REGULACE ENZYMOVÉ AKTIVITY Proč je nutno regulovat enzymovou aktivitu? (homeostasa) Řada úrovní: • regulace množství přítomného enzymu (exprese = proteosynthesa, odbourávání) • synthesa vhodného enzymu (isoenzymy) • kompartmentace (organely) • prostorová organisace "následných" enzymů • nevratná aktivace (limitovaná proteolysa) • vratná kovalentní modifikace • vratná nekovalentní modifikace aktivity (efektory) • inhibice aktivity zpětnou vazbou (regulace koncovými produkty metabolických drah) • rychlost reakce v závislosti na koncentraci substrátu Které enzymy regulovat: • začátky (klíčové body) metabolických drah (citrátsynthasa, PFK) • reakce s velkým energetickým spádem (G << 0)
Příklady: Glykolysa v srdečním svalu: produkt reakce
enzym
G (kJ/mol)
glc-6-P frc-6-P frc-1,6-bisP glycerald-3-P 1,3-bisfosfoglycerát 3-fosfoglycerát 2-fosfoglycerát fosfoenolpyruvát pyruvát
hexokinasa fosfoglukoisomerasa fosfofruktokinasa aldolasa glygerald-3-P-dehydrog. fosfoglycerátkinasa fosfoglukomutasa enolasa pyruvátkinasa
-27,2 -1,4 -25,9 -5,9
regulovatelný enzym
aktivátory
inhibitory
hexokinasa fosfofruktokinasa pyruvátkinasa
-ADP, AMP, cAMP
glc-6-P ATP, citrát (PEP) ATP
-1,1 -0,6 -2,4 -13,9
______________________________________________________ Citrátový cyklus: velké negativní G:
ostatní enzymy: G 0
citrátsynthasa isocitrátdehydrogenasa 2-OG-dehydrogenasový komplex
A) Regulace množství přítomného enzymu konstitutivní, indukovatelné a reprimovatelné enzymy a) Regulace na úrovni transkripce (a translace)
- podle momentálních metabolických potřeb (adaptabilita metabol.) - podle tkáňové specializace v mnohobuněčných organismech
Možnosti regulace: u prokaryot: operon: koordinovaná jednotka genetické exprese regulační oblast s promotorem + strukturní geny (jednotná regulace, polycystronní geny) Příklady: lac-operon - 3 bílkoviny: -galaktosidasa (hydrol. laktosy) galaktosidpermeasa (aktivní transport laktosy) galaktosidacetylasa (zatím nejasná funkce)
CAP = catabilite activatror protein
u eukaryot (řada mechanismů): - hormony pronikající do buňky: steroidní a thyreoidní hormony - rozpustné receptory - kovalentní modif. : - methylace DNA a histonů - fosforylace transkripčních faktorů - různé posttranskripční úpravy mRNA - alternativní setřih - selektivní transport mRNA do cytoplasmy - řízení rychlosti degradace mRNA - miRNA
Regulace na úrovni translace: inhibice iniciačních faktorů (interferon, fosforylace v retikulocytech ...)
Interakce regulačních bílkovin s DNA aneb Jak nalézt určitou sekvenci v dvouřetězcové DNA?
konformace DNA (vlásenky, palindromní sekvence) interakce vazebných bílkovin se specifickými sekvencemi "zvenku" vazebné motivy : helix - turn - helix zinkové prsty leucinový zip aj.
b) Regulace rychlosti odbourávání enzymu u eukaryot: ubiquitin (velmi konzervativní malá bílkovina) vazba na aminoskupiny Lys = označení proteinu pro odbourání
rozhodující: N-koncová aminokyselina: poločasy života: Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly: >20 h Ile, Glu: > 30 min Tyr, Gln: > 10 min Phe, Leu, Asp, Lys, Arg: 2 - 3 min
B) Synthesa vhodného enzymu - isoenzymy definice: 2 enzymy stejné substrátové i účinkové specifity s různou primární strukturou produkované různými geny) (pseudoisoenzymy: stejný gen, různé posttranslační modifikace) Příklady: glukokinasa vs. hexokinasa Km, hexokinasa = 0,01 mmol.dm-3 Km, glukokinasa = 5 mmol.dm-3
1,2
hexokinasa
1 0,8 0,6
glukokinasa
0,4 0,2 0 0
5
10
15
20
koncentrace Glu (mmol/l)
laktátdehydrogenasa srdce vs. svaly podjednotky M a H, tetramer HxMy, x + y = 4 (různá pohyblivost na elfo - diagnostika infarktu myokardu) H- aerobní tkáň (inhibice vyšší koncentrací pyruvátu), M -anaerobní tkáň M CH3-CO-COO- + NADH + H+
CH3-CHOH-COO- + NAD+ H
C) Kompartmentace (organely) - lokalisace specifických funkcí (mitochondrie, peroxisomy, endoplasmatické retikulum a Golgiho komplex ...) - zajištění specifických podmínek (různé pH - lysosomy...)
D) Prostorová organisace "následných" enzymů multifunkční enzymy (synthetasa mastných kyselin) multienzymové jednotky (pyruvátdehydrogenasový komplex) „redukce rozměrnosti“ (dýchací řetězec) organisace následných enzymů pomocí cytoskeletu???
E) Nevratná aktivace (limitovaná proteolysa) zymogeny, proenzymy
trávicí enzymy (trypsin, pepsin ..., autokatalytická aktivace, konformační změna) kaskády - "amplifikace signálu" (koagulační, komplement) odštěpování pre-sekvencí aktivace polyproteinů (produkty polycistronních genů)
F) Vratná kovalentní modifikace (fosforylace, adenylace...) součást regulačních kaskád, pečlivé řízení enzymy: např: proteinkinasa vs. proteinfosfátfosfatasa názvosloví: ATP:[acetylCoA-karboxylasa]-fosfotransferasa [acetylCoA:CO2-ligasa (ADP-tvořící)]-fosfát-fosfohydrolasa Pozn: Fosforylovaná forma je neaktivní.
důsledky fosforylace: - ovlivnění struktury akt. místa - ovlivnění oligomerního až polymerního stavu (obvykle monom. neaktivní, oligo- až polym. aktivní, např. glykogenfosforylasa, acetylCoA-karboxylasa)
G) Vratná modifikace aktivity pomocí efektorů pojmy: efektor aktivátor inhibitor "čistá" a smíšená inhibice inhibitor kompetitivní nekompetitivní akompetitivní heterotropní allosterický efekt u regulačních enzymů
H) Inhibice aktivity zpětnou vazbou (regulace koncovými produkty metabolických drah) POZOR: "obracení" reakce změnou koncentrací (thermodynamický trik) NE VLIV ENZYMŮ!!! kompetitivní inhibice: "překážení" přímého produktu reakce v aktivním místě nekompetitivní nebo akompetitivní inhibice: působení koncového produktu dráhy
I)
Rychlost reakce v závislosti na koncentraci substrátu (rovnice Michaelise a Mentenové, Hillova rovnice) K = [ S ]n 1/ 2
Vlim = 1 mmol/l/min, K = 8 mmol/l, hodnoty n jsou vyznačeny u křivek Nešťastný termín: „allosterické enzymy“ Příklady: aspartátkarbamoyltrasnferasa, isocitrátdehydrogenasa (NADP)
