Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
1 Popis vzorku Podle protokolu č. 04 lze vyšetřit vzorky různých druhů masných výrobků na přítomnost pšeničné bílkoviny.
2 Detekční limit vyšetření Přítomnost pšeničné bílkoviny lze spolehlivě prokázat, pokud je její množství ve výrobku větší než 10 g/kg a více s pravděpodobností nad 95 % při vyšetření alespoň třech řezů z různých odběrových míst.
3 Časová náročnost Příprava vzorku: 72 hodin Vlastní pracovní postup: 9 hodin
4 Imunohistochemické zpracování Řezy je nutné před vlastním zpracováním nechat 1 hodinu na vyhřívací ploténce. Vlastní zpracování je z důvodu přizpůsobení prostředí pro úspěšnou vazbu antigen – protilátka zahájeno odparafinováním řezů. Parafín se v řezech rozpouští rozpouštědlem (xylen) a sestupnou alkoholovou řadou se vzorky převedou do vody. Celý postup se provádí ručně ve speciálních kyvetách nebo v automatu pro imunohistochemické zpracování. Reakční směsi, protilátky a barviva se aplikují dle popsaného postupu.
1/6 Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
4.1 Postup metody ABC Tab. 1 Postup imunohischotemického vyšetření Krok č.
Fáze
1
Fixace
2 3 4 5 6 7
Odparafinování
8 9 10 11 12 13 14
Příprava pro IHC vyšetření
15 16 17 18 19 20 21
Vlastní IHC vyšetření
22 23 24 25
Popis kroku potření podložních skel do roztoku 0,5 g želatiny rozpuštěné ve 100 ml teplé vody s přídavkem 0,05 g síranu chromitodraselného a 1 ml poly-L-lysinu lázeň v xylenu lázeň v xylenu lázeň ve 100% alkoholu lázeň ve 100% alkoholu lázeň ve vodovodní vodě lázeň v destilované vodě lázeň v PBS (80 g/l NaOH, 2g/l KCl, 2 g/l KH2PO4, 23,4 g/l Na2HPO4*12 H2O, 0,16 g/l NaOH, upravit pH na 7,4, ředění 1:10) lázeň v citrátovém pufru, zahřátí v mikrovlnce po dobu při 650W chladnutí oplach v PBS lázeň v 200 ml PBS s 6,7 ml H2O2 lázeň v PBS lázeň v PBS inkubace řezů s roztokem o složení 0,25 g sušeného mléka do 5 ml TBS + 5µl Tweenu inkubace s primární protilátkou v množství 45 µl na jeden řez lázeň v PBS s přídavkem Tweenu lázeň v PBS s přídavkem Tweenu inkubace se sekundární biotinilovanou protilátkou v množství 45 µl na jeden řez lázeň v PBS lázeň v PBS inkubace s ABC reagentem (5 ml TBS, 2 kapky reagentu A a 2 kapky reagentu B) lázeň v PBS lázeň v PBS inkubace s DAB
Čas
7 min. 7 min. 7 min. 7 min. 7 min. 7 min. 7 min.
5 min. 20 min. 5 min. 20 min. 5 min. 5 min. 20 min. 1 hod. při teplotě 24°C 5 min. 5 min. 30 min. 5 min. 5 min. 30 min. 5 min. 5 min. 3–5 min.
2/6 Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
Krok č. 26
Fáze
27
Barvení
28 29 30 31 32
Popis kroku lázeň v destilované vodě lázeň v barvícím roztoku/roztocích
Odvodnění Projasnění
Výsledky barvení
oplach v destilované vodě lázeň v alkoholu lázeň v acetonu lázeň v xylenu I lázeň v xylenu II pšeničná bílkovina ostatní komponenty
Čas 5 min. dle použitých roztoků – 10 min. 3 min. 5 min. 5 min. hnědě dle použitého barvení
Příprava roztoků: Fosfátový pufr – zásobní roztok PBS (phosphate buffered saline) 2000 ml destilovaná voda 160 g
chlorid sodný
4g
chlorid draselný
4g
dihydrogen fosforečnan draselný
46,8 g
hydrogen fosforečnan sodný
2 pecky hydroxid sodný -
roztok je nutné přefiltrovat a jeho pH upravit na 7,4
-
před použitím 10x ředit
Citrátový pufr – zásobní roztok 2000 ml destilovaná voda 42 g
kyselina citrónová
18 g
hydroxid sodný
-
roztok je nutné přefiltrovat a jeho pH upravit na 6,0
-
před použitím 10x ředit, pravidelně kontrolovat pH
Tris buffered saline (TBS) 1000 ml destilovaná voda 1 ks -
sáček TBS
zásobní roztok uchovávat v lednici 3/6
Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
4.2 Barvení pozadí Dobarvení preparátu (pozadí) se používá ke zvýraznění ostatních struktur ve vyšetřovaném vzorku pro dosažení přehlednosti celého řezu a vhodného barevného kontrastu. Pro možnost vyšetřování i dalších mikroskopicky posouditelných parametrů výrobku je pro dobarvení preparátu doporučeno přehledné barvení toluidinovou modří, které zároveň poskytuje odpovídající barevný kontrast pro případnou kvantifikaci výsledků (obrazovou analýzou či stereologickými postupy). Tab. 2 Postup dobarvení pozadí toluidinovou modří Krok č.
Fáze
1
Barvení
2 3 4 5 6
Popis kroku
Čas
lázeň v roztoku toluidinová modř
3–5 min.
oplach v destilované vodě
–
lázeň v 96% alkoholu
10 min.
lázeň ve 100% alkoholu
3 min.
lázeň v xylenu I
5 min.
lázeň v xylenu II
5 min.
Odvodnění Projasnění
Příprava roztoku: Roztok toluidinové modře 100 ml destilované vody 0,7 g toluidinové modři k 70 ml tohoto roztoku přidáme 30 ml glycerolu a 1,01 g fenolu -
roztok přefiltrujeme a pH vyrovnáme na 7,0
-
vždy před použitím roztoku zkontrolujeme pH a případně upravíme na 7,0
Výsledek barvení: svalovina – modrá s červenofialovými jádry elastická vlákna – tyrkysová kolagenní tkáň – bledě lososová s modrofialovými fibroblasty 4/6 Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
pšeničná bílkovina – hnědě (bledě modrozeleně) stěny rostlinných buněk – fuchsinově škrob a neutrální tuky – nebarví se
5 Vyšetření preparátů a hodnocení výsledků Zpracované a dobarvené řezy jsou vyšetřovány ve světelném mikroskopu při zvětšení 100x a 400x, pro studium detailů je používáno většího zvětšení. Obvykle se jedná o kvalitativní vyšetření. Pro fotodokumentaci volíme zvětšení 400x, v případě nutnosti zobrazit větší detaily volíme zvětšení např. 600x. Sledujeme přítomnost jednotlivých druhů tkání ve vyšetřovaných vzorcích se zřetelem na přítomnost pšeničné bílkoviny, která je zvýrazněná DAB chromogenem hnědě. Při identifikaci tkání živočišného i rostlinného původu je nutné vycházet z údajů v literatuře, pro srovnávání používat vzorky připravené v laboratoři a dále také schématické obrázky a fotodokumentaci z literatury. Vyšetření je možné doplnit o kvalitativní zpracování získaných obrazů streologickými metodami nebo analýzou obrazu.
6 Dokumentace O každém vyšetřovaném vzorku je veden laboratorní protokol s těmito údaji – datum odběru, druh výrobku, výrobce, složení (pokud bylo známé), postup zpracování (fixace, barvení), výsledek vyšetření. Aby nedošlo k záměně vzorků, je třeba označit nádobku názvem vzorku a číslem, pod kterým je vzorek veden v laboratorním protokolu, příp. I datem odběru, a dále i druh použité fixační tekutiny. Stejným způsobem označíme bločky a mikroskopická skla. Vzorky je možné označit a identifikovat také čárovým kódem. Všechny zhotovené preparáty jsou uchovány a podle potřeby je zhotovena fotodokumentace.
5/6 Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
Protokol 04 Sledovaná složka potraviny
pšeničná bílkovina
Druh potraviny
masné výrobky
Způsob vyšetření vzorku
imunohistochemické vyšetření
Verze protokolu
zkrácená verze
7 Výsledky Hnědě zbarvená pšeničná bílkovina tvoří houbovité struktury s otvory a nepatrnými zbytky škrobu.
8 Fotodokumentace
1
Popis obrázku: pšeničná bílkovina (1), zvětšení 100x
9 Seznam použitých zkratek -
ABC .............................................. avidin biotin komplex
-
DAB chromogen .......................... 3,3´diaminobenzidín
-
TBS ............................................... trisfosfátový pufer (trisphosphate bufered saline)
-
PBS ................................................ polyfosfátový pufer (phosphate bufered saline) 6/6
Zuzana Řezáčová Lukášková
1. 8. 2013
