KO-187
0376: Yusnita Rifai dkk.
METODE CEPAT BERBASIS TARGET UNTUK ISOLASI SENYAWA BIOAKTIF KANDIDAT ANTIKANKER PENGHAMBAT GLIOMA DARI BAHAN ALAM Yusnita Rifai*, Subehan, dan Muhammad Aswad Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar 90245 *E-mail:
[email protected] Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Isolasi berbasis bioassay senyawa bioaktif bahan alam membutuhkan proses fraksinasi dan sistem bioassay yang menyita waktu. Telah dikembangkan aplikasi protein terimmobilisasi pada magnetic beads berbasis nano partikel untuk mengisolasi secara cepat senyawa penghambat Glioma (GLI) dari bahan alam. Kultur GLI-GST yang diimmobilisasikan pada magnetic dynabeads COOH digunakan untuk menapis beberapa tanaman. Tanaman hit diseleksi jika campuran suspensi GLI-magnetic beads dan ekstrak tanaman membentuk endapan. Supernatan yang mengandung senyawa-senyawa non spesifik dihilangkan sedangkan endapan diekstraksikan dengan dengan metanol lalu dipisahkan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Metode ini menghasilkan isolasi yang cepat dan efisien senyawa penghambat GLI dengan menyeleksi Lempuyang wangi (Zingiber aromaticum), Temu putih (Curcuma zedoria), Temu kunci (Kaempferia pandurata), Kunyit Putih (Kaempferia rotunda), Lada Hitam (Piper nigrum), Cabe Jawa (Piper retrofractum) dan Selasih (Ocimum basillicum) sebagai simplisia aktif yang masingmasing mengandung 3, 4, 2, 6, 5, 4, 3 senyawa bioaktif utama. Pengoptimalan metode isolasi berbasis target dilakukan dengan membandingkan profil kromatogram pemisahan Temu Putih. Isolasi secara konvensional menghasilkan 42 puncak dengan 10 senyawa bioaktif utama sedangkan isolasi berbasis target menghasilkan 4 konstituen utama. Hal ini menunjukkan bahwa metode konvensional menghasilkan lebih banyak isolat yang bersifat non spesifik sehingga dibutuhkan waktu untuk pemurnian fraksifraksi dan uji aktivitasnya. Sebaliknya Isolasi berbasis target mengurangi sejumlah proses fraksinasi dan uji assay sehingga lebih efektif dan lebih efisien. Kata Kunci: Antikanker, GLI-Magnetic Beads, Signal Hedgehog, Isolasi Berbasis Target
I. PENDAHULUAN Kanker menjadi salah satu penyebab utama kematian di dunia. Kendati penelitian di bidang obat antikanker berkembang pesat, prevalensi penyakit ini tetap meningkat setiap tahun. Salah satu signal yang berperan penting dalam proliferasi sel kanker adalah Hedgehog (Hh). Signal Hh mengatur berbagai kejadian dalam perkembangan embrio dan pemeliharaan jaringan otot dewasa [1]. Kerusakan pada Hh mengakibatkan cacat lahir bawaan sedangkan penyimpangan ekspresi Hh memicu terjadinya kanker [2]. Signal dimulai dengan pengikatan ligan protein Hh pada membran reseptor PTCH. Ikatan ini lalu menekan aktivitas proto-onkogen Smoothened (Smo) dan memicu pelepasan gen GLI (glioma)[2]. Ekspresi berlebihan GLI dalam tubuh menyebabkan terjadinya karsinoma, medulablasoma, kanker pankreas dan
kanker prostat [3,4]. Olehnya, GLI merupakan target protein untuk penemuan bahan-bahan obat antikanker. Magnetic beads bermanfaat sebagai magnet yang akan menarik senyawa-senyawa aktif dari ekstrak metanol tanaman untuk terjerap pada target protein terimmobilisasi yang diinginkan. Pengembangan magnetic beads berbahan partikel nano merupakan kecenderungan mutakhir bagi ketersediaan bahan baku obat/ligan yang bersifat spesifik. Prinsip kerjanya, GLI-magnetic beads dan ekstrak metanol tanaman diinkubasi dalam tube. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dan pelepasan supernatan. Endapan yang mengandung senyawa-senyawa aktif antikanker dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Gambar 1).
KO-188
0376: Yusnita Rifai dkk.
Gambar 1. Outline pemanfaatan GLI-magnetic beads Pada penelitian sebelumnya, kami telah mengisolasi sejumlah senyawa bioaktif inhibitor Hh [5,6,7,8]. Namun dalam proses skrining dan isolasi yang menggunakan bioassay-guided separation ditemukan beberapa masalah, antara lain: rendahnya rendamen isolat (< 2 mg), hilangnya aktivitas biologi senyawa aktif akibat kontaminasi lemak dan zat pengotor, non-spesifiknya kerja isolat tunggal terhadap target protein GLI, dan tidak efisiennya proses skrining dan pemisahan sebab membutuhkan waktu yang lama dan jumlah pelarut yang tidak sedikit. Untuk mengatasi persoalan ini, kami mendisain suatu langkah inovasi yakni: mengimmobilisasikan target protein GLI pada magnetic beads asam karboksilat di mana ikatan GLI dan magnetic beads selanjutnya digunakan menjerap cepat senyawa-senyawa aktif dari ekstrak metanol tanaman menggunakan KCKT. Isolasi ekstrak metanol yang aktif berikutnya akan menghasilkan bahan baku obat antikanker yang bekerja spesifik pada protein GLI.
II. METODOLOGI A. Penyiapan Sampel Penelitian Koleksi ekstrak tanaman golongan Zingiberaceae diperoleh dari Balai UPT Materia Medica, Kota Batu, Malang, Jawa Timur. B. Ekstraksi Tanaman Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Sampel tanaman golongan Zingiberaceae (12 Simplisia), Lamiaceae (3 Simplisia) dan Piperaceae (4 simplisia) masing-masing dimasukkan ke dalam bejana maserasi bersama cairan metanol hingga seluruh sampel terendam, lalu ditutup rapat. Bejana maserasi disimpan di tempat yang terhindar dari sinar matahari langsung selama 3 hari sambil dilakukan pengadukan beberapa kali (minimal 2 x sehari). Ekstrak cair dikumpulkan kemudian diuapkan pada alat evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. C. Pengoleksian dan Pelabelan Ekstrak Masing-masing ekstrak yang telah dikoleksi dilabel dengan kode FU (Farmasi UNHAS) dan nama tanaman
Lempuyang wangi (FU-LW), Bangle (FU-BL), Lempuyang gajah (FU-LG), Jahe (FU-JH), Temu putih (FU-TP), Temu giring (FU-TG), Temu kuci (FU-TK), Kunyit kuning (FU-KK), Temulawak (FU-TW), Kencur (FU-KC), Lengkuas (FU-LK), dan Kunyit Putih (FU-KP), Kemangi (FU-KG), Lavender (FU-LV), Selasih (FU-DS), Lada Hitam (U-LH), Sirih (FUSH), Cabe Jawa (FU-CJ), Kemukus (FU-KS). D. Penyiapan dan Pengaktifan Suspensi GLI-Magnetic Beads Rekombinan GLI-Glutathione sepharose (GST) yang bersumber dari kultur sel Escherichia coli diperoleh dari H.Sasaki (RIKEN Japan). Dynabeads M-270 asam karboksilat (Invitrogen) dicuci berturut-turut menggunakan; 150 mL Nhydroxysuccinimide ; 150 mL 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride dan dalam 33 mL buffer MES selama 30 menit pada suhu kamar. Rekombinan GLI-GST dalam 400 mL larutan PBS ditambahkan untuk mengaktifkan magnetic beads. Pencampuran dilakukan pada suhu 400 C dan didiamkan selama 30 menit. Beads lalu direndam dalam 400 mL buffer tris-HCl selama 15 menit pada suhu kamar. Beads dicuci kembali dengan 200 µL buffer tris-HCl sebanyak 4 kali sebelum beads disuspensikan ke dalam 225 mL buffer NETN. Larutan suspensi ini selanjutnya disebut sebagai “suspensi GLI-magnetic beads”. E. Aplikasi Suspensi GLI-magnetic beads Pada Metode Isolasi Berbasis Target Ekstrak metanol tanaman Zingiberaceae, Lamiaceae dan Piperaceae yang telah dimaserasi ditimbang (10 mg) lalu ditambahkan 10 µL suspensi GLI-Magnetic Beads, kemudian campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit pada suhu -4 0C. Ekstrak yang membentuk endapan dinyatakan positif terjerap pada protein GLI. Supernatan yang mengandung senyawasenyawa non spesifik dibuang. F. Isolasi Senyawa Tunggal dari Ekstrak Tanaman Aktif pada GLI menggunakan Sepacore® Ekstrak metanol simplisia yang telah dimaserasi (Lempuyang Wangi, Temu Putih, Temu Kunci, Kunyit Putih,
0376: Yusnita Rifai dkk. Lada Hitam, Cabe Jawa dan Selasih) masing-masing ditimbang (10 mg) lalu ditambahkan 10 µL suspensi GLIMagnetic Beads, kemudian campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit pada suhu -4 0C. Endapan yang terbentuk dikeringkan sedangkan supernatan dibuang. Endapan kering dari 50 mikrotube dikumpulkan ke dalam bejana yang lebih besar, dilarutkan dalam heksan kemudian diinjeksikan ke dalam injektor Sepacore® sebanyak 5 mL (Kolom Cartridge PP 12/75, flow rate 10 mL/min, pressure max 10 bar) menggunakan eluen Hexane: Etil asetat. Deteksi UV dilakukan pada 254 nm dan 366 nm. Isolat-isolat dikumpulkan dalam vial-vial penampung diuapkan dan ditimbang. G. Perbandingan Profil Kromatogram Temu Putih Menggunakan 2 Metode Prosedur penyiapan simplisia, ektraksi dan injeksi ekstrak metanol Temu putih ke dalam Sepacore® secara konvensional dilakukan sama dengan metode Isolasi berbasis target. Bedanya, pada metode konvensional, tidak dilakukan aplikasi suspensi GLI-magnetic beads. Setelah diperoleh profil kromatogram, dibandingkan jumlah puncak dan jumlah senyawa bioaktif utama berdasarkan perbedaan waktu retensi, antara metode konvensional dan metode isolasi berbasis target.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Skrining terhadap tanaman golongan Zingiberaceae (12 Simplisia), Lamiaceae (3 Simplisia) dan Piperaceae (4 simplisia) dilakukan untuk mencari ekstrak metanol yang positif membentuk endapan (Tabel 1). Kemudian ekstrak tersebut diisolasi menggunakan Sepacore® untuk memperoleh senyawa bioaktif yang bekerja spesifik pada protein GLI, kandidat antikanker. Isolasi tanaman Lempuyang wangi, Temu putih, Temu kunci, Kunyit putih, Lada Hitam, Cabe jawa dan Selasih yang telah dicampurkan dengan suspensi GLI-magnetic beads menghasilkan masing-masing 3, 4, 2, 6, 5, 4, 3 komponen kimia utama (Gambar 1-7). Untuk mengoptimalkan metode isolasi berbasis target, Temu putih diisolasi 2 kali menggunakan 2 metode berbeda lalu dibandingkan profil kromatogramnya (Gambar 8). Dari metode konvensional, diperoleh 42 puncak dengan 10 senyawa bioaktif utama (major compounds) sedangkan dari metode baru (isolasi berbasis target) diperoleh 4 puncak khas dengan waktu retensi yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa terdapat 4 komponen kimia utama dalam tanaman Temu putih yang terjerap pada protein GLI. (Gambar 6, bawah) Dari profil kromatogram Sepacore® ini, disimpulkan bahwa metode konvensional menghasilkan lebih banyak isolat (major dan minor compounds) yang bersifat
KO-189 non spesifik. Dibutuhkan waktu untuk pemurnian fraksifraksi dan uji aktivitas sehingga tidak efisien dan efektif dibandingkan metode isolasi berbasis target menggunakan suspensi magnetic beads. Tabel 1. Hasil Pengamatan Campuran Suspensi GLI-Magnetic Beads dengan Ekstrak Metanol Tanaman Warna No Simplisia Endapan Endapan 1 Lempuyang (+) Coklat wangi 2 Bangle (-) (-) 3 Jahe (-) (-) 4 Temu putih (+) Coklat 5 Temu giring (-) (-) 6 Temu kunci (+) Kuning tua 7 Kunyit (-) (-) kuning 8 Temulawak (-) (-) 9 Kencur (-) (-) 10 Lengkuas (-) (-) 11 Lempuyang (-) (-) gajah 12 Kunyit (+) Coklat putih 13 Kemangi (-) (-) 14 Lavender (-) (-) 15 Selasih (+) Coklat 16 Lada Hitam (+) Coklat 17 Sirih (-) (-) 18 Cabe jawa (+) Coklat 19 Kemukus (-) (-)
Gambar 1. Profil Kromatogram Lempuyang wangi
KO-190
0376: Yusnita Rifai dkk.
Gambar 2. Profil Kromatogram Temu Putih
Gambar 6. Profil Kromatogram Cabe Jawa
Gambar 3. Profil Kromatogram Temu Kunci
Gambar 7. Profil Kromatogram Selasih
Gambar 4. Profil Kromatogram Kunyit Putih
Gambar 8. Profil Kromatogram Temu Putih dengan metode konvensional (Isolasi Berbasis Assay) tanpa aplikasi suspensi GLIMagnetic Beads.
IV.KESIMPULAN
Gambar 5. Profil Kromatogram Lada Hitam
Riset ini telah menghasilkan metode baru sebagai cara cepat dan efektif mengisolasi senyawa aktif antikanker yang bekerja pada target protein GLI. Dibandingkan metode konvensional, metode isolasi berbasis target lebih efisien sebab hemat waktu dan biaya. Selain itu, senyawa aktif yang diisolasi memiliki rendamen yang banyak, bebas dari
0376: Yusnita Rifai dkk. kontaminasi lemak dan bekerja spesifik sebab hanya terjerap pada target protein yang diinginkan.
DAFTAR PUSTAKA [1] Ruiz, A. A.; Sanchez, P,; Dahmane, N. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 361-372. [2] Rubin, L. L.; de Sauvage, F. J. Nat. Rev. Drug Disc. 2006, 5, 1026-1033. [3] Thayer, S. P.; di Magliano, M. P.; Heiser, P. W.; Nielsen, C. M.; Roberts, D. J.; Lauwers, G. Y.; Qi, Y. P.; Gysin, S.; Fernández-del Castillo, C.; Yajnik, V.; Antoniu, B.; McMahon, M.; Warshaw, A. L.; Hebrok, M. Nature 2003, 425, 851-856. [4] Sanchez, P.; Hernandez, A. M.; Stecca, B.; Kahler, A. J.; De Gueme, A. M.; Barrett, A.; Beyna, M.; Datta, M. W.; Datta, S.; Ruiz i Altaba, A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 12561-12566. [5] Rifai, Y.; Arai, M. A.; Koyano, T.; Kowithayakorn, T.; Ishibashi, M. J. Nat. Prod. 2010, 35, 995-997. [6] Rifai, Y.; Arai, M. A.; Sadhu, S. K.; Ahmed, F.; Ishibashi, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 718-722. [7] Shintani, A.; Toume, K.; Rifai, Y.; Arai, M. A.; Ishibashi, M. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1711-1713. [8] Rifai, Y.; Arai, M. A.; Koyano, T.; Kowithayakorn, T.; Ishibashi, M. J. Nat. Med. 2011, 65, 629-632.
KO-191
