MÁGNESES MAGREZONANCIA A KÉMIÁBAN, GYÓGYSZERÉSZETBEN, ORVOSTUDOMÁNYBAN
1) A jelenség 2) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 3) Magnetic Resonance Imaging (MRI) 4) Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)
NMR és Nobel díj
1952 Fizika Módszer és elméleti alapok Felix Bloch
Edward Mills Purcell
1991 Kémia Nagy felbontású NMR spektroszkópia Fourier transzformáció, 2D technika
2002 Kémia
Richard Ernst
Kurt Wüthrich
Biológiai makromolekulák 3D szerkezete
2003 Orvosi MRI (Magnetic Resonance Imaging) felfedezése Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield
Atommagok mágneses tulajdonságai spin Proton
Kvark fel Kvark fel Kvark le
Neutron
Kvark fel Kvark le Kvark le
Töltések: Kvark fel : +2/3
1/2
Kvark le : -1/3
1/2
Proton : +1 Neutron : 0
1/2 1/2
Mag
Spin: saját, belső impulzusmomentum (perdület – megtévesztő, mert azt sugallja, hogy a részecske saját tengelye körüli forgásából adódik)
A protonok és neutronok a legalacsonyabb energiaszintű pályákat igyekeznek elfoglalni (ebben az elektronokkal megegyeznek), és az ellentétes spinűek igyekeznek párosítódni (ebben az elektronoktól eltérnek).
A protonok és neutronok saját impulzusmomentumának következménye az atommag saját impulzusmomentuma (spinje), ennek nagysága kvantált.
I = I(I + 1) ⋅ h
Spinimpulzus-momentum nagysága
h=
h 2π
I: a mag spinkvantumszáma, függ a magban lévő protonok és neutronok számának típusától
Mag
Példa
Protonszám
Neutronszám
I
páros
páros
0
12C, 16O
páratlan
páratlan
1 (2,3..)
14N
.,5
1H, 13C, 19F,
Az egyik páros, a másik páratlan
31P 23Na
(1,5) 17O (2,5)
NMR inaktív magok
NMR aktív magok
A spinimpulzus momentum vektormennyiség: iránya és nagysága is kvantált. Egy I spinű mag I impulzusmomentumának (vektor félkövér!) egy tetszőlegesen választott (pl. a z) tengelyre nézve 2I+1 számú merőleges vetülete van. Azaz, I z komponense, Iz kvantált:
I z = mh m: a mag mágneses kvantumszáma, melynek értéke lehet: -I, -I+1, … , I-1, I
+h
+ 0. 5 h Θ
− 0. 5 h I=0,5
0
Θ
−h
Iz mI h mI cosΘ = = = I I(I + 1)h I(I + 1) →1 H(I = 0.5) :Θ = 54.7o
I=1
A mag mágneses momentuma, µ – szintén vektormennyiség – arányos I-vel. A γ arányossági tényezőt giromágneses (csavarómágneses) hányadosnak nevezzük.
µ=γI
Egyes izotópok mágneses magrezonanciás tulajdonságai
µ magmagneton
γ radian/ Tesla sec
NMR frekvencia [MHz] 4,7 Tesla térerőnél
Kémiai eltolódás tartomány [ppm]
Relatív érzékenység Egyenlő számú magra
Természetes izotóp-arány mellett
Izotóp
I
Természetes előfordulás %
1H
1/2
99,9844
2,7927
2,6751
200
10
1,000
1,000
2H
1
0,0156
0,8574
0,4107
30,7
10
9,65×10-3
1,45×10-6
11B
3/2
81,17
2,6880
0,8583
64,2
250
0,165
0,133
13C
1/2
1,108
0,7022
0,6726
50,3
250
1,59×10-2
1, 76×10-4
14N
1
99,635
0,4036
-0,1933
14,4
900
1,01×10-3
1,00×10-3
15N
1/2
0,365
-0,2830
-0,2711
20,3
900
1,04×10-3
3,85×10-6
17O
5/2
0,037
-1,8930
-0,3627
27,1
700
0,0291
1,08×10-5
19F
1/2
100
2,6273
2,5167
188
800
0,833
0,833
23Na
3/2
100
2,2161
0,7076
53
0,095
0,095
29Si
1/2
4,70
-0,5548
-0,5316
39,7
400
7,84×10-3
3,68×10-4
31P
1/2
100
1,1305
1,0829
81
700
0,0663
0,0663
35Cl
3/2
75,53
0,8209
0,2621
19,6
7,70×10-3
3,55×10-3
Precesszió: az NMR spektroszkópiában a külső mágneses térbe helyezett NMR aktív magok mágneses momentumának vektora egy kúppalást mentén forog, ez a forgás a Larmor precesszió
B0
precesszió B0
eredő mágnesezettség
z x
z
+ 0. 5 h
x
Θ y
y
− 0. 5 h I=0,5
a különböző fázisú spinek egyenletes eloszlása a precesszió szöge θ
Mz > 0 M XY = 0
B0>>>>Mz (mérhetetlen)
Mágneses energiaszintek Példa: I=1/2
0
= − γh
B
m
0000
BBBB
E = −µz E
1H
B0
β antiparallel
13C
β
13C
α
1H
∆E Nα = e kT
Nβ
pl.:
E=0,5γγħB0
m= +1/2
E=-0,5γγħB0
α parallel
B0 −
m= -1/2
∆E= γħB0
B0= 11,74 Tesla (500 MHz) 1H (500 MHz) Ntotál= 2 000 000 Nα = 1 000 016 Nβ = 999 984
A precesszió frekvenciája:
1 ν= γ ⋅ B0 2π
ω = γ ⋅ B0
radián Hertz sec Larmor frekvencia = f (γ, B0)
Larmor frekvencia: egy adott NMR magra jellemző precessziós mozgás frekvenciája
A rezonancia (a spinek parallel állapotból antiparallel állapotba jutnak): a besugárzás frekvenciája egyezzen meg a Larmor frekvenciával.
∆E = hν ν = γħB0 Rezonancia frekvencia:
1 ν= γ ⋅ B0 2π
CW NMR (continuous wave, ν-t (B0-t) fokozatosan változtatják, pásztázzák) PFT NMR (pulse Fourier transformation, az összes átmenetet egyszerre gerjesztik egy rövid pulzussal)
γ-sugarak röntgensugarak
Az elektromágneses spektrum
10 22 10 20
Mössbauer
600 500
18
10
400 300
ultraibolya 1016 látható infravörös
1H
19F
elektrongerjesztési 200
1014 rezgési
31P
1012 100
mikrohullámú
rádiófrekvenciás
1010
forgási
108
NMR
106
ν/Hz
13C
ν/MHz
Az NMR kísérlet z
z
B0
x
x
B0
y
y
B1
Mz eredő mágnesezettség
rezonancia fázis-koherencia (kötegelődés) My eredő mágnesezettség B0 >>>> B1
Az eredő mágnesezettség megváltozása B0
B1 Rezonancia: Mz → 0, My alakul ki Relaxáció: Mz visszaépül, My → 0
FT
FID: free induction decay szabad indukciós lecsengés FID:Az NMR készülék mérőfejében az NMR aktív magok gerjesztését követően mérhető szinuszoid, oszcilláló, exponenciálisan lecsengő elektromos jel.
FT
FT B1
Idő
Frekvencia
forgó légpárna
korrekciós tekercs
vákuum folyékony N2-kamra (-70 °C) vákuum folyékony He-kamra (-269 °C)
szupravezető tekercs
900 MHz 3500 e USD
600 MHz 750 e USD 200 MHz 250 e USD
A rezonancia frekvencia függ: - a mag fajtájától - a mag kémiai környezetétől Mágneses térerő egy adott mag környezetében:
Bhelyi = B0 − σB0 = B0 (1 − σ ) σ : árnyékolási tényező 1729,6 Hz 4324 Hz
Kémiai eltolódás
ν=
502,4 Hz 1256 Hz
ν megfigyelt − ν TMS δ= ⋅ 106 ν spektrométer
1 γ ⋅ Bhelyi 2π
6,136 ppm 6,136 ppm
ppm, dimenzió nélküli
200⋅⋅106 500⋅⋅106 CH3 H3C
Si CH3 CH3
TMS 0,00 ppm
CH3
O H2C
CH2
H2C
CH2
O
dioxán 2,50 ppm
H3C
C
OH
CH3
tercier-butanol 1,24 ppm
Legfontosabb NMR jellemzők: 1) Kémiai eltolódás 2) Spin-spin csatolás (csatolási állandók, multiplicitás) 3) Intenzitás/terület 4) Relaxációs idő
1) Kémiai eltolódás A kémiai eltolódás az NMR spektroszkópiában az adott kémiai környezetű magra jellemző számadat, mely a mag környezetében lévő elektronfelhő árnyékoló hatásától függ. Értékét ppm-ben adják meg, ami egy dimenzió nélküli mennyiség. (összefüggés előző diáról) H H
H
NH H
HDO
1H
H
NMR: 13C NMR: 19F NMR: 31P NMR:
C
CH2
H
10 ppm 250 ppm 800 ppm 700 ppm
CH3
TMS
H
10
8
6
4
2 0 ppm Magasabb helyi tér Magasabb frekvencia Kiseb b árnyékolás Alacsonyabb elektronsűrűség
A pH változtatás hatása a kémiai eltolódásra savas karakterű molekulák esetén Ecetsav 1H NMR titrálása
δ HL
• az 1H kémiai eltolódást
δL
−
meghatározó egyik fő faktor a helyi elektronsűrűség 8
• a savi disszociáció növeli az elektronsűrűséget a savi csoport környezetében
7 6
• a szomszédos szénhez pH
5 4 3 2
kapcsolódó protonok NMR jele alacsonyabb ppm felé tolódik köztes pH értékeknél a savi és bázikus forma kiátlagolt jele látható
1 2.20
2.15
2.10
2.05
2.00
1.95
1.90
1H chemical shift (ppm)
1.85
δ mért = δ HL ⋅ xHL + δ L− ⋅ xL−
Ecetsav NMR-pH titrálási görbéje 2.2 HL
δ
mért
2.1
(ppm ) 2.0 pK a = 4.64
1.9
L-
1.8 1
2
3
4
pH = pK a + log
5
6
7
δ mért − δ HL δ L− − δ mért
8 pH
2) Spin-spin csatolás: aktív magok közötti kölcsönhatás, ami jelfelhasadást okoz (multiplicitás) Csatolás: 1) direkt (D, dipoláris), téren keresztüli (szilárd fázisú NMR-ben) 2) indirekt (J, skaláris, független B0-tól), kötő elektronokon keresztüli csatolási állandók
3J HH
(vicinális)
2J HC
(geminális )
1J CH
A 3-kötéses csatolási állandók fontos jelzői a konformációnak Összefüggés a diéderes szög és 3JHH csatolási állandók között (Karplus)
θ
H
transz
H C
C Hz
3J HH
(Hertz)
θ mágnesesen ekvivalens magok: azonos kémiai eltolódással és csatolási állandókkal (kémiailag ekvivalens magoknál a csatolási állandók eltérőek) 2n: nem ekvivalens magok (három kötésen belül) multiplicitás (a csúcsok száma) n+1: ekvivalens magok (három kötésen belül)
Multiplicitás egyenértékű szomszédokkal
Az NMR csúcs: Lorentz görbe
F
a)
C
Nincs szomszédos mag: szingulet
F
b)
C
c)
H
F
B
H
C
H
A
F
d) B
H
C HC
H
A
Egy szomszédos mag:
dublet
Két szomszédos mag: HA HB α α α β β α β β
triplet
1:1
1:2:1
1:3:3:1
Három szomszédos mag: kvartet HA HB HC α α α β α β β β
α α β α β α β β
α β α α β β α β
n+1 Intenzitások: Binomiális együtthatók (összegük 2n) Egy spin energiája függ a szomszédos spinek orientációjától
Multiplicitás nem-ekvivalens szomszédos magok esetén: ABX spinrendszer O H3C
H HX COOH N HA
N-acetilcisztein
HB SH
HA
Hx
HB
ppm 3J
3J
BX
3J
AX
3J
BX
2J
AB
3J
AX
2J
AB
2J
AB
BX
2J
AB
ppm
Ez elsőrendű (∆νAB/JAB > 7) spektrumokra igaz, a másodrendű spektrumok bonyolultabbak (háztető effektus, a csúcsok összeolvadása) → Bo legyen nagy
1H-NMR
spektrum: N-acetilcisztein D2O-ban
pD~12 500 MHz
O H3C
H Hx COOH N Ha
Hb SH
d-d
t-but
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
3) Intenzitás/terület Efedrin-hidroklorid D2O-ban (360 MHz) H
H OD
HB
C
C
HA
N C H3 D2
H
H
C H3
+
H
1.18
1.16
1.14
1.12
1.10
1.08
1.06
1.04
Terc-butanol 3.60
5.170
5.160
5.150
5.140
5.130
5.120
5.110
5.100
5.090
3.55
3.50
3.45
HDO
5h 1h
3h
3h
1h 7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
4) Relaxációs idő: E2 β
90°x B0
E1 α z
z
x
z
x
z
x
x
90°x y
y
y
y
gerjesztés relaxáció Relaxáció az NMR spektroszkópiában: az a folyamat, melynek során a gerjesztett magok a felvett energiát leadják más magoknak (spin-spin relaxáció) vagy a környezetüknek (spinrács relaxáció)
Mz
1,2
spin-rács
1,2
0,8
M z = M l = M zmax − M zmax ⋅ e
0,6 0,4
spin-spin
t Mxy
1
1
−
M xy = M t = M xymax ⋅ e
0,8
T1
0,6
−
0,4 0,2
0,2
0
0 0
1
2
3
4
A populáció különbség visszaáll idő
5
0
1
2
3
4
5
A fázis-koherencia megszűnik idő
6
t T2
A térerő hatása a spektrumra Ha
1,88 Tesla
cH
COOH
bH
OCOMe
Hd
5,87 Tesla
Hertzben a skála ~3-szorosára növekedett, a vonalszélesség ppm-ben 1/3-ára csökkent. Ha cH
COOH
bH
OCOMe
Hd
δHertz = f(B0) JHertz = f(B0)
Me
OH
18
Me
19
O
∆1-dehidrotesztoszteron
Érzékenység növelés spektrum akkumulációval
Jel/zaj
1.5 1.5 S/N ~ n cγ excγ det B0
Mag Overhauser hatás (NOE - Nuclear Overhauser effect) NOE: az I spin intenzitásának megváltozása, ha az S spint telítésbe visszük. Mágneses dipólusok relaxációján alapul, a molekulák rotációs mozgása révén
Két térközeli mag J (kötéseken keresztüli) csatolás nélkül besugárzás telítés
a) S telítése, I nagysága nő vagy csökken
b)
I − I0 I0
molekulatömeg 1000 gyors „bukfencezés”
lassú „bukfencezés”
A molekulák átfordulási sebességét befolyásolja a) Hőmérséklet b) Oldószer (viszkozitás) A NOe arányos
r-6 -nal
5 Å távolságon belül érvényesül A NOe és annak 2D változata a fő eszközök a a) 3D konformáció b) Hatóanyag-receptor kölcsönhatás meghatározására.
Több-pulzusos technikák 1) Inverziós visszaépülés
Pulzusszekvencia
π
tD
π/2
Felvétel
2) Hahn spin echo
π/2 3) 2D NMR
tD
π
tD Felvétel
Inverziós visszaépülés B0
π
z
tD
π/2
z x y
Felvétel
z
πx
x y
π/2x
x y
tD z
z
x y
π/2x
x y
tD z
z
π/2x
x
x y
y
T1 relaxációs idő mérése
tD z
z
π/2x
x y
x y
HO DO
Hm CH2R
Magok relaxációs tulajdonságainak (T1) mérése A relaxációs idő az 1H és 13C NMR spektroszkópiában 10-1-102 másodperc tartományba esik.
Hahn spin echo: T2 relaxációs idő mérése, spinek refókuszálása
B0
z
z x y
z
π/2x
z
tD
x
x
3 spin
y
y
x
y
y
z
πx
y
x
x
x
x
z
z x
tD
x y
x
y
z x
x y
y
x
x
y
y
y
x
y
y
2D NMR A kísérlet 3 (4) fázisa: 1) Előkészítés π/2 2) Kifejlődés: 1D kísérletek sorozata tD tD+i tD+i+i tD+i+i+i… tipikusan 256 i 3) Keverés (nem feltétlenül) 4) Detektálás: az utolsó
π/2
COSY
B0
z
z
x
x y
π/2x
y
t1
z
z x
2π ν t 1
t1
. M t = M0 e
M x = M t sin(2π ν t 1 ) M y = M t cos(2π ν t 1 )
y −
t1 T2
x
π/2x
y Felvétel (t2)
t1
ν2
t1=0
t1
COSY – Correlation Spectroscopy Kontúr plot átlón kívüli off-diagonális
Aszpirin kis-felbontású 400 MHz-es COSY spektruma
H
a COOH
ν1
cH
b
H
OCOMe H d
ν2
COSY Gly – Tyr – Gly
COSY TOCSY NOESY
DNS-RNS oligonukleotid 500 MHz NOESY Diagonális Off-diagonális
NMR képalkotó technikák
NMR
200-1000 MHz
MRI
8,5-170 MHz
NMR képalkotó technikák
0,5-1 ml
50-4000 ml
in vivo
NMR képalkotó technikák 1H
Egész test képalkotás NMR mikroszkópia µm felbontás
31P
H2O
Mágneses Rezonancia Képalkotás Magnetic Resonance Imaging – MRI B01
B02
Térbeli információ
Térerő
B0 gradiens
γ ⋅ B0 ν= 2π
ω1 = γ ⋅ B 01
Frekvencia
ω 2 = γ ⋅ B 02
ω = γ ⋅ B0
in vivo MRI 1H, 31P
„Morfológiai profil” Valós idejű, non-invazív A tumor sejtekhez kötött víz relaxációs ideje eltérő
Emberi fej MRI felvétele
Kontraszt anyagok: Szerv-specifikus Gd3+ komplexek
Ertg EMRI
≅ 1010
Agytumor diagnosztizálása MRI-vel
A képalkotó technikákban T1 vagy T2 relaxációs időt vizsgálunk. A relaxációs idő megmutatja: 1) Hogy a víz kötött -e 2) Hogy van –e jelen valamilyen fémion (főként paramágneses) Kötött víz: lassú átfordulás (bukfencezés) Paramágneses fémionok: gyors víz H relaxáció Így daganatokat, főként körülírt (solid ) daganatokat lehet diagnosztizálni.
agytumor
májtumor
in vivo
MRS magnetic resonance spectroscopy
„Kémiai” és „metabolikus” profil Valós idejű Non-invazív, non-destruktív 1H, 31P, 19F, 23Na, 13C
kreatin-foszfát
PO43-
Emberi felkar 40 MHz-es 31P NMR spektruma nehéz fizikai munka elött és után.
Kreatin-foszfát szintje gyaloglás előtt és után
in vivo MRS
Emberi máj in vivo (2,1 T) 13C MR spektruma.
Etanol 1H NMR spektruma, amelyben külön láthatók az OH, CH2 és CH3 protonok jelei (balról jobbra.)
