Szárított élelmiszeradalékok mikrobiológiai minségének becslése közeli infravörös spektrometria felhasználásával

Szárított élelmiszeradalékok mikrobiológiai min ségének becslése közeli infravörös spektrometria felhasználásával Seregély Zs.a Kaffka K.J.b és Kiskó G.b a

Metrika K+F Kft., H-1119 Budapest, Petzvál J. u. 25, Hungary. E-mail: [email protected] b

Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, H-1118 Budapest, Ménesi út 45, Hungary. E-mail: [email protected] / [email protected] Bevezetés Mind a mez gazdasági, mind az élelmiszerkutatás területén a kertészeti termények penészszennyezettségének szántóföldi és a feldolgozás közbeni meghatározása mind nagyobb jelent séggel bír. A feldolgozó vagy szennyezettség mentesít kezelések és feldolgozó az él penész részleges inaktiválása technológiák során alkalmazott körülmények között nyilvánvaló. A penészek által termelt toxikus metabolitok (számos penészfaj mikotoxin termelésre képes) azonban nem feltétlenül inkativálódnak és végs fokon a jelen lehetnek a feldolgozott élelmiszerben. Ezért gomba eredet romlás és a lehetséges közegészségügyi veszélyek miatt nagy szükség van tehát olyan módszerek kidolgozására, melyek mind az életképes, mind az inaktiválódott penészgombákat, azaz a szennyez biomassza egészét képesek meghatározni, jelezve ezzel azt, hogy az élelmiszerterméket szennyezetlen magas min ség anyagokból készítették, vagy sem. Az olyan módszerek, melyek alkalmasak a penészek bármely körülmény melletti felismerésére az élelmiszerben, a gomba eredet szennyezések okozta lehetséges kockázat kiértékelésében rendkívüli hasznosak lennének. Hagyományos módszerként penészek élelmiszerben történ kimutatására különböz eljárások állnak rendelkezésre. Ilyenek a tenyésztéses módszerek1, a táptalaj vezet képességét, vagy egyéb elektromos jellemz inek változását felhasználó elektromos mérések 2 a h stabil penész összetev k, mint pl. a kitin meghatározása 3 mikroszkópos módszerek a micéliumok kimutatására4 közvetlen epifluorescens sz r technikák alkalmazása5 stb. Ezek közül a módszerek közül a legtöbb ország standard módszerként a penész telepszámot és a Howard penészszámot (HMC) alkalmazza min ségbiztosítási célokra. A rendelkezésre álló módszerek többségének vannak bizonyos hiányosságai. A hagyományos tenyésztéses módszerek id igényesek (id szükséglet 5-8 nap) és a h károsodott inaktiválodott penészeket nem érzékeli. A micéliumok mikroszkópos meghatározása kis precizitású. Az ATP assay alkalmazása például a micélium és az élelmiszer elkülönítési problémái miatt nem alkalmazottak széleskör en. A gomba eredet kitin meghatározásán alapuló kémiai módszerek nem teljes kör en elfogadottak a penésztörzsek változó kitintartalma miatt. A HMC helyettesítésére egyébb alternatív technikákat fejlesztettek ki. Ilyen módszer az ergoszterol mennyiségi meghatározása a gomba eredet szennyezés jelz jeként. 6–8. Az ergoszterol tartalom meghatározását flourodensitometria alkalmazásával fejlesztették tovább9 A penészek élelmiszerekben történ kimutatására néhány immunológiai módszert is leírtak. 10–13 A különböz penészek által termelt extracelluláris poliszacharidok (EPS) kimutatására enzimkötött immunoszorbent assayt (ELISA) használó serológiai módszereket fejlesztettek. A latex agglutination Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference

445

www.nirpublications.com

446

Zs. Seregély, K.J. Kaffka and G. Kiskó

érzékeny technikáját is leírták.14,15 A különböz illékony gomba eredet metabolitok szintén a gombnövekedés indikátoraként alkalmazhatók. 16–18 Jonsson és munkatársai egy elektronikus orrot (különböz érzékel típusokból álló érzékel sort) alkalmaztak zab jó, penészek, gyengén vagy er sen dohos illatosztályainak becslésére19 Egy új fluorescens lecitin vizsgálatot fejlesztettek ki paradicsomlé penésztartalmának mennyiségi meghatározására. 20 Asher jó eredményeket ért el sárga és barna árparozsda spóra, valamint barna búzarozsda estében közeli infravörös (NIR) spektroszkópi felhsználásával.21 Davies22 el tanulmányt végzett túlzott penésztartalmú paradicsom püré NIR monitorozására. Roberts munkatársai penész kémiai és spektrális mennyiségi meghatározásáról számoltak be szénában23 és szennyezett árpában 24 NIR alkalmazásával. Aramaki rizsben micélium tömegét becsülte meg NIR spektroszkópiával.25

Anyagok és módszerek A búzakorpa mintákat búzaszemek gyakorlatilag penészmentes termények közül történ körültekint kiválogatásával gy jtöttük. A gyakorlatilag penészmentes mintát, látható penészszennyez dés mentes mintaként határoztuk meg. A mintákat 1998-ban, 1999-ben é 2000ben gy jtöttük. Kísérleteink során mindhárom évb l három fajtát vizsgáltunk: “Régia”, “Mlynské otruby” és “Ilona”. A mintákat 30 kGy sugárdózissal sugároztuk be, mely steril minták rendelkezésre állását tette lehet vé. A paprika mintákat kiskereskedelmi üzletb l, a fekete bors mintákat a Kotanyi GmbHt l, Bécs (Ausztria) szereztük be. Kísérleteink során a következ penésztörzsek álltak rendelkezésre:: Aspergillus flavus (nonaflatoxigenic), Penicillium verrucosum (non-ochratoxigenic) and Fusarium graminearum (nonfumonisinogenic). A Szent István Egyetemen (korábbi Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest), ezeket a törzseket Czapek–Dox agar (Merck 1. 05460.0500) felületén egy hétig 25°C-on tenyésztettük. A penész kultúrákat tartalmazó hígító oldatot (0.1% peptont és 0.85% NaCl-ot) pipettáztunk Czapek–Dox agar felületére. A micéliumokat az agar felületér l egy kis rozsdamentes acél oltót vel steril vizes oldatba távolítottuk és keveréssel homogenizáltuk. Azt a szuszpenziót használtuk beoltáshoz. Fusarium graminearum esetében a micélium szuszpenzió homogenizálásakor apró steril gyöngyöket helyezetünk az üveg kever edénybe. A különböz minták ergoszterol tartalmának meghatározására módosított Seitz és Paukstelis26 módszert alkalmaztunk. Az ergoszterol mennyiségi meghatározását nagy teljesítmény folyadék kromatográfiával (HPLC)27 végeztük. Ezt a HPLC módszert eredetileg karotinoid elemzéshez fejlesztették ki, de e módszer alkalmas az ergoszterol tartalom elkülönítésére és meghatározására. A módszer pontossága (ismételhet sége) ±1 × 10–3 mg ergosterol/g alacsony ergoszterol tartalomnál (0,04 mg ergosterol/g körül) és 100 × 10–3 mg ergosterol/g magas ergoszterol tartalomnál (0,6 mg ergosterol/g körül). NIR méréseink során a mintákat egy Spectralyzer (PMC type10-25, Svájc) scanning NIR spektrométer felhasználásával elemeztük. Log(1/R) spektrumokat 1000–2500 nm hullámhossz tartományban rögzítettük 2 nm lépésközzel. Kvalitatív kiértékeléseinket Kaffka és Seregély28 nyomán a Polár Min sít Rendszer (PQS) program alkalmazásával hajtottuk végre. A minták "min ségpontjait" határoztuk meg a "min ségsíkon". A min ségpontot a polár koordináta rendszerben ábrázolt spektrum (a spektrális pontok) középpontjaként határoztuk meg.

Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference


Szárított Élelmiszeradalékok Mikrobiológiai Min sége

1. ábra A korpa minták log(1/R) spektruma a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben, piros: kontrol, kék: kétszeres ergoszterol tartalom

447

2. ábra A korpa minták 2. derivált spektruma a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben. Az optmális hullámhossz tartomány 1418–1590 nm, piros: kontrol, kék: kétszeres ergoszterol tartalom

Az els ábra a legnagyobb és a legkisebb penész-szennyezettség korpa minta log(1/R) spektrumait szemlélteti a Descartes (fent) és a polár (lent) koordináta rendszerben. Bár a polár spektrum szokatlannak t nhet, a két ábrázolásmód egymással teljesen egyenérték .. Néha el fordulhat, hogy a spektrumot a polár koordinátarendszerben ábrázolva ugyanazon összetev abszorpciós csúcsai 180°–ra kerülnek egymástól, gyengítve egymás, a min ségpontok elhelyezkedésére gyakorolt hatását. Ezt a problémát az ún. „hullámhossztartomány optimizálás” bevezetésével oldottuk meg. A hullámhossztartomány optimizálás célja azon hullámhossztartomány (spektrumrészlet) meghatározása, amely a két minta közötti legjobb elkülönülést biztosítja, a minták min ségpontjainak alapján. A legjobb elkülönítés meghatározására három kifejezést ismertettünk. Az optimum egy lehetséges feltétele az „abszolút távolság”, a „normalizált távolság”, vagy az „érzékenység” maximuma. A normalizált távolság maximális értéke 1, míg az érzékenység értéke azt mutatja meg, hogy mennyivel nagyobb a klaszterközéppontok közötti távolság szórásaik összegénél. Az el z kifejezések értékének kiszámításával az osztályozás min sége számszer en is kifejezhet , lehet vé téve a különböz osztályozó modellek eredményeinek összehasonlítását.

Eredmények és értékelésük Miel tt a mintákat a fenti módszerekkel min sítettük számos, a NIR spektroszkópia területén általánosan használt el transzformációs eljárást (simítás, deriválás, MSC, stb.) alkalmaztunk a zaj, részecske méret hatás, stb. kiküszöbölésére. Ezen eljárások a PQS elkülönít hatékonyságára, ebben az alkalmazásban kifejtett hatását a maximális érzékenység értékeinek összehasonlításával vizsgáltuk. A fenti el transzformációkat követ en futtatott hullámhossz tartomány optimizálás eredményeit (az optimális hullámhossz tartományok és a vonatkozó érzékenység értékek a két széls szennyezettségi szint között) az 1. táblázat foglalja össze. Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference


448


1. Táblázat Az ILONA, REGIA és MLYNSKE búzafajtákból el állított, ASPERGILLUS flavus 301, PENICILLIUM verrucosum 499 és FUSARIUM graminearum 457 penésztörzsekkel szennyezett korpa minták hullámhossztartomány optimizálási eredményei, a log(1/R) spektrumokra alkalmazott el kezelések hatásainak összehasonlításával (a táblázat minden cellájában fent: optimális hullámhossz-tartomány, lent: érzékenység)

A 2. ábra a legkisebb és a legnagyobb penész-szennyezettség korpa minták ismételt méréseinek 2. derivált spektrumait mutatja be a Descartes (fent ) és a polár (lent) koordináta rendszerben. Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference



449

A számított optimális hullámhossz tartomány 1418–1590 nm. Ezt a tartományt a fels ábrán szaggatott vonal határolja, míg a polár diagram kizárólag e kijelölt tartományt ábrázolja. E spektrumok középpontjait (min ségpontjait) a 3. ábra fels fele mutatja be. Mint látható a mintacsoportok közötti távolság nagy szórásaikhoz hasonlítva. A 3. ábra alsó felén a két széls szennyezettségi szint közötti penésztartalmú minták min ségpontjainak elhelyezkedése látható ugyanazon hullámhossz tartomány felhasználásával ugyanazon a min ségsíkon. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl (0–50%-ig 5% -os lépésközzel, c: 0%, 1: 5%,...10: 50 %, 11: 100% relatív penésztartalom). Mint látható a közbens minták pontjai az optmizálásban résztvev minták között megfelel sorrendben helyezkednek el.

3. ábra A legnagyobb és a legkisebb penészszennyezettség korpa minták 2. derivált spektrumainak optimális tartományából számított min ségpontjai. (fent). A széls szennyezettségi szintek közötti penésztartalmú minták min ségpontjai (lent). A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl.

4. ábra A 2000-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal különböz mértékben szennyezett minták min ségpontjai közötti polár távolságok az ergoszterol tartalom függvényében. (fent). Az 1999-ben betakarított kontrol- és a Fusariummal, Aspergillus-szal, Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett minták min ségpontjai közötti polár távolságok az ergoszterol tartalom függvényében. (lent).

A 4. ábra fels része a 2000-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal különböz mértékben szennyezett minták min ségpontjai közötti polár távolságokat mutatja be az ergoszterol tartalom függvényében. Az ábra alsó fele a 1999-ben betakarított kontrol- és a Fusarium-mal, Aspergillus-szal, Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett minták min ségpontjai közötti polár távolságokat szemlélteti az ergoszterol tartalom függvényében. A 4. ábra segítségével a penésznövekedés által Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference


450


okozott változásokban fennálló tendencia figyelhet meg, illetve hasonlítható össze a vizsgált penésztörzsek között. Mint látható a Penicillium növekedésének van a polár spektrumok középpont eltolódásában jelentkez legérzékenyebben detektálható hatása..

5. ábra A Pennicillium-mal szennyezet pirospaprika minták min ségpontjai a két széls szennyezési szint között. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl. Az optimális hullámhossz tartomány: 2330– 2340 nm

Figure 6. A Pennicillium-mal szennyezet fekete bors minták min ségpontjai a két széls szennyezési szint között. A növekv jelöl karakter növekv szennyezési szintet jelöl. Az optimális hullámhossz tartomány: 1040– 1332 nm

Az 5. és a 6. ábrákon Pennicillium-mal különböz mértékben szennyezett pirospaprika és a feketebors minták min ségpontjai láthatók optimális hullámhossz tartományaikban a PQS felhasználásával.

Következtetések A penészszennyezettség a korpa termékek egyik legfontosabb mikrobiológiai min ségi jellemz je. A penészek különböz toxikus metabolitokat termelhetnek, melyeket a feldolgozó technológiák nem távolítják el, inaktiválják, miközben az él biomasszát drasztikusan csökkentik. Ezért rendkívül fontos az mind él és a nem él penész biomassza együttes detektálása. A rendelkezésre álló mikroszkopikus, immunológiai és kémiai módszerek lassúak, drágák és pontatlanok. A NIR spektroszkópia - új távlatokat nyitva a termékek min sítésére és azonosítására közeli infravörös spektrumaik felhasználásával gyors, pontos és olcsó módszert kínáló PQS alkalmazására - roncsolásmentes, reagenst nem igényl módszert nyújt e célra. Köszönetnyílvánítás A szerz k szeretnék kifejezni öszinte köszönetüket Vydrany Taraslovakianak (Szlovákia), a Szlovák Agrártudományi Egyetemnek, Nyitra (Szlovákia), a Kotanyi GmbH, Bécs (Ausztria) és a the BundesforschungSanstalt für Ernahrung, Karlsruhe (Németország) szíves segítségükért, hogy a a különböz mintákat, azok analitikai adatait, a penész törzseket a szerz k rendelkezésére bocsátották. Munkánkat támogatta az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA) No: T 023020 és No: T 032814 és az EU INCO Copernicus project ERB IC15-CT 98-0901 Irodalom 1. L.R. Beuchat, B.V. Nail, R.E. Brackett and T.L. Fox, J. Food Prot. 54(6), 443 (1991). Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference



451

2. I.A. Watson-Craik, K.E. Aidoo, and J.G. Anderson, Food Microbiol. 7, 129 (1990). 3. J.P. Ride, and R.B. Drysdale, Physiol. Plant. Pathol. 1, 409 (1971). 4. P. Blaser, Zbl. Bakt. Hyg. 166, 45 (1978). 5. G.L. Pettipher, R.A. Williems and G.S. Gutteridge, Lett. Appl. Micribiol. 1, 49 (1985). 6. P. Bertoni, G.P. Ghiretti, L. Sandei, F. Strina and C. Leoni, Ind. Conserve 69(1), 18 (1994). 7. P. Battalini, G. Chiusa, C. Cervi, M. Trevisan and C. Ghebbioni, Ital. J. Food Sci. 4, 283 (1996). 8. H. Gourama and L.B. Bullerman, Lebensm. Wiss. u.-Technol. 28, 185 (1995). 9. J.D. Bailly, P. Le Bars, A. Pietri, G. Benard and J. Le Bars, J. Food Prot. 62(6), 686 (1999). 10. S. Notermans, C.J. Heuvelman, H.P. Van Egmond, W.E. Paulusch and J.R. Besling, J. Food Prot. 49, 786 (1986). 11. H.H. Lin, R.M. Lister and M.A. Cousin, J. Food Sci. 51, 180 (1986). 12. H.H. Lin and M.A. Cousin, J. Food Sci. 52, 1089 (1987). 13. G.J. Tsai and M.A. Cousin, J. Dairy Sci. 73, 3366 (1990). 14. H.J. Kamphuis, S. Notermans, G.H. Veeneman, J.H. Van Bomm and F.M. Rombouts, J. Food Prot. 52, 244 (1989).o 15. S. Notermans and H. Kamphuis, Food Agr. Imm. 2, 37 (1990). 16. T. Börjesson, U. Stöllman and J. Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 56(12), 3705 (1990). 17. T, Börjesson, U. Stöllman and J. Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 58(8), 2599 (1992). 18. H. Jelen and E. Wasowicz, Food Rev. Int. 14(4), 391 (1998). 19. A. Jonsson, F. Winquist, J. Schnürer, H. Sundgren and I. Lundström, Int. J. Food Microbiol. 35, 187 (1997). 20. S.J. Potts, D.C. Slaughter and J.E. Thompson, J. Food Sci. 65(2), 346 (2000). 21. M.J.C. Asher, I.A. Cowe, C. E. Thomas and D.C. Cuthbertson, Plant Pathol. 31, 363 (1982). 22. A.M.C. Davies, C. Dennis, A. Grant, M.N. Hall and A. Robertson, J. Sci. Food Agric. 39, 349 (1987). 23. C.A. Roberts, K.J. Moore, D.W. Graffis, R.P. Walgenbach and H.W. Kirby, J. Dairy Sci. 70, 2560 (1987). 24. C.A. Roberts, R.R. Marquardt, A.A. Frohlich, R.L. McGraw, R.G. Rotter and J.C. Henning, Cereal Chem. 68(3), 272 (1991). 25. I. Aramaki, K. Fukuda, T. Hashimoto, T. Ishikawa and Y. Kizaki, J. Soc. Ferment. Bioeng. 73, 33 (1995). 26. L.M. Seitz and J.V. Paukstelis, J. Agric. Food Chem. 25, 838-843 (1977). 27. P.A. Biacs and H.G. Daood, J. Plant Physiol. 143, 520 (1994). 28. K.J. Kaffka and Zs. Seregély, Acta Alimentaria 31, 3 (2002).

Copyright 2004 NIR Publications. All rights reserved. Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference


Szárított élelmiszeradalékok mikrobiológiai minségének becslése közeli infravörös spektrometria felhasználásával

Recommend Documents