny spermiogramu. Prodělaná epididymoorchitis můţe být příčinou obstrukční azoospermie s následnou sterilitou. Je prokázána souvislost mezi hladinou antichlamydiálních protilátek ve spermatu a tubární sterilitou ţeny (Mašata et al., 2001). Infekce uretry můţe být provázena konjuktivitidou a reaktivním zánětem synovie velkých kloubů (Reiterův syndrom)(Pinkavová a Koliba, 2007).

3.1.4 Konjuktivitida u dospělých Onemocnění se vyskytuje u sexuálně aktivních osob a přenáší se z genitálu do oka. Akutně probíhá jako inkluzní konjuktivitida, která se většinou vyhojuje bez následků (Votava et al., 2003).

16

3.1.5 Riziko vzniku karcinomu děložního hrdla Cervikální chlamydiová infekce je v současnosti povaţována za jeden z faktorů zvyšujících riziko vzniku karcinomu děloţního hrdla ze skvamózních buněk (SCC- Squamous Cell Carcinoma). C. trachomatis inhibuje apoptózu hostitelských buněk a vzniká chronická perzistentní infekce, která by mohla zahájit a podporovat karcinogenezi. Asociace s SCC je sérotypově specifická, pravděpodobně jde o sérotyp G. S větším počtem prodělaných infekcí během ţivota, stoupá i riziko pravděpodobnosti SCC (Moss, 2006).

3.2 Endemické nákazy

3.2.1 Trachom Sérotypy A, B, Ba, C C. trachomatis vyvolávající trachom (Obr. 3) jsou v hyperendemických oblastech nejčastější příčinou slepoty (Greenwood et al., 1999; Bednář et al., 1996), která se vyvíjí pomalu 20-30 let. Rezervoárem akutní infekce bývají děti. Přenos je moţný přímým kontaktem nebo přes infikované mouchy, které nasedají na oči. Jde o chronickou keratokonjuktivitidu vedoucí k loţiskovým nekrózám a jizvám na spojivce. Důsledkem je stočení víčka s abrazí rohovky řasami, takţe dochází k jejímu zakalení a slepotě. (Greenwood et al., 1999; Votava et al., 2003).

Obr. 3. Oko postižené trachomem (převzato z http://www.atlasophthalmology.com/atlas) .

17

3.2.2 Lymfogranuloma venerum Sérotypy L1, L2, L2a, L3 C. trachomatis jsou brány jako invazivní samostatný biotyp (LGV). Způsobují

klasickou

venerickou

nákazu

lymphogranuloma

v hyperendemických oblastech. Onemocnění začíná

venerum

s

výskytem

vředem na genitálu s regionální

lymfadenopatií a vznikem bubonů. Důsledkem je destruktivní zánět s následným zjizvením tkáně genitálu a recta (Greenwood et al., 1999; Votava et al., 2003). Venerický lymfogranulom a trachom se v našich podmínkách prakticky nevyskytují, endemické jsou v tropech a subtropech (Votava et al., 2003).

18

4 Epidemiologie a prevalence sérotypy D-K Nejvyšší výskyt infekce je u mladých lidí ve věku 15-30 let. Ročně se nakazí v Evropě 3 miliony, v USA aţ 4 miliony lidí (Obr. 4; Obr. 5). Cena jejich léčby je odhadována na více neţ 2 miliardy dolarů. Dle WHO vzniká kaţdoročně přibliţně 90 milionů infekcí C. trachomatis. Vyskytuje se 4krát častěji neţ kapavka a 30krát častěji neţ syfilis (Jarčuška et al., 2009). V ČR není v současnosti prevalence infekce přesně známa. Nákazy nepodléhají povinnému hlášení a systematický screening se neprovádí (Medková et al., 2001) na rozdíl od jiných vyspělých států (USA, Velká Británie, Švédsko) (Pinkavová a Koliba, 2007).

Obr. 4. Případy pohlavně přenosných chorob v USA (1997-2008) (převzato z http://www.avert.org).

Obr. 5. Případy pohlavně přenosných chorob ve Velké Británii (1999-2008) (převzato http://www.avert.org).

19

5 Imunologie Chlamydie jsou adaptované na ţivot v eukaryotických buňkách včetně monocytů, makrofágů, dendritických buněk a jiných buněk spolupracujících s imunitním systémem. Po invazi chlamydií do organismu proběhne humorální a buněčná imunitní odpověď (Jarčuška et al., 2009).

5.1 Imunitní odpověď hostitelského organismu V první fázi infekce se zapojují mechanismy nespecifické buněčné i humorální imunity (komplementový systém, MBL, cytokiny, NK-buňky, neutrofily, monocyty a makrofágy). MBL (sérový lektin vázající manózu) zabraňuje vazbě infekčního EB na hostitelskou buňku a tím invazi patogena. Makrofágy fagocytují EBs a mohou být jimi i infikovány. Makrofágy (APC - Antigen Present Cells ) prezentují zpracované antigeny chlamydií prostřednictvím HLA (antigeny lidských leukocytů) komplexu II. třídy Th lymfocytům CD4+ (Medková 2004a). Tak je zahájena humorální specifická (protilátková) imunitní odpověď, s následnou tvorbou slizničního IgA, cirkulujícího IgM a IgG (Jarčuška et al., 2009). Protilátky jsou tvořeny jak proti LPS (lipopolysacharid), tak proti komplexu hlavních membránových proteinů (MOMP). IgG protilátky jsou schopny neutralizace infekčních forem (EBs), ale vzhledem k sérotypové specifitě nezaručí ochranu před reinfekcí jiným kmenem (Šimko, 1999; Toršová, 2004). Výkonnými efektorovými buňkami buněčné imunitní odpovědi jsou aktivované makrofágy a CD8+ lymfocyty. INFγ (interferon gama, produkt Th1 lymfoctů) aktivuje infikované i neinfikované makrofágy k intracelulární mikrobicidii. Nízká hladina tohoto působku můţe souviset s perzistentními formami (Medková et al., 2001; Medková, 2004a; Jarčuška et al., 2009).

5.2 Imunopatologie Nejsou-li imunitní pochody optimálně vyváţeny, můţe dojít k přechodu fyziologické obranné reakce v patologický proces, kterým je chronický zánět. Vazivovatění tkáně a moţnost autoimunitního onemocnění jsou jeho hlavním rysem (Medková et al., 2001; Medková, 2004; Pinkavová a Koliba, 2007). Antigenní výbava chlamydií je riziková a souvisí s indukcí autoimunitního zánětu proti hHSP (lidský protein tepelného šoku) v důsledku zkříţené reakce s cHSP (chlamydiový protein tepelného šoku), který má schopnost 20

protahované prozánětlivé reakce. Tento imunopatologický proces souvisí i s poruchami reprodukce u ţen. Polyklonální aktivátor makrofágů a lymfocytů LPS (chlamydiový lipopolysacharid) je schopen vazby na CD14 receptor makrofágů. Receptor CD14 je i součástí membrány fibroblastů (buňky chronického fibroproduktivního zánětu). LPS stimuluje fibroblasty k produkci TGFβ (transformující růstový faktor β ) a následkem tohoto procesu dochází k nadměrné tvorbě vaziva ve tkáni (Medková, 2004).

5.3 Individuální imunitní reakce Průběh chlamydiové infekce ovlivňuje i individuální imunitní reakce hostitele. Primárně je určena geneticky. U konkrétního jedince je její aktuální stav výsledkem interakce genetické dispozice a jiných (negenetických) vlivů. Předmětem výzkumu je asociace určitých typů alel HLA s jednotlivými klinickými projevy chlamydiových infekcí. Známý je vztah mezi pozitivitou znaku HLA-B27 a reaktivní chlamydiovou artritidou. HLA-DQ lokusy (DQA*0102, DQB*0602 ) jsou zkoumány u ţen s tubární infertilitou (Medková et al., 2001).

21

6 Prevence a terapie 6.1 Primární a sekundární prevence Primárně se prevence týká zábrany přenosu infekčního agens na zdravou osobu a sekundárně brání přechodu infekce do chronického stadia (Medková et al., 2001). Vyhledání a včasná léčba nakaţených osob je nejrychlejší způsob, který vede ke sníţení moţnosti dalšího přenosu (Pinkavová a Koliba, 2007). Nezastupitelnou roli má zdravotní a sexuální výchova mladých lidí (Medková, 2004). Jednou z moţností prevence dle odborníků z Velké Británie (1998) je tzv. oportunní screening, který doporučuje k vyhledávání tyto skupiny (Tab. 3)(Medková, 2004).

Tab. 3. Kategorie osob pro oportunní screening (upraveno podle Medková, 2004). Osoby trpící příznaky chlamydiové infekce

Asymptomatické osoby

ţeny se zánětlivým pánevním onemocněním (PID) muţi s nespecifickou uretritidou

sexuálně aktivní ţeny do 25 let

kojenci s konjuktivitidou a jejich rodiče pacienti s STD ţeny před interrupcí sexuální partneři infikovaných osob

pozitivní případy předat gynekologovi či urologovi za účelem dohledání a léčby asymptomatických případů u muţů

ţeny nad 25 let s novým sexuálním partnerem, nebo více partnery

6.2 Volba vhodné diagnostiky Vhodně zvolená diagnostika je důleţitou součástí prevence. Molekulárně biologickými metodami, detekujícími specifický úsek DNA C. trachomatis, je odhaleno 92-99% akutních převáţně asymptomatických infekcí. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena (Medková et al., 2001; Toršová, 2004).

6.3 Otázka vakcinace Vývoj efektivních očkovacích látek je ve fázi intenzivního výzkumu. Dekódováním genomu C. trachomatis se otevřely nové moţnosti pro vývoj účinné vakcíny (Pospíšil a Zralý, 2000). Perspektivně se jeví moderní typy očkovacích látek (např. DNA vakcíny či vakcíny 22

antiidiotypové)(Medková, 2004). Problémem zůstává odlišnost jednotlivých chlamydiových sérotypů a také individualita v imunitní odpovědi jedinců (Pinkavová a Koliba, 2007).

6.4 Terapie Základem léčby je včasná identifikace osob s akutní chlamydiovou infekcí, jejich správné přeléčení včetně všech sexuálních partnerů. Nevyhnutelné je se zdrţet veškerých sexuálních aktivit. Metoda PCR (polymerázová řetězová rekce) je doporučována ke kontrole efektivity léčby (Jarčuška et al., 2009). Antibiotickými preparáty první volby v léčbě onemocnění jsou makrolidy, tetracykliny nebo systémové chinolony. Důleţitá jsou farmakokinetická a farmakodynamická kritéria (velmi nízká minimální inhibiční koncentrace - účinná na chlamydie a vysoké koncentrace antibiotika přímo v buňkách infikované tkáně). Preparáty působí jen na RBs (replikace DNA), proto je důleţité, aby účinná koncentrace přetrvávala v infikované buňce po dobu několika vývojových cyklů (Toršová, 2004). Např. makrolidy jsou v infikované tkáni fagocytovány makrofágy, které jsou chemotakticky přitahovány k místu infekce, kde se projeví jejich účinnost i imunomodulační schopnosti (Medková et al., 2001; Jarčuška et al., 2009). Délka léčby makrolidy u nekomplikovaných infekcí je u ţen 7 dní u muţů 10 dní. Závaţným problémem zůstává léčba chronických infekcí. Přítomnost srůstů ve tkáních nebo opouzdřených abscesů, vyţaduje mnohdy chirurgický zákrok. Univerzální indikace na podávání antibiotik neexistuje. Platí, ţe léčba ţen by měla trvat 14-21 dní a muţů aţ 21 dní, častá je kombinace antibiotik doporučená specialistou (Medková et al., 2001; Miller, 2006).

23

7 Laboratorní diagnostika 7.1 Nepřímá diagnostika Zahrnuje detekci protilátek proti rodově i druhově specifickým antigenům C. trachomatis. Jedná se o tzv. nepřímý průkaz (průkaz protilátek, sérologické testy), které mají v případě lokalizované urogenitální infekce nízkou výpovědní hodnotu (Votava et al., 2003). Z krevního séra se vyšetřují izotopy IgA a IgG, IgM (Medková et al., 2001). Při průkazu specifických protilátek je vţdy nutné si uvědomit: tzv. „diagnostické okno“, tj. dobu uběhlou od nákazy do vytvoření detekovatelného mnoţství sérových protilátek, kdy se u lokálního zánětu protilátková odpověď vůbec nemusí dostavit. anamnestické protilátky IgG mají informativní charakter; vyjadřují, zda se pacient s infekcí setkal a nevylučují ani nepotvrzují aktivní infekci. pozitivita IgM nebo sérových IgA informuje o primoinfekci, reinfekci nebo chronické infekci; jejich negativita nikdy nevylučuje akutní lokální infekci; dlouhodobé přetrvávání protilátek je interpretačním problémem (Förstl et al., 2004). sérologie má význam při detekci chlamydiové pneumonie u primoinfekce novorozenců, kde prokazujeme IgM (Votava et al., 2003).

7.1.1 Nepřímá imunofluorescence Jde o sérologickou reakci k průkazu druhově specifických protilátek v séru. Antigenním substrátem jsou purifikované EBs. Přítomná protilátka v séru se naváţe na antigenní strukturu a vytvoří se imunokomplex AgxAb (antigen-protilátka). Po aplikaci konjugátu značeného fluorochromem dojde k vazbě na antigenní struktury, které ve fluorescenčním mikroskopu fluoreskují (Mahony et al., 2003).

7.1.2 ELISA Jedná se o imunoanalytickou metodu. Antigen je imobilizován na pevném nosiči (jamka mikrotitrační destičky). Pokud jsou v testovaném séru přítomny specifické protilátky, vytvoří se imunokoplex AgxAb. Po aplikaci konjugátu značeného enzymem, inkubaci a přidání 24

substrátu dojde k enzymatické reakci. Substrát je přeměněn na barevný produkt, jehoţ intenzita se detekuje spektrofotometricky (ELISA reader).

7.1.3 Western blot Proteinové antigeny chlamydií jsou rozděleny elektroforeticky na SDS-PAGE podle molekulové hmotnosti a poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu v tzv. elektroblotu. Nitrocelululozový prouţek je ponořen do pufrem ředěného vyšetřovaného séra. Po inkubaci se místa s navázanými protilátkami proti jednotlivým rodovým i druhovým antigenům (MOMP, cHSP, MIP) vizualizují prostřednictvím konjugátu (zvířecí protilátky proti lidskému Ig) značené enzymem. Po přidání substrátu dojde k enzymatické reakci a v místech, kde došlo ke specifické vazbě AgxAb je patrná barevná zóna – pozitivní reakce. Podle přiloţené šablony lze odečíst přítomnost protilátek. WB (western blot) se vyuţívá k průkazu chronických a perzistujících infekcí jako konfirmační test (Litzman et al., 2003; Teislerová a Ţampachová, 2007).

7.2 Přímá diagnostika Infekční agens se detekuje přímo z klinického materiálu. Hlavní podmínkou je správně provedený odběr. Druh klinického materiálu a typ odběrového setu musí být kompatibilní s daným laboratorním testem. Vzhledem k nitrobuněčné lokalizaci C. trachomatis, musí být stěr proveden tak, aby došlo k abrazi buněk sliznice (Mahony et al., 2003).

7.2.1 Kultivace na tkáňové kultuře Klinické vzorky se kultivují na tkáňové kultuře (Hep-2 a HeLa buňky) ošetřené cykloheximidem, který eliminuje metabolismus hostitelských buněk (Mahony et al., 2003). Centrifugací se dosáhne adheze chlamydií na buňky tkáňové kultury. Po inkubaci (48-72h) dojde k vytvoření intraplasmatických inkluzí, které lze detekovat fluorescenčně značenými monoklonálními protilátkami, barvením Lugolovým roztokem či Giemsou. Metoda je technicky i časově náročná, obtíţně standardizovatelná a finančně nákladná. Klade vysoké nároky na transportní podmínky. Z těchto důvodů se v rutinní diagnostice nevyuţívá (Mahony et al., 2003; Votava et al., 2003). 25

7.2.2 Metody detekce antigenu Přímá mikroimunofluorescence MIF Po aplikaci a fixaci vzorku na podloţní sklo se přidá monoklonální protilátka proti hledanému antigenu C. trachomatis značená fluoresceinem. Pokud je antigen ve vzorku přítomen, dojde k fluorescenci, kterou lze pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu (Black, 1997; Mahony et al., 2003). Metoda EIA Monoklonální protilátka proti LPS chlamydiovému antigenu je navázána na pevnou fázi. V přítomnosti hledaného antigenu ve vzorku se vytvoří komplex AbxAg. Vazbou konjugátu a následně substrátu, dojde k vytvoření barevného produktu, jehoţ intenzitu lze změřit např. spektrofotometricky. Konfirmace monoklonálními protilátkami proti specifickému epitopu LPS C. trachomatis bývá nutná k vyloučení falešně pozitivních výsledků (zkříţená reaktivita s jinými gramnegativními bakteriemi)(Barnes, 1989).

7.3 Molekulárně biologické metody Metody přímého průkazu popsané v předchozí části (viz. 7.2) jsou charakteristické svými nároky na transport, uchování vzorku, techniku zpracování a standardizaci. Vykazují pouze 60-80 % citlivost, proto jsou nahrazovány vysoce specifickými metodami molekulárně biologickými, které umoţňují přímý průkaz DNA patogena (Mahony et al., 2003). Dělí se na metody bez amplifikace (namnoţení) úseku nukleové kyseliny a metody amplifikační.

7.3.1 Metody bez amplifikace Příkladem je metoda tzv. hybridizace se sondami. Hybridizační sondy jsou krátké úseky nukleových kyselin (20-50 nukleotidů) schopné specifické vazby s komplementární sekvencí úseku nukleové kyseliny patogena za tvorby stabilního dvouřetězcového komlpexu tzv. hybridu. Sensitivita testu je cca 104 molekul nukleové kyseliny na 1 ml vzorku a postačuje pouze k ozřejmění genetické příslušnosti vykultivovaného mikroba. K průkazu infekčního agens v klinickém materiálu je tato detekční mez nedostatečná, proto je vhodné pouţívat metody s amplifikací úseku nukleové kyseliny (Pavlík, 2. část). 26

7.3.2 Amplifikační metody Amplifikační metody (NAATs -Nucleic Acid Amplification Tests), např. LCR (Ligázová řetezová reakce) a PCR (Polymerázová řetězová reakce) jsou preferovány pro svou vysokou citlivost (92-99%) a specificitu (Mahony et al., 2003; Van Der Pol, 2006). Jedinečný úsek nukleové kyseliny patogena je exponenciálně amplifikován aţ do dosaţení potřebného mnoţství kopií, které jsou detekovatelné zvoleným systémem (Šmarda et al., 2008).

7.3.2.1 LCR (Ligase Chain Reaction) Ligázová řetezová reakce (LCR) byla prvně popsána v roce 1989 Wuem a Walacem (Pavlík, 7. část). Jde o metodu amplifikace sondy zaloţené na ligaci oligonukleotidových sond v závislosti na jejich vazbě na cílovou DNA. LCR vyţaduje čtyři oligonukleotidy (LCRprimery). Dva sousední, které specificky hybridizují k jednomu řetězci cílové DNA a další komplementární dvojici sousedních oligonukleotidů (Šmarda et al., 2008). Komerční soupravy na podkladě LCR uvedla na český trh firma Abbott Laboratories,s.r.o. v r. 1995. K detekci byl pouţit adaptovaný systém MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay), vyuţívající mikročástice s magnetickým jádrem a sond značených hapteny. Starší evaluační studie diagnostických LCR souprav pro STD deklarovaly jako hlavní výhodu LCR oproti PCR niţší výskyt inhibic. Tento závěr je diskutabilní. Systém LCR neobsahoval IS (interní standard), proto nemohla být inhibice DNA polymerasy prokázána (Pavlík, 7část). Nemoţnost kvantifikace produktů reakce, absence interního standardu a obtíţná inaktivace postamplifikačních produktů tento systém vyřadila z rutinní klinické diagnostiky (Hayden, 2004).

7.3.2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR byla koncipována v r. 1983 Kary B. Mullisem (Nobelova cena za chemii v r. 1993). Podstatou reakce je opakující se enzymová syntéza nových řetězců specifických úseků DNA ve směru 5´→3´ prostřednictvím DNA polymerasy. Inkriminovaný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, které se váţou na protilehlé řetězce DNA tak, ţe jejich 3´konce směřují proti sobě. Jde o proces, při kterém se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři cyklicky se opakující kroky (Obr. 6), v průběhu kterých probíhají tři odlišné děje s odlišnými nároky na teplotu. Konečným produktem PCR jsou amplikony (fragmenty DNA) definované délky (desítky aţ tisíce bp) (Šmarda et al., 2008). 27

Obr. 6. Schéma standardní PCR (upraveno podle www.dialogica.com.ar/medline/archives/004975.php). 1. denaturace DNA (94-98°C) – rozdělení řetězců DNA 2. anealing (30-65 °C) – připojení primerů k odděleným řetězcům DNA 3. extense (72°C) – syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA polymerasy

Real-time PCR Nejpouţívanější aplikace PCR v současné době. Umoţňuje průběţné sledování reakce tzv. „v reálném čase" pomocí fluorescenčních sond (TaqMan beacons“, sondy Scorpions

®

TM

sondy, sondy „molecular

aj.). V kaţdém cyklu reakce je fluorescence detekována a

hodnoty se zaznamenávají do grafu. Výsledkem pozitivní amplifikace je typická amplifikační křivka (Obr. 7). K hlavním výhodám oproti konvenční PCR patří moţnost přesného stanovení výchozího počtu kopií sekvence DNA, vysoká specifita, reprodukovatelnost, niţší časová náročnost a niţší pravděpodobnost kontaminace amplifikačními produkty (Wittwer a Kusukawa ,2004). Amplifikační křivka Čím dříve amplifikační křivka dosáhne exponenciální fáze, popř. překročí určitý fluorescenční práh umístěný do této fáze, tím více startovních templátových molekul bylo přítomno ve vzorku na počátku reakce (Wittwer a Kusukawa, 2004). 28

Obr. 7. Model amplifikační křivky (upraveno podle http://www.generi-biotech.com). 1. „background" – fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot 2. exponenciální fáze – nárůst produktu 3. fáze plató – mnoţství amplifikovaného produktu se z důvodu vysycení reakčních sloţek jiţ nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní Ct „treshold cycle "(fluorescenční práh)

Možnost kvantifikace metodou real – time PCR Absolutní kvantifikace (Obr. 8), která se pouţívá např. při detekci DNA mikroorganismů, přímo determinuje výchozí počet kopií cílových molekul. Existuje lineární vztah mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a Ct (treshold cycle-fluorescenční práh) příslušné amplifikační křivky. Amplifikujeme-li vzorek o neznámé koncentraci společně s naředěnou sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibrační přímku, ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku (Wittwer a Kusukawa, 2004). A)

B)

Obr. 8. Modelové křivky absolutní kvantifikace (upraveno podle http://www.generi-biotech.com). A) ukázka amplifikace 3 kontrol o různých koncentracích vstupní DNA B) kalibrační křivka s vynesenými hodnotami Ct pro jednotlivé vzorky proti jejich koncentracím

29

8 Správná laboratorní diagnostika PCR C. trachomatis Metodika provádění PCR klade extrémní nároky na dodrţování správné laboratorní práce. Počínaje preanalytickou fází, která je prezentována správnou indikací a samotným odběrem klinického materiálu za pouţití vhodné odběrové soupravy (Black, 1997; Mahony et al., 2003).

8.1 Preanalytická fáze Správně provedený odběr je klíčovým momentem v preanalytické fázi a výrazně ovlivňuje validitu výsledku vyšetření. K průkazu DNA C. trachomatis se nehodí bakteriologické transportní media (obsahují inhibitory) (Votava, 2001). Vzhledem k nitrobuněčné lokalizaci chlamydií, je nutné odběry provádět razantně, aby došlo k abrazi slizničních buněk (Black, 1997).

8.1.1 Typy klinických materiálů a technika odběru výtěr z cervixu - po odstranění exocervikálního hlenu se provede výtěr z endocervixu abrazivním tamponem nebo kartáčkem rotačním pohybem po dobu 20 sekund výtěr z uretry (ženy i muži) - odběr z uretry se provádí abrazivním tamponem, šroubovitým vsunutím do hloubky 3 - 4 cm (před odběrem 2 hodiny nemočit) stěry ze spojivky - pro diagnostiku očních infekcí se odebere tekutina nebo se provede stěr ze spojivkového vaku či z rohovky moč - pro vyšetření moče se odebírá 10-30 ml první porce (nejlépe první ranní) moče do sterilní nádobky bez transportního media sperma - pro stanovení chlamydiové kontaminace spermatu je třeba vyšetřit 200 μl ejakulátu; odběr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media a spermicidů za 2-3 dny po poslední ejakulaci rektální výtěr - stěr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media nazofaryngeální výtěr- stěr se provede do sterilní zkumavky bez transportního media

30

8.2 Analytická fáze První částí analytické fáze je izolace nukleové kyseliny z primárního vzorku. Laboratoř má moţnost pro izolaci DNA za účelem vyšetření C. trachomatis vyuţít komerčních souprav, které mohou být manuální nebo automatické. Manuální soupravy jsou obecně levnější, ale manipulace s nimi je pracnější, tudíţ nesou vyšší riziko nevalidních výsledků (falešně negativní výsledky, kříţová kontaminace). Automatické izolační systémy přináší výhodu niţší pracnosti a standardnějších výsledků, ale jsou vykoupeny vyšší cenou. Vlastní PCR je další částí diagnostického procesu. Některé laboratoře si pro průkaz C. trachomatis připravují vlastní PCR reakce, tzv. „home made“ metody. Tento přístup přináší výhodu velmi nízké ceny, ale je náročný na vysokou odbornost personálu, pracnost a náročnou kontrolu kvality celého procesu (Friedecký et al., 2004). Z toho důvodu většina laboratoří přechází na vyuţívání komerčních CE IVD certifikovaných souprav.

8.2.1 Kontrola kvality diagnostického procesu 8.2.1.1 Vnitřní kontrola kvality (VKK) Diagnostický proces musí obsahovat systém kontrol (VKK), který umoţní vyloučit falešně pozitivní a falešně negativní výsledky. Hlavní příčinou těchto nevalidních výsledků bývá kontaminace či inhibice diagnostického systému.

8.2.1.1.1 Kontrola falešně pozitivních výsledků Kontaminace reakce Vysoká specifita a senzitivita metody způsobuje, ţe kontaminace i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA je výsledkem falešně pozitivní reakce. Bývá nejčastěji způsobena kontaminací vzorků amplikony z předchozích reakcí, které jsou ideálními cílovými strukturami pro primery. Pro minimalizaci tohoto problému jsou doporučeny standardní postupy (uspořádání laboratoře, práce v laminárním boxu, pravidelná dekontaminace, vyhrazené sady pomůcek, kvalitní mikrozkumavky, pouţívání špiček s filtrem, minimalizace pipetovacích kroků, častá výměna rukavic, přidávání UDG do vzorku, apod.)(Hayden, 2004). K vyloučení falešné pozitivity výsledku z výše uvedených důvodů je doporučeno provádět tyto typy kontrol: 31

negativní kontrolu izolace (negativní vzorek, ukazatel moţné kontaminace v průběhu izolace). negativní kontrolu amplifikace (např. destilovaná voda upravená pro PCR, ukazatel moţné kontaminace v průběhu amplifikace, prochází jen druhou analytickou fází).

8.2.1.1.2 Kontrola falešně negativních výsledků Metodika provádění PCR je citlivá na účinnost izolace DNA a přítomnost inhibitorů DNA polymerasy, které způsobují falešně negativní výsledky. Do diagnostického procesu je nutné zařadit systémy kontrol, které tyto vlivy mohou odhalit. Inhibice reakce interní kontrola inhibice (amplifikace interní kontroly probíhá v jedné zkumavce s testovanou DNA, v případě inhibice DNA polymerasy, vykazuje negativní signál) Neúčinná izolace pozitivní kontrola izolace (pozitivní vzorek, kontroluje správnost provedení celého procesu, neumoţňuje kontrolovat účinnost izolace konkrétního vzorku) interní kontrola izolace (můţe zároveň slouţit jako interní kontrola inhibice, přidává se ke vzorku před izolací, umoţňuje kontrolu účinnosti izolace konkrétního vzorku) Nízká sensitivita PCR reakce pozitivní kontrola (koncentrace kontroly se blíţí prahu detekce pouţité PCR metody)

8.2.1.2 Externí kontrola kvality (EKK) Diagnostické laboratoře mají moţnost ověření kvality svého analytického procesu na panelech EKK (INSTAND e.V-Německo; QCMD-Velká Británie). Jedná se o neznámé vzorky s přidaným patogenem. V rámci tohoto systému, tak laboratoře mají jednak moţnost kontroly nad svými postupy a moţnost porovnání kvality výsledků s jinými laboratořemi.

32

9 Cíl bakalářské práce Výběr vhodné diagnostiky je základním předpokladem prevence a účinné terapie chlamydiových infekcí. Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Pro svou vysokou citlivost a specificitu jsou preferovány především amplifikační metody průkazu nukleových kyselin C. trachomatis zaloţené na polymerázové řetězové reakci (PCR). Klíčovým krokem diagnostického procesu je účinná a sensitivní izolace DNA. V diagnostických laboratořích se především kvůli ceně běţně vyuţívá manuálních metod izolace nukleových kyselin. Stále vyšší poţadavky na standardizaci a kvalitu výsledků poskytovaných diagnostickými laboratořemi vedou k zavádění automatických provozů. Bakalářská práce si z těchto důvodů dává za cíl srovnat účinnost, sensitivitu a variabilitu manuální kolonkové izolace zaloţené na principu vazby uvolněné DNA na ionexovou membránu s automatickou izolací zaloţenou na purifikaci DNA s vyuţitím magnetických částic.

33

II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 10 Materiál a metody 10.1 Struktura experimentu 10.1.1 Účel testu Srovnání účinnosti a sensitivity manuální kolonkové izolace DNA (Pathogen Free DNA Kit; GeneProof) a automatické izolace zaloţené na purifikaci nukleových kyselin na magnetických částicích (Arrow BUGS´n BEADSTM; NorDiag).

10.1.2 Schéma experimentu 1.

Sériovým ředěním přirozeně infikovaného vzorku byla připravena koncentrační řada vzorků od nejkoncentrovanějšího nad detekčním limitem po nejméně koncentrovaný pod detekční limit PCR detekční metody.

2.

DNA kaţdého takto připraveného vzorku byla izolována 6 krát manuální kolonkovou soupravou GeneProof (M) a 6 krát automatickým izolačním procesem firmy NorDiag (A).

3.

Kaţdý izolovaný vzorek byl vyšetřen ve 3 opakováních na přítomnost DNA C. trachomatis metodou real-time PCR certifikovanou soupravou pro in vitro diagnostiku (CE IVD) (Chlamydia trachomatis PCR Kit; GeneProof) (Tab. 4).

4.

Hodnocena byla shoda rozloţení pozitivních záchytů u jednotlivých typů izolací.

Tab. 4. Schéma experimentu. Ředění pozitivní moče

30x

M Typ izolace* Počet opakování izolace pro každé 6 ředění

90x

270x

810x

2430x

7290x

Celkový počet izolací M A

A

M

A

M

A

M

A

M

A

M

A

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

Celkový počet PCR vyšetření

Celkový počet PCR vyšetření pro 18 každý typ izolace a ředění

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

216

Počet opakování PCR vyšetření každého izolovaného vzorku

36

36

34

10.2 Příprava koncentrační řady pozitivního vzorku Sériovým ředěním přirozeně infikovaného vzorku byla připravena koncentrační řada vzorků od nejkoncentrovanějšího vzorku nad detekčním limitem po nejméně koncentrovaný pod detekčním limitem pouţité PCR diagnostické metody (Tab. 5). Tab. 5. Příprava koncentrační řady sériovým ředěním pozitivního vzorku. Faktor ředění Moč negativní

30x 90x 270x 810x 2430x 7290x 8120 5600 5600 5600 5600 5600 280 2800 2800 2800 2800 2800 Pozitivního Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. Vzorku č. Moč pozitivní vzorku 1 2 3 4 5 pacienta 5600 5600 5600 5600 5600 8400 Konečný objem vzorku 560 560 560 560 560 840 Interní standard 6x700 6x700 6x700 6x700 6x700 6x700 Alikvotace 6x200 6x200 6x200 6x200 6x200 6x200 Pozn. Objemy jsou uvedeny v µl.

Pro přípravu koncentrační řady byl pouţit přirozeně pozitivní vzorek moče pacienta odeslaného na PCR vyšetření na přítomnost DNA C. trachomatis. Tento vzorek byl sériově ředěn v negativní moči zdravého dárce. Ke kaţdému takto připravenému ředění byl přidán interní standard (IS) v poměru 1 µl na 10 µl. vzorku. Interní standard je součástí komerční diagnostické soupravy pro PCR detekci C. trachomatis (Chlamydia trachomatis PCR Kit, kat. č. CHT/ISEX/100, GeneProof a.s.). Jedná se o uměle připravený genetický konstrukt plasmidu a insertu obsahující sekvence komplementární k primerům pouţitým pro PCR detekci DNA C. trachomatis uvedenou komerční diagnostickou soupravou. Kopurifikace interního standardu společně s DNA vyšetřovaného vzorku umoţňuje kontrolu účinnosti izolačního procesu a průběhu PCR reakce. Umoţňuje tedy kontrolovat falešně negativní výsledky z důvodu neúčinné izolace DNA nebo inhibice PCR reakce. Alikvotace a uchování Z kaţdého takto připraveného ředění bylo připraveno 6 alikvotů o objemu 700 µl pro účely automatické izolace nukleových kyselin a 6 alikvotů o objemu 200 µl pro účely manuální izolace DNA. Vzorky byly do zpracování uchovávány při -70 °C.

35

10.3 Izolace DNA Kaţdé ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku bylo podrobeno 6 opakováním manuální izolace DNA (PathogenFree DNA Isolation Kit; GeneProof) a 6 opakováním automatické izolace nukleových kyselin (Arrow BUGS´n BEADSTM; NorDiag) Tab. 6. Schéma izolačního experimentu.

Ředění pozitivního vzorku Počet opakování izolace Celkem izolací Iniciální objem vzorku Eluční objem vzorku

AUTOMATICKÁ IZOLACE Arrow BUGS´n BEADSTM 30x 90x 270x 6 6 6

810x 6

2439x 6

7290x 6

2439x 6

7290x 6

36 700 µl 100 µl

MANUÁLNÍ IZOLACE PathogenFree DNA Isolation Kit 30x 90x 270x 810x Ředění pozitivního vzorku 6 6 6 6 Počet opakování izolace 36 Celkem izolací 200 µl Iniciální objem vzorku 100 µl Eluční objem vzorku

10.3.1 Manuální izolace DNA Kaţdé ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku bylo podrobeno 6 opakováním manuální izolace nukleových kyselin komerční soupravou PathogenFree DNA Isolation Kit (GeneProof). Iniciální objem vzorku vstupující do izolace byl 200 µl a purifikovaná DNA byla rozpuštěna ve 100 µl elučního pufru (Tab. 6). Vzorky byly izolovány ve 3 izolačních cyklech po 12 kusech a to tak, ţe v rámci 1 izolačního cyklu byly provedeny 2 izolace kaţdého ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku. Takto zvolený postup umoţňuje sledovat moţnou kříţovou kontaminaci negativních vzorků ze vzorků pozitivních. Princip Kolonková manuální izolace nukleových kyselin soupravou GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit je zaloţena na lýze buněk v prostředí chaotropních iontů a proteinasy K s následnou vazbou uvolněné DNA na ionexovou membránu ve speciální purifikační kolonce, vyčištění vázané nukleové kyseliny promývacími pufry a uvolnění purifikované DNA do elučního pufru (Obr. 9).

36

1.

Lýza buněk v prostředí chaotropních iontů a proteinasy K při 70 °C.

2.

Vazba uvolněné DNA na silika membránu v purifikační kolonce.

3.

Promytí purifikační kolonky s navázanou DNA promývacími pufry centrifufigací při 14 000 rpm.

4.

Vysušení prázdné kolonky centrifugací při 14 000rpm

5.

Uvolnění purifikované DNA z ionexové membrány do elučního pufru.

Obr. 9. Princip manuální kolonkové izolace.

10.3.2 Automatická izolace DNA Stejným způsobem bylo kaţdé ředění připravené koncentrační řady podrobeno 6 opakováním automatické izolace nukleových kyselin komerční izolační soupravou Arrow BUGS´n BEADSTM (NorDiag) na automatické pipetovací stanici NorDiag Arrow (NorDiag). Iniciální objem vzorku vstupující do izolace byl 700 µl a purifikovaná DNA byla uvolněna do 100 µl elučního pufru (Tab. 6). Automatická pipetovací stanice umoţňuje maximálně 12 izolací v jednom izolačním cyklu. Vzorky byly (stejně jako v případě manuální izolace) zpracovávány ve 3 izolačních cyklech. V rámci 1 izolačního cyklu byly provedeny vţdy 2 izolace kaţdého ředění připravené koncentrační řady pozitivního vzorku. Princip Izolační souprava vyuţívá patentované BUGS´n BEADS TM technologie. Princip izolace je zaloţen na vyuţití paramagnetických částic k vyvázání mikroorganismů z roztoku, purifikaci jejich nukleových kyselin na těchto částicích a uvolnění vyčištěné DNA do elučního pufru (Obr. 10). Souprava je určena pro automatickou izolaci nukleových kyselin z moče na automatické izolační pipetovací stanici NorDiag Arrow (NorDiag). 37

1.

Paramagnetické částice jsou smíchány se vzorkem.

2.

Vazba mikroorganismů na paramagnetické částice a jejich magnetická separace od zbytku vzorku.

3.

Mikroorganismy jsou lyzovány v prostředí lyzačního pufru.

4.

Po přidání 96% ethanolu dojde k vazbě uvolněné DNA na magnetické částice.

5.

Magnetické částice s navázanou DNA jsou několikrát promyty promývacími pufry.

6.

Purifikovaná DNA je při 80 °C uvolněna do elučního pufru.

Obr. 10. Princip automatické izolace založené na BUGS´n BEADSTM technologii.

10.4 Detekce DNA C. trachomatis metodou real-time PCR Detekce přítomnosti DNA C. trachomatis ve vzorcích byla prováděna metodou real-time polymerázové řetězové reakce (real-time PCR) s pouţitím CE IVD certifikované soupravy (Chlamydia trachomatis PCR KIT, Kat. č. CHT/ISEX/100; GeneProof) na přístroji RotorGeneTM 6000 (Corbett Research).

Princip detekce Diagnostická souprava je určena pro simultánní detekci genomové a plasmidové DNA Chlamydia trachomatis metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) a měření nárůstu koncentrace amplifikačního produktu v průběhu PCR pomocí fluorescenčně značené sondy (real-time PCR). Detekce je cílená na multikopiovou sekvenci kryptického plasmidu umoţňující vysokou sensitivitu vyšetření a zároveň na sekvenci genu kódujícího bakteriální 16S RNA jedinečnou pro Chlamydia trachomatis umoţňující vysokou specificitu reakce. Přítomnost DNA chlamýdií ve vzorku je indikována nárůstem fluorescence FAM fluoroforu. Součástí soupravy je interní standard (IS), který umoţňuje kontrolu moţné inhibice PCR reakce a účinnost DNA izolačního procesu. Pozitivní amplifikace IS je detekována ve 38

fluorescenčním kanálu pro JOE fluorofor. Detekční souprava vyuţívá technologii “hot start”, která minimalizuje nespecifické reakce a zajišťuje maximální sensitivitu, protoţe obsahuje uracil-DNA-glykosylázu

(UDG)

kontrolující

moţnou

kontaminaci

PCR

reakce

amplifikačními produkty. Schéma řazení vzorků Kaţdý izolovaný vzorek byl podroben 3 opakovaným PCR vyšetřením na přítomnost nukleových kyselin C. trachomatis. Kapacita přístroje umoţňuje provést 36 PCR reakcí najednou. Struktura provádění experimentu byla zvolena tak, aby v rámci jednoho cyklu bylo vyšetřeno 1 opakování celé ředící řady manuální a automatické izolace s pouţitím stejné šarţe diagnostické soupravy. Takto strukturovaný experiment poskytuje nejhomogennější data (Tab. 7). Tab. 7. Schéma řazení vzorků pro jeden cyklus PCR vyšetření. PCR reakce č. Ředění pozitivního vzorku Počet opakování PCR každého vzorku PCR reakce č. Ředění pozitivního vzorku Počet opakování PCR každého vzorku

AUTOMATICKÁ IZOLACE 1-3 4-6 7-9 30x 90x 270x 3

3

3

MANUÁLNÍ IZOLACE 19-21 22-24 25-27 30x 90x 270x 3

3

3

10-12 810x

13-15 2439x

16-18 7290x

3

3

3

28-30 810x

31-33 2439x

34-36 7290x

3

3

3

10.5 Kvantifikace DNA C. trachomatis Pro kvantitativní stanovení DNA C. trachomatis ve vzorcích byla opět pouţita diagnostická souprava firmy GeneProof (Chlamydia trachomatis PCR KIT, Kat. č. CHT/ISEX/100) a analýza byla provedena na přístroji Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Research).

10.5.1 Příprava kalibrační řady Pro tyto účely bylo nutno připravit kvantitativní kalibrační řadu v rozsahu 104 – 101 kopií/µl sériovým desetinásobným ředěním pozitivní kontroly o koncentraci 106 kopií/µl (kontrola byla dodána výrobcem PCR diagnostické soupravy)(Tab. 9).

39

Tab. 9. Příprava kvantitativní kalibrační řady. Koncentrace pozitivní kontroly (kopie/µl) DDW* PK**

105

104

103

102

101

90 µl 10 µl PK o konc. 106

90 µl 10 µl PK o konc. 105

90 µl 10 µl PK o konc. 104

90 µl 10 µl PK o konc. 103

90 µl 10 µl PK o konc. 102

*DDW – Nuclease-Free Water (Qiagen) **PK – pozitivní kontrola (GeneProof)

10.5.2 Stanovení koncentrace DNA Byla stanovována koncentrace DNA C. trachomatis u pozitivního vzorku ředěného 30x po manuální a automatické izolaci (Tab. 8). Tab. 8. Schéma řazení vzorků pro kvantifikaci DNA C. trachomatis. PCR reakce č. 1-6 7-12 13-15 16-18 A M PK 104 PK 103 Typ vzorku Vysvětlivky: A - 30x ředěný pozitivní vzorek zpracovaný automatickou izolací M - 30x ředěný pozitivní vzorek zpracovaný manuální izolací PK – pozitivní kontrola s uvedenou koncentrací v kopiích/µl NK – negativní kontrola

19-21 PK 102

22-24 PK 101

25-26 NK

10.6 Statistické vyhodnocení Data byla zpracovávána statistickým programem Minitab 15 (Minitab Inc.). Pro ověřování předpokladu normality rozloţení získaných dat byl pouţit Anderson-Darling test normality. Srovnávání středních hodnot kvantitativních dat bylo prováděno T-testem (Studentův test). Rozptyly hodnot kvantitativních dat byly hodnoceny F-testem (za předpokladu normálního rozloţení dat) a Levene-testem, který nepředpokládá normálně rozdělená data. Sensitivita vyšetření byla stanovena Probit analýzou. Hodnoty obou izolací byly proloţeny Weibullovým rozdělením. Vhodnost pouţití Weibullova rozdělení byla ověřena Pearsonovým testem dobré shody. Pro odhad koeficientů rozdělení byl pouţit Newtonův-Raphsonův algoritmus. Pro porovnání sensitivity obou izolací byla testována shoda parametru měřítka (Scale) se stejným parametrem tvaru (Shape). Shodnost středních hodnot Ct interního standardu byla testována Analýzou rozptylu (ANOVA – Analysis of Variance) a rozptyl hodnot Ct byl testován Levene-testem při předpokladu nenormálně rozloţených dat a Bartlett-testem za předpokladu normálního rozloţení dat.

40

11 Výsledky a diskuse 11.1 Porovnání účinnosti manuální a automatické izolace Pro účely srovnání manuální a automatické izolace DNA byly připravené izolované vzorky o nejvyšší koncentraci (30x ředěný pozitivní vzorek) podrobeny kvantitativnímu stanovení přítomnosti DNA C. trachomatis metodou real-time PCR (Obr. 11). Vzorky o niţší koncentraci nebyly do této analýzy zařazeny, protoţe se sniţující se koncentrací k limitu detekce se zvyšuje variabilita měření a také z důvodu, ţe niţší koncentrace připravených vzorků jiţ nevykazovaly 100% detekci C. trachomatis ve všech opakováních (Tab. 12). A)

B)

Obr. 11. Real-time PCR. A) Grafické zobrazení amplifikačních křivek stanovovaných vzorků a kalibračních kontrol. B) Zobrazení kalibrační křivky (vzorky jsou označeny červenými body a kalibrační kontroly body modrými)

41

Srovnávané izolační metody DNA vyţadují odlišný objem vzorku vstupujícího do izolačního procesu (700 µl vzorku pro automatickou a 200 µl vzorku pro manuální izolaci). Eluční objem obou metod je ale stejný (100 µl). V průběhu manuální izolace dochází k zakoncentrování vzorku 2krát a v případě automatické izolace dokonce 7krát. Protoţe se do PCR reakce přidává fixní objem izolované DNA (10µl), pak by rozdíl kvantitativního stanovení DNA C. trachomatis ve stejném vzorku izolovaném srovnávanými metodami měl být 3,5 násobný ve prospěch automatické metody. Výsledky kvantitativního stanovení DNA C. trachomatis jsou uvedeny v tabulce (Tab. 10). Průměrná hodnota koncentrace DNA C. trachomatis ve vzorku po manuální izolaci je 22,59 kopií/µl a po automatické izolaci 37,97 kopií/µl. Srovnání středních hodnot T-testem (Tab. 11) a provedený F-test (předpokládá normálně rozdělená data) a Levene-test (nepředpokládá normálně rozdělená data) rovnosti rozptylu (Obr. 12) neprokázaly statisticky významný rozdíl (p>0,05) ve stanovení koncentrace C. trachomatis ve výsledném izolátu DNA mezi manuální a automatickou metodou purifikace nukleových kyselin. Pokud vezmeme v úvahu faktor zakoncentrování vzorku v průběhu izolace, pak by při střední hodnotě koncentrace vzorku 22,59 kopií/µl po manuální izolaci měla být hodnota koncentrace DNA C. trachomatis ve vzorku po automatické izolaci 79,07 kopií/µl. Očekávaný rozdíl středních hodnot mezi srovnávanými izolačními metodami je tedy 56,48 kopií/µl. Při dané variabilitě a počtu hodnot by se uţ jako statisticky významný projevil rozdíl středních hodnot o velikosti 35,37 kopií/µl (Síla testu). Zjištěný rozdíl středních hodnot dosahuje pouze hodnoty 15,38 kopií/µl. Z toho se dá usuzovat na niţší účinnost automatické izolační metody DNA ve srovnání s metodou manuální.

42

Tab. 10. Výsledky kvantitativního stanovení DNA C. trachomatis ve vzorku. No.

Name

Type

Ct

Calc Conc (copies/ul)

1

BnB CHT 30x

Unknown

35,84

6,38E+01

2

BnB CHT 30x

Unknown

36,91

3,42E+01

3

BnB CHT 30x

Unknown

36,64

4,00E+01

4

BnB CHT 30x

Unknown

37,14

2,98E+01

5

BnB CHT 30x

Unknown

36,29

4,92E+01

6

BnB CHT 30x

Unknown

38,89

1,08E+01

7

GP CHT 30x

Unknown

41,82

1,97E+00

8

GP CHT 30x

Unknown

38,36

1,47E+01

9

GP CHT 30x

Unknown

36,58

4,14E+01

10

GP CHT 30x

Unknown

37,86

1,97E+01

11

GP CHT 30x

Unknown

36,56

4,20E+01

12

GP CHT 30x

Unknown

38,24

1,58E+01

13

PK 10000

Standard

26,85

1,19E+04

14

PK 10000

Standard

27,02

1,08E+04

15

PK 10000

Standard

27,43

8,45E+03

16

PK 1000

Standard

30,65

1,31E+03

17

PK 1000

Standard

30,93

1,10E+03

18

PK 1000

Standard

31,24

9,26E+02

19

PK 100

Standard

36,16

5,28E+01

20

PK 100

Standard

35,22

9,14E+01

21

PK 100

Standard

35,21

9,17E+01

22

PK 10

Standard

39,62

7,09E+00

23

PK 10

Standard

37,97

1,85E+01

24

PK 10

Standard

38,72

1,19E+01

25

NTC

NTC

NEG (NTC)

26

NTC

NTC

NEG (NTC)

Vysvětlivky: BnB CHT 30x – 30x ředěný vzorek izolovaná automatickou metodou GP CHT 30x - 30x ředěný vzorek izolovaná manuální metodou PK – pozitivní kontrola s uvedenou koncentrací v kopiích/µl NTC – negativní kontrola Test for Equal Variances for Calc Conc (copies/ul) F-Test Test Statistic P-Value

BnB C HT 30x

1,27 0,799

Izolace

Lev ene's Test Test Statistic P-Value

GP C HT 30x

10

20 30 40 95% Bonferroni Confidence Intervals for StDevs

0,04 0,845

50

Izolace

BnB C HT 30x

GP C HT 30x

0

10

20

30 40 Calc Conc (copies/ul)

50

60

70

Obr. 12. Test rovnosti rozptylů kvantitativního stanovení koncentrací DNA C. trachomatis. Upravený výstup ze statistického programu Minitab 15.

43

Tab. 11. Test rovnosti středních hodnot kvantitativního stanovení koncentrací DNA C. trachomatis. Upravený výstup ze statistického programu Minitab 15 . Two-sample T for Calc Conc (copies/ul) Izolace BnB CHT 30x GP CHT 30x

N 6 6

Mean 38,0 22,6

StDev 18,0 16,0

SE Mean 7,3 6,5

Difference = mu (BnB CHT 30x) - mu (GP CHT 30x) Estimate for difference: 15,37 95% CI for difference: (-6,49; 37,24) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 1,57 Both use Pooled StDev = 16,9972

P-Value = 0,148

DF = 10

11.2 Srovnání celkové sensitivity vyšetření Pro stanovení sensitivity molekulárně mikrobiologických metod se pouţívá Probit analýza. Při Probit analýze je vzorek sériově ředěn aţ pod detekční limit metody. Kaţdé ředění vzorku je podrobeno opakovanému vyšetření a u kaţdého ředění je sledován počet pozitivních výsledků. Sensitivita vyšetření se pak stanovuje jako nejniţší průměrná detekovatelná hodnota při 95% záchytu (při této hodnotě je 95 vzorků ze 100 pozitivních). Experiment byl prováděn na sériově ředěném přirozeně infikovaném vzorku pacienta (Tab. 5) s předpokladem, ţe vzhledem k vyššímu faktoru zakoncentrování (7x) v průběhu automatické izolace nukleových kyselin ve srovnání s manuální izolací (2x), bude v případě automatické izolace podíl pozitivních výsledků u více ředěných vzorků vyšší. Vzhledem k tomu, ţe výsledné kvantitativní hodnoty se u nejkoncentrovanějších vzorků po izolaci DNA oběma metodami nelišily a vstupní koncentrace DNA C. trachomatis ve vzorku pro obě izolace se shodovaly, byla k jednotlivým ředěním přiřazena koncentrace kalkulovaná z průměrné koncentrace DNA C. trachomatis stanovené u nejkoncentrovanějšího vzorku oběma izolacemi (Tab. 12). Následně byl srovnáván počet pozitivních výsledků u jednotlivých koncentrací a Probit analýzou stanovená mez detekce.

44

Tab. 12. Srovnání pozitivních záchytů automatické a manuální izolace DNA na koncentrační řadě sériově ředěného vzorku. Počet dosažených pozitivních výsledků

Ředění

Kalkulovaná koncentrace (kopie/ul)

Počet opakování

30x

30,28

90x

18

BnB AUTOMATICKÁ IZOLACE 18

GP MANUÁLNÍ IZOLACE 18

10,094

18

17

16

270x

3,364

18

13

11

810x

1,121

18

10

6

2430x

0,374

18

4

0

7290x

0,125

18

1

1

Získané hodnoty pro obě izolace byly proloţeny Weibullovým rozloţením se stejným parametrem tvaru a testována byla shodnost parametru měřítka. Pásy spolehlivosti se pro oba typy izolací překrývají, z čehoţ lze usuzovat, ţe celková sensitivita vyšetření daného vzorku obou metod se neliší (P=0,052) (Obr. 13).

Probability Plot for events Weibull - 95% CI Probit Data - ML Estimates

Percent

99

Ty pe BnB GP

90 80 70 60 50 40 30

Table of S tatistics S hape S cale 0,849612 2,23605 0,849612 4,01314

20 10 5 3 2 1

0,001

0,010

0,100 1,000 (copies/ul)

10,000

100,000

Obr. 13. Probit analýza. Srovnání rozloţení hodnot procentuálního záchytu automatické (BnB) a manuální (GP) izolace sériově ředěného vzorku. Weibullovo rozloţení.

45

Sensitivitu vyšetření obou metod stanovenou Probit analýzou uvádí tabulka (Tab 13). Automatická izolační metoda dosáhla sensitivity 8,13 a manuální 14,6 kopií na µl při 95% pravděpodobnosti záchytu. Je nutno brát v úvahu, ţe reálnou koncentraci C. trachomatis ve vzorku před izolací neznáme a účinnost izolace se u jednotlivých metod liší. Dosaţené hodnoty nám tedy slouţí pouze k relativnímu srovnání obou izolačních metod. Nicméně můţeme shrnout, ţe sensitivita vyšetření stejného vzorku zpracovaného oběma metodami izolace DNA je srovnatelná. Niţší účinnost testované automatické izolace je vyváţená větším objemem vzorku vstupujícího do izolace a vyšším stupněm zakoncentrování vzorku během izolačního procesu.

46

Tab. 13. Stanovení sensitivity vyšetření porovnávaných izolačních metod. Červeně je označena sensitivita vyšetření v kopiích/µl při 95% záchytu. Upravený výstup ze statistického programu Minitab 15. Arrow BUGS´n BEADSTM

PathogenFree DNA Isolation Kit

AUTOMATICKÁ IZOLACE

MANUÁLNÍ IZOLACE

Standard

95,0% Fiducial CI

Standard

95,0% Fiducial CI

Percent

Percentile

Error

Lower

Upper

Percent

Percentile

Error

Lower

Upper

1

0,0099548

0,0068427

0,0017485

0,0300224

1

0,0178664

0,0119354

0,0033035

0,0523145

2

0,0226431

0,0134645

0,0050577

0,0590528

2

0,0406386

0,0234083

0,0095420

0,103046

3

0,0367119

0,0198603

0,0094287

0,0880544

3

0,0658886

0,0344544

0,0177684

0,153828

4

0,0518196

0,0260777

0,0146865

0,117211

4

0,0930029

0,0451704

0,0276491

0,204968

5

0,0677974

0,0321500

0,0207328

0,146610

5

0,121679

0,0556216

0,0389961

0,256615

6

0,0845453

0,0381016

0,0275038

0,176307

6

0,151737

0,0658560

0,0516864

0,308864

7

0,101997

0,0439514

0,0349546

0,206340

7

0,183059

0,0759105

0,0656329

0,361782

8

0,120108

0,0497148

0,0430520

0,236740

8

0,215564

0,0858152

0,0807708

0,415424

9

0,138846

0,0554047

0,0517708

0,267533

9

0,249193

0,0955950

0,0970503

0,469837

10

0,158185

0,0610322

0,0610916

0,298744

10

0,283902

0,105272

0,114432

0,525066

20

0,382614

0,115655

0,185249

0,638373

20

0,686694

0,199904

0,344290

1,13080

30

0,664512

0,171636

0,364398

1,04343

30

1,19263

0,299470

0,671718

1,86352

40

1,01418

0,235004

0,602857

1,54272

40

1,82020

0,416269

1,10166

2,77930

50

1,45255

0,313655

0,911609

2,18155

50

2,60696

0,566161

1,65093

3,96577

60

2,01741

0,420188

1,31159

3,03808

60

3,62074

0,773867

2,35410

5,57255

70

2,78207

0,578087

1,84457

4,26372

70

4,99311

1,08481

3,28247

7,88797

80

3,91506

0,841354

2,60776

6,21323

80

7,02654

1,60296

4,60372

11,5866

90

5,96777

1,39280

3,91632

10,0931

90

10,7106

2,67965

6,86213

18,9638

91

6,29046

1,48674

4,11479

10,7384

91

11,2898

2,86205

7,20443

20,1916

92

6,65417

1,59466

4,33645

11,4763

92

11,9425

3,07133

7,58673

21,5954

93

7,07014

1,72064

4,58748

12,3332

93

12,6891

3,31526

8,01968

23,2259

94

7,55496

1,87070

4,87691

13,3488

94

13,5592

3,60536

8,51886

25,1587

95

8,13447

2,05436

5,21873

14,5857

95

14,5993

3,95983

9,10842

27,5126

96

8,85224

2,28790

5,63636

16,1506

96

15,8875

4,40971

9,82877

30,4909

97

9,79063

2,60251

6,17363

18,2483

97

17,5717

5,01454

10,7556

34,4834

98

11,1363

3,07034

6,92878

21,3520

98

19,9869

5,91172

12,0584

40,3911

99

13,4936

3,93107

8,21456

27,0347

99

24,2175

7,55710

14,2772

51,2088

47

11.3 Srovnání variability izolací Testovanou hypotézou bylo, zda manuální izolace vykazuje vyšší variabilitu ve výtěţku ve srovnání s automatickým postupem, kde je eliminován vliv laboratorního pracovníka v průběhu provádění izolačního procesu. Pro účel testování této hypotézy byl hodnocen rozptyl Ct hodnot interního standardu (IS) vzorků ředěných 2430x a 7290x. U těchto vzorků se pozitivní výsledek na přítomnost DNA C. trachomatis vyskytoval ojediněle a variabilita Ct interních standardů je kompetitivní amplifikací DNA chlamýdií ovlivňována nejméně. Variability Ct IS obou typů izolací byly srovnávány s variabilitou Ct IS samotné PCR reakce (do reakce byl místo vzorku přidán eluční pufr s IS v poměru 10:1). Rovnost rozptylů hodnot Ct interních standardů všech tří souborů (manuální izolace, automatická izolace, variabilita PCR reakce) byla testována Bartlett-testem (předpokládá normálně rozdělená data) Levene-testem (nepředpokládá normálně rozdělená data). Oba testy na hladině významnosti 0,05 neprokázaly rozdíl ve variabilitě Ct hodnot mezi manuální a automatickou izolací. Jejich variabilita je shodná s variabilitou Ct IS hodnot samotné PCR reakce (Obr. 14). To poukazuje na velmi standardní postup při izolaci jak automatickou tak i manuální metodou. Test for Equal Variances for Ct Bartlett's Test Test Statistic P-Value

BnB CHT

0,39 0,824

Levene's Test

Name

Test Statistic P-Value

0,22 0,802

GP-CHT

CHT-IS

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 95% Bonferroni Confidence Intervals for StDevs

Obr. 14. Test rovnosti rozptylů. BnB CHT – automatická izolace, GP-CHT – manuální izolalace, CHT-IS – variabilita PCR reakce. Upravený výstup ze statistického programu Minitab 15.

48

Test shodnosti středních hodnot metodou ANOVA však proti očekávání poukázal na rozdíl středních hodnot Ct IS u jednotlivých souborů (P<0,05) (Obr. 15). Tento rozdíl je moţno interpretovat právě faktorem zakoncentrování interního standardu (IS) v průběhu izolačního procesu. V případě automatické izolace došlo k zakoncentrování IS 7x a jeho střední hodnota Ct je nejniţší (31,06). U manuální izolace dochází pouze k dvojnásobnému zakoncentrování vzorku a střední hodnota Ct IS činí 32,47. Střední hodnota Ct nezakoncentrovaného IS je nejvyšší: 33,77. V souvislosti s niţší účinností izolace DNA C. trachomatis automatickým izolačním procesem by tento jev poukazoval na rozdílnou účinnost volné DNA (IS) a buněčné DNA (C. trachomatis). Princip Arrow BUGS´n BEADSTM automatického izolačního postupu je zaloţen na vyvázání DNA a buněk na paramagnetické částice. Rozdílná účinnost izolace volné a v buňce vázané DNA by mohl poukazovat na niţší schopnost paramagnetických částic vázat na svůj povrch buňky ve srovnání se schopností vazby uvolněné DNA anebo na neúčinný proces lýzy buněk v průběhu izolace DNA.

Histogram of Ct Normal

Name BnB CHT GP-CHT CHT-IS

0,8 0,7

Density

0,6

Mean 31,06 32,47 33,77

0,5

StDev N 0,5053 12 0,5630 12 0,6121 12

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

30

31

32

33

34

35

Ct

Obr. 15. Histogram. Znázornění histogramu pro rozloţení hodnot Ct interního standardu u testovaných souborů. BnB CHT – automatická izolace, GP-CHT – manuální izolalace, CHT-IS – variabilita PCR reakce. Upravený výstup ze statistického programu Minitab 15.

49

11.4 Křížová kontaminace izolačního procesu Celý experiment byl opakován z důvodu kříţové kontaminace vzorků v průběhu manuální izolace DNA. Jde o typický negativní jev, který provází manipulačně náročnou manuální izolaci. Zvláště v situaci zpracovávání většího počtu vzorků nebo následkem časového stresu.

50

12 Závěr Průkaz nukleové kyseliny C. trachomatis v klinickém materiálu je podle WHO povaţován za zlatý standard v diagnostice tohoto patogena. Klíčovým krokem diagnostického procesu je účinná a sensitivní izolace DNA. V diagnostických laboratořích se především kvůli ceně běţně vyuţívá manuálních metod izolace nukleových kyselin. Stále vyšší poţadavky na standardizaci a kvalitu výsledků poskytovaných diagnostickými laboratořemi vedou k zavádění automatických provozů. Bakalářská práce si z těchto důvodů kladla za cíl srovnat účinnost, sensitivitu a variabilitu manuální kolonkové izolace zaloţené na vazbě uvolněné DNA na ionexovou membránu a automatické izolace zaloţené na purifikaci DNA s vyuţitím magnetických částic. Experimentální srovnání obou metod na koncentrační řadě sériově ředěného pozitivního vzorku moči ukázalo, ţe automatická izolace DNA C. trachomatis z klinického materiálu vykazovala niţší účinnost, ale umoţnila především z důvodu většího zakoncentrování vzorku během izolačního procesu srovnatelnou sensitivitu vyšetření. Na případu kříţové kontaminace vzorků během manuální izolace nukleových kyselin se ukázala hlavní nevýhoda manuálních metod (chybovost laboratorního pracovníka), kterou automatizace celého procesu výrazně sniţuje a přispívá k vyšší kvalitě poskytovaných výsledků.

51

Seznam zkratek 16sRNA

podjednotka kyseliny ribonukleové (16S)

23s RNA

podjednotka kyseliny ribonukleové (23S)

AgxAb

komplex antigen-protilátka

aj.

a jiný

APC

antigen prezentující buňka (Antigen Present Cell)

apod.

a podobně

atd.

a tak dále

ATP

adenosintrifosfát

AR39

izolát Chlamydophila pneumoniae

bp

počet párů bazí

cca

přibliţně

C. trachomatis

Chlamydia trachomatis

CD

skupinový diferenciační znak (Cluster of Diferentiation)

CDS

kódující oblasti genu

cHSP60

chlamydiový protein tepelného šoku (Chlamydial Heat Shock Protein)

Ct

fluorescenční práh (treshold cycle)

ČR

Česká republika

DNA

deoxyribonukleová kyselina

EBs

elementární tělíska (Elementary Bodies)

EIA

enzymová imunoanalýza (enzyme immuno assay)

EKK

externí kontrola kvality

ELISA

enzymová imunoanalýza probíhající na pevné fázi (enzyme-linked immunosorbent assay)

FAM

fluorofor

HeLa

buněčné kultury 52

Hep-2

buněčné kultury

hHSP

lidský protein tepelného šoku (Human Heat Shock Protein)

HLA

antigeny lidských leukocytů (Human Leukocyte Antigens)

HSP

protein tepelného šoku (Heat Shock Protein)

IgA

imunoglobulin třídy A

IgG

imunoglobulin třídy G

IgM

imunoglobulin třídy M

VKK

vnitřní kontrola kvality

INFγ

interferon gama

INSTAND e V.

Institut für Standardisierung und Dokumentation im medizinischen Laboratorium Düsseldorf

IS

interní standard

JOE

fluorofor

kDa

kilodalton

LCR

ligázová řetězová reakce (Ligase Chain Reaction)

LGV

biotyp lymfogranuloma venerun

LPS

lipopolysacharid

MBL

lektin vázající manózu (Mannose Binding Lectin)

MIF

mikroimunoflurescence

MIP

stimulátor infektivity makrofágů (Macrophage Infectivity Potentiator)

MOMP

hlavní protein zevní membrány (Major Outer Membrane Protein)

NAATs

amplifikační testy nukleových kyselin (Nucleic Acid Amplification Tests)

např.

například

NK-buňky

přirození zabíječi (Natural Killers)

PCR

polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction)

PID

zánětlivé onemocnění pánve (Pelvic Inflammatory Disease) 53

popř.

případně

pozn.

poznámka

QCMD

Quality Control for Molecular Diagnostics

r.

rok

RBs

retikulární tělíska (Reticular Bodies)

RNA

ribonukleová kyselina

SCC

skvamocelulární karcinom (Squamos Cell Carcinoma)

SDS- PAGE

elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

STD

pohlavně přenosné choroby (Sexually Transmited Diseases)

TGFβ

růstový faktor fibroblastů

Th

pomocný T-lymfocyt (T-helper)

tj.

to je

tzv

takzvaný

UDG

uracil-DNA-glykosyláza

USA

Spojené Státy Americké (United States of America)

v r.

v roce

WB

western blot

WHO

Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)

54

Seznam použité literatury 1. BARNES, R C. Laboratory diagnosis of human chlamydial infections, Clin. Microbiol. Rev. 1989, 2, s.119–136. 2. BEDNÁŘ, M. et al. Lékařská mikrobiologie. Praha: Marvil 1996, s. 325-333. 3. BLACK, C. M. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin Microbiol Rev. 1997; 10(1), s. 160-184. 4. BUSH, R. M. - EVERETT, K. D. E. Molecular Evolution of the Chlamydiaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.2001, 51, s. 203 – 220. 5. FÖRSTL, M. et al. Chlamydia trachomatis: aktuální pohled, moţnosti a limity přímé diagnostiky, Pediatrie pro praxi, 2004, č. 4, s. 198-202. 6. FRIEDECKÝ, B. et al., Validace a verifikace molekulárně biologických metod zaloţených na analýze extrahumánního genomu , Doplněk k doporučení výboru České společnosti klinické biochemie o validaci a verifikaci analytických metod v klinických laboratořích (z 16. 11. 2004). 7. GREENWOOD, D. et al., Lékařská mikrobiologie. Přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. Praha: Grada, 1999, s. 369-377. 8. HAYDEN, R. T. In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques, In PERSING, D. H (ed.), Molecular Microbiology- Diagnostic Principles and Practice. Washington, DC: ASM Press, 2004, s. 43-53. 9. HERRMANN, B. -TORNER, A. - LOW, N. - KLINT, M. - NILSSON, A. VELICKO, I. - SODERBLOM, T. - BLAXHULT, A. Emergence and spread of Chlamydia trachomatis variant, Sweden. Emerg Infect Dis 2008, 14:1462-1465. 10. JARČUŠKA, P., et al. Infekcie vyvolané chlamýdiami, Via practica, 2009,6(4), s. 147-152. 11. KALMAN, S. - MITCHELL, W. - MARATHE, R. et al. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nature Genetics ,1999, 21, s. 385-389.

55

12. LUNDEMOSE, A. G. et al., Chlamydia trachomatis Mip-like protein, Molecular Microbiology 1992,6, 2539 – 2548. 13. LITZMAN, J. - FREIBERGER, -T. KRÁL, V. -THON, V. Základy vyšetření v klinické imunologii, Brno: Masarykova univerzita 2007, 59s. 14. MAHONY, BJ - COOMBES, BK - CHERNESKY, MA. Chlamydia and Chlamydophila, In MURRAY, P. R. (ed.), Manual of clinical microbiology 8th ed.,Washington DC:ASM Press, 2003, s. 991-1000. 15. MAŠATA, J. - ŘEZÁČOVÁ, J. - DRBOHLAV, P. Urogenitální chlamydiové infekce, Praktická gynekologie, 2001, č. 3, s. 27-31. 16. MATOUŠKOVÁ, M. - HANUŠ, M. Chlamydia trachomatis-postrach urologické ambulance? Urologie pro praxi, 2009, č. 2, s. 60-64. 17. MEDKOVÁ,

Z.

2004.

Epidemiologie

a

prevence

urogenitálních

infekcí

C. trachomatis (sérotypy D-K), Správy klinickej mikrobiólogie, 2004, č. 4, s. 21-33. 18. MEDKOVÁ, Z. 2004a. Imunologie infekcí způsobených chlamydiemi, Správy klinickej mikrobiólogie, 2004, č. 4, s. 10-20. 19. MEDKOVÁ, Z. -KALOUSEK, I. -JARČUŠKA, P. Chlamydiové infekce. Praha: Triton 2001, 111s. 20. MILLER, K. E. Diagnosis and treatment Chlamydia trachomatis infection, In Am Fam Physician 2006, 73:1411-6. 21. MOSS, T. R. Human genital infection with Chlamydia trachomatis - is there a role for serology, In International Handbook of Chlamydia, 2nd edition, Haslemere UK: Alden Press, 2006, s. 55-74. 22. PAVLÍK, E. Molekulární biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku část 2, [cit. 1. dubna 2010] Dostupné na World Wide Web: http://www.rochediagnostics.cz/download/la/odborne/pcr2.pdf 23. PAVLÍK, E. Molekulární biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku část 3, [cit. 1. dubna 2010] Dostupné na World Wide Web: http://www.rochediagnostics.cz/download/la/odborne/pcr3.pdf

56

24. PAVLÍK, E. Molekulární biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku část 7, [cit. 1. dubna 2010] Dostupné na World Wide Web: http://www.rochediagnostics.cz/download/la/odborne/pcr7.pdf 25. PETERSON, E M. - MARKOFF, BA. – SCHACHTER, J - de la MAZZA, LM. The 7.5 - kb plasmid present in Chlamydia trachomatis is not essential for the growth of this microorganism. Plasmid , 1990, 23. s. 144-148. 26. PICKETT, MA. et al., The plasmids of Chlamydia trachomatis and Chlamydophila pneumonie (N16): accurate determination of copy numer and the paradoxical effect of plastid-curing agents, Mikrobiology, 2005, 151, s.893-903. 27. PINKAVOVÁ, I. - KOLIBA, P. Infekce Ch. trachomatis u dětí a dospívajících, Pediatria pre prax, 2007,č.4, s.185-188. 28. POSPÍŠIL, L. -ZRALÝ, Z. Nové pohledy na chlamydie jako příčinu neplodnosti. [cit.

GyNe.cz 2000

15.

března

2010]

Dostupné

na

World

Wide

Web:http://gyne.cz/clanky/2000/200cl2.htm. 29. RIPA, T . -NILSSON, P. A variant of Chlamydia trachomatis with deletion in cryptic plasmid: implications for use of PCR diagnostic tests. Euro Surveill 2006,11. 30. RIPA, T. - NILSSON, P. A Chlamydia trachomatis strain with a 377 bp deletion in the cryptic plasmid causing false-negative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis 2007. 31. ROUBALOVÁ, K. Současný průkaz DNA Chlamydia pneumoniae a Chlamydia trachomatis pomocí real-time PCR. Epidemiolog. Mikrobiolog. Imunol.56, 2007, s. 166-173. 32. SETH-SMITH, H. et al. Co-evolution of genomes and plasmids witin Chlamydia trachomatis and emergence in Sweden of new variant strain, BMC Genomics , 2009, 10s.

[cit.

30.

března

2010]

Dostupné

na

World

Wibe

Web:http://www.biomedcentral.com 33. ŠIMKO, J. -LANGŠANDL,L. - JARČUŠKA,P. Chlamydiové infekcie urogenitálního traktu-ich klinické prejavy, diagnostika a moţnosti terapie, Bratislava 1999, Roche a Pliva editors, 20s. 57

34. ŠMARDA, J. et al. Metody molekulární biologie, Brno: Masarykova univerzita 2008, s. 73-106. 35. TEISLEROVÁ, D. - ŢAMPACHOVÁ, E., Pouţití metody Western blot v serologické diagnostice chlamydiových infekcí. Klinická mikrobiologie a infekční lékařství, 2007, č. 1, s. 21-25. 36. TOBIAS, P. S. - TAPPING, R. I. – GEGNER, J. A. Endotoxin interactions with lipopolysacharide responsive cells. Clin Infect Dis 1999, 28: 476 – 81. 37. TORŠOVÁ,V. Urogenitální chlamydiové infekce: stále aktuální problém, Praktická Gynekologie, 2004, č. 4, s. 53-57. 38. VAN DER POL, B. The diagnosis of Chlamydia trachomatis genital infection, In MOSS, T. R. (ed.) International Handbook of Chlamydia, 2nd edition, Haslemere UK: Alden Press, 2006, s. 39-53. 39. VOTAVA, M., Lékařská mikrobiologie obecná. Brno: Neptun, 2001 s. 215-216. 40. VOTAVA, M. et al., Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003. s. 173176. 41. WITTWER, C. T. - KUSUKAWA, N. Real-Time PCR, In PERSING, D. H (ed.), Molecular Microbiology- Diagnostic Principles and Practice. Washington, DC: ASM Press, 2004, s. 71-85.

58

59