MÁGNESES MAGREZONANCIA SPEKTROMETRIA

2.2.33. Mágneses magrezonancia spektrometria

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.3-1

01/2009:20233

2.2.33. MÁGNESES MAGREZONANCIA SPEKTROMETRIA BEVEZETÉS A mágneses magrezonancia spektrometria (NMR) olyan analitikai módszer, amely különösen alkalmas szerves molekulák kémiai szerkezetének felderítésére, a molekulák 1H- vagy heteroatom-magjaiból (pl. 13C, 19F, 15N, 31P) származó NMRspektrumok értelmezése révén. A spektrumok kvalitatív és kvantitatív célokra is használhatók. Alkalmas kísérleti körülmények között az NMR-jelek intenzitásának integrálja egyenesen arányos az adott jelet adó csoportban található magspinek számával. Ezek az integrálok mennyiségi elemzéshez is alkalmasak. ALAPELVEK Ha impulzusmomentummal és mágneses momentummal rendelkező atommagokat statikus mágneses térbe (B0) helyezünk, az atommagok a mágneses tér irányához képest különböző, kvantummechanikailag meghatározott irányokba rendeződnek. Az egyes orientációk energiaszintjei különbözők. Egy nagy frekvenciával oszcilláló mágneses tér (B1), amelynek iránya merőleges a B0-ra, nettó energiaabszorpción keresztül képes átmeneteket létrehozni az egyes energiaszintek között. A rezonanciafeltétel szerint ekkor ω0 = γ∙B0, ahol γ a giromágneses együttható, ω0 pedig a Larmor-frekvencia. Mind a B0, mind pedig a B1 változtatásával nyerhető spektrum (folyamatos pásztázás (continuous wave – CW) módszer). Manapság a B1 besugárzás rádiófrekvenciás tér alkalmazásával történik (Fouriertranszformációs – FT módszer). A kezdeti állapotba való visszatérés során kibocsátott koherens sugárzás egy csillapodó görbével írható le, amelyet szabad indukciós lecsengésnek (free induction decay – FID) nevezünk. Az ezt követő Fourier-transzformáció az időfüggő jelet frekvencia-tartományú spektrummá alakítja, amely információt nyújt a molekuláris szerkezetről. Az atommagok közötti skaláris kölcsönhatások kiküszöbölésére további rádiófrekvenciás tér is alkalmazható („lecsatolás”). Az egy-és többdimenziós technikák egyaránt alkalmazhatóak minőségi és mennyiségi elemzés céljára, folyadék- vagy szilárdfázisú minták esetében.


A következő spektroszkópiás információ:

paraméterekből


nyerhető fontos

szerkezeti

rezonanciafrekvencia

a vizsgált atommag fajtája

a rezonanciajelek (szingulett, multiplett) száma

a kémiailag nem ekvivalens atom(csoport)ok száma

kémiai eltolódás δ (ppm)

a vizsgált szerkezeti elem kémiai tulajdonsága és környezete

jelintenzitás

a jelet szolgáltató magok száma

a csatolási mintázat multiplicitása

a vizsgált maggal skalárisan csatoló magok száma

csatolási állandó nJ (Hz)

a csatolásban résztvevő magok közötti kötések száma és a kötésgeometria

A spektrális paraméterek közötti korreláció (például kémiai eltolódás és csatolási állandó vagy különböző magok kémiai eltolódásai ugyanazon molekulában) homovagy heteronukleáris két- és többdimenziós módszerekkel vizsgálható. Megfelelő módszerekkel információ nyerhető továbbá a T1 és T2 relaxációs időkről, a mag Overhauser hatásról (NOE), illetve idő függvényében lejátszódó folyamatok kinetikájáról. KÉSZÜLÉK A nagyfelbontású NMR-spektrométer alapvető részei: 

a B0 állandó mágneses teret biztosító mágnes;



termosztált mérőfej, mely tartalmazza a mintát, itt történik a rádiófrekvenciás impulzus kibocsátása és a minta által kibocsátott sugárzás detektálása;



egy elektronikus konzol, amely generálja a nagy energiájú rádiófrekvenciás impulzusokat, illetve gyűjti és digitalizálja a FID jelet; ez az egység felelős a készülék elektronikájának stabilitásáért;



adatgyűjtő és -feldolgozó egység (számítógép);

a spektrométer tartalmazhat továbbá: 

átfolyó cellát folyadékkromatográf-NMR kapcsolt technika esetén, vagy folyamatosan áramló rendszereken végzett analízis esetén



impulzus-grádiensek előállítására alkalmas egységet.

Az erős mágneses teret egy folyékony héliummal töltött, hőszigetelt tartályban lévő szupravezető tekercs biztosítja. A mérőfejbe a mintát általában egy 5 mm külső



átmérőjű mintatartó csőben vagy az átfolyó cellába juttatjuk be; a mérőfejet az konzollal rádiófrekvenciás kábel kapcsolja össze, amely továbbítja a lock-, 1H és heteroatom-frekvenciákat. További egységek szükségesek a hangoláshoz és a minta hőmérsékleti kontrolljának megvalósításához. Igazolni kell, hogy az NMR-spektrométer megfelelően működik. Ennek céljára általában a következő vizsgálatok alkalmazhatók: a jelszélesség mérése meghatározott körülmények között felvett, meghatározott jelek félmagasságánál, jel/zaj viszony (S/N) standard keverékek esetében, impulzusteljesítmény (90°-os pulzusszélességben kifejezve) és az impulzus reprodukálhatósága. A készülékek gyártói az egyes készülék/mérőfej kombinációkra minden esetben közzéteszik az ezen paraméterekre vonatkozó követelményeket és mérési protokollokat; igazolni kell a követelményeknek való megfelelést. FOURIER-TRANSZFORMÁCIÓS NMR (FT-NMR) A jelenleg használt spektrométerek általában Fourier-transzformációs (FT) elven működnek: miután a minta besugárzása megtörtént megfelelő frekvenciájú (ν), amplitúdójú (B1), időtartamú (τp) rádiófrekvenciás impulzussal, rövid holtidőt (td) követően (az elektronika visszaállítása céljából) a felerősített FID jel gyűjtése az adatgyűjtés időtartama (tac) alatt történik. Ezután egy analóg-digitális konverter (ADC) a jelet digitalizálja, majd az adatokat a spektrométer memóriájában tárolja. A jel felerősítésére a digitalizálás előtt azért van szükség, hogy a maximális érzékenység elérhető legyen az ADC telítése nélkül. Heteroatomok vizsgálata esetén, amennyiben szükséges, a mérés során szélessávú 1H-lecsatolás is történik, az összes proton besugárzásával. A jel/zaj viszony növelése érdekében lehetőség van több FID jel akkumulációjára és összegzésére. Az idő-domíniumú jel Fouriertranszformációjával nyerhető a frekvencia-domíniumú spektrum. PARAMÉTEREK Egy FT mérés eredményét a következő paraméterek befolyásolják, melyeket ezért be kell állítani és ellenőrizni kell. Impulzusszélesség (τp). A gerjesztéshez használt impulzus az úgynevezett forgó koordinátarendszer x-tengely irányába mutat; időtartama (vagy „szélessége”, τp) meghatározza a precesszió szögét (θ) és ezáltal a rezonanciajel intenzitását (I):

     B1   p

(1)

M y  M 0  sin 

(2)

A megfigyelt mágnesezettség (My) θ = 90 °-nál a legnagyobb. Az impulzus időtartamának olyan rövidnek kell lennie, ami garantálja, hogy a



spektrumtartományban minden jel hasonló mértékben legyen gerjesztve. A mágnesezettség a relaxációs folyamatok során cseng le. Holtidő (td). Holtidőnek nevezzük az impulzus vége és az adatgyűjtés kezdete közötti időt. A holtidő technikai okokból szükséges. Mivel befolyásolhatja a jelintenzitást és a jel fázisát, kellő körültekintést igényel. A gyorsan lecsengő jelek (amelyek széles spektrumvonalakat eredményeznek) intenzitása nagyobb mértékben csökken, mint a lassan lecsengő jeleké (amelyek keskeny spektrumvonalakat eredményeznek). Az adatgyűjtés időtartama (tac). Az adatgyűjtés időtartama (tac) a spektrumszélességgel (a teljes vizsgált tartománnyal) és az adatgyűjtés során gyűjtött digitális adatpontok (DP) számával van összefüggésben.

t ac 

DP 2 SW

(3)

Akkor érhető el a legnagyobb jelintenzitás és jel/zaj viszony, ha tac ≈ 1,2/(πν1/2), ahol ν1/2 a jelszélesség a csúcsmagasság felénél, viszont a jeltorzulás minimalizálása érdekében nagyobbra kell állítani 5/(πν1/2) értéknél. Ismétlési idő (tr). A spin-rács relaxáció (T1) határozza meg azt az időt, amíg a spinek egy impulzus után visszatérnek az egyensúlyi állapotba. A relaxációs idő speciális reagensekkel csökkenthető. Kvantitatív mérés esetén az ismétlési időt a T1 és θ függvényében úgy kell beállítani, hogy elkerüljük a telítést. Jelerősítés. A detektált analóg jelet a digitalizálás és tárolás előtt erősíteni kell, melynek mértékét úgy kell automatikusan vagy kézi úton beállítani, hogy az erősített jel ne okozza az ADC túltelítését, ami a jel torzulásához vezet, de tegye lehetővé a véletlen zaj digitalizálását (mivel annak értéke nem nulla). AZ ADATGYŰJTÉSI ÉS -FELDOLGOZÁSI PARAMÉTEREK OPTIMALIZÁLÁSA KVANTITATÍV MÉRÉS CÉLJÁBÓL Az adatgyűjtési paraméterek mellett a jelintenzitást számos adatfeldolgozási paraméter is befolyásolja. Megfelelő számú felvétel után a FID Fouriertranszformációja történik. A megbízható kvantitatív mérés céljából a következő paramétereket kell optimalizálni. Digitális felbontás. A digitális felbontás az adatpontok közötti frekvencia különbséget jelenti. A feldolgozott jelnek legalább 5 adatponttal kell rendelkeznie az integrálandó jelek félmagassága felett. A digitális felbontás javítása érdekében a mérés során kapott FID végét nulla intenzitású pontokkal egészíthetjük ki a jel transzformációja előtt (‘zero filling’). Jel/zaj viszony (S/N). A jel/zaj viszony egy adott jelre jellemző intenzitás (jelmagasság) és a jelben a véletlen ingadozás okozta hatás aránya. A véletlen



ingadozást általában a spektrumnak a vizsgált anyagtól származó jelet nem tartalmazó régiójában mérjük. A gyenge jel/zaj viszony korlátozza a jelek integrálásának és a mennyiségi meghatározásnak a helyességét. Amennyiben a jel/zaj viszony legalább 150:1, az integrálás relatív szórása (standard deviációja) kevesebb, mint 1%. A jelenleg használt spektrométerek rendelkeznek olyan szoftver algoritmussal, amely kiszámítja az adott jelekre vonatkozó jel/zaj viszonyt. Bizonyos esetekben, például híg oldatok vizsgálatánál, vagy abban az esetben, ha 1H-tól eltérő magokat vizsgálunk, nehézséget okozhat a megfelelő S/N érték elérése. A következő módszerek lehetnek alkalmasak az S/N növelésére: 

a mérések számának (n) növelése, mivel az S/N √n-nel arányosan növekszik;



a FID jel exponenciális fügvénnyel történő szorzása a Fourier-transzformáció előtt; az exponenciális szorzótényezőnek a jel félmagasságnál mért csúcsszélességének megfelelő nagyságrendűnek kell lennie;



nagyobb B0 mágneses térrel rendelkező spektrométerek használata, mivel az S/N B03/2-nel arányos;



digitális szűrés alkalmazása a zaj csökkentésére;



olyan mérőfej használata, amely a lehető legnagyobb kitöltési tényezővel rendelkezik;



hűtött mérőfej használata a termikus zaj csökkentésére.

Az integrálás intervalluma. Az NMR-jelek intenzitásának értékét kvázi analóg integrálással nyerjük, lépcsőfüggvény szerinti integrálással vagy pontosabb módon szakaszonkénti integrálással és digitális adatelőállítással. Folyadékfázisú NMR esetében a jelek alakja Lorentz-görbe szerinti. A gyógyszerkönyvi cikkelyben jelzett esetek, illetve a jelek átlapolásának kivételével, ugyanazon integrálási tartomány, a jelek félmagasságánál vett csúcsszélessége többszöröseként kifejezve, alkalmazandó a vizsgált jel és az összehasonlító jel esetében. Dinamikus tartomány. Az analóg-digitális konverter (ADC) dinamikus tartománya meghatározza azt a legkisebb intenzitásvonalat, amely megfigyelhető vagy mennyiségileg meghatározható, amennyiben egy spektrumban két azonos szélességű jelet integrálunk. Egy 16 bites ADC esetében még azonosítható egy olyan jel, melynek relatív intenzitása 0,003% egy olyan erős jelhez viszonyítva, amely teljesen kitölti az ADC dinamikus tartományát. OLDATFÁZISÚ MINTÁK VIZSGÁLATA NMR-REL Az NMR-vizsgálatok többségét a vizsgálandó minta megfelelő oldószerrel készült híg (kb. 1%-os) oldatában végzik, amelyhez megfelelő standard adható a kémiai eltolódás skála kalibrációja érdekében.



Oldószerek. Az oldószer képes legyen a minta oldására egyéb kölcsönhatás nélkül, kivéve ha más az oldás célja. A nagy oldószerjelek minimalizálása érdekében teljesen deuterált oldószerek (R deutérium-oxid, R deuterokloroform, R deuterodimetil-szulfoxid, R deuteroaceton, R deuterometanol stb.) alkalmazandók. Az oldószer atomjainak jeleit könnyű azonosítani kémiai eltolódásuk alapján, és használhatók a kémiai eltolódás skála kalibrálására (másodlagos referencia). A kémiai eltolódás megadása. Az atomnak a molekulában lévő kémiai környezetétől leginkább függő spektrális paramétere a kémiai eltolódás, melyet δval jelölünk és ppm-ben (parts per million; milliomodrész) fejezünk ki. Egy NMRaktív mag rezonanciájának kémiai eltolódását (δX, minta) ppm-ben a következő módon fejezzük ki: az adott mag rezonanciafrekvenciájának (νX, minta) és a kémiai eltolódás referenciastandard rezonanciafrekvenciájának (νX, referencia) különbségét (mindkét frekvenciát hertzben kifejezve) elosztjuk a spektrométer megahertzben kifejezett alapfrekvenciájával (νspektrométer), egy adott B0 mágneses térben:

 X , min ta 

 X , min ta   X , referencia  spektrométer

(4)

Megállapodás szerint a kémiai eltolódás megadásához használt standard az R tetrametilszilán (TMS) 1H rezonanciája, vagyis δTMS = 0 ppm. Elméletileg a 1H kémiai eltolódási skálának a TMS-re történt beállítása után számítható a heteroatom rezonanciája, és kalibrálható az arra vonatkozó kémiai eltolódás skála. Egy (másodlagos) referenciastandard frekvenciája δX = 0 ppm-nél (νX, referencia) a TMS 1H frekvenciájából (νH,TMS) és a heteroatom izotóp-specifikus frekvenciájának és a TMS 1H frekvenciának a táblázatban feltüntetett arányából (Ξ X, referencia) számítható:

 X , referencia   H , TMS   X , referencia

(5)



A következőkben láthatók a referenciastandardok δX = 0 ppm-nél és a megfelelő Ξ X, referencia értékek: Mag 1

H

Más oldószerek

Ξ X, referencia

1,00000000

TMS

1,00000000

b

DSS

C

DSS

0,25144953

TMS

0,25145020

15

N

NH3

0,10132912

CH3NO2

0,10136767

19

CF3COOH

nem ismert

CCl3F

0,94094011

31

H3PO4 (85%)

0,40480742

(CH3O)3PO

0,40480864

P

b

Ξ X, referencia b

13

F

a

Víza

a kémiai eltolódás pH-függő DSS = nátrium-2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonát

A gyakorlatban a kémiai eltolódásokat közvetlenül egy megfelelő standardhoz viszonyítják. A 1H és 13C NMR esetében általában belső standardot használnak, vagyis a referenciaanyagot közvetlenül a vizsgálandó mintához adják. A 15N, 19F és 31 P NMR esetében gyakran a külső standard alkalmazása a megfelelő, ebben az esetben a mintát és a referenciastandardot két különböző, párhuzamosan elhelyezett hengeres mintatartó cső tartalmazza. Frekvencia stabilizálás („Lock”). A spektrum csúszásának elkerülése érdekében stabilizáló eljárást végzünk, ezt nevezzük frekvencia “lock”-olásnak. Erre a célra deuterált oldószerektől származó 2H (deutérium) jelet alkalmazunk, kivéve amennyiben a cikkely másként rendelkezik. KVALITATÍV ANALÍZIS A kvalitatív analízis céljára felvett NMR-spektrumokat főleg azonosításra használják, aminek során egy minta 1H vagy 13C spektrumát egy referenciaminta spektrumával vagy ritkábban egy közzétett referenciaspektrummal hasonlítják össze. A referencia- és a vizsgált minta spektrumát azonos eljárással, azonos mérési körülményeket alkalmazva kell felvenni. A jelek vagy karakterisztikus régiók helye, intenzitása és multiplicitása egyezzék meg a két spektrum esetében. Bizonyos esetekben az összehasonlításhoz matematikai módszerek, például korrelációs koefficiens számítása alkalmazhatók. Elérhető referenciastandard hiányában saját készítésű referenciaanyag is alkalmazható, amelynek azonosságát alternatív módszerekkel igazolták, vagy pedig igazolt, hogy az NMR-spektrum teljesen megfelel az anyag deklarált szerkezetének. KVANTITATÍV ANALÍZIS Az NMR-jelek intenzitása alapvetően a görbe alatti területtel mérhető. A jelmagasság kizárólag abban az esetben alkalmazható az intenzitás jellemzésére, amennyiben két jel esetében egyaránt azonos a félértékszélességük a multiplicitásuk. Abban az esetben, ha az egymást követő felvételek között teljes



relaxáció történik, a jelintenzitással (IA) mérhető az adott jelet adó magok száma (NA):

I A  KS  N A

(6)

A KS állandó alapvető állandókat, illetve a minta és a detektor tulajdonságait foglalja magában; az állandó elhagyható, amennyiben jelintenzitásokat hasonlítunk össze, ezzel megadva az összehasonlított A és B szerkezeti elemben lévő megfelelő magok számának arányát:

IA NA  IB NB

(7)

Egy adott molekula különböző funkciós csoportjaihoz tartozó magok száma (Ni) kis egész szám. A mért értékeket a legközelebbi egész számra kerekítjük. A spektrométer adatgyűjtésének és -feldolgozásának megfelelősége könnyen ellenőrizhető ismert szerkezetű szerves vegyület spektrumában látható jelek pontos intenzitásának összehasonlításával. Egy keverék esetében azonkívül, hogy az egyes komponensek esetében a jelintenzitások egymás egész számú többszörösei, a komponensek mólaránya is mérhető a különböző komponensektől származó jelek normalizált intenzitásainak összehasonlításával. Egy keverékben található két komponens mólaránya a következő egyenlet alapján számítható:

nA I A N B   nB I B N A

(8)

A meghatározás csak abban az esetben értékelhető, amennyiben a molekulák szerkezete, amelyeknél az IA-t és IB-t meghatározzuk, ismert (vagy legalább az N értékek ismertek a vizsgált csoportok esetében). A meghatározások belső standardot használva vagy normalizációs eljárással egyaránt végezhetők. Belső standard módszer. Egy minta (A) tömege (mA) meghatározható, amennyiben egy anyag (B) ismert tömegét (mB) ismert százalékos koncentrációban (PB) intenzitásstandardként az oldathoz adjuk. A (8) egyenletet ebben az esetben a következőképpen alakíthatjuk át:

mA 

I A NB M A P    mB  B IB NA M B 100

(9)

Itt az Mi molekulatömegeket jelent. Az intenzitásstandardot körültekintően kell megválasztani: teljesen fel kell oldódnia a minta oldásához használt oldószerben, kevés jelet kell adnia, és a számításhoz használt jelnek a spektrum olyan tartományában kell lennie, ahol nincs



más jel. Nagytisztaságú és relatíve nagy molekulatömegű vegyület alkalmazása ajánlott e célra. Normalizációs eljárás. Egy keverék komponenseinek aránya, egy szerkezetileg módosított polimer szubsztitúciós foka vagy egy szennyező mennyisége meghatározható a relatív intenzitások összehasonlításával. A mérési módszert validálni kell annak biztosítására, hogy az adott jelek esetében nincs más jelekkel történő átlapolás. Amennyiben a szennyező szerkezete vagy molekulatömege rosszul definiálható, az adott anyag ismert mennyiségeit az NMRcsőbe adagolva kalibrációs egyenest kell felvenni. MÓDSZER Mintaelőkészítés. A mintát feloldjuk az oldószerben, amelyhez megfelelő referenciaanyag is adható, a kémiai eltolódás kalibrálására, a cikkely előírásai szerint. Mennyiségi analízis esetén az oldatoknak szilárd részecskéktől mentesnek kell lenniük. Egyes mennyiségi meghatározások esetében belső standard használata szükséges, így a vizsgált minta és a referenciaanyag megfelelő jelének intenzitása hasonlítható össze. Az egyedi cikkelyek előírják a megfelelő referenciaanyagokat és az alkalmazandó koncentrációkat. Más esetekben az eredményt a vizsgálati minta két vagy több relatív intenzitásának összehasonlításával nyerjük. A mintát betöltjük az NMR-csőbe, bedugaszoljuk, belehelyezzük az NMR-mágnes belsejébe, beállítjuk a mérési paramétereket és végrehajtjuk a mérést. A legfontosabb mérési paramétereket a cikkely előírásai tartalmazzák. A mérési eljárás. Miután a minta a mérőfejben egyensúlyi állapotba került, optimalizáljuk a készülék beállításait a legjobb rezonanciafeltételek elérése és a jel/zaj viszony maximalizálása céljából a mérőfej hangolása és illesztése által, illetve olyan beállításokat végzünk, hogy a mágneses tér homogén legyen a minta körül („shimmelés”). A paraméterek beállításait feljegyezzük vagy a számítógépben elmentjük. Egy mérés állhat több impulzus-adatgyűjtés-késleltetés sorozatból; az egyedi FID-ek a számítógép memóriájában összegezhetők, ezáltal a véletlen zaj kiátlagolódik. Amennyiben a megfelelő jel/zaj viszony elérésre került, a FID tárolódik, és az összegzett FID Fourier-transzformációjával generálódik a frekvencia-domíniumú spektrum.

SZILÁRD FÁZISÚ NMR Szilárd fázisú minták speciálisan erre a célra tervezett NMR-készülékekkel vizsgálhatók. Bizonyos műszaki eljárások segítségével megfigyelhetővé válnak az



egyes atomoknak megfelelő vonalak, ami az NMR alkalmazhatóságát szervetlen anyagokra is kiterjeszti. Az egyik ilyen eljárás az elporított minta gyors forgatása (4-30 kHz) egy (kb. 4 mm külső átmérőjű) rotorban, amely 54,7°-kal („mágikus szög”) meg van döntve a B0 mágneses tér irányához képest. Az eljárást ’magic angle spinning’-nek (MAS) nevezik. További hasznos módszer a nagy teljesítményű lecsatolás, illetve egy harmadik eljárás a polarizáció-átvitel egy könnyen gerjeszthető magról egy kevésbé polarizálható magra, vagyis kereszt-polarizáció (cross polarisation, CP). Az említett technikák kombinációja segítségével nagy felbontású spektrumok nyerhetők, amelyek sok információt tartalmaznak a kerámia, polimer vagy ásványi eredetű, üvegszerű, amorf és kristályos szilárd anyagok kémiai és szerkezeti adatairól. Amennyiben szilárd anyag NMR-vizsgálatát írja elő a Gyógyszerkönyv, az adott cikkelyben megtalálható az eljárás részletes leírása.

MÁGNESES MAGREZONANCIA SPEKTROMETRIA

Recommend Documents