! mechanismy regulace enzymatické aktivity ! hemoglobin jako příklad allosterického proteinu ! vitamíny ! struktura a funkce koenzymů
Mechanismy regulace enzymatické aktivity
Regulace enzymové aktivity " Michaelis-Mentenová " Genetická regulace (indukce versus represe)
Příklady allosterických proteinů: – Aspartát Transcarbamoylasa
– Glykogen Fosforylasa – Hemoglobin
" Kovalentní modifikace !Kinasy, fosfatasy !Zymogeny, proenzymy " Modulatory " Allosterická regulace
1
Kovalentní modifikace (1) " "
Kovalentní modifikace (2)
Protein kinasa a protein fosfatasa – změna formy enzymu – aktivní versus inaktivní V tomto případě je fosforylovaný enzym inaktivní, ale u některých enzymů to může být naopak.
Zymogeny " zymogeny či proenzymy – prekurzory pro aktivní enzym " Zymogeny získají specifickou aktivitu pouze jsou-li specificky rozštěpeny na jednom či více místech (proinsulin # insulin, chymotrypsinogen # chymotrypsin)
Modulátorové proteiny
" Phosphoprotein phophatase inhibitor-1 (PPI-1) se váže na fosfoprotein fosfatasu (inhibice) " Insulin se váže na glucose transporter protein " Cyclic AMP protein kinase je inaktivní v tetramerní formě. Po navázání cAMP, regulační podjednotky disociují a uvolní katalytické podjednotky, čímž se protein stane aktivním.
2
Allosterické proteiny (enzymy)
Kvartérní struktura – ztráta allosterických vlastností
" Inhibice nadbytkem substrátu
" Denaturace – ztráta 3D struktury
" Odchylky od Michaelis-Menten hyperbolické kinetiky (hemoglobin jako modelový systém)
" Denaturace – pH, tepelná, chemická (např. močovina)
" Df. protein obsahující dvě (či více) topologicky různá vazebná místa, která navzájem interagují
" Mírná denaturace – ztráta alosterických vlastností " Allosterický protein – minimálně 2 podjednotky vázané slabými vazbami
" Kooperativita (positivní či negativní) je modifikace vazebné konstanty substrátu předchozím navázáním jiné molekuly " Homotropní versus heterotropní efektory (modulátory) " " " " "
Sigmoidní průběh enzymové kinetiky Existence efektorů, modulátorů Dvojfázová odpověd na kompetitivní inhibitory Ztráta allosterických vlastností i při slabé denaturaci Kvarterní struktura
Kinetika & allosterické efektory " Allosterické inhibitory x aktivátory " K-systémy x V-systémy " Kompetitivní inhibitory – dvoufázový efekt
Hillova rovnice " Hillův koeficient – míra kooperativity
Vmax=4 & K0.5=10
3
Mechanismy allosterie " Isozymy – odlišné kvarterní formy jednoho enzymu; různé isozymy, jejichž tvorba je regulována, mají odlišné aktivity " Např. Lactate dehydrogenase (LDH) - 5 isozymů
Sekvenční x MWC model " „symetrická“ MWC hypotéza – 1965 – Monod, Wyman and Changeux
" sekvenční hypotéza – Koshland
" „symetrická“ MWC hypotéza – 1965 – Monod, Wyman and Changeux " sekvenční hypotéza – 1966 – Koshland
MWC model (1)
MWC model (2) Míra kooperativity závisí na L a afinitě substrátu k R a T stavu (KR a KT). L= T0/R0 a c=KR/KT
In cre as
Posuv rovnováhy vyvolaný „přidáním“ dalšího stavu R1
ing
co op er a
tiv ity
Increasing cooperativity
4
MWC – allosterické modulátory (3) " allosterické heterotropní efektory - kooperativita In cr
R0 A
L
T0
ea s
in g
co o
pe ra tiv
ity !
R0
" Allosteric enzymes are generally larger and more complex than their non-allosteric counterparts.
L
T0 I
R1A
Glycogen Phosphorylase (GP) " odštěpuje glc. z neredukujícího konce glykogenu " homodimer
Aspartate Transcarbamoylase " Aspartate transcarbamoylase catalyzes the first reaction in the biosynthesis of pyrimidine nucleotides, and is therefore highly regulated. It is composed of 12 polypeptide chains containing either catalytic or regulatory subunits.
T1I
GP – modulátory aktivity " Pi je positivní homotropní efektor - Pi se potom váže lépe
+AMP er op co
" Glukosa-6-P je negativní heterotropní efektor (tj. Inhibitor) - regulace glykolýzy
v
ing as cre In
" ATP je zpětnovazební inhibitor a negativní heterotropní efektor. ATP zeslabuje vazbu Pi - regulace glykolýzy
+ATP
iv at ity
" AMP je positivní homotropní efektor (tj. aktivátor) zlepšuje vazbu Pi
[Pi]
" GP je regulováno také kovalentní modifikací
5
Hemoglobin " Hemoproteiny – kofaktorem je hem = metaloporfyriny " Hemoproteiny – hemo- a myo-globiny, cytochromy, katalasy, peroxidasy, tryptofanpyrrolasa & chlorofyl (Mg) " Význam: " Názorná ilustrace vztahu struktura – funkce " Studium allosterie " Fyziologický význam – molekulární mehanismy: " Transport kyslíku " Mechanismus výškové nemoci a adaptace na nadmořskou výšku " Otrava CO či kyanidem " Genetická onemocnění (srpkovitá anemie, thalasemie) " atd.
Myoglobin " Deoxy – Fe 0.3Å nad rovinou hemu k proximálnímu His F8
Struktura myoglobinu " Myoglobin – oxymyoglobin = zásobárna kyslíku ve tkáni " MW 17 000 – 153AA " polární povrch molekuly " H93&H64 – koordinace železnatého iontu " (His F8 a His E7) – vazba O2 " globulární bílkovina 4.5x3.5x2.5nm " 8 alfa helixů (A-H) " Hem – cyklický tetrapyrrol&Fe2+ " (pyrrol&methylenový můstek – porfyrin) " výskyt v monomerní formě " vazba kyslíku, oxidu uhelnatého
" disociační křivky kyslíku myoglobin x hemoglobin
Struktura hemoglobinu " Tetramerní (monomery: α, β, γ, δ, S, atd.) " HbA (α2β2), HbF (α2γ2), HbS (α2S2) a HbA2 (α2δ2)
" Oxy – Fe 0.1Å nad rovinou hemu k His F8 $ změna konformace " Role distálního His E7 " O=O – úhel cca 120° " C=O – cca 25 000x pevnější vazba " Sterické omezení – distální His $ jen cca 200x pevnější vazba než O
6
Hemoglobin
Disociační křivky O2 " Transport kyslíku do tkání " Transport oxidu uhličitého a protonů do plic " Váže CO2 bezprostředně po uvolnění kyslíku " CO2 reaguje s N-terminálními aminoskupinami " CO2 + Hb-NH3+ = 2H+ + Hb-NH-COO" Hb – váže 2 protony / 4 uvolněné molekuly kyslíku
MYOGLOBIN x HEMOGLOBIN
Disociační křivky O2
Hemoglobinopathie " Methemoglobinemie - HbM (HisE8 či HisF7 # Tyr)
" Fetální hemoglobin (HbF) " BPG – stabilizuje deoxygenovanou T formu HbA (HbA x HbF) " BPG (2,3-bisfosfoglycerát) – akumuluje se v periferních tkáních při nedostatku kyslíku (glykolýza) " BPG – crosslinking – stabilizace kvartérní struktury deoxyhemoglobinu " BPG – HbA (His143) x HbF (Ser143)
" Srpkovitá anemie (sickle-cell anemia) " 4 z 1000, smrtelné onemocnění před 30 rokem věku " Poškození téměř všech tělních orgánů " 1904 – James Herrick " " " "
Abnormální gen – HbS (Glu A2(6)β # Val) Gen poskytuje ochranu proti nejsmrtelnějším formě malárie 40% výskyt v určitých oblastech Afriky Nepolární Val na povrchu – „lepkavý úsek“
" Polymerizace – deoxy HbS má komplementární místo k „lepkavému úseku“ HbS " Polymerizace $ vlákna deoxyHbS deformují strukturu erythrocytů – charakteristický srpkovitý tvar " Homozygotní (50%) x heterozygotní (1%)
7
! malé organické molekuly nezbytné pro vyšší organismy (potřeba - µg-mg) ! slouží stejnému účelu ve všech org., ale vyšší org. ztratily
vitamíny rozpustné ve vodě – koenzymy (WSV – Water Soluble Vitamins)
schopnost jejich syntézy
X ! např. E.coli vs. H.sapiens – růst na glc. + org.solích vs. alespoň 12 potřebných vitamínů
vitamíny rozpustné v tucích (FSV – Fat Soluble Vitamins)
! avitaminosy, hypovitaminosy, event. hypervitaminosy
FSV – široké spektrum funkcí
Vitamín K ! srážlivost krve (regulace hladiny „blood clotting proteins“) ! posttranslační modifikace – karboxylace specifických Glu (vitamin K – kofaktor) ! K1 – fylochinon (zelené rostliny) ! K2 – menachinon (intestinální bakterie; n=6, 7 či 9) ! K3 – syntetický menadione (v org. alkylace → K1 či K2) ! deficience – u dospělých zřídka (K2 – antibiotika!), u novorozenců – hemorhagický syndrom
8
Vitamín E ! směs tokoferolů – nejúčinnější α-tokoferol ! příjem potravou – chylomikrony
Vitamín D ! steroidní hormon – reguluje expresi genů po interakci s receptorem ! biologicky aktivní forma – calcitriol – 1, 25-dihydroxyvitamin D3 ! ergosterol (rostlinný) [+UV]→ vitamin D2
! přírodní antioxidant – odstraňuje volné radikály a molekulární kyslík ! zabraňuje zejména peroxidaci polynenasycených MK
! 7-dehydrocholesterol (kůže) [+UV]→ vitamin D3 ! D2 a D3 → 25-hydroxyD3 ! 25-hydroxyD3 → calcitriol
! regenerace – interakcí s vitamínem C či vyloučení žlučí ! v našich podmínkách je hypovitaminosa velmi vzácná…
Vitamín D
Vitamín A ! retinol, (cis-trans) retinal a retinová kyselina ! provitamin A – β-karoten (antioxidant)
! společně s PTH – parathyroidním hormonem reguluje koncentraci fosforu a vápníku v séru
! retinol a kyselina retinová – steroidní/thyroidní hormony – kontrola exprese genů ovlivňujících embryogenesi, diferenciaci, organogenesi a vývoj končetin
! hypovitaminosa – křivice (u dětí), osteomalacie (měknutí kostí u dospělých)
! vidění a role vitaminu A – fotoreceptorový protein – rhodopsin ! rhodopsin – komplex opsinu a cis-retinalu
! v našich podmínkách se prakticky nevyskytuje ! hypovitaminosa (jen po dlouhodobém nedostatku – játra): ! šeroslepost (→oslepnutí), zvýšené riziko rakoviny a anemie ! hypervitaminosa
9
! WSV – často prekurzory koenzymů
Vitamín C ! syntéza z glc. (NE u primátů, morčat kaloňů, ptáků…) ! kyselina askorbová – redukční činidlo – antioxidant ! redukuje O2, nitráty, cytochromy A a C (regenerace)
Vitamín C
! nedostatek vitamínu C ⇒ kurděje (skorbut) – podkožní hemorhagie, svalová slabost, křehké, zduřelé dásně, vypadávání zubů
! hydroxyprolin stabilizuje triple-helix kolagenu ! Jacques Cartier (1536) – popis příznaků
! nezbytný pro: – syntézu kolagenu (hydroxylace prolinu), odbourávání tyrosinu, syntézu adrenalinu, tvorbu žlučových kyselin, atp
Some did lose all their strength, and could not stand on their feet. . . . Others also had all their skins spotted with spots of blood of a purple colour: then did it ascend up to their ankles, knees, thighs, shoulders, arms, and necks. Their mouths became stinking, their gums so rotten, that all the flesh did fall off, even to the roots of the teeth, which did also almost all fall out.
10
Kyselina listová ! živočichové nejsou schopni syntetizovat PABA či spojovat Glu-pteridin
Kyselina listová (folacin) ! aktivní forma – tetrahydrofolát
! sulfonamidy – antivitamíny (antimetabolity)
(H4-folát) ! přenos skupin:
! nedostatek – megaloblastická anemie, makrocytická anemie (tvorba erythrocytů)
methyl, methylen, methenyl, formyl, formimin
! chroničtí alkoholici, poruchy vstřebávání ! v těhotenství vyšší příjem – proliferace
Vitamín B12 - kobalamin ! korinový kruh – koordinace kobaltu ! syntetizován výlučně mikroorganismy, skladován v játrech ! koenzym methylmalonyl-CoA mutasy a methionin synthasy ! metabolismus MK a AA
Biotin ! hojně rozšířen v potravě + syntetizován střevními bakteriemi ! nedostatek – zřídka, s výjimkou dlouhodobého užívání antibiotik či nadměrné konzumace syrových vajec (bílek – avidin) ! koenzym karboxylas
! v játrech zásoba až na 6 měsíců ! megaloblastická anemie
11
Vitamín B5 – kyselina pantothenová
Vitamín B6
! β-alanin + kyselina pantoová
! pyridoxal, pyridoxamin a pyridoxin
! součást CoA a ACP (Acyl Carrier Protein)
! aktivní forma – pyridoxal fosfát (konverze - potřeba ATP)
! cca 70 enzymů potřebyje CoA či ACP jako koenzym ! v potravě rozšířena (celozrnné obiloviny, maso, zelenina)
! koenzym enzymů v metabolismu AA (transaminační reakce)
! nedostatek – jen vzácně
! potřeba závislá na množství konzumovaných proteinů (1,4-2,0 mg/den) ! zvýšená spotřeba během laktace a těhotenství ! projevy nedostatku vzácné (alkoholici) ! nedostatek vyvolaný interakcí s léky (isoniazid, penicillamin)
Vitamín B3 - niacin ! kyselina nikotinová a nikotinamid
Vitamín B2 - riboflavin ! isoalloxazin + ribitol
! aktivní forma NAD+ či NADP+
(termostabilní, fotonestabilní)
! koenzymy mnoha oxidoredukčních enzymů ! striktně vzato nejde o vitamín (neúčinná syntéza z tryptofanu)
! FAD, FMN – flavoproteiny ! redoxní reakce
! projevy nedostatku: ! pellagra (váhový úbytek, dermatitidy, deprese a demence) – populace odkázané na kukuřici (chudá na niacin), léky
! 1,2 – 1,7 mg/den ! projevy nedostatku – alkoholici ! nedostatek – nezhoubný: zánět jazyka, rtů, fotofobie
! kyselina nikotinová – sňižuje hladinu cholesterolu v krvi (snížení tvorby VLDL, LDL)
12
Vitamín B1 - thiamin ! aktivní forma – thiamidinpyrofosfát (TPP) ! pyrimidin + thiazol + methylenový můstek ! koenzym – pyruvát a α-ketoglutarát dehydrogenas a transketolas ! projevy nedostatku – redukce produkce energie buňkou ! beri-beri (hodně sacharidů málo TPP) ! vyčerpanost, anorexie, otoky, svalové a nervové degenerativní změny
! koenzymy oxidoreduktas (NAD+, NADP+, FAD, FMN, kyselina lipoová) ! koenzymy transferas (ATP, CoA, kyselina lipoová, biotin, kyselina listová, pyridoxalfosfát)
! Wernickeova encefalopathie (u alkoholiků) ! zdroj neloupaná zrna a maso
FAD & NAD(P)+ ! prostetická skupina x koenzym
! koenzymy lyas a isomeras (pyridoxalfosfát)
Koenzym A ! 3’-fosfoadenosindifosfát – kyselina pantoová – kyselina pantothenová – β-merkaptoethylamin ! přenos acylů
! UV absorpce (adenin – 260nm/nikotin 340nm) ! antivitamíny – antimetabolity
! FAD – tzv. 1-4 adice (oxidovaná forma)
(sulfonamidy)
! FADH2 – redukovaná forma ! chinon – (semichinon) – hydrochinon ! NAD+ / NADH – ztráta aromaticity (UV absorpce) ! NAD+ / NADP+ ! NADH odevzdává vodík enzymům dých.řetězce ! NADPH dodává vodík potřebný při biosyntéze
13
