Praktikum z mikrobiologie (KBI/MIKC) verze 04
Listopad/prosinec 2013
Zásady bezpečnosti práce při praktiku z mikrobiologie: •
práce v praktiku bude umožněna pouze účastníkům oblečeným v bílém plášti.
•
v laboratoři je zakázáno jíst a pít, pokud možno nepoužívat kapesník během práce, zbytečně nemluvit
•
v případě vzniku otevřeného poranění (zejména na rukou) je nutno tuto skutečnost ihned nahlásit vedoucímu praktik
•
bezpodmínečně dodržovat všechny pokyny vedoucího cvičení
•
je zakázáno dotýkat se mikroorganismů rukou
•
po ukončení práce vypnout elektrický proud, překontrolovat uzavření plynu
•
při práci s hořlavinami (zvláště těkavými – benzín, aceton, líh) dbát, aby v blízkosti nehořel kahan
•
v případě požáru vypnout elektrický proud a plyn a použít hasicí přístroj
•
obezřetnost při pipetování – při nasátí čehokoli do úst, okamžitě vyplivnout na podlahu, vypláchnout ústa vodou a uvědomit vedoucího praktik
•
udržovat pořádek na pracovní ploše
•
po ukončení práce umýt ruce mýdlem
LITERATURA: Blaškovič D. Základy lékárskej virologie. – SAV. Bratislava 1978. Kaprálek F.: Fyziologie bakterií I.- IV. – UK Praha 1982. Kaprálek F.: Základní mikrobiologické praktikum. – UK Praha 1980. Rosypal S. a kol.: Obecná bakteriologie. – SPN. Praha 1980. Rosypal S. a kol.: Fylogeneze, systém a biologie organismů. – SPN. Praha 1992. Bednář M. a kol.: Lékařská mikrobiologie. – Marvil. 1996.
ÚVOD Laboratorní pomůcky a sklo pro mikrobiologii Petriho miska, mikrobiologická zkumavka klička + Coheho držák, Pasteurovy pipety, hokejka, Erlenmayerova baňka. Příprava laboratorního skla na sterilizaci Všechno nádobí se musí před sterilizací zabalit do hliníkové folie (zabrání kontaminaci po vyjmutí ze sterilizátoru), sterilizace se provádí 1h při 120° C; klička se sterilizuje vypálením v plameni kahanu do červeného žáru. ŽIVNÉ PŮDY O přítomnosti mikroorganismů je možno se přesvědčit dvěma způsoby: prohlédnutím materiálu pod mikroskopem, nebo přenesením jeho části (inokula) do živného média (roztoku, živné půdy) a navodit pomnožení přítomných organismů do té míry, že jsou patrné makroskopicky – vytvářejí kolonie. Všechny živné půdy musí obsahovat zdroje energie, C, N, ostatních biogenních prvků (P, S, Mg, Cl, Ca, Fe, K, Na), stopových prvků (Co, Zn, Mo, Cu aj.) a růstových faktorů (vitaminy, aminokyseliny), musí mít vhodné pH, osmotický tlak a teplotu. Živné půdy pro běžné chemoorganotrofní bakterie jsou (dle složení) dvojího typu: 1) komplexní – obsahují (někdy jako jedinou komponentu) extrakty z biologických materiálů, např. masový vývar (bujón), kvasničný extrakt, pepton aj. 2) minerální – kromě jediné organické látky (např. glukosy – zdroj C i energie) obsahují jen látky anorganické, případně jeden či více růstových faktorů. Podle konsistence se půdy dělí na tekuté a pevné: 1) Tekuté kultivační půdy jsou nalévány obvykle do zkumavek. Umožňují snadnou difúzi živin i metabolických produktů a proto je množení mikrobů zvýhodněno. Používají se jako půdy pomnožovací, po inkubaci v termostatu je růst patrný již makroskopicky. Formy růstu jsou však podobné u různých druhů bakterií, proto se nehodí k jejich rozlišení. 2) Tuhé kultivační půdy připravujeme z tekutého základu, splňující nutriční nároky mikroba, přidáním agaru. Po zahřátí se půda gelifikuje. Plní se většinou do Petriho misek (agarová plotna) nebo do zkumavek v šikmé pozici (tzv. šikmý agar). Množící se bakterie vytvářejí na povrchu půdy makroskopicky viditelné kolonie, charakteristického zbarvení, tvaru atp. Pro identifikaci některých druhů se používají selektivní půdy, které jsou sestaveny tak, že neovlivňují růst požadovaného druhu (např. patogena), zatímco růst kontaminujících druhů je částečně nebo úplně inhibován.
STERILIZACE Motto: „Kde je prach, jsou i bakterie.“ L. Pasteur Dekontaminace: Odstraňování všech mikroorganismů z prostředí od pouhého snižování počtu úklidem až po úplnou eliminaci sterilizací. Úklid, mytí, praní: Mechanické odstraňování pomocí horké vody i povrchově aktivních látek. Pečlivým prostým úklidem lze dosáhnout snížení počtu mikrobů až o 90-95%. Tento krok podmiňuje vyšší účinnost následné desinfekce či sterilizace. Spálení: Používá se u předmětů, které nemají stálou hodnotu nebo náklady na dekontaminaci jsou vyšší než jejich cena. Desinfekce: Odstraňování původců infekcí, patogenních i mírně patogenních mikroorganismů. Provádí se většinou za použití chemických prostředků. Výsledek má být blízký 100%. Sterilizace: Kvantitativní ničení všeho životaschopného na povrchu nebo uvnitř daných systémů za použití fyzikálních nebo chemických prostředků. Asepse: Dodržování takových podmínek a postupů, které brání přístupu patogenních mikroorganismů. Antisepse: Zábrana rozvoje patogenních mikroorganismů za použití desinfekčních prostředků – antiseptik, antibiotik či chemoterapeutik. Antiseptika: Látky používané k odstraňování patogenních mikroorganismů na povrchu živých organismů, tedy látky, při jejich použití nesmí být poškozován makroorganismus. Desinfekční prostředky: Látky používané k ničení mikroorganismů na neživých předmětech. Chemoterapeutika: Látky určené k ničení mikroorganismů přímo v napadeném makroorganismu, při nichž je základním požadavkem minimální toxicita pro makroorganismus. Antimikrobiální látky buď zastavují růst mikroorganismů – působí staticky, nebo je ničí – působí cidně. Ke sterilizaci (tj. úplnému odstranění nebo usmrcení mikroorganismů v určitém prostředí nebo na předmětech) se používají buď fyzikální, nebo chemické metody: 1) Metody fyzikální A. Teplo vlhké: 1. Pasteurizace (t < 100° C) 2. Var za normálního tlaku 3. Pára 4. Var pod tlakem (t >>100° C) B. Teplo suché 1. Otevřený plamen 2. Horký vzduch C. Filtrace D. Záření
E. Ultrazvuk 2) Metody chemické A. Anorganické kyseliny (všechny silné kyseliny – HCl, H2SO4, HNO3,…) B. Louhy (silné hydroxidy – NaOH, KOH,…) C. Organické kyseliny (HCOOH, kys. octová,…) D. Peroxokyseliny (kys. peroxooctová – PERSTERIL,…) E. Oxidační prostředky (KMnO4, Cl2, I2, O3,…) F. Sloučeniny halogenů (chloramin, chlorové vápno,…) G. Další sloučeniny (sloučeniny těžkých kovů – CuSO4, detergenty,…)
Část I. OČKOVACÍ TECHNIKA A ASEPTICKÉ PRÁCE A) IZOLACE A KULTIVACE MIKROORGANISMU Základem mikrobiologické práce je práce s čistou kulturou mikroba. Čistá kultura je populace bakterií vzniklá z jedné izolované buňky a je udržovaná a vedená tak, že žádný jiný mikrobiální druh se s ní nesetká. To umožňuje aseptická práce. Očkovací technika: Očkování – přenesení části populace čisté kultury (inokula) z nádoby, v níž je udržována, do jiné nádoby, v níž je připraveno nové sterilní médium. Nástroji pro očkování jsou mikrobiologická klička, pipeta a hokejka. Práce s kličkou. Před použitím i po použití kličku vypálíme, držíme ji přitom svisle v plameni a opalujme i kovový konec držáku. Po vypálení necháme kličku několik vteřin vychladnout a než se dotkneme očkem kultury, ochladíme očko o okraj agarové půdy. Přeočkování ze šikmého agaru na šikmý agar. Obě zkumavky si položíme rovnoběžně do levé dlaně, jednu uchopíme mezi palec a ukazovák, druhou mezi ukazovák a prostředník. Držíme je šikmo. Pravou rukou ovládáme kličku. Kličku vypálíme, necháme vychladnout. Hřbetem prstů pravé ruky uchopíme zátky a vytáhneme. Ožehneme hrdla obou zkumavek a přeneseme inokulum z jedné do druhé. Vypálíme kličku a odložíme ji. Ožehneme okraje zkumavek a vnitřní konce zátek a zkumavky uzavřeme. Přeočkování z plotny do zkumavek a naopak. Vypálíme kličku. Zkumavku držíme v levé ruce ohnutým ukazovákem. Malíkem pravé ruky zkumavku odzátkujeme, ožehneme její okraj, palcem a prostředníkem levé ruky zdvihneme víko Petriho misky, odebereme kličkou část kultury, uzavřeme Petriho misku, vneseme materiál do zkumavky, vypálíme a odložíme kličku, ožehneme okraj zkumavky a vnitřní konec zátky a zkumavku uzavřeme. Očkování tekutých půd. Technika očkování tekutých půd je obdobná jako přeočkování ze šikmého agaru na šikmý agar, zkumavky však držíme šikmo. Inokulum přeneseme do tekuté půdy vpichem nebo rozetřením nad hladinou a po uzavření zkumavky inokulum spláchneme do půdy zatřepáním zkumavkou. Izolace čisté kultury. Je založena na oddělení buněk jednoho druhu ze smíšené kultury nebo přirozeného materiálu. Na plotnách se izolace provádí takto: vypálenou a vychladlou kličkou nabereme smíšenou kulturu a několika tahy kličkou rozetřeme po agaru na okraji plotny. Kličku vypálíme, necháme vychladnout a rozetřeme okraj prvního nátěru kolmo na novou plochu agarové půdy, tento postup ještě dvakrát opakujeme. V posledním roztěru získáme po inkubaci jednotlivé kolonie. Práce s pipetou. Používáme vysterilizované pipety, které na poslední chvíli vyjímáme z obalu. Při práci s tekutými půdami je výhodná práce ve dvojici, kde jeden pracuje s nádobami obsahujícími živnou půdu a druhý pipetuje. Všeobecné zásady při očkování Očkujeme v místnosti kde je čisto, není prach a není průvan. Vždy sedíme a vše potřebné máme předem připraveno. Na stůl neodkládáme nic, co přijde do styku s kulturou. Odzátkované nádoby držíme šikmo, ne svisle, pracujeme rychle, bez prodlení, ale
s přehledem. Pokud odkládáme některou část sterilní nádoby, pak vždy tak, aby možnost kontaminace sporami byla co nejmenší (např. víčko Petriho misky dutou stranou dolů). Vzhled kolonií nebo změny kultivační půdy v jejich okolí jsou charakteristické pro určitý druh. Proto jsou tuhé kultivační půdy často používány jako půdy diagnostické. U kolonií si všímáme velikosti, tvaru, povrchu, okrajů, konzistence, barvy, ev. zápachu, vzájemných vztahů apod. Některé rostou na povrchu půdy v povlaku (Proteus). Vzhled kolonií u jednoho druhu mikroba může být ovlivněn jeho růstovou-disociační fází (Mfáze mukosní, hlenovitá, S-fáze hladká, R-fáze drsná). ÚKOLY: 1. Naučte se techniku očkování ze šikmého agaru na šikmý agar, ze šikmého agaru na plotnu a naopak, z plotny na plotnu, přeočkování do tekuté půdy. Výsledkem bude každá kultura naočkovaná na plotně, šikmém agaru a v tekuté půdě. 2. Izolujte čisté kultury z připravených smíšených kultur. 3. Na další plotnu dejte několik zrnek půdy, otiskněte pomerančovou kůru či povrch jablka, otiskněte prst, mírně naprskejte apod. Dejte kultivovat do termostatu při 30° C 48 hodin. B) METODY TESTOVÁNÍ ANTIBIOTIK Laboratorní vyšetření citlivosti mikroorganismů k chemoterapeutikům je vodítkem pro racionální chemoterapii infekcí. Až na výjimky je citlivost kmenů téhož bakteriálního druhu variabilní. Proto je nutno ověřovat in vitro aktuální citlivost každého izolovaného patogenního kmene. V indikovaných případech slouží laboratorní testy také k ověření účinnosti zavedení léčby, eventuálně ke zjištění vzniku resistentní mikrobiální populace. Stanovení citlivosti k antibiotikům in vitro 1) Difusní disková metoda se běžně používá jako kvalitativní test pro několik antibiotik současně. Na povrch agarové půdy na plotně, naočkované suspenzí vyšetřovaného kmene se kladou komerční vyráběné disky z filtračního papíru, nasyceného antibiotiky. Po inkubaci vzniká kolem účinného antibiotika zóna inhibice růstu bakterie. Velikost inhibiční zóny je ovlivněna (kromě citlivosti dané bakterie k danému antibiotiku) množstvím antibiotika v disku, složením půdy, výškou agarové vrstvy, rychlostí difuse antibiotika v gelu a množstvím inokula mikroba. Kmen se hodnotí jako citlivý nebo rezistentní, případně hraničně citlivý. Jako citlivé se hodnotí kmeny, které mají inhibiční zónu o průměru alespoň 12 mm. Pracovní postup: 1. Na sterilní plotny pipetou přeneste 1 ml suspenze připravené z 5-10 kolonií. Suspenze se vytvoří z 5 ml fyziologického roztoku (0,85% roztok NaCl) 2. Suspenzi rozetřete sterilní hokejkou po ploše plotny, nechejte zaschnout a po označení na spodní straně misky položte disky z filtračního papíru na plotnu. 3. Dejte kultivovat.
2) Kombinace antibiotik se testují in vitro pro ověření synergického nebo antagonického účinku dvou preparátů. Na agaru lze demonstrovat vzájemné ovlivnění použitím dvou u sebe ležících disků nebo dvěma proužky filtračního papíru, které se nasytí antibiotiky a položí na plotnu kolmo na sebe. Z tvaru inhibiční zóny v úhlu mezi proužky je možno usuzovat na účinek. Reakce může být indiferentní, synergická nebo antagonistická. Pracovní postup: 1. Na sterilní plotnu pipetou přeneste 1 ml suspenze z úkolu 1. 2. Suspenzi rozetřete sterilní hokejkou po ploše plotny, nechejte zaschnout a po označení na plotnu položte křížem proužky filtračního papíru napuštěné antibiotiky. 3. Dejte kultivovat. Úkoly: 1. Otestujte citlivost daného druhu bakterie na 5 přidělených antibiotik. (1 plotna) 2. Otestujte citlivost daného druhu bakterie na kombinaci 2 antibiotik. (1 plotna) C) STANOVENÍ POČTU ŽIVÝCH BAKTERIÍ METODOU CFU Množství živých buněk v kultuře je možno stanovit výsevem známých objemů vhodně ředěných suspenzí na plotny. Při této metodě se předpokládá, že při inkubaci vyroste z každé buňky jedna kolonie (CFU = colony forming units). Průměrný počet kolonií na plotně násobíme zředěním suspenze a přepočítáme na 1 ml, čímž dostaneme počet živých buněk v 1 ml původní kultury. Optimální počet kolonií na plotně je 50–200, neboť je tak minimalizována možnost dopadu dvou buněk do jediného místa (a tím překryv kolonií). Rozetřením 0,1 ml zředěné suspenze na povrchu plotny, která je dostatečně suchá, aby plotna rychle vsála rozetřenou tekutinu. Roztíráme sterilní skleněnou zahnutou tyčinkou – „hokejkou“. Kolonie vyrostou na povrchu plotny a jsou přibližně stejně velké. Nevýhodou je chyba způsobená ulpěním části suspenze na tyčince. Pracovní postup: 1. Čerstvě dodanou kulturu bakterií Escherichia coli (asi 109 buněk v ml) zředíme sterilní vodou a sterilními pipetami v poměru 1:10 až 1:100 tak, abychom nakonec dostali suspenzi zředěnou 10-6 a 10-7. Ředíme podle schématu: 0,1 ml kultury do 9,9 ml vody dává zředění 10-2 0,1 ml zředění 10-2 do 9,9 ml vody dává zředění 10-4 1 ml zředění 10-4 do 9 ml vody dává zředění 10-5 1 ml zředění 10-5 do 9 ml vody dává zředění 10-6 1 ml zředění 10-6 do 9 ml vody dává zředění 10-7 2. Po 0,1 ml zředění 10-5, 10-6, 10-7 napipetujeme sterilními pipetami na povrch 3 ploten a roztíráme skleněnou tyčinkou. Každé zředění pipetujeme na samostatnou plotnu. Plotny musí mít suchý povrch, aby se vzorek po krátké době vsákl.
3. Plotny inkubujeme dnem vzhůru v termostatu při 30° C a odečítáme výsledky nejlépe po 48 hodinách. 4. Vybereme to ředění, které dává 30 až 300 kolonií na misce, spočítáme kolonie na třech paralelních miskách, vypočteme průměr, vynásobíme ředění a stanovíme počet živých bakterií v 1 ml kultury. Výsledek zapíšeme. ÚKOL: 1. Zjistěte počet živých bakterií v dodané kultuře.
Část II. MIKROSKOPICKÉ METODY A) POZOROVÁNÍ ŽIVÝCH BAKTERIÍ VE VISUTÉ KAPCE Pozorování živých bakterií ve visuté kapce slouží k orientačnímu prohlédnutí kultury a používá se zejména ke zjištění pohyblivosti dané bakterie. Je nutno odlišovat aktivní pohyb bakterie od pasivního (Brownova) pohybu. Aktivní pohyb je možno eliminovat přidáním kapky formaldehydu nebo jiného dezinfekčního prostředku. PRACOVNÍ POSTUP 1. Z tekuté kultury dodaných bakterií (vodou spláchnutý čerstvý šikmý agar s Bacillus subtilis) oddělte nesterilně do dvou zkumavek po 1 ml. Do jedné zkumavky přidejte 0,1 ml vody, do druhé 0,1 ml 8% roztoku formaldehydu. 2. Totéž proveďte se senným nálevem a výplavem půdy. 3. Vyžíhanou a vychladlou kličkou naberte několikrát ze sledované zkumavky a vytvořte malou kapku uprostřed krycího skla. Do čtyř rohů sklíčka dejte malé kapičky vody. Na takto připravené krycí sklo shora přiložte podložní sklo s jamkou tak, aby kapka s bakteriemi byla proti jamce a celý preparát opatrně obraťte krycím sklem navrch. 4. Pozorujte nejsilnějším objektivem suchého systému. 5. Takto zhotovte preparát ze všech kultur. 6. Bakterie nakreslete a výsledky zapište do tabulky.
Název kultury
Pohyblivost
Charakteristika
B) BARVENÍ BAKTERIÍ Živé, nezbarvené bakteriální buňky se jen málo liší od okolí a proto je nutno pro pozorování je barvit. Základním bakteriologickým barvením je barvení podle Grama. Je to barvení diferenciální, které umožňuje rozdělit bakterie na grampozitivní (barví se krystalvioletí a neodbarvují se v ethanolu) a gramnegativní. Gramnegativní mikroby jsou dobarvovány odlišným barvivem (např. safraninem nebo karbolfuchsinem). Rozdíl v barvitelnosti grampozitivních a gramnegativních bakterií je způsoben odlišným složením buněčných stěn.
BARVENÍ ORIENTAČNÍ (MONOCHROMATICKÉ) Nejčastěji se používá barvení karbolfuchsinem. Pracovní postup: 1. Na dobře vyčištěné podložní sklo, protáhnuté plamenem (pro odmaštění), kápněte trochu destilované vody. 2. Vypálenou a vychladlou kličkou naberte ze šikmého agaru nebo plotny malé množství kultury a rozmíchejte v kapce vody v jemně zakalenou suspenzi. Kličkou rozetřete suspenzi do plochy tak, aby vznikl tenký souvislý film. Ten nechte bez zahřívání na vzduchu zaschnout. Fixaci pak proveďte trojnásobným protáhnutím vysušeného preparátu plamenem kahanu. Po vychladnutí barvěte. 3. Na nátěr kápněte několik kapek Ziehlova karbolfuchsinu a nechte působit několik vteřin (asi 5 s) nebo několik kapek zředěného karbolfuchsinu (1:10 dest. vodou) a nechte působit 20s. 4. Spláchněte barvivo vodou. 5. Osušte preparát – vložte mezi dva listy filtračního papíru a přežehlete dlaní. 6. Pozorujte olejovou imerzí. 7. Nakreslete tvary buněk při zachování poměru velikostí. Bakterie jsou červeně obarveny. Jsou-li modročerné, jsou přebarveny a je třeba zkrátit dobu jejich barvení. Jsou-li růžové, je třeba dobu působení barviva prodloužit. Není-li pozadí preparátu čisté a jasné, byl preparát nedostatečně opláchnut vodou nebo byla s kulturou nabrána i agarová půda. BARVENÍ PODLE GRAMA Gramovo barvení je diferenciální, tzn. slouží k odlišení dvou skupin bakterií – grampozitivních (G+) a gramnegativních (G– ). Pracovní postup: 1. Připravte preparáty z jednotlivých čistých kultur bakterií a i jejich směsi. 2. Barvěte 90 s roztokem krystalvioleti. 3. Opláchněte (opatrně!) vodou a ponořte na 60 s do Lugolova roztoku 4. Opláchněte vodou a osušte filtračním papírem. 5. Asi 30 s odbarvujte v 95% etanolu. 6. Osušte filtračním papírem a dobarvěte (asi 60 s) safraninem nebo zředěným roztokem karbolfuchsinu. 7. Opláchněte vodou, osušte filtračním papírem a pozorujte olejovou imerzí. 8. Nakreslete tvary buněk při zachování jejich vzájemné velikosti a určete gramnegativitu či grampozitivitu u jednotlivých druhů a zapište ji. Grampozitivní bakterie jsou modré, neboť se neodbarvují etanolem. Gramnegativní jsou červené, protože se odbarvily etanolem a byly dobarveny kontrastním barvivem. Preparáty zhotovujte a barvení provádějte tak dlouho, až je výsledek dokonalý.
Pozn.: Časy barvení jsou pouze orientační, závislé na koncentraci a množství použitého barviva. BARVENÍ PŘÍRODNÍCH KULTUR PODLE GRAMA 1. Proveďte diferenciální barvení podle Grama s kulturou jogurtu, piva, případně i jiných potravinářských kultur. 2. Proveďte diferenciální barvení podle Grama s hlenem, který pomocí párátka seškrábnete z povrchu zubu. Výsledky nakreslete a popište. (v jogurtové kultuře patří tyčinky druhu Lactobacillus bulgaricus, řetízky kulovitých bakterií druhu Streptococcus lactis) SPECIÁLNÍ BARVENÍ Barvení bakteriálních spór Bakteriální spóry nelze běžnými metodami barvit, používají se některé speciální metody, např. metoda Scharffer-Fultonova. Pracovní postup: 1. Na podložní sklo kličkou rozetřete 14 dní starou kulturu Bacillus subtilis. 2. Sklo s kulturou fixujte teplem (tj. asi 3x protáhnout plamenem). 3. Dejte probarvit do malachitové zeleně na dobu 15 minut při 90-95° C. 4. Opláchněte a kontrastně dobarvěte zředěným roztokem karbolfuchsinu asi 30 s, nebo 5% vodním roztokem eosinu. 5. Opláchněte vodou, osušte a pozorujete imerzním objektivem. Živé buňky jsou obarveny červeně, spory jsou obarvené zeleně. C) TESTOVÁNÍ BAKTERICIDNÍHO A BAKTERIOSTATICKÉHO ÚČINKU 1. Odečtěte velikost inhibičních zón z „testování účinnosti antibiotik“ 2. Zdali byl účinek daného antibiotika baktericidní nebo bakteriostatický je možné otestovat pomocí tzv. metody razítka (metoda replica plating). V principu jde o přenesení kultury vyrostlé pod vlivem daného antibiotika na jinou, čistou plotnu bez antibiotik. Na nové plotně se pak pozoruje, jestli zůstanou zachovány původní inhibiční zóny. Pracovní postup: 1. Po odečtení výsledků z testování antibiotik difúzní diskovou metodou sejměte disky z plotny. 2. Pomocí „razítka“, které je opatřeno sterilním filtračním papírem, se kultura z plotny přenese na vedlejší plotnu. 3. Dáme kultivovat.
4. Po kultivaci buď zůstávají inhibiční zóny zachovány – antibiotikum má baktericidní účinek – nebo inhibiční zóny nejsou přítomny (bakterie rostou v původních inhibičních zónách), antibiotikum má pouze bakteriostatický účinek. D) BAKTERIORHIZA Na kořenech bobovitých rostlin je možno najít hlízky, které vznikly působením bakterií fixujících vzdušný dusík (Rhizobium radicicola). Tyto bakterie je možno po obarvení karbolfuchsinem nebo methylenovou modří pozorovat mikroskopem. Pracovní postup: 1. Hlízky z kořenů bobovitých rostlin dobře omyjte a opláchněte destilovanou vodou. Mezi dvěma křížem položenými podložními skly (předtím nutno odmastit protažením v plameni) rozmačkejte a rozetřete větší hlízku a roztěr nechte uschnout. 2. Fixaci proveďte trojnásobným protáhnutím vysušeného preparátu plamenem kahanu. Po vychladnutí barvěte. 3. Barvení – buď monochromaticky (karbolfuchsinu, safranin,…) nebo podle Grama. 4. Spláchněte barvivo vodou. 5. Osušte preparát mezi dvěma listy filtračního papíru. 6. Pozorujte olejovou imerzí. 7. Nakreslete tvary buněk při zachování poměru velikosti. Na preparátu jsou vidět různé tvary bakterií, neboť tyto bakterie mají svůj tvarově rozmanitý vývojový cyklus. U druhu Rhizobium radicicola jsou bakterie v nejmladším stadiu kulovité (nejčastěji v době květu rostliny) ty přecházejí v tyčkovité (barví se slaběji), dále v buňky protáhlé (barví se silněji). Někdy je možno pozorovat i buňky ve tvaru písmene T nebo Y.
Část III. A) KULTIVACE BAKTERIÍ – odečítání výsledků 1) Popište velikost, tvar, okraje, profil, povrch, barvu, okolí kolonie, konzistence kolonie, vůni či zápach a vzájemné vztahy kolonií. Druh
Velikost kolonie v mm
Barva
Tvar
Povrch
Okraj
Další vlastnosti
2) Popište vzhled tekutých kultur Druh
zákal
blanka
sediment
B) METODA CFU – vyhodnocení C) TESTOVÁNÍ BAKTERICIDNÍHO A BAKTERISTATICKÉHO ÚČINKU ANTIBIOTIK METODOU REPLICA PLATING – vyhodnocení D) ZKOUŠKOVÝ TEST
