MÁGNESES MAGREZONANCIA A KÉMIÁBAN, GYÓGYSZERÉSZETBEN, ORVOSTUDOMÁNYBAN
1) A jelenség 2) Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
3) Magnetic Resonance Imaging (MRI) 4) Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)
NMR és Nobel díj
1952
Fizika Módszer és elméleti alapok Felix Bloch
Edward Mills Purcell
1991 Kémia Nagy felbontású NMR spektroszkópia Fourier transzformáció, 2D technika
2002
Kémia
Richard Ernst
Kurt Wüthrich
Biológiai makromolekulák 3D szerkezete
2003
Orvosi MRI (Magnetic Resonance Imaging) felfedezése Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield
Atommagok mágneses tulajdonságai spin Proton
Kvark fel Kvark fel Kvark le
Neutron
Kvark fel Kvark le Kvark le
Töltések: Kvark fel : +2/3
1/2
Kvark le : -1/3
1/2
Proton : +1 Neutron : 0
1/2 1/2
Mag
Spin: saját, belső impulzusmomentum (perdület – megtévesztő, mert azt sugallja, hogy a részecske saját tengelye körüli forgásából adódik)
A protonok és neutronok a legalacsonyabb energiaszintű pályákat igyekeznek elfoglalni (ebben az elektronokkal megegyeznek), és az ellentétes spinűek igyekeznek párosítódni (ebben az elektronoktól eltérnek).
A protonok és neutronok saját impulzusmomentumának következménye az atommag saját impulzusmomentuma (spinje), ennek nagysága kvantált. Spinimpulzus-momentum nagysága=
I(I 1 )
h 2
I: a mag spinkvantumszáma, függ a magban lévő protonok és neutronok számának típusától
Mag
Példa
Protonszám
Neutronszám
I
páros
páros
0
12C, 16O
páratlan
páratlan
1 (2,3..)
14N
.,5
1H, 13C, 19F,
Az egyik páros, a másik páratlan
31P 23Na
(1,5) 17O (2,5)
NMR inaktív magok
NMR aktív magok
A spinimpulzus momentum vektormennyiség: iránya és nagysága is kvantált. Egy I spinű mag I impulzusmomentumának (vektor félkövér!) egy tetszőlegesen választott (pl. a z) tengelyre nézve 2I+1 számú merőleges vetülete van. Azaz, I z komponense, Iz kvantált:
I z m m: a mag mágneses kvantumszáma, melynek értéke lehet: -I, -I+1, … , I-1, I
0.5
0.5 I=0,5
0
cos
Iz mI mI I I(I 1) I(I 1)
1 H(I 0.5) : 54.7 I=1
A mag mágneses momentuma, m – szintén vektormennyiség – arányos I-vel. A g arányossági tényezőt giromágneses (csavarómágneses) hányadosnak nevezzük.
m=gI
Egyes izotópok mágneses magrezonanciás tulajdonságai
m magmagneton
g radian/ Tesla sec
Relatív érzékenység
NMR frekvencia [MHz] 4,7 Tesla térerőnél
Kémiai eltolódás tartomány [ppm]
Egyenlő számú magra
Természetes izotóp-arány mellett
Izotóp
I
Természetes előfordulás %
1H
1/2
99,9844
2,7927
2,6751
200
10
1,000
1,000
2H
1
0,0156
0,8574
0,4107
30,7
10
9,65×10-3
1,45×10-6
11B
3/2
81,17
2,6880
0,8583
64,2
250
0,165
0,133
13C
1/2
1,108
0,7022
0,6726
50,3
250
1,59×10-2
1, 76×10-4
14N
1
99,635
0,4036
-0,1933
14,4
900
1,01×10-3
1,00×10-3
15N
1/2
0,365
-0,2830
-0,2711
20,3
900
1,04×10-3
3,85×10-6
17O
5/2
0,037
-1,8930
-0,3627
27,1
700
0,0291
1,08×10-5
19F
1/2
100
2,6273
2,5167
188
800
0,833
0,833
23Na
3/2
100
2,2161
0,7076
53
0,095
0,095
29Si
1/2
4,70
-0,5548
-0,5316
39,7
400
7,84×10-3
3,68×10-4
31P
1/2
100
1,1305
1,0829
81
700
0,0663
0,0663
35Cl
3/2
75,53
0,8209
0,2621
19,6
7,70×10-3
3,55×10-3
Mágneses energiaszintek E mB0 mgB0
Példa: I=1/2
E
1H
b antiparallel
13C
b
13C
a
1H
Na e Nb
E kT
pl.:
E=0,5għB0
m= +1/2
E=-0,5għB0
a parallel
B0
m= -1/2
E= għB0
B0= 11,74 Tesla (500 MHz) 1H (500 MHz) Ntotál= 2 000 000 Na = 1 000 016 Nb = 999 984
B0
eredő mágnesezettség
precesszió
z
z x
B0
x
y
y
Mz 0 M XY 0 a különböző fázisú spinek egyenletes eloszlása a precesszió szöge q
B0>>>>Mz (mérhetetlen)
A precesszió frekvenciája:
1 g B0 2
g B0
radián Hertz sec Larmor frekvencia = f (g, B0) A rezonancia (a spinek parallel állapotból antiparallel állapotba jutnak): a besugárzás frekvenciája egyezzen meg a Larmor frekvenciával.
E = h = għB0 Rezonancia frekvencia:
1 g B0 2
CW NMR (continuous wave, -t (B0-t) fokozatosan változtatják, pásztázzák) PFT NMR (pulse Fourier transformation, az összes átmenetet egyszerre gerjesztik egy rövid pulzussal)
g-sugarak röntgensugarak
Az elektromágneses spektrum
10 22 10 20
Mössbauer
600 500
18
10
400 300
ultraibolya 1016 látható infravörös
1014
1H
19F
elektrongerjesztési 200 rezgési
31P
1012 mikrohullámú
rádiófrekvenciás
100
1010
forgási
108
NMR
106
/Hz
13C
/MHz
z
z
B0
x
x
B0
y
y
B1
Mz eredő mágnesezettség
rezonancia fázis-koherencia (kötegelődés) My eredő mágnesezettség
Az eredő mágnesezettség megváltozása B0
B1 Rezonancia: Mz 0, My alakul ki Relaxáció: Mz visszaépül, My 0
B0 >>>> B1
FT
FID: free induction decay szabad indukciós lecsengés szinuszoid oszcilláló
FT
FT B1
Idő
Frekvencia
forgó légpárna
korrekciós tekercs
vákuum folyékony N2-kamra (-70 C) vákuum folyékony He-kamra (-269 C)
szupravezető tekercs
900 MHz 3500 e USD
600 MHz 750 e USD 200 MHz 250 e USD
A rezonancia frekvencia függ: - a mag fajtájától - a mag kémiai környezetétől
Mágneses térerő egy adott mag környezetében:
Bhelyi B0 B0 B0 (1 ) : árnyékolási tényező Kémiai eltolódás
1729,6 Hz 4324 Hz
502,4 Hz 1256 Hz
megfigyelt TMS 106 spektrométer
1 g Bhelyi 2
6,136 ppm 6,136 ppm
ppm, dimenzió nélküli
200106 500106 CH3 H3C
Si CH3 CH3
TMS
CH3
O H2C
CH2
H2C
CH2
O
dioxán
H3C
C
OH
CH3
tercier-butanol
Legfontosabb NMR jellemzők: 1) Kémiai eltolódás 2) Spin-spin csatolás (csatolási állandók, multiplicitás) 3) Intenzitás/terület 4) Relaxációs idő
1) Kémiai eltolódás
1H
NMR: 13C NMR: 19F NMR: 31P NMR:
10 ppm 250 ppm 800 ppm 700 ppm
H H
H
H
NH H
H
HDO
C
CH2
CH3
TMS
H
10
8
6
4
2
0 ppm
Magasabb helyi tér Magasabb frekvencia Kisebb árnyékolás Alacsonyabb elektronsűrűség
A pH változtatás hatása a kémiai eltolódásra savas karakterű molekulák esetén Ecetsav 1H NMR titrálása
HL
• az 1H kémiai eltolódást
L
meghatározó egyik fő faktor a helyi elektronsűrűség
8
• a savi disszociáció növeli az elektronsűrűséget a savi csoport környezetében
7 6
• a szomszédos szénhez pH
5 4 3 2
kapcsolódó protonok NMR jele alacsonyabb ppm felé tolódik köztes pH értékeknél a savi és bázikus forma kiátlagolt jele látható
1 2.20
2.15
2.10
2.05
2.00
1.95
1.90
1H chemical shift (ppm)
1.85
obs HL xHL L xL
Ecetsav NMR-pH titrálási görbéje 2.2 HL
obs
2.1
(ppm) 2.0
pK a 4.64
1.9
L-
1.8 1
2
3
4
5
6
obs HL pH pK a log L obs
7
8 pH
2) Spin-spin csatolás: aktív magok közötti kölcsönhatás, ami jelfelhasadást okoz (multiplicitás) Csatolás: 1) direkt (D, dipoláris), téren keresztüli (szilárd fázisú NMR-ben) 2) indirekt (J, skaláris, független B0-tól), kötő elektronokon keresztüli
csatolási állandók
3J HH
(vicinális)
2J HC
(geminális )
1J CH
A 3-kötéses csatolási állandók fontos jelzői a konformációnak Összefüggés a diéderes szög és 3JHH csatolási állandók között (Karplus)
q
H
transz
H C
C Hz
3J HH
(Hertz)
q mágnesesen ekvivalens magok: azonos kémiai eltolódással és csatolási állandókkal (kémiailag ekvivalens magoknál a csatolási állandók eltérőek) 2n: nem ekvivalens magok (három kötésen belül) multiplicitás (a csúcsok száma) n+1: ekvivalens magok (három kötésen belül)
Multiplicitás egyenértékű szomszédokkal
Az NMR csúcs: Lorentz görbe
F
a)
C
Nincs szomszédos mag: szingulet
F
b)
C
c)
H
F
B
H
C
H
A
F
d) B
H
C HC
H
A
Egy szomszédos mag:
dublet
Két szomszédos mag: HA HB a a a b b a b b
triplet
1:1
1:2:1
1:3:3:1
Három szomszédos mag: kvartet HA HB HC a a a b a b b b
a a b a b a b b
a b a a b b a b
n+1 Intenzitások: Binomiális együtthatók (összegük 2n) Egy spin energiája függ a szomszédos spinek orientációjától
Multiplicitás nem-ekvivalens szomszédos magok esetén: ABX spinrendszer O H3C
H HX COOH N HA
N-acetilcisztein
HB SH
HA
Hx
HB
ppm 3J
3J
BX
3J
AX
3J
BX
2J
AB
3J
AX
2J
AB
2J
AB
BX
2J
AB
ppm
Ez elsőrendű (ΔAB/JAB > 7) spektrumokra igaz, a másodrendű spektrumok bonyolultabbak (háztető effektus, a csúcsok összeolvadása) → Bo legyen nagy
1H-NMR
spektrum: N-acetilcisztein D2O-ban
pD~12 500 MHz
O H 3C
H Hx COOH N Ha
Hb SH
d-d
t-but
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
3) Intenzitás/terület Efedrin-hidroklorid D2O-ban (360 MHz) H
H
H
H
OD
HB
C
C
HA
N CH3 D2
CH3
+
H
1.18
1.16
1.14
1.12
1.10
1.08
1.06
1.04
Terc-butanol 3.60
5.170
5.160
5.150
5.140
5.130
5.120
5.110
5.100
3.55
3.50
3.45
HDO
5.090
5h 1h
3h
3h
1h 7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
4) Relaxációs idő E2 b
90°x
B0
E1 a z
z
x
z
x
z
x
x
90°x y
y
y
y
gerjesztés relaxáció spin-rács
1,2
Mz
1,2
spin-spin
Mxy
1
1
0,8
0,8 0,6
M z M l M zmax M zmax e
0,4 0,2 0
t T1
M xy M t M xymax e
0,6 0,4
0,2 0
0
1
2
3
4
idő
5
A populáció különbség visszaáll
0
1
2
3
4
idő 5
6
A fázis-koherencia megszűnik
t T2
A térerő hatása a spektrumra Ha
1,88 Tesla
cH
COOH
bH
OCOMe
Hd
5,87 Tesla
Hertzben a skála ~3-szorosára növekedett, a vonalszélesség ppm-ben 1/3-ára csökkent. Ha cH
COOH
bH
OCOMe
Hd
Hertz = f(B0) JHertz = f(B0)
Me
OH
18
Me
19
O
1-dehidrotesztoszteron
Érzékenység növelés spektrum akkumulációval
Jel/zaj
1.5 1.5 S/N ~ n cg excg det B0
Mag Overhauser hatás (NOE - Nuclear Overhauser effect) NOE: az I spin intenzitásának megváltozása, ha az S spint telítésbe visszük. Mágneses dipólusok relaxációján alapul, a molekulák rotációs mozgása révén
Két térközeli mag J (kötéseken keresztüli) csatolás nélkül besugárzás telítés
a) S telítése, I nagysága nő vagy csökken
b)
I I0 I0
molekulatömeg 1000 gyors „bukfencezés”
lassú „bukfencezés”
A molekulák átfordulási sebességét befolyásolja a) Hőmérséklet b) Oldószer (viszkozitás) A NOe arányos
r-6 -nal
5 Å távolságon belül érvényesül A NOe és annak 2D változata a fő eszközök a a) 3D konformáció b) Hatóanyag-receptor kölcsönhatás meghatározására.
Dinamikus NMR Kémiai csere: olyan folyamat, amely során az atommag cserélődik két olyan környezet között, amelyben NMR paraméterei eltérőek - intramolekuláris folyamatok: proton átadás (pl. keto-enol tautoméria), konformációs változások (pl. rotamerek egymásba alakulása) - intermolekuláris folyamatok: kis molekulák kötődése makromolekulákhoz, protonálódási folyamatok Kicserélődési sebességek az NMR kémiai eltolódás skálához viszonyítva - lassú csere: k << AB ( A- B) a két rezonancia láthatóan elkülönül k - gyors csere: k >> AB A B csak egy átlagos rezonancia figyelhető meg k observed = xAA + xBB
H3C
O
k
H3C
N N H3C
N N
k
H3C
O
Kémiai csere Hőmérsékletfüggő spektrumsorozat
k A
B k
k << AB
k >> AB
Több-pulzusos technikák 1) Inverziós visszaépülés
Pulzusszekvencia
tD
Felvétel
2) Hahn spin echo
3) 2D NMR
tD
tD Felvétel
Inverziós visszaépülés B0
z
tD
z
z
x
Felvétel
x
y
y
/2x
x y
tD z
z
x y
/2x
x y
tD z
z
/2x
x
x y
y
T1 relaxációs idő mérése
tD z
z
/2x
x y
x y
HO DO
Hm CH2R
Magok relaxációs tulajdonságainak (T1) mérése A relaxációs idő az 1H és 13C NMR spektroszkópiában 10-1-102 másodperc tartományba esik.
Hahn spin echo: T2 relaxációs idő mérése, spinek refókuszálása
B0
z
z
z
/2x
x
z
tD
x
x
y
y
x
y
y
x
x
x
x
y
y
z
x
3 spin
z
z x
tD
x y
x
y
z x
x y
y
x
x
y
y
y
x
y
y
2D NMR A kísérlet 3 (4) fázisa:
1) Előkészítés /2 2) Kifejlődés: 1D kísérletek sorozata tD tD+i tD+i+i tD+i+i+i…
tipikusan 256 i 3) Keverés (nem feltétlenül) 4) Detektálás: az utolsó
/2
B0
z
z
x
x y
/2x
y
t1
z
z x
2π ν t1
t1
.
M t M0 e
M x M t sin(2π ν t 1 ) M y M t cos(2π ν t 1 )
y
t1 T2
x
/2x
y Felvétel (t2)
t1
2
t1=0
t1
COSY – Correlation Spectroscopy Kontúr plot átlón kívüli off-diagonális
DNS-RNS oligonukleotid 500 MHz NOESY Diagonális Off-diagonális
Aszpirin kis-felbontású 400 MHz-es COSY spektruma
COOH
1
cH
H a
b
H
OCOMe H d
2
COSY Gly – Tyr – Gly
COSY
TOCSY NOESY
NMR képalkotó technikák
in vivo
1H
Egész test képalkotás
NMR mikroszkópia mm felbontás
31P
H 2O
Mágneses Rezonancia Képalkotás Magnetic Resonance Imaging – MRI B01
B02
Térbeli információ
Térerő
B0 gradiens
ν
ω1 γ B01
Frekvencia
ω2 γ B02
γ B0 2π
ω γ B0
in vivo MRI 1H, 31P
„Morfológiai profil” Valós idejű, non-invazív A tumor sejtekhez kötött víz relaxációs ideje eltérő
Emberi fej MRI felvétele
Kontraszt anyagok: Szerv-specifikus Gd3+ komplexek
Ertg EMRI
10
10
Agytumor diagnosztizálása MRI-vel
A képalkotó technikákban T1 vagy T2 relaxációs időt vizsgálunk. A relaxációs idő megmutatja: 1) Hogy a víz kötött -e 2) Hogy van –e jelen valamilyen fémion (főként paramágneses)
Kötött víz: lassú átfordulás (bukfencezés) Paramágneses fémionok: gyors víz H relaxáció Így daganatokat, főként körülírt (solid ) daganatokat lehet diagnosztizálni.
agytumor
májtumor
in vivo
MRS magnetic resonance spectroscopy
„Kémiai” és „metabolikus” profil Valós idejű Non-invazív, non-destruktív 1H, 31P, 19F, 23Na, 13C
kreatin-foszfát
PO43-
Emberi felkar 40 MHz-es 31P NMR spektruma nehéz fizikai munka elött és után.
Kreatin-foszfát szintje gyaloglás előtt és után
in vivo MRS
Emberi máj in vivo (2,1 T) 13C MR spektruma.
Etanol 1H NMR spektruma, amelyben külön láthatók az OH, CH2 és CH3 protonok jelei (balról jobbra.)
Kvantitatív NMR - qNMR • Tényleges koncentráció meghatározása • Relatív koncentráció meghatározása A módszer alapja:
HO
CH2
Az NMR jelek alatti terület (integrál) arányos a jelet adó magok számával
CH3
1
3 2
A qNMR előnye más analitikai módszerekkel szemben • Univerzálisan alkalmazható hiszen minden szerves molekula ad NMR jelet (1H ,13C). • Az integrál jel nagysága csak a megfigyelt NMR aktív magok számától függ • Az azonosításhoz más NMR paraméterek (pl. a kémiai eltolódás és a csatolási állandók) szolgáltatnak információt
Egyetlen NMR spektrum felvételével lehetővé válhat többkomponensű rendszerek mennyiségi analízise a komponensek előzetes elválasztása nélkül.
Kvantitatív NMR spektrum felvétel
pw Aq
NMR 13C lecsatolással a 13C szatellit jelek kiküszöbölésére 13C NMR 1H lecsatolással az 1H csatolások megszüntetése, NOe effektus kiküszöbölése 1H
1H 13 C
13 C 1H
d1
Tényleges koncentráció meghatározása qNMR-el Ismert koncentrációjú standard anyag alkalmazása szükséges Standard anyagok kritériumai: • nagy tisztaságú • olcsó • stabil
• kémiailag inert • nem illékony • nem higroszkópos NO2
COOH
O O
HOOC
COOH
NO2
1,3,5-benzol-trikarbonsav
1,4-dioxán
1,4-dinitrobenzol CH3
HOOC
CH
CH
maleinsav
COOH
H3C
C
OH
CH3
tercier-butanol
Levodopa, karbidopa és metildopa meghatározása egymás mellett gyógyszerkészítményben H2 3
HO
H 6 H3C NH2
HO
COOH H 1 H4 H5
metildopa H2 3
HO
H 6 H3C NH
HO
NH2
COOH H1
H4 H5
karbidopa H2 HO
H
3
H
6
HO
NH2 COOH
H1
H4 H5
levodopa
Talebpour Z., Haghgoob S., Shamsipur M. Anal. Chim. Acta 506 (2004) 97–104.
Levodopa, karbidopa és metildopa meghatározása egymás mellett gyógyszerkészítményben HOOC
CH
CH
COOH
Talebpour Z., Haghgoob S., Shamsipur M. Anal. Chim. Acta 506, 97–104, 2004.
NMR-t tartalmazó cikkelyek a Ph.Eur. 5.1-ben Azonosítás • Buserelinum (1H) - a gonadotropinreleasing hormon szintetikus analógja • Goserelinum (13C) • Heparina massae molecularis minoris (13C) • Tobramycinum
Kvantitatív meghatározás • Hydroxypropylbetadexum • Poloxamera • Salmonis domestici oleum
Azonosítás: összehasonlítás Ph.Eur. referencia spektrummal vagy CRS spektrummal Poliszacharidok azonosítása vakcinákban • Vaccinum haemophili stirpe b coniugatum • Vaccinum meningococcale classis C coniugatum • Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum coniugatum adsorbatum
Hidroxipropilbetadex moláris szubsztitúciójának meghatározása RO RO
O OR O
O
RO
RO
O
O
RO
RO
OR RO
RO O
b-ciklodextrin részlegesen szubsztituált poli(hidroxipropil)-étere.
O
OR
O RO
OR O
OR OR
O O
OR RO O
O RO
OR OR O
OR
R=-[CH2-CH(CH3)-O]n-H
n=0, 1, 2 ...
Moláris szubsztitúció (MS): az anhidroglükóz egységekre jutó hidroxipropil-csoportok száma
Hidroxipropilbetadex moláris szubsztitúciójának meghatározása HO O H OH O
O O CH2 CH CH3 OH
A1 MS 3 A2 A1: az 1,2 ppm-nél lévő metil csoportok dublet jeleinek területe A2: az 5 és 5,4 ppm közötti glikozidos protonok jeleinek területe
Oxipropilén-oxietilén arány meghatározása Poloxamérekben
A1
csak az oxipropilén egységekből, egységenként 3 proton, összesen 3·b proton
dublet, ~1,08 ppm
H CH3
H H
H H O
O
HO
O b
a
H H
a H
H H
Etilén-oxid és propilén-oxid szintetikus polimerje
H H
összetett jelcsoport 3,2 és 3,8 ppm között
az oxipropilén egységekből 3 proton, az oxietilén egységekből 4 proton, összesen 3·b+4·a proton
A2 ( A2 A1 ) 44 ( A2 A1 ) 33 4 m%oxietilén 100 ( A2 A1 ) A1 ( A2 A1 ) 33 A1 58 44 58 4 3
Ex vivo NMR Élő szervezetből nyert testfolyadékok és szöveti kivonatok komponenseinek közvetlen NMR spektroszkópiás vizsgálata (előzetes elválasztás nélkül) agyi és gerincvelői liquor nyál vér izzadtság
magzatvíz
vizelet ondófolyadék
Vizeletanalízis
Valproinsav-mérgezés diagnózisa NMR spektroszkópiával Egészséges ember vizelete
Mérgezett ember vizelete
H3C
CH2 CH2
H3C
CH2 CH2
CH
COOH
C, kreatinin U, urea L, lactát G, glicin T, trimetilamin oxid Ci, citrát H, hippurát Al, alanin 2,3,4,5, a valproinsav protonjai 1′,2′,3′,4′,5′, glukuronsav protonjai Azaroual N. et al. Magn Reson. Mater. Phys. Biol. Med. 10, 177-182, 2000
