SINTESIS DAN UJI TOKSISITAS SENYAWA ANALOG KURKUMIN TURUNAN 1-METIL-4-PIPERIDINON N. Hidayah1, Y. Eryanti2, A. Zamri2 1
Mahasiswa Program S1 Kimia Bidang Kimia OrganikJurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia 2
[email protected] ABSTRACT Curcumin is one of secondary metabolites included into the class of group fenolic which was known to have biological activity such as anticancer, antioxidant, antidiabetic, and anti-inflammatory. Therefore, curcumin becomes model of target compounds that have various structure. In this research, curcumin analog coumponds of 1-methyl-4piperidone derivative were synthesized using microwave irradiation with a base catalyst (NaOH). The rendement obtained from each of curcumin analogs are (3E,5E)-3,5-bis (2-chlorobenzilidyn)-1-methylpiperidyn-4-one (1) with value 38,86 %, (3E,5E)-3,5-bis (4-chlorobenzilidyn)-1-methylpiperidyn-4-one (2) with value 65,60 % dan (3E,5E)-3,5bis (3-bromobenzilidyn)-1-methylpiperidyn-4-one (3) with value 19,73%. The purity of all compounds has been tested using TLC, melting point test, and analytical HPLC. The identification of curcumin analog coumponds was analysed using UV, IR, 1H NMR and MS. The toxicity test done by Brine Shrimpt Lethality Test (BSLT) method to Artemia salina Leach larva showed that LC50 < 200 μg/mL. The result toxicity test to all of compounds showed that the coumpond(1) is the most toxic compared to (2) and (3). Keywords: Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), curcumin, toxicity test
ABSTRAK Kurkumin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder golongan fenolik yang dikenal memiliki aktivitas biologis seperti antikanker, antioksidan, antidiabetes dan antiinflamasi. Oleh karena itu, kurkumin menjadi model senyawa target dengan variasi struktur yang beragam. Dalam penelitian ini, senyawa analog kurkumin turunan 1-metil-4-piperidinon telah disintesis menggunakan metode iradiasi mocrowave dengan katalis basa (NaOH). Rendemen senyawa yang diperoleh untuk masing-masing analog kurkumin yaitu senyawa (3E,5E)-3,5-bis(2-klorobenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on (1) sebesar 38,86 %, senyawa (3E,5E)-3,5-bis(4-klorobenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on (2) sebesar 65,60 %.dan senyawa (3E,5E)-3,5-bis(3-bromobenzilidin)-1-metilpiperidin-4on (3) sebesar 19,73 %. Kemurnian senyawa telah diuji menggunakan KLT, uji titik leleh, dan analisis HPLC. Identifikasi senyawa analog kurkumin dianalisis
1
menggunakan spektroskopi UV, IR, 1H NMR dan MS. Uji toksisitas senyawa kurkumin menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) terhadap larva Artemia salina Leach menunjukkan nilai LC50< 200 µg/mL. Hasil uji toksisitas untuk semua senyawa menunjukkan bahwa senyawa (1) lebih toksik dibandingkan senyawa (2) dan (3). Kata kunci: Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), kurkumin, uji toksisitas PENDAHULUAN Kurkumin (1,7-bis-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-dion) merupakan salah satu metabolit sekunder yang termasuk golongan fenolik yang dikenal memiliki aktivitas biologis seperti antiinflamasi, antioksidan, antiviral, antiinveksi, antialergi (Hendler et al., 2007), antikanker (Aggarwal et al., 2007), antitumor (Thangapazham et al., 2006)dan lain-lain. Senyawa kurkumin berwarna kuning kemerahan yang diekstraksi dari akar tanaman Curcuma longa L (Zingibraceae) (Fadda et al., 2009). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa modifikasi struktur kurkumin menjadi suatu senyawa analog kurkumin menghasilkan efek farmakologi yang lebih baik dibandingkan senyawa kurkumin. Pada tahun 2005, Handler melaporkan bahwa produk sintesis berupa analog kurkumin (1E,6E)-1,7-bis(3,4-diflorofenil)hepta-1,6dien-3,5-dion, (1E,6E)-1,7-bis(4-(metiltio)fenil)hepta-1,6-dien-3,5-dion, (1E,6E)-1,7bis(4-(metilsulfonil)fenil)hepta-1,6-dien-3,5-dion dan (1E,6E)-1,7-bis(2,3,4(trimetoksifenil)hepta-1,6-dien-3,5-dion yang dihasilkannya sebayak 8-50% memiliki aktivitas sebagai antikarsinogenik. Penelitian selanjutnya Hasil penelitian yang dilakukan oleh Yadav (2012) menunjukkan analog kurkumin heterosiklik 3,5-bis(3,4,5trimetoksibenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on dan 1-metil-3,5-bis[(E)-(4-piridil) metilidin]-4-piperidon berpotensi sebagai antikanker dan anti-angiogenik. Berdasarkan aktivitas biologis tersebut maka kurkumin dapat dijadikan sebagai model struktur senyawa target yang akan disintesis. Sintesis kurkumin dapat dilakukan dengan reaksi kondensasi aldol yang sering dikenal dengan kondensasi Claisen-Schmidt. Kondensasi aldol merupakan reaksi pembentukan ikatan karbon-karbon antara keton dan aldehid aromatik.. Reaksi ini dikenal ramah lingkungan karena tidak banyak menggunakan bahan-bahan kimia berbahaya dan prosesnya juga sangat sederhana.Reaksi kondensasi aldol dapat dilakukan dengan menggunakan katalisasam atau basa. Katalis asam yang biasa digunakan dalam reaksi kondensasi aldol antara lain HCl dan SOCl 2 sedangkan katalis basa yang biasa digunakan adalah NaOH dan KOH (Jayapal and Sreedhar, 2011). Pada penelitian ini dilakukan sintesis tiga analog kurkumin dengan metode satu tahap reaksi menggunakan iradiasi microwave. Metode iradiasi microwave mempunyai keuntungan seperti prosesnya lebih ramah lingkungan, ekonomis dan cara baru dalam meningkatkan green chemistry (Jayapal and Sreedhar, 2010).
2
METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat penentu titik leleh Fisher John, HPLC (Shimadzu Lcsolution), spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S UV-VIS v4.002 2L9N175013), spektroskopi IR (FTIR Shimadzu, IR Prestige-21), spektroskopi 1H NMR (JEOL tipe ECA 500 mHz) di Institut Teknologi Bandung (ITB), Bandung, spektroskopi Massa (MS water LCT premier XE mode positif) di Institut Teknologi Bandung (ITB), Bandung, alat-alat untuk sintesis dan uji toksisitas yang umum digunakan di laboratorium. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah senyawa 1-metil-4piperidinon (Merck), 2-klorobenzaldehid (Merck), 4-klorobenzaldehid (Merck), 3bromobenzaldehid (Merck), natrium hidroksida (NaOH), etanol absolut, dimetilsulfoksida (DMSO), telur udang (Artemia salina Leach), air laut dan pelarutpelarut organik yang umum digunakan. b. Sintesis kurkumin(1) dan (2) Sebanyak 0,5658 g (5 mmol) 1-metil-4-piperidinon dan sebanyak 1,4057 g (10 mmol) halobenzaldehid (2-klorobenzaldehid dan 4-klorobenzaldehid) dimasukkan ke dalam labu leher dua yang dilengkapi dengan magnetic stirrer kemudian ditambahkan 5 ml etanol absolut dan 1 ml NaOH 40%. Campuran diiradiasi selama 4 menit dengan suhu 800C dan 400 Watt menggunakan iradiasi microwave. Reaksi dibantu dengan pengadukan menggunakan magnetik stirrer dan reaksi dikontrol dengan KLT. Setelah reaksi selesai, Crude product didinginkan dan dicuci dengan aquades dingin hingga terbentuk endapan kuning kehijauan. Endapan yang terbentuk disaring menggunakan corong Buchner dan dicuci dengan n-heksan dingin lalu dikeringkan. Crude product yang diperoleh dilakukan rekristalisasi dengan pelarut etanol absolut. Uji kemurnian dengan KLT, pengukuran titik leleh dan HPLC. Senyawa murni dikarakterisasi dengan IR, NMR dan MS. c. Sintesis kurkumin (3) Sebanyak 0,5658 g (5 mmol) 1-metil-4-piperidinon dan sebanyak 1,8497 g (10 mmol) 3-bromobenzaldehid dimasukkan ke dalam labu leher dua yang dilengkapi dengan magnetic stirrer kemudian ditambahkan 1 mL etanol absolut dan 1 ml NaOH 40%. Campuran diiradiasi selama 3 menit dengan suhu 80 0C dan 400 Watt menggunakan iradiasi microwave. Reaksi dibantu dengan pengadukan menggunakan magnetik stirrer dan reaksi dikontrol dengan KLT. Setelah reaksi selesai, Crude product didinginkan dan dicuci dengan aquades dingin hingga terbentuk endapan kuning. Endapan yang terbentuk disaring menggunakan corong Buchner dan dicuci dengan n-heksan dingin lalu dikeringkan. Crude product yang diperoleh dilarutkan dengan etilasetat dan silika gel kemudian disaring dan dipisahkan pelarutnya dengan evaporator hingga diperoleh padatan. Padatan yang diperoleh belum murni sehingga dilakukan rekristalisasi dengan pelarut etanol absolut. Uji kemurnian dengan KLT, pengukuran titik leleh dan HPLC. Senyawa murni dikarakterisasi dengan IR, NMR dan MS.
3
d. Uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Sampel sebanyak 20 mg dilarutkan dalam 2 mL metanol (larutan induk, konsentrasi 10000 µg/mL), kemudian dari larutan induk dibuat konsentrasi yang berbeda 1000 µg/mL, 100 µg/mL, 10 µg/mL dengan cara pengenceran bertingkat. Sampel dipipet kedalam masing-masing vial sebanyak 0,5 mL, lalu pelarut diuapkan hingga mengering. Selanjutnya, ditambahkan 50 µL DMSO, 10 ekor larva Artemia salina Leach dan air laut sampai batas kalibrasi 5 mL. Larva yang mati dihitung setelah 24 jam. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan dengan perlakuan yang sama untuk masing-masing konsentrasi. Data yang diperoleh dihitung nilai LC50 dengan metode kurva menggunakan tabel analisis probit (Harefa, 1987). HASIL DAN PEMBAHASAN a. Sintesis analog kurkumin Sintesis senyawa analog kurkumin menggunakan metode iradiasi microwave dengan katalis NaOH dan pelarut etanol. Skema reaksi sintesis senyawa analog kurkumin dapat dilihat pada Gambar 1. O R4
O
H
2
R3
+
R1
N CH3
R2
O
NaOH
R4
-2H2O
R3
6
1
1'
6'
R4
5
5' 2'
2 4
3
R1
R2
R1 N CH3
(1) R1= Cl R2= H R3= H (2) R1= H R2= H R3= Cl (3) R1= H R2= Br R3= H
3'
4'
R3
R2 R4= H R4= H R4= H
Gambar 1. Skema reaksi sintesis analog kurkumin Tabel 1: Sifat fisik senyawa analog kurkumin Senyawa 1 2 3
Rumus Molekul C20H18Cl2NO C20H18Cl2NO C20H18Br2NO
Berat Molekul 357,07 357,07 444,97
Rendemen (%) 38,86 65,60 19,73
Warna Kristal Kuning Kuning Kuning
Titik Leleh (0C) 38-86 65-60 129-130
Senyawa analog kurkumin yang dihasilkan yaitu (3E,5E)-3,5-bis(2klorobenzaldehid)-1-metilpiperidin-4-on (1), (3E,5E)-3,5-bis(4-klorobenzaldehid)-1metilpiperidin-4-on (2) dan (3E,5E)-3,5-bis(3-bromobenzaldehid)-1-metilpiperidin-4-on (3). Ketiga senyawa analog kurkumin menghasilkan rendemen yang cukup baik (19-66%). Uji kemurnian senyawa analog kurkumin dilakukan dengan uji KLT menggunakan eluen yang berbeda yang menunjukkan satu noda, uji titik leleh dengan range ≤ 20C dan analisis HPLC yang menunjukkan satu puncak dengan tR= 16,9 menit untuk senyawa (1) pada, tR= 17,8 menit untuk senyawa (2) dan tR= 18,8 menit untuk senyawa (3).
4
Spektrum UVsenyawa (1)memperlihatkan adanya serapan maksimum pada λ 205, 239 dan 315 nm, senyawa (2) pada λ 202, 236 dan 333 nm dan senyawa (3) pada λ 210, 324 dan 374 nm. Hal ini menunjukkan adanya ikatan rangkap terkonjugasi. Spektrum IR senyawa analog kurkumin masing-masing memperlihatkan adanya serapan pada bilangan gelombang 3065-3066 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus C-H aromatik, pada bilangan gelombang 1668-1674 cm-1 menunjukkan adanya gugus C=O, pada bilangan gelombang 1613-1620cm-1 menunjukkan adanya gugus C=C aromatik, pada bilangan gelombang 1266-1282 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-N dan pada bilangan gelombang 633-780 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-X. Tabel 2:Interpretasi data 1H-NMR senyawa (1) No Atom C δH (ppm) C-3/C-3’ 7,24 (m) C-4/C-4’ dan C-5/C-5’ 7,31 (m) C-6/C-6’ 7,46 (m) Cβ 8,00 (s) -CH2-N-CH23,61 (s) CH3-N2,37 (s) Tabel 2 diatas memperlihatkan interpretasi data spektrum 1H-NMR senyawa (1) pada pergeseran kimia δ 8,00 ppm (2Hβ) menunjukkan proton betadengan puncak singlet. Pergeseran kimia pada 7,46 ppm (2H) menunjukkan proton pada atom C-6/C-6’dengan puncak multiplet. Pergeseran kimia pada 7,31 ppm (4H) menunjukkan adanya proton pada C-4/C-4’ dan C-5/C-5’ dengan puncak multiplet. Pergeseran kimia pada 7,24 ppm (2H) menunjukkan proton pada atom C-3/C-3’ dengan puncak multiplet. Pergeseran kimia pada 3,61 ppm (4H) menunjukkan sinyal proton pada cincin heterosiklik (–CH2-N-CH2-) dengan puncak singlet dan pergeseran kimia pada 2,37 ppm (3H) menunjukkan adanya proton dari metil yang terikat pada N heterosiklik (CH3-N-) dengan puncak singlet. Data ini telah mengkonfirmasi struktur yang diperoleh sesuai dengan struktur senyawa target. Tabel 3:Interpretasi data 1H-NMR senyawa (2) No Atom C δH (ppm) C-2/C-2’ dan C-6/C-6’ 7,38 (d, J= 5 Hz) C-3/C-3’ dan C-5/C-5’ 7,31 (d, J= 10 Hz) Cβ 7,73 (s) -CH2-N-CH23,71 (s) CH3-N2,46 (s) Tabel 3 diatas memperlihatkan interpretasi data spektrum 1H-NMR senyawa (2) pada pergeseran kimia δ 7,73 ppm (2Hβ) menunjukkan proton beta dengan puncak singlet. Pergeseran kimia pada 7,38 ppm (4H) menunjukkan proton pada atom C-2/C-2’ dan C-6/C-6’ dengan puncak doublet. Pergeseran kimia pada 7,31 ppm (4H) menunjukkan proton pada atom C-3/C-3’ dan C-5/C-5’ dengan puncak doublet.
5
Pergeseran kimia pada 3,71 ppm (4H) menunjukkan sinyal proton pada cincin heterosiklik (–CH2-N-CH2-) dengan puncak singlet dan pergeseran kimia pada 2,45 ppm (3H) menunjukkan adanya proton dari metil yang terikat pada N heterosiklik (CH3-N-) dengan puncak singlet. Data ini telah mengkonfirmasi struktur yang diperoleh sesuai dengan struktur senyawa target. Tabel 4:Interpretasi data 1H-NMR senyawa (3) No Atom C δH (ppm) C-4/C-4’, C-5/C-5’ 7,50 (m) C-2/C-2’, C-6/C-6’ 7,28 (m) Cβ 7,73 (s) -CH2-N-CH23,73 (s) CH3-N2,47 (s) Tabel 4 diatas memperlihatkan interpretasi data spektrum 1H-NMR senyawa (3) pada pergeseran kimia δ 7,73 ppm (2Hβ) menunjukkan proton betadengan puncak singlet. Pergeseran kimia pada 7,38 ppm (4H) menunjukkan proton pada atom C-2/C-2’ dan C-6/C-6’ dengan puncak doublet. Pergeseran kimia pada 7,31 ppm (4H) menunjukkan proton pada atom C-3/C-3’ dan C-5/C-5’ dengan puncak doublet. Pergeseran kimia pada 3,71 ppm (4H) menunjukkan sinyal proton pada cincin heterosiklik (–CH2-N-CH2-) dengan puncak singlet dan pergeseran kimia pada 2,45 ppm (3H) menunjukkan adanya proton dari metil yang terikat pada N heterosiklik (CH3-N-) dengan puncak singlet. Data ini telah mengkonfirmasi struktur yang diperoleh sesuai dengan struktur senyawa target. Spektrum massa menunjukkan berat molekul senyawa (1) dihitung sebagai C20H18Cl2NO dengan puncak molekul m/z 358,0776 [M+H]+ dan yang dihitung secara teoritis adalah 358,0765. Selisih massa molekul (1) yang diperoleh 0,0011. Nilai DBE (Double Bound Eqivalen) dari rumus molekul senyawa yang ditunjukkan oleh spektrum massa dan yang dihitung secara teoritis yang diperoleh yaitu 12 yang menunjukkan adanya 12 jumlah ikatan rangkap pada senyawa (1). Berat molekul senyawa (2) yang dihitung sebagai C20H18Cl2NO menunjukkan puncak molekul m/z 358,0778 [M+H]+ dan secara teoritis dihitung berat molekul (2) adalah 358,0765. Selisih molekul (2) yang diperoleh adalah 0,0013. Nilai DBE (Double Bound Eqivalen) dari rumus molekul senyawa yang ditunjukkan oleh spektrum massa dan yang dihitung secara teoritis yang diperoleh yaitu 12 yang menunjukkan adanya 12 jumlah ikatan rangkap pada senyawa (2). Berat molekul senyawa (3) yang dihitung sebagai C20H18Br2NO menunjukkan puncak molekul m/z 445,9746 [M+H]+ dan secara teoritis dihitung berat molekul (3) adalah 445,9755. Selisih massa molekul (3) yang diperoleh adalah 0,0009. Nilai DBE (Double Bound Eqivalen) dari rumus molekul senyawa yang ditunjukkan oleh spektrum massa dan yang dihitung secara teoritis yang diperoleh yaitu 12 yang menunjukkan adanya 12 jumlah ikatan rangkap pada senyawa (3). Berdasarkan data diatas menunjukkan bahwa senyawa (1), (2) dan (3)berturut-turut diidentifikasi sebagai senyawa (3E,5E)-3,5-bis(2-klorobenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on, senyawa (3E,5E)3,5-bis(4-klorobenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on dan senyawa (3E,5E)-3,5-bis(3bromobenzilidin)-1-metilpiperidin-4-on.
6
b. Uji toksisitas Tabel 5: Hasil uji toksisitas senyawa analog kurkumin Senyawa
Nama Senyawa
1
(3E,5E)-3,5-bis(2klorobenzilidin)-1metilpiperidin-4-on
Nilai LC50 (µg/mL)
Struktur senyawa O
11,76 Cl
N
Cl
O
2
(3E,5E)-3,5-bis(4klorobenzilidin)-1metilpiperidin-4-on
3
(3E,5E)-3,5-bis(3bromobenzilidin)-1metilpiperidin-4-on
Cl
Cl
N
14,13
O
36,39 N
Br
Br
Hasil uji toksisitas senyawa (1), (2) dan (3) diperoleh nilai LC50< 200 μg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa adanya efek toksik terhadap kematian larva dan menunjukkan tingkat toksisitas yang berbeda. Senyawa (1) menunjukkan tingkat toksik lebih besar dibandingkan senyawa (2) dan (3). Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan Adams et al (2004) melaporkan bahwa senyawa 3,5-Bis-(2florobenzilidin)piperidine-4-on yang memiliki subtituen halogen pada posisi orto aktif terhadap antikanker. Aktivitas biologis senyawa analog kurkumin pada penelitian ini, kemungkinan dipengaruhi adanya gugus α, β-tak jenuh oleh substituen pada cincin aromatik dan alkil yang terikat pada atom N heterosiklik yang terdapat pada senyawa tersebut. Pada senyawa (1) substituen halogen pada cincin aromatik terletak pada posisi orto. Sedangkan pada senyawa (2) substituen halogen pada cincin aromatik terletak pada posisi para dan pada senyawa (3) terletak pada posisi meta. Efek mesomeri positif dari substituen halogen pada posisi orto dan para dapat mempengaruhi ikatan rangkap α, β pada gugus karbonil α, β tak jenuh sehingga menyebabkan aktivitas toksisitas pada senyawa (1) dan (2) lebih besar dari senyawa (3) yang substituen halogennya terletak pada posisi meta. Selain itu, aktivitas senyawa analog kurkumin juga dipengaruhi oleh gugus metil yang terikat pada N heterosiklik menjadi lebih aktif sebagai nukleofil sehingga menyebabkan tingkat toksisitasnya jauh lebih besar. Hal ini kemungkinan akan memudahkan senyawa analog kurkumin untuk berinteraksi dengan larva Artemia salina Leach.
7
KESIMPULAN DAN SARAN Ketiga senyawa analog kurkumin dapat disintesis menggunakan katalis basa NaOH dengan metode iradiasi microwave dengan rendemen masing-masing senyawa 1, 2 dan 3 adalah 38,86 %, 65,60 % dan 19,73 %. Ketiga senyawa analog kurkumin memiliki nilai LC50<200 µg/ml sehingga berpotensi sebagai senyawa antikanker. Hasil uji toksisitas menunjukkan tingkat toksisitas senyawa (1) lebih besar dibandingkan dengan senyawa (2) dan (3) sehingga perlu dilakukan uji aktivitas lainnya terutama uji antikanker dan dapat dimanfaatkan secara luas. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Universitas Riau melalui Lembaga Penelitian yang telah membantu biaya penelitian ini melalui Dana Hibah Bersaing atas nama Dra. Yum Eryanti, MS tahun 2013.Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Adel Zamri, MS, DEA dan Dra. Yum Eryanti, MS yang telah membimbing, memotivasi serta membantu penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. DAFTAR PUSTAKA Adams, B.K., Ferstl, E.M., Davis, M. C., Herold, M., Kurtkaya, S., Camalier, R.F., Hollingshead, M.G., Kaur, G., Sausville, E.A., Rickles, F.R., Snyder, J.P., Liotta, D.C. and Shoji, M. 2004. Synthesis and Biological Evaluation of Novel Curcumin Analogs As Anti-cancer and Anti-angiogenesis Agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry.12:3871-3883. Aggarwal, B., Sundaram, C., Malani, N. and Ichikawa, H. 2007. Curcumin: The Indian Solid Gold. Biomedical and life Sciences.(595): 1-75. Fadda, A., Badria, F.A. and El-Attar, K.M. 2009. Synthesis and Evaluation of Curcumin analogues as sytotoxic agents. Mansoura University. Handler, N.,Jaener, W.,Pushacher, H., Leiser, K. and Erker, T. 2007. “Synthesis of Novel Curcumin Anologues and Their Evaluation As Selective Cyloxigenase1(cox-1) Inhibitors”. J. chem. Pharm. Bull.55:64-71. Harefa, F. 1997. Pembudidayaan Artemia salina untuk Pakan Udang dan Ikan.Penebit Swadaya, Jakarta. Jayapal, M.R and Sreedhar, N.Y. 2010. Anhydrous K2CO3 as Catalyst for the synthesis of Chalcones under Microwave Irradiation.Journal of Pharmaceutical Science and Research. 2(10): 644-647. Thangapazham, R.L., Sharma, A. and Maheshwari, R.K., 2006, Multiple Molecular Targets in Cancer Chemoprevention by curcumin,The AAPS Journal. 8 (3) : 52. Yadav, B.D. 2012. Study of New Curcumin Analogs for the Treatment of ERα Negative Breast Cancer. University of Otago, Dunedin, New Zealand.
8
