ABSTRAK
DESAIN INHIBITOR KARBONAT ANHIDRASE II BERBASIS SENYAWA BAHAN ALAM GOLONGAN FENOLIK DAN SENYAWA ANALOG KURKUMIN Oleh:
Reza Aditama NIM: 30511012 (Program Studi Doktor Kimia)
Karbonat anhidrase II (CAII) adalah enzim yang memiliki aktivitas katalitik yang sangat tinggi. Peran fisiologis utama CAII adalah mengkatalisis reaksi reversibel hidrasi CO2 hasil proses metabolisme menjadi ion bikarbonat dan air. Selain itu, enzim ini juga berperan dalam aktivitas regulasi pH tubuh, regulator elektrolit, transpor air dan lainnya. Banyaknya proses fisiologis penting yang dilakukan oleh CAII mengakibatan defisiensi maupun kelebihan enzim ini teridentifikasi sebagai penyebab beberapa penyakit seperti glaukoma, osteopetrosis dan diabetes. Glaukoma merupakan penyakit yang terkait dengan tingginya tekanan intraokular pada mata yang dapat menyebabkan gangguan penglihatan bahkan kebutaan. Tingginya tekanan intraokular adalah akibat dari tingginya aktivitas CAII dalam menghidrasi CO2 sehingga menyebabkan kenaikan tekanan osmotik pada mata. Penanganan penyakit tersebut biasanya dilakukan dengan penggunaan inhibitor CAII. Senyawa sulfonamida seperti asetazolamida dan metazolamida merupakan obat komersial untuk glaukoma yang memiliki kemampuan inhibisi yang tinggi terhadap CAII. Akan tetapi, penggunaan inhibitor komersial ini diketahui menimbulkan banyak efek samping, seperti penurunan berat badan, mual, pusing dll. Oleh karena itu, pencarian inhibitor baru yang aman masih terus diupayakan. Salah satu pendekatan yang sering digunakan untuk mencari inhibitor yang aman adalah dengan memanfaatkan kerangka molekul berbasis senyawa bahan alam. Pada penelitian ini digunakan dua kerangka senyawa bahan alam dalam upaya mencari inhibitor alternatif CAII, yaitu senyawa golongan fenolik dan senyawa analog kurkumin. Kedua kelompok senyawa ini memiliki kemiripan dalam karakteristik strukturnya, yaitu sama-sama memiliki gugus hidroksil pada cincin aromatiknya. Kedua jenis senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antiinflamasi dan anti-kanker yang baik. Namun, penelitian mengenai potensi inhibisi kedua golongan senyawa tersebut terhadap CAII masih belum banyak diteliti. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan pencarian inhibitor CAII baru berbasis senyawa bahan alam golongan fenolik dan senyawa analog kurkumin yang memiliki kemampuan inhibisi cukup baik terhadap CAII.
i
Seleksi awal dilakukan dengan mengevaluasi potensi senyawa bahan alam golongan fenolik sebagai inhibitor CAII. Dari 40 senyawa yang dievaluasi secara in silico dengan metode docking diperoleh fisetin sebagai senyawa kandidat inhibitor CAII terbaik dengan nilai fitness score sebesar 51,46. Dari studi in silico ini diperoleh informasi bahwa molekul fisetin membentuk kompleks dengan ion Zn2+ dan distabilkan pula oleh ikatan hidrogen dengan residu Asn67, Thr199 dan Thr200. Analisis in silico lebih lanjut dengan simulasi dinamika molekul menunjukkan interaksi CAII dengan residu Asn67 dan Thr200 tidak teramati sedangkan interaksi fisetin dengan residu Thr199 masih teramati selama simulasi dinamika molekul berlangsung. Tahap seleksi awal dilanjutkan dengan mengevaluasi afinitas senyawa analog kurkumin terhadap CAII. Dari 44 senyawa yang diteliti, didapatkan 6 buah senyawa yang memiliki afinitas tinggi terhadap CAII. Keenam senyawa tersebut kemudian diverifikasi secara eksperimen dengan menentukan nilai IC50 dari masing-masing senyawa tersebut. Hasil uji inhibisi menunjukkan senyawasenyawa tersebut memiliki potensi inhibisi terhadap CAII dengan rentang nilai IC50 antara 7,92±0,54 µM hingga 72,31±2,21 µM. Senyawa a1 atau (E)-3-((E)-2hydroxybenzylidene)-5-((2-hydroxyphenyl) methylene)piperidin-4-one memiliki level aktivitas terbaik secara eksperimen yaitu dengan nilai IC50 7,92±0,54 µM. Untuk mengetahui interaksi antara inhibitor a1 dengan CAII, pada penelitian ini dilakukan analisis in silico dengan metode docking dan simulasi dinamika molekul. Hasil docking memperlihatkan interaksi spesifik yang terjadi antara senyawa a1 dan residu-residu pada pusat aktif CAII dengan fitness score sebesar 49,76. Gugus hidroksil pada posisi orto (R2) dan gugus NH pada posisi R1 berinteraksi melalui ikatan hidrogen dengan residu Gln92, Thr199 dan Thr200. Interaksi antara a1 dengan residu Gln92 tidak teramati setelah dilakukan simulasi, sedangkan interaksi Thr199 dan Thr200 cukup stabil setelah dievaluasi lebih lanjut dengan simulasi dinamika molekul. Untuk lebih mengoptimalkan kemampuan inhibisi dari senyawa-senyawa kandidat yang telah diperoleh dari hasil seleksi, maka pada penelitian ini juga dilakukan desain inhibitor baru dengan membuat turunan dari kedua senyawa tersebut. Senyawa-senyawa kandidat inhibitor CAII (fisetin dan a1) dimodifikasi strukturnya secara in silico dan hasil docking menunjukkan bahwa senyawa F12 hasil desain memiliki afinitas yang lebih baik terhadap CAII dibandingkan dengan senyawa fisetin. Hal ini ditunjukkan dari adanya peningkatan fitness score dari 51,46 menjadi 55,95. Kehilangan interaksi dengan ion Zn2+ dikompensasi dengan penambahan kekuatan interaksi terhadap residu Thr199 dan Thr 200 dan penambahan kontribusi interaksi hidrofobik. Peningkatan fitness score juga teramati pada senyawa 3-piperidinil-a1 serta 3,3’-diamin-a1 yang menunjukkan afinitas yang lebih baik terhadap CAII apabila dibandingkan senyawa kandidat a1. Hal ini terlihat dari fitness score kedua senyawa tersebut yang meningkat dari 49,76 menjadi 54,42 (3-piperidinil-a1) dan 54,89 (3,3’-diamin-a1). Peningkatan afinitas 3-piperidinil-a1 didapatkan dari penguatan interaksi antara senyawa desain dengan residu Thr199 dan Thr200, serta tambahan interaksi dengan ion Zn2+. Sedangkan peningkatan afinitas 3,3’-diamin-a1 didapatkan dari penguatan interaksi senyawa tersebut dengan residu Thr199 dan Thr200 tanpa melibatkan interaksi kovalen dengan ion Zn2+.
ii
Penelitian ini memberikan kontribusi terhadap beberapa hal baru yaitu pencarian dan pengembangan serta desain inhibitor CAII berbasis senyawa bahan alam golongan fenolik dan senyawa analog kurkumin. Kata kunci: karbonat anhidrase II (CAII), desain inhibitor, senyawa fenolik, analog kurkumin
iii
ABSTRACT
DESIGN OF CARBONIC ANHYDRASE II INHIBITOR BASED ON NATURAL PRODUCT COMPOUNDS FROM PHENOLIC GROUP AND CURCUMIN ANALOGUES By:
Reza Aditama NIM: 30511012 (Doctoral Study Program in Chemistry)
Carbonic anhydrase II (CAII) is an enzyme with a supercatalytic activity. This enzyme catalyzes a reversible reaction of CO2 into a bicarbonate ion and a water molecule. It also play an important roles on many metabolism process in human body such as regulation of body’s pH, electrolyte regulator, water transport process, etc. Because of many physiological process involving CAII, the deficiency or excess of this enzyme are closely related to several diseases such as glaucoma, osteopetrosis and diabetes. Glaucoma is a disease associated to high intraocular pressure in the eye that causes vision problem, even blindness. The treatment of the glaucoma is usually performed using CAII inhibitors. Sulfonamide compounds such as acetazolamide and methazolamide have been used as commercial drugs to treat glaucoma. These compounds have been shown to have strong inhibition activity against CAII. However, the use of these drugs produces many side effects such as weight loss, nausea, dizziness, etc. Therefore, the searches for novel inhibitor are still being carried out. One of the common approaches to search a novel inhibitor is by using molecular framework from natural products structure. In this study, phenolic compounds and curcumin analogues are used in the search for the novel CAII inhibitor. These two compounds have hydroxyl group at the aromatic ring. Both of phenolic and curcumin compounds are known to have anti-inflammatory and anti-cancer activity. However, research on the potential of inhibition of these compounds against CAII still has not been explored yet. Hence, searching of novel CAII inhibitor based on phenolic group and curcumin analogues that have inhibition activity against CAII has been carried out on this study. In this study, we have evaluated the potency of phenolic group to inhibit CAII. Evaluation of 40 compounds from phenolic group with docking method showed that fisetin was the best inhibitor candidate for CAII. Fitness score resulted from the docking was 51.46. This fitness score indicates that fisetin has good affinity to the CAII. Docking simulation shows that fisetin interacts with the Zn2+ ion and is stabilized by hydrogen bonding from Asn67, Thr199 and Thr200. Further analysis with molecular dynamics simulation showed that the interaction of fisetin with iv
Asn67 and Thr200 was not observed, meanwhile the interaction of fisetin with Thr199 residue was still observed during the simulation. The screening of CAII inhibitors from curcumin analogues was also performed in this study. From 44 curcumin analogues compounds, we found six curcumin analogues that have high affinity against CAII with IC50 values within range of 7.92±0.54 µM to 72.31±2.21 µM. (E)-3-((E)-2-hydroxybenzylidene)-5-((2hydroxyphenyl)methylene)piperidine-4-one or a1 has the lowest IC50 value of 7.92±0.54 µM. Fitness score for a1 obtained from the docking simulation was 49.76. The interactions of a1 with CAII were occured between the hydroxyl group at the ortho position (R2) and the NH group at the position R1 with Gln92, Thr199 and Thr200 residues. The interaction between a1 with Thr199 and Thr200 remained stable after being evaluated by molecular dynamics simulation, meanwhile the interaction of a1 with Gln92 was not observed. We have also successfully carried out the design of new inhibitors from phenolic compounds and curcumin analogues. The structures of inhibitor candidates of CAII (fisetin and a1) were modified in silico to produce better binding affinity to the CAII. The designed compound (F12) has a better affinity against CAII compared to fisetin. The fitness score of F12 produced from docking simulation was increased from 51.46 to 55.95. The strenghtening interactions of F12 with Thr199 and Thr200 compensate the missing interaction with Zn2+ ion. A similar increase in the fitness score was also observed in 3-piperidinil-a1 and 3,3’diamin-a1, which showed better affinity against CAII compared to a1. The fitness score of these compounds were increased from 49.76 to 54.42 and 54.89 for 3piperidinil-a1 and 3,3’-diamin-a1, respectively. The increased affinity of 3piperidinil-a1 is obtained from the strengthening interaction between the designed compounds with Thr199 and Thr200 residues, as well as the additional interaction with Zn2+ ion. On the other hand, the increased affinity of 3,3’-diamin-a1 gained from the strengthening interaction with Thr199 and Thr200 residues without involving covalent interaction with Zn2+. This study contributes a new insight on the systematic search, development and design of CAII inhibitors from phenolic groups and curcumin analogues. Keywords: carbonic anhydrase II (CAII), the design of inhibitors, phenolic compounds, curcumin analogues
v
