LONGITUDINÁLNÍ PROTILÁTKOVÝ PROFIL U KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY

Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

LONGITUDINÁLNÍ PROTILÁTKOVÝ PROFIL U KLÍŠŤOVÉ ENCEFALITIDY

Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce:

Autor:

MUDr. Jana Bednářová, Ph.D.

Markéta FIKSOVÁ

Brno, duben 2013

Jméno a příjmení autora: Markéta Fiksová Název bakalářské práce: Longitudinální protilátkový profil u klíšťové encefalitidy Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Bednářová, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2013

Souhrn:

Ve své bakalářské práci jsem se zabývala onemocněním klíšťová encefalitida. V teoretické části jsem se zaměřila na popis viru klíšťové encefalitidy. Dále popisuji vektor klíšťové encefalitidy, jak onemocnění probíhá, jaká je jeho prevence a léčba. Důležitou součástí teoretické části byla kapitola o laboratorní diagnostice. V experimentální části popisuji soubor pacientů, který mi byl poskytnut z laboratorního systému Oddělení klinické mikrobiologie ve Fakultní nemocnici Brno. U pacientů jsem zkoumala přítomnost pozitivity protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgG a IgM. Skupinu pacientů s pozitivními protilátkami ve třídě IgM jsem na základě anamnestických údajů rozdělila na dvě podskupiny – pacienty s akutní fází onemocnění a pacienty s dlouhodobě přetrvávajícími IgM protilátkami. Z výsledku jsem zpracovala tabulky a grafy, které jsou uvedené v experimentální části mé bakalářské práce.

Klíčová slova: klíšťová encefalitida, klíště obecné, viry, enzymová imunoanalýza, protilátky

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

OBSAH SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................................... - 5 1 ÚVOD ................................................................................................................................. - 9 2 TEORETICKÁ ČÁST ...................................................................................................... - 10 2.1 Virus klíšťové encefalitidy ......................................................................................... - 11 2.1.1 Přehled významných příslušníků rodu Flavivirus ............................................... - 11 2.2 Vektor klíšťové encefalitidy....................................................................................... - 13 2.2.1 Taxonomie a stavba těla klíštěte obecného ......................................................... - 13 2.3 Klinické příznaky klíšťové encefalitidy ..................................................................... - 16 2.3.1 Post encefalitický syndrom.................................................................................. - 17 2.4 Léčba a aktivní imunizace .......................................................................................... - 18 2.5 Ochrana a prevence .................................................................................................... - 18 2.5.1 Vakcinace ............................................................................................................ - 19 2.5.2 Očkování a věk .................................................................................................... - 19 2.5.3 Očkovací schéma ................................................................................................. - 20 2.5.3.1 Schémata vakcíny FSME-IMMUN ............................................................ - 20 2.5.3.2 Schémata vakcíny Encepur ......................................................................... - 20 2.6 Imunitní odpověď hostitelského organismu ............................................................... - 22 2.6.1 Specifická buněčná imunita ................................................................................. - 23 2.6.2 Specifická humorální imunita.............................................................................. - 23 2.6.3 Tvorba protilátek ................................................................................................. - 24 2.7 Vyšetření mozkomíšního moku ................................................................................. - 26 2.7.1 Lumbální punkce ................................................................................................. - 27 2.7.2 Nález buněk v likvoru u klíšťové encefalitidy .................................................... - 28 2.8 Laboratorní diagnostika ............................................................................................. - 30 2.8.1 Přímý průkaz ....................................................................................................... - 30 2.8.2 Nepřímý průkaz ................................................................................................... - 32 2.8.3 Virus neutralizační test (VNT) ............................................................................ - 33 2.8.4 Hemaglutinačně inhibiční test (HIT) .................................................................. - 34 2.8.5 Komplement fixační reakce (KFR) ..................................................................... - 34 2.8.6 Enzymová imunoanalýza (ELISA)...................................................................... - 36 2.4.6.1 Obecně kompetitivní stanovení ................................................................... - 37 2.4.6.2 Obecně nekompetitivní stanovení – neboli sendvičové .............................. - 37 2.9

Cíl práce ............................................................................................................... - 39 -

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................ - 40 3.1 Soubor pacientů a vzorků ........................................................................................... - 40 3.2 Detekce specifických protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ............................... - 41 3.2.1 Základní princip testu .......................................................................................... - 41 3.2.2 Vybavení potřebné ke stanovení protilátek ......................................................... - 42 3.2.3 Příprava pracovních roztoků................................................................................ - 42 3.2.4 Ředění vzorků...................................................................................................... - 42 3.2.5 Pracovní postup u vyšetřování přítomnosti IgM a IgG protilátek ....................... - 43 3.2.6 Interpretace výsledků........................................................................................... - 44 3.3 Zhodnocení výsledků- celkový počet vyšetření ......................................................... - 45 3.3.1 Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek ................................ - 47 3.3.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku ................................ - 50 3.4 Zhodnocení výsledků – akutní fáze onemocnění ....................................................... - 52 3.4.1 Rozdělení podle pohlaví ...................................................................................... - 52 3.4.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku ................................ - 53 3.5 Přítomnost přetrvávajících protilátek IgG a IgM ....................................................... - 54 3.5.1 Rozdělení podle pohlaví ...................................................................................... - 54 3.5.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku ................................ - 55 3.5.3 Rozdělení podle délky přetrvávání pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci ........................................................................................................................... - 56 3.6 Kazuistiky .................................................................................................................. - 57 3.6.1 Pacient č. 1........................................................................................................... - 57 3.6.2 Pacient č. 2........................................................................................................... - 58 3.6.3 Pacient č. 3........................................................................................................... - 59 4 ZÁVĚR ............................................................................................................................. - 60 5 LITERATURA ................................................................................................................. - 61 6 PŘÍLOHY ......................................................................................................................... - 64 -

SEZNAM ZKRATEK Al (OH)3 – hydroxid hlinitý BB – buňka CB – celková bílkovina CNS – centrální nervová soustava CPE – cytopatický efekt DNA – deoxyribonukleová kyselina ELISA – imunoenzymatická analýza FN Brno – Fakultní nemocnice Brno HIT – hemaglutinačně inhibiční test IgG – imunoglobulin G IgM – imunoglobulin M IL 1β - interleukin 1 β IL 8 – interleukin 8 IP – index pozitivity KE – klíšťová encefalitida KFR – komplement fixační reakce L4 – čtvrtý obratel bederní L5 – pátý obratel bederní LIS – laboratorní informační systém MHC – hlavní histokompaktibilní komplex MTD – mikrotitrační destička ND50 – poloviční neutralizační dávka NI – neutralizační index NK – natural killers OKM FN Brno – Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno PCR – polymerázová řetězová reakce

RIA – radioimunoanalýza RNA – ribonukleová kyselina ssRNA – jednořetězová RNA TBE – Tick-borne encephalitis TMB-Complete – jednosložkový chromogenní substrátový roztok TNF – tumor nekrotizující faktor VNT – virus neutralizační test

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jany Bednářové, Ph.D., a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.

V Brně dne .......................

.................................................. (Markéta Fiksová)

Zde bych ráda poděkovala MUDr. Janě Bednářové PhD., za odborné vedení při tvorbě bakalářské práce. Její cenné rady, zkušenosti, trpělivost a velice kladné jednání byly pro moji práci velkým přínosem. Poděkování patří rodičům a partnerovi za podporu.

-9-

1 ÚVOD Klíšťová encefalitida je závažné onemocnění vyskytující se ve střední Evropě včetně České republiky. Virus klíšťové encefalitidy patří do skupiny arbovirů. Onemocnění může probíhat inaparentně, abortivně, nebo s plně rozvinutými klinickými příznaky jako encefalitida, meningitida, meningoencefalitida, encefalomyelitida. Po onemocnění mohou přetrvávat neurologické následky, v ojedinělých případech může onemocnění skončit úmrtím. Vektorem viru klíšťové encefalitidy je klíště obecné. Člověk se nejčastěji nakazí po přisátí infikovaného klíštěte v ohnisku nákazy. Specifická terapie klíšťové encefalitidy není k dispozici, onemocnění se léčí symptomaticky. K prevenci se používá aktivní imunizace inaktivovanou očkovací látkou. Ke stanovení viru klíšťové encefalitidy se využívá přímý a nepřímý průkaz. Nejčastěji se používá průkaz protilátek enzymovou imunoanalýzou (ELISA). Stanovení protilátek je možné z lidské plazmy, séra a mozkomíšního moku.

- 10 -

2 TEORETICKÁ ČÁST Viry představují různorodou skupinu infekčních agens. Liší se od sebe tvarem, velikostí, chemickým složením a rozmnožováním. Od ostatních organismů se odlišují tím, že nejsou organizovány jako buňky, nýbrž částice obsahující buď RNA či DNA. Jejich rozmnožování probíhá pomocí syntézy svých vlastních složek, tzn. syntéza je závislá na ribozomech hostitelské buňky. Dalším typickým znakem virů je, že nejsou viditelné v běžném optickém mikroskopu, nedají se kultivovat na půdách, pouze je můžeme pěstovat na živých buňkách (Votava a kol., 2003).

- 11 -

2.1 Virus klíšťové encefalitidy Virus klíšťové encefalitidy se řadí do RNA virů, čeleď Flaviviridae, rod Flavivirus. Jedná se o obalené ssRNA viry pozitivní polarity, nesegmentované, s ikosaedrickou symetrií (Rajčáni, Čiampor, 2006). Obecně mají flaviviry menší velikost a jejich molekulární hmotnost je 4*106. Rozměr je okolo 50nm (Lindquist, Vapalahti, 2008). Tyto viry jsou přenášeny pomocí členovců. Virus evropské klíšťové encefalitidy je přenášen klíšťaty druhu Ixodes ricinus. Do čeledi Flaviviridae patří komplex virů klíšťové encefalitidy, komplex virů japonské encefalitidy, viry horečky dengue a viry žluté zimnice. Jednotlivé druhy virů komplexu KE jsou navzájem antigenně příbuzné. Odlišení je zahrnuto ve stupni závažnosti onemocnění, která vyvolávají u člověka (Rajčáni, Čiampor, 2006).

2.1.1 Přehled významných příslušníků rodu Flavivirus 1, Do komplexu virů klíšťové encefalitidy patří: •

Virus nemoci Kyasanurského lesa → Výskyt v Indii. Způsobuje hemoragické horečky s meningoencefalitidou.

•

Virus Omské hemoragické horečky → Výskyt na Sibiři. Způsobuje těžké onemocnění CNS.

•

Virus Louping ill → Výskyt na Britských ostrovech. Způsobuje lehce probíhající meningoencefalitidy.

•

Virus Powasan → Výskyt v Kanadě a USA. Onemocnění se objevuje vzácně, průběh bývá lehký.

•

Virus Langat → Výskyt v Malajsii. Nevyvolává běžně onemocnění u člověka.

•

Virus klíšťové encefalitidy dálněvýchodního podtypu → Vyskytuje se na východ od Uralu po Dálný Východ. Pokud člověk není vůči onemocnění imunizován, dochází k těžkým meningoencefalitidám.

- 12 •

Virus klíšťové encefalitidy evropského podtypu → Vyskytuje se na západ od Uralu až po území východní Francie (Rajčáni, Čiampor, 2006).

2, Do skupiny virů japonské encefalitidy patří: •

Virus japonské encefalitidy

•

Virus St. Louis

•

Virus západonilské horečky

•

Virus encefalitidy údolí Murray.

Tyto encefalitidy jsou přenášeny komáry rodu Culex (Rajčáni, Čiampor, 2006).

3, Do skupiny virů horečky dengue patří: •

Čtyři antigenní podtypy 1 až 4. Přenašečem jsou komáři rodu Aedes (Rajčáni, Čiampor, 2006).

4, Do skupiny virů žluté zimnice patří: •

Virus žluté zimnice

•

Wesselsbron virus

(Rajčáni, Čiampor, 2006)

- 13 -

2.2 Vektor klíšťové encefalitidy Virus evropské klíšťové encefalitidy přenáší různá vývojová stádia klíšťat druhu klíště obecné (Ixodes ricinus).

Obr. 1: Klíště obecné (převzato z http://www.helago-cz.)

2.2.1 Taxonomie a stavba těla klíštěte obecného Říše: Živočichové (Animalia) Kmen: Členovci (Arthropoda) Třída: Klepítkatci (Chelicerata)

Řád: Roztoči (Acarina) Čeleď: Klíšťatovití (Ixodidae) Podčeleď: Ixodinae Rod: klíště (Ixodes) (Hubálek, Rudolf, 2007)

- 14 -

Roztoči jsou množstvím nejpočetnější skupina klepítkatců. Klíště obecné je u nás nejznámějším a medicínsky nejvýznamnějším zástupcem čeledi Ixodidae (Votava a kol., 2003). Klíšťata mají klíšťkovité chelicery, které jsou zakrnělé a umístěné na spodní straně savého chobotku neboli hypostomu. Schopnost sání krve není přítomna u samců, jelikož mají zakrnělé sací ústrojí. Samice, nymfy a larvy krev sají. Samci mají hřbetní část krytou štítkem, zatímco samice mají pouze malý štítek na přední části hřbetu, a proto dokážou několikanásobně zvětšovat svůj objem (Bártová, Klimeš, 2010). Na prvním páru končetin, přesněji na tarzálním článku, má klíště umístěné termorecepční a chemorecepční receptory, tzv. Hallerův orgán, což je jamka, kde jsou lokalizované smyslové orgány. Klíšťata rodu Ixodes nemají oči. Klíšťata parazitují nejčastěji na savcích, ptácích a plazech (Bártová, Klimeš, 2010). Samice na svých hostitelích sají okolo 6–10 dní, jejich velikost se pohybuje mezi 3 – 4 mm a objem dokážou zvětšit až 200krát. Nymfy dorůstají velikosti 1 – 2 mm. Jejich sání trvá 3 – 5 dní, přičemž se jejich objem zvětší 15 – 40krát. Nejmladší vývojová stádia larvy se při sání zvětšují 10 – 20krát. Jejich původní velikost je 0,6-1mm a na hostitelích parazitují 2 – 4 dny (Bártová, Klimeš, 2010). Klíště je trojhostitelské, což znamená, že šestinohá larva zpravidla saje na drobných obratlovcích (myšovití), nymfa na větších savcích (zajícovití) a dospělec napadá velká zvířata. Na člověku sají všechna vývojová stádia (Bártová, Klimeš, 2010). Klíšťata se nejčastěji vyskytují v listnatých či smíšených lesích. Častěji se vyskytují v dubových či dubohabrových lesích, než v lesích jehličnatých (Jírovec a kol., 1977). Nejvíce se klíšťata vyskytují v teplejších měsících. Sezónní aktivita klíšťat má zpravidla dvouvrcholový průběh s prvním maximem v dubnu až červnu a druhým v září (Votava a kol., 2003). Podle vývojových stádií se klíšťata nacházejí v různých porostech, např: larvy a nymfy jsou v trávě, dospělec ve vyšších porostech (Hubálek, Rudolf, 2007). Klíšťata identifikují své oběti pomocí Hallerova orgánu. Díky němu detekují pachy, pohyby, amoniak. Klíště obecné přenáší původce řady onemocnění, např. virus klíšťové encefalitidy, Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, Francisella tularensis (Hubálek, Rudolf, 2007).

- 15 -

Obr. 2: Vývojová stádia klíštěte obecného (převzato z http://www.ezoo.cz)

- 16 -

2.3 Klinické příznaky klíšťové encefalitidy Doba inkubace u klíšťové encefalitidy je průměrně 7–14 dní, ale může kolísat v rozmezí 2–28 dní. Po požití infikovaného nepasterizovaného mléka se inkubační doba zkrátí na 3–4 dny (Dumpis a kol., 1999). Pro západní typ viru je typické dvoufázové horečnaté onemocnění. U východního typu je průběh jednofázový. Jednofázový průběh je charakterizován postupným nastupováním symptomů od bolesti hlavy až po těžké symptomy bez průběžného zlepšení. Hlavními příznaky první fáze jsou bolesti svalů a hlavy, člověk se cítí celkově unavený, pociťuje malátnost. Objevují se horečnaté stavy (Dumpis a kol., 1999). V krevním nátěru můžeme nalézt snížený počet trombocytů a leukocytů (Haglund, Gϋnther, 2003). Dvoufázový průběh se projevuje horečkou, která trvá 2–7 dní, a teploty dosahují 37,5 – 39,0 stupňů Celsia (Dumpis a kol., 1999). Pro dvoufázový průběh je typické, že po nastoupení první vlny příznaků nastane fáze zlepšení, avšak ani v této fázi se člověk necítí úplně v pořádku. Po fázi bez symptomů nastupuje celkové zhoršení (Dumpis a kol., 1999). Pokud je KE postiženo dítě, je průběh mírnější. U dospělých lidí a lidí, kteří jsou starší více jak 60 let, je průběh závažnější až závažný (Dumpis a kol., 1999). Druhá

fáze

KE

se

projevuje

klinicky

jako

meningitida,

encefalitida,

meningoencefalomyelitida, meningoencefaloradikulitida (Haglund, Günther, 2003). Virus při svém kolování v těle prostoupí hematoencefalitickou bariéru a v šedé hmotě a mozkových plenách způsobuje léze. Nejvíce je postižena mícha, mozeček, mozkový kmen, prodloužená mícha a jádra hlavových nervů (Banzhoff a kol., 2008). U východního typu je výše úmrtnosti kolem 20%, u typu evropského kolem 1%. Výsledky jsou ovlivněny dostupností správné zdravotní péče, prevence (Kaiser, 2007).

- 17 -

2.3.1 Post encefalitický syndrom

Je to syndrom, který se může projevit po průběhu onemocnění meningoencefalitidou (Günther, Haglund, 1997). U pacientů v Rakousku byl proveden výzkum, jehož výsledky říkají, že 10 – 20% pacientů, kteří prodělali těžší formu KE, zaznamenali přetrvávající následky jako bolesti hlavy, deprese, poruchy sluchu, závratě, neschopnost se koncentrovat a probíhaly časté změny nálad (Kaiser, 2007).

- 18 -

2.4 Léčba a aktivní imunizace Proti viru klíšťové encefalitidy zatím nebyla vyvinuta specifická léčba (Charrel a kol., 2004). Pacienti s virem klíšťové encefalitidy podstupují léčbu podpůrnou (Dumpis a kol., 1999). V dřívějších letech se pro léčbu využíval imunoglobulin, v dnešní medicíně se již nevyužívá (Broker, Kollaritsch, 2008). V mírných případech současná medicína pacientům předepisuje léky jako paracetamol či aspirin nebo jiné nesteroidní protizánětlivé léky (Dumpis a kol., 1999). Může se stát, že se u pacienta objeví příznaky meningoencefalitidy, nadále by se měl pacient zodpovědně sledovat, jelikož je možné, že by mohl upadnout do bezvědomí z otoku mozku, nebo do neuromuskulární paralýzy, která následně vede k selhání dýchání (Dumpis a kol. 1999). Pokud dojde k selhání dýchání, pacient se musí zaintubovat a připojit na dýchací přístroj (Dumpis a kol., 1999). Pokud dochází k paralýze končetin, je nutná fyzioterapie (Kunze, 2008).

2.5 Ochrana a prevence Nejspolehlivější ochrana před kousnutím klíštěte je uzpůsobení oděvu tak, aby se klíště nepřisálo. Dále se mohou využívat repelenty či jiné přípravky. Do přírody jsou doporučovány pevné boty, vyšší ponožky, do kterých se dají zastrčit kalhoty. Při ulehání do trávy by se měla použít podložka, protože klíšťata se vyskytují hlavně v nižších travinách. Maximálně vylezou do výšky 60 cm (Mutz, 2004). Důležité je se prohlédnout po návratu z přírody a zjistit, zdali není klíště přítomné. Pokud ano, správným způsobem se odstraní. Odstraní se bez vytáčení, stačí použít alkoholový dezinfekční roztok, tím se klíště zakápne. Poté se kývavým pohybem pomocí speciálních kleštiček vytáhne a spláchne do toaletní mísy (Mutz, 2004). Jelikož uvedená doporučení nejsou vždy účinná, je vhodné viru klíšťové encefalitidy předcházet pomocí aktivní imunizace neboli očkováním.

- 19 -

2.5.1 Vakcinace

Proti viru KE ještě nebyla vyvinuta specifická léčba, proto onemocnění předcházíme pomocí aktivní imunizace, která je v 99% účinná, pokud se dodrží správný postup podávání látky (Mutz, 2004). První vakcína, která se začala používat, byla vytvořena v Rakousku a to z kmene Neudӧrfl. Dnes se v Evropě používají dva typy vakcín. 1, Vakcína Encepur. Tuto vakcínu vyrábí německá firma Novartis Vaccines and Diagnostic, která obsahuje kmen K 23. 2, Vakcína FSME-IMMUN, kterou vyrábí rakouská firma Baxter AH. Ta obsahuje kmen Neudӧrfl. Obě tyto vakcíny jsou vyrobeny z kmenů viru klíšťové encefalitidy (Charrel a kol., 2004). Kmeny, které využívají jednotlivé vakcíny, jsou homogenní (Heinz, 2003). Obsah vakcín je tvořený inaktivovanými viriony, které se množí na kulturách z fibroblastů kuřecích embryí (Rendi-Wagner, 2004). Další zpracování je jejich filtrace, dále se inaktivují formaldehydem a pomocí ultracentrifugace jsou přečišťovány. Důležitý antigen je adsorbován

na Al (OH)3 a ustalován humánním albuminem v případě vakcíny FSME-IMMUN. U vakcíny Encepur se používá na stabilizaci sacharόza (Lindguist, 2008).

2.5.2 Očkování a věk

Vakcíny mohou využívat všechny věkové skupiny. Jelikož u dětí s předškolním věkem byly pozorované horečky, upravilo se dávkování vakcíny na polovinu, tzn., obsahují polovinu antigenu. Vakcíny pro děti jsou FSME-IMMUN junior a Encepur junior (Charrel a kol., 2004).

- 20 -

2.5.3 Očkovací schéma

Vakcína se podává pacientovi 3krát v přesně daných rozmezích. Podává se buď do svalu, nebo podkožně. Po aplikaci první dávky se druhá aplikace provádí za 1–3 měsíce. Třetí dávka pak za 9 – 12 měsíců. Protilátky se vytváří za 14 dní od podání druhé dávky. Nejvhodnější na podání vakcín je podzim či zima. Je to z toho důvodu, aby se stihly vytvořit protilátky, než začne sezona, ve které se klíšťata nejvíce množí (Kunz, Hofmann a kol., 1980, Kunz, 2003).

2.5.3.1 Schémata vakcíny FSME-IMMUN

1, základní očkovací schéma
1. Dávka – 0. den
2. Dávka – 1–3 měsíc po první dávce
3. Dávka – 5 – 12 měsíců po druhé dávce 2, zrychlené očkovací schéma
1. Dávka – 0. den
2. Dávka – 14. den
3. Dávka – 5 – 12 den po druhé dávce Opakování očkování by se mělo provádět každé tři roky (Charrel a kol., 2004).

2.5.3.2 Schémata vakcíny Encepur

1, základní očkovací schéma
1. Dávka – 0. den
2. Dávka – 1 – 3 měsíce po 1. dávce
3. Dávka – 9 – 12 měsíců po 2. dávce

- 21 -

2, zrychlené očkovací schéma
1. Dávka – 0. den
2. Dávka – 7. den
3. Dávka – 21. den Opakování očkování se provádí každé tři roky. Při zrychleném schématu se musí přeočkovat za 12–18 měsíců (Schöndorf, Ternak a kol., 2007, Schöndorf, Beran a kol., 2007). Při očkování osob nad 60 let by se očkování mělo opakovat každé tři roky. Pokud se jedná o osoby pod 60 let, stačí přeočkovat každé 4 roky (Rendi-Wagner, 2007).

- 22 -

2.6 Imunitní odpověď hostitelského organismu Po vniknutí viru klíšťové encefalitidy do organismu dojde v lidském těle k zaktivování dendritických buněk, a též Langerhansových buněk kůže virovým antigenem. Tyto buňky se následně přesouvají do lymfatických uzlin v místě vniknutí do organismu. Po vniknutí viru KE do organismu dochází k humorální a buněčné imunitní odpovědi (Johnston et al., 2000, Byrne, Halliday et al., 2001).

V první fázi infekce se zapojují mechanismy nespecifické buněčné i humorální imunity. Jedná se o interferony, makrofágy, NK buňky, komplementový systém (Hořejší, Bartůňková, 2009). •

Interferony: jsou glykoproteiny navozující v buňkách tzv. antivirový stav (Hořejší, Bartůňková, 2009).

•

Makrofágy: jsou buňky, které mají schopnost fagocytovat a produkovat rozmanité signální a antimikrobiální proteiny. Produkují antigen-prezentující buňky, dále produkují IL-1β, IL-8 a TNFα (Hořejší, Bartůňková, 2009).

•

NK buňky: jejich hlavním úkolem je zničit buňku, která je infikovaná virem KE. NK buňky poznávají ty buňky, které na svém povrchu obsahují málo MHC gp1. Jejich nejdůležitější zbraní jsou cytotoxická granula obsahující perforin a granzymy (Hořejší, Bartůňková, 2009).

•

Komplement: je souhrn asi 30 sérových a membránových proteinů, které spolupracují jednak mezi sebou a též s ostatními imunitními mechanismy. Jeho hlavními funkcemi jsou opsonizace, chemotaxe a osmotická lýza. Aktivuje se třemi způsoby neboli cestami. Klasickou, alternativní a lektinovou. Za hlavní složky komplementu považujeme devět sérových proteinů C1-C9. Složka C3 rozpoznává povrch mikroba. Lýzu buňky mají na starost proteiny C5-C9 (Hořejší, Bartůňková, 2009).

- 23 -

2.6.1 Specifická buněčná imunita

Ve specifické buněčné imunitě hrají zásadní funkci lymfocyty. Rozeznáváme dva typy lymfocytů: 1, B lymfocyty, které jsou tvořeny v kostní dřeni. Vznikají z nich plazmatické buňky, které produkují protilátky a zodpovídají za imunitu látkovou, která spočívá v tvorbě specifických protilátek neboli imunoglobulinů. Protilátky rozdělujeme do tříd: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD (Hořejší, Bartůňková, 2009).

2, T lymfocyty, které jsou závislé na thymu. Jsou důležité při tvorbě protilátek a zodpovídají za buněčnou imunitu (Hořejší, Bartůňková, 2009).

2.6.2 Specifická humorální imunita

Ve specifické humorální imunitě hrají nejdůležitější roli imunoglobuliny a cytokiny.

1, Imunoglobuliny jsou přirozené protilátky třídy IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, které se produkují na začátku, ale i v průběhu infekce. IgM je protilátka, která se vytváří jako první při setkání s antigenem, následně se vytváří další izotopy. Je pro ni typické, že se výborně dokáže navázat na protein komplementu C1 a tím aktivuje klasickou dráhu komplementu. U protilátky třídy IgG, která je nejpočetnějším izotopem imunoglobulinů, se rozlišují 4 podtřídy a ty různě aktivují komplement. Třída IgG3 a IgG1 komplement aktivují dobře. IgG2 aktivují hůře a IgG4 nemají schopnost aktivovat komplement (Hořejší, Bartůňková, 2009).

2, Cytokiny jsou látky bílkovinné povahy. Slouží k předávání informací. Uplatnění v imunitním systému je regulace růstu, aktivace buněk. Využívají se v léčbě chorob (Hořejší, Bartůňková, 2009).

- 24 -

Obr. 3: Stavba imunoglobulinu (převzato z http://www.symbinatur.com)

2.6.3 Tvorba protilátek

Protilátky se tvoří z buněk, které nazýváme B lymfocyty. V klidovém stádiu má B lymfocyt na svém povrchu určitý typ v membráně vázané protilátky, která je nepostradatelná pro rozeznání specifického antigenu. Slouží jako tzv. receptor. Jakmile nastane situace, že se antigen naváže na receptor, dochází k aktivaci B buňky a následnému dělení, tvorbě a sekreci téže protilátky, která zachytila na povrchu antigen. Pokud se organismus s antigenem setkává poprvé, dochází k primární imunitní odpovědi. Pokud je setkání s antigenem opakované, aktivují se paměťové buňky a sekundární reakce organismu proti antigenu je intenzivnější (převzato z www.med.muni.cz).

- 25 -

Tab. 1: Rozdělení a funkce protilátek (převzato z uia.fnplzen.cz)

Izotyp

IgG, tento typ protilátky má 4 podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 • monomer

Obsah v séru dospělých (g/l) 8-18

Biologický poločas

21 dnů

Funkce

Výskyt v tělesných tekutinách Sérum, intersticiální tekutina

• • • • •

IgA Dva typy: • sérový • slizniční ( dimer)

0,9-3,5

IgM

0,9-2,5

• •

6 dnů

6 dnů

pentametr monomer

Sérum, slzy, sliny, povrch sliznic a jejich sekrety, mléko, pot

•

Sérum, membrána, B lymfocyty

•

•

• •

•

IgD

IgE

• •

ochrana sliznic (neutralizace) opsonizace

aktivace komplementu primární protilátkové reakce při intrauterinní infekci produkovaná plodem receptor pro Ag (BCR)

0,1

3 dny

Sérum, membrána, Blymfocyty

•

receptor pro Ag ( BCR)

3x10-4

2 dny

sérum, intersticiální tekutina, povrch mastocytů a bazofilů

•

ochrana proti parazitům atopická reakce

monomer

monomer

opsonizace neutralizace aktivace komplementu přestup placentou sekundární protilátková reakce

•

- 26 -

2.7 Vyšetření mozkomíšního moku Vyšetření mozkomíšního moku je pomocná vyšetřovací metoda. První lumbální punkci provedl německý lékař Heinrich Quincke v roce 1891. Mozkomíšní mok je bezbarvá čirá tekutina, která se nachází v mozkových komorách a subarachnoideálním prostoru mozku a míchy. Objem mozkomíšního moku v těle dospělého člověka je 120–180 ml, denně je produkováno 500 – 600ml likvoru (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004).

Obr. 4: Schéma cirkulace likvoru (Ambler, 2011).

Funkce likvoru: •

Ochrana mozku a míchy před otřesy.

•

Ochrana před změnou teploty.

•

Ochrana před změnou tlaku.

•

Udržování homeostázy.

•

Udržování optimálního prostředí pro buňky centrální nervové soustavy.

•

Ochrana před patogenními organismy (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004).

- 27 -

Indikace pro vyšetření likvoru: •

Infekční onemocnění (toto vyšetření pomáhá určit původ onemocnění. Jedná-li se o zánět virový, bakteriální, tuberkulózní nebo způsobený kvasinkami)

•

Autoimunitní onemocnění

•

Subarachnoideální krvácení

•

Onkologické onemocnění CNS (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004)

2.7.1 Lumbální punkce

Mozkomíšní mok se k vyšetření nejčastěji získává lumbální punkcí. Je prováděna v místě bederní páteře mezi obratli L4 a L5. Pacient může být při procesu v poloze vsedě s flektovanou páteří nebo v poloze vleže na boku s maximální flexí páteře. K odběru se používají speciální jehly, nazývané spinální či punkční jehly. Po zavedení jehly do subarachoideálního prostoru se vytáhne kovové vlákno (mandrén) z jehly a likvor může volně odkapávat do zkumavky. Objem odebíraného mozkomíšního moku je maximálně 3–4 ml. Po provedení lumbální punkce je doporučován klid na lůžku (Kala, Mareš, 2008).

Obr. 5: Místo bederní páteře, odkud je odebírán mozkomíšní mok. (převzato z http://www.zbynekmlcoch.cz)

Typy buněk, které mohou být v mozkomíšním moku:

- 28 -

•

Lymfocyt → Tyto buňky najdeme ve fyziologickém likvoru.

•

Plazmocyty → Patologický nález u pacientů se zánětlivým onemocněním CNS. Tzn., nejsou přítomny jen u virových zánětů, ale i u zánětů jiné, i neinfekční etiologie.

•

Monocyty → Přítomnost monocytů v likvoru je fyziologická. Aktivované monocyty nebo makrofágy potvrzují patologický děj.

•

Erytrocyty

•

Neutrofilní polymorfonukleáry→Za fyziologických podmínek se vyskytují v likvoru pouze ve zralé, segmentované podobě. Neutrofily jsou přítomné při akutním zánětu nervového systému, zejména u zánětu bakteriálního. Eosinofilní granulocyty jsou vzácným nálezem. Můžeme je sledovat u parazitárních onemocnění.

•

Nádorové buňky (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004).

Typy vyšetření: •

Cytologické

•

Biochemické vyšetření likvoru (základem je stanovení celkové bílkoviny, laktátu, glukózy. Dále se stanovují chloridy, albumin, imunoglobuliny.)

•

Spektrofotometrické vyšetření likvoru

•

Mikrobiologické vyšetření (využívá se metoda PCR, případně stanovení protilátek) (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004).

2.7.2 Nález buněk v likvoru u klíšťové encefalitidy

Nález: Serózní zánět s přítomností mononukleárů a polymorfonukleárů. Z mononukleárů jsou zastoupeny lymfocyty, monocyty, plazmatické buňky. Jedná se o smíšenou pleocytózu. Počet buněk je v desítkách až stovkách /ul, tento typ zánětu se vyskytuje u infekcí virových, infekcí způsobených borreliemi, leptospirami nebo bacily tuberkulózy. Obecně se vyskytuje u nehnisavých zánětů (Ambler, Bednařík, Růžička 2004).

- 29 -

Obecně celkové vyšetření likvoru u virových onemocnění: •

Počet buněčných elementů různý – desítky, stovky

•

Převaha lymfocytů, aktivované formy a přítomnost plazmocytů

•

CB < 1 g/l

•

Laktát < 4,2 mmol/l

•

Glukóza – nedochází ke snížení (Ambler, Bednařík, Růžička, 2004)

- 30 -

2.8 Laboratorní diagnostika Pro diagnostiku virů používáme průkaz přímý, což znamená, že se virus snažíme izolovat nebo prokazovat jeho antigen ve vyšetřovaném vzorku, a nepřímý neboli serologický průkaz, pomocí kterého prokazujeme ve vyšetřovaném vzorku přítomnost protilátek (Votava a kol., 2000).

2.8.1 Přímý průkaz

Ve vyšetřovaném vzorku lze viry vyšetřovat přímo jako 1. Morfologicky typické částice (elektronově mikroskopický průkaz) 2. Antigeny (průkaz virových antigenů serologickou technikou pomocí známých antisér) 3. Typické chemické substance (průkaz virového genomu resp. virových nukleových kyselin) 4. Infekční agens (izolace viru na vhodných objektech) (Votava a kol., 2000)

Ad 1) Pro morfologicky typické částice používáme mikroskopický průkaz, jehož výhodou je rychlý výsledek. Používáme klasické optické mikroskopy, kde se dají sledovat jenom některé viry (Orthopoxvirus). Důležitější je používání elektronového mikroskopu, kde pomocí techniky negativního kontrastu zjistíme viriony přímo ve vyšetřovaném vzorku (Votava a kol., 2000).

- 31 -

Obr. 6: Elektronový mikroskop (převzato z http://ams.fzu.cz)

Ad 2) Průkaz virových antigenů Metody používané pro průkaz antigenů jsou hlavně latex-aglutinační test a reakce se značenými složkami, mezi které patří: •

Imunoenzymatická metoda ELISA

•

Imunofluorescence

•

Radioimunologická analýza RIA

•

Precipitace a příbuzné techniky

•

Elektronová mikroskopie (Votava a kol., 2000)

Ad 3) Průkaz virových nukleových kyselin Díky těmto metodám můžeme dosvědčit, že se ve vzorku nacházejí virově specifické nukleotidy. Typické je využití metody PCR (Votava a kol., 2000).

- 32 -

Ad 4) Izolace viru Izolací viru rozumíme jeho průkaz jako infekčního agens na vhodných objektech. Původně se viry daly zachytit jen na zvířatech. Později bylo zavedeno pěstování virů na kuřecích zárodcích. Dnes jsou nejdůležitějším vnímaným objektem různé druhy tkáňových (přesněji buněčných) kultur. Používají se pokusná zvířata, kuřecí zárodky, tkáň buněčné kultury (Votava a kol., 2000).

2.8.2 Nepřímý průkaz

Výhody nepřímého průkazu jsou rychlost, jednoduchost a nižší cena. Nepřímý průkaz zahrnuje komplement fixační reakci (KFR), precipitaci, neutralizační test, hemaglutinačně inhibiční test (HIT) a reakce se značenými složkami (Votava a kol., 2000).

Druhy neutralizačních testů •

Test zábrany CPE na tkáňových kulturách

•

Neutralizační testy na zvířatech

•

Test zábrany hemadsorpce

•

Test snížení počtu plaků

•

Test inhibice metabolismu

Reakce se značenými složkami: •

Nepřímá imunofluorescence

•

Enzymová imunoanalýza

•

Westernblot

Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy se provádí zejména pomocí metod PCR (RT-PCR), ELISA, KFR, HIT, VNT (Votava a kol., 2000).

- 33 -

2.8.3 Virus neutralizační test (VNT)

Tento test je drahý, manuálně náročný, ale je velice specifický. Principem tohoto testu je vazba neutralizačních protilátek na virus a zbavení infekčnosti, což je třeba dokázat na vhodných vnímaných objektech (Votava a kol., 2000). Nejčastějším typem je test zábrany cytopatického efektu na tkáňových kulturách, který se může provádět dvojím způsobem. 1. První způsob se odvíjí od konstantního ředění séra se sériově ředěným virem. Jakmile uplyne stanovená doba, po kterou trvala neutralizace, připravenou směsí naočkujeme buněčné kultury. Používaná kontrola se připravuje stejným způsobem, ale na místo séra použijeme ředící roztok. Rozdíl titrů musí být minimálně 50 – ti násobný. 2. Druhý způsob se odlišuje v ředění viru, které je konstantní a ředění séra je různé (sériové). Opět necháme proběhnout neutralizaci a následně očkujeme. Dokládá se, že tento postup je přesnější. Za titr séra považujeme ředění, které z jedné poloviny neutralizuje účinek pracovní dávky viru, označuje se jako ND50, padesáti procentní neutralizační dávka. ND50 = poloviční neutralizační dávka (Votava a kol., 2000). Sledujeme snížený titr reakce v porovnání s kontrolním vzorkem. Výsledek se označuje jako neutralizační index (NI), který vyjadřuje počet ND50 příslušného viru, neutralizovaného vyšetřovaným sérem (Celer, 2002).

- 34 -

2.8.4 Hemaglutinačně inhibiční test (HIT) Princip HIT je založen na faktu, že protilátka, která je navázána na přítomném hemaglutinačním viru, mu nepovolí aglutinovat krvinky, tzn., zastavuje virovou hemaglutinaci. HIT se dá využívat pouze u hemaglutinujících virů. HIT využíváme pro detekci antigenů i protilátek. Pomocí tohoto testu vyšetřujeme KE a dále např. spalničky.

Hodnocení reakce •

Při pozitivní reakci dochází k zábraně hemaglutinace.

•

Při negativní reakci dochází k hemaglutinaci.

•

Titr protilátek je obrácená hodnota nejvyššího ředění séra, kde dochází k zábraně hemaglutinace (Celer, 2006)

2.8.5 Komplement fixační reakce (KFR) Nejčastěji se průkaz protilátek komplement fixační reakcí popisuje jako vazba komplementu. Nepostradatelnou součástí je komplement, který se váže na vytvářející se imunokomplex antigen – protilátka. Tato reakce není viditelná pouhým okem, proto se přidají látky, které reakci zviditelní. V následné fázi KFR se dodá indikátorový neboli hemolytický systém, což je systém, který se přichystá smíšením shodných objemů dobře propraných beraních erytrocytů s naředěným amboceptorem. Amboceptor je králičí protilátka proti beraním krvinkám. Následují dvě situace: V první fázi reakce se naváže komplement a přidané erytrocyty zůstanou beze změny. Tento jev nazýváme jako tzv. zábrana hemolýzy. Reakce je pozitivní. Pokud protilátka přítomna nebyla, následně se nemohl vytvořit imunokomplex antigen – protilátka,

- 35 -

komplement zůstal volný, a tudíž se navazuje na hemolytický systém a vzniká jev, kterým je hemolýza krvinek. Reakce je negativní.

Zdroj komplementu je morčecí sérum. Komplement je velmi citlivý na teplotu, proto ho musíme uchovávat hluboko zmražený. Reakce KFR probíhá ve dvou fázích. V první fázi necháme komplement vázat 50 min /42°C. V druhé fázi dochází k přidání indikátorového systému a následně inkubujeme 10min/42°C. (Votava a kol., 2000).

V akutní fázi infekčního onemocnění je doporučeno vyšetřovat tzv. párová séra, tzn., první odběr má být proveden na začátku onemocnění, druhý odběr za 2–3 týdny, dvojice sér se vyšetřují najednou v jedné reakci (převzato z http://labmet.zshk.cz). Pokud je onemocnění přítomno, je typická tzv. serokonverze, což je tvoření protilátek v rekonvalescentním séru, nebo musí být přítomno 4násobné zvýšení hladiny protilátek v rekonvalescentním séru. Protilátky se v sérech pozitivních pacientů vyšetřují ještě během několika následných měsíců. Hladina protilátek by měla klesat a úplně vymizet (Votava M., 2004c2003).

- 36 -

2.8.6 Enzymová imunoanalýza (ELISA) Je imunoanalytická metoda, která je založena na specifické reakci antigenu s protilátkou.

Obr. 5: Zde jsou dva příklady, jak může být metoda ELISA prováděna. Ve vrchní části je na mikrotitrační destičku (MTD) navázána protilátka, na níž se váže antigen. Provádí se u vyšetření, kde se zjišťuje přítomnost antigenu ve vzorku. V spodní části obrázku je na MTD navázán antigen, na který se váže protilátka. Provádí se u vyšetření, kde se zjišťuje přítomnost protilátky ve vzorku. Capture antibody → protilátka Viral antigen → virový antigen Second antibody → druhá protilátka Indicator → indikátor Antibody in sample → protilátky ve vzorku (převzato z http://www.virology.ws)

- 37 -

Obecně imunoanalytické metody rozdělujeme podle •

Uspořádaní reakce o Kompetitivní o Nekompetitivní

•

Prostředí o Homogenní imunoanalýza (detekujeme přímo v reakční směsi) o Heterogenní imunoanalýza (využívá se ve většině metod)

•

Techniky, která je použita k detekci signálu o Fluoroimunoanalýza, o

Enzymoimunoanalýza

o Radioimunoanalýza o Luminiscenční imunoanalýza •

Použití značky

2.4.6.1 Obecně kompetitivní stanovení Ve vyšetřovaném vzorku je stanovovaný antigen a značený antigen. Tyto dva antigeny mezi sebou soutěží o vazebná místa na protilátce, která je navázaná na pevném povrchu např. mikrotitrační destičky. Výsledek je nepřímo úměrný a kalibrační křivka má hyperbolický tvar (Dastych, Breinek, 2011).

2.4.6.2 Obecně nekompetitivní stanovení – neboli sendvičové Antigen, který stanovujeme ze vzorku, reaguje se dvěma protilátkami, jež jsou v reakci v nadbytku. První protilátka je navázaná na MTD a druhá protilátka se dává do vyšetřovaného séra v podobě konjugátu. Výsledek je přímo úměrný. Křivka má tvar parabolický (Dastych, Breinek, 2011).

- 38 -

Obr. 7: Grafy popisující průběh kompetitivního a nekompetitivního uspořádání u metody ELISA (Dastych, Breinek, 2011).

- 39 -

2.9 Cíl práce V bakalářské práci jsou zpracovány počty vyšetření specifických protilátek a záchyt onemocnění klíšťové encefalitidy v serologické laboratoři OKM FN Brno v roce 2012. Cílem práce bylo: 1. Stanovení pozitivity specifických protilátek třídy IgG a IgM proti viru klíšťové encefalitidy v souboru pacientů vyšetřeném během roku 2012. 2. Charakterizace souboru pacientů s pozitivním průkazem specifických protilátek z hlediska pohlaví, věku a délky přetrvávání pozitivity specifických protilátek. 3. Sledování dynamiky specifických protilátek proti viru klíšťové encefalitidy a stanovení protilátkového profilu u pacientů s akutní klíšťovou encefalitidou a u pacientů po dříve prodělané infekci.

Součástí práce jsou kazuistiky reprezentující typický profil pacienta s akutní klíšťovou encefalitidou, pacienta se současnou infekcí klíšťovou encefalitidou a neuroborreliózou a pacienta s dlouhodobě přetrvávajícími protilátkami třídy IgM.

- 40 -

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Soubor pacientů a vzorků V období 1. 1. 2012 až 31. 12. 2012 bylo v serologické laboratoři Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno vyšetřeno celkem 2537 vzorků sér na přítomnost protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgG a IgM. Z celkového souboru 2537 vzorků sér byla vyčleněna podskupina 529 vzorků s prokázanou pozitivitou alespoň v jedné třídě protilátek. Tato podskupina byla dále charakterizována dle pozitivity IgG, resp. IgM protilátek. Ze souboru byla dále vyčleněna podskupina 99 vzorků sér s pozitivitou IgM protilátek, ve které bylo na základě anamnestických, klinických a dalších laboratorních údajů vyhodnoceno, zda se jednalo o akutní infekci nebo přetrvávající pozitivitu protilátek po dříve prodělané infekci. Zdrojem informací byl laboratorní informační systém MLab.

- 41 -

3.2 Detekce specifických protilátek proti viru klíšťové encefalitidy Stanovení protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgG a IgM bylo provedeno metodou ELISA ve Fakultní nemocnici v Brně na Oddělení klinické mikrobiologie. K vyšetření byly použity komerční soupravy EIA TBE Virus IgG a EIA TBE Virus IgM imunoenzymatické soupravy ke stanovení IgG a IgM protilátek proti viru klíšťové encefalitidy v lidském séru, plazmě nebo mozkomíšním moku od firmy TestLine Clinical Diagnostics. Sama jsem měla možnost si vyšetření na klíšťovou encefalitidu v serologické laboratoři OKM FN Brno vyzkoušet pod dohledem kvalifikovaných pracovníků.

Obr. 8: Obrázek komerční soupravy TestLine Clinical Diagnostics (převzato z http://www.testlinecd.cz)

3.2.1 Základní princip testu

V soupravě je připravena mikrotitrační destička, na jejímž povrchu je navázán antigen viru KE. Po dávkování naředěných vzorků a kontrol na destičku dochází k vytvoření imunokomplexů, tzn. vazbě specifické protilátky IgM nebo IgG na antigen viru KE. Následně dochází k promytí, inkubaci, přidání konjugátu, promytí a přidání zastavovacího roztoku. Detekce probíhá spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm.

- 42 -

3.2.2 Vybavení potřebné ke stanovení protilátek •

Plnohodnotná souprava, ve které nalezneme potaženou destičku, negativní a pozitivní kontrolu, cut-off, konjugát, ředící, promývací a zastavovací roztoky, substrát.

•

Jedno a vícekanálové pipety

•

Špičky

•

Promývací zařízení

•

Stopky

•

Termostat s nastavenou teplotou na 37°C

•

Fotometr pro mikrotitrační destičky

3.2.3 Příprava pracovních roztoků

Příprava pracovních vzorků probíhá u vyšetření protilátek IgM a IgG totožně. •

Ředění promývacího roztoku → Promývací roztok se ředí 1+19 (např: 100ml promývacího roztoku a 1900ml destilované vody)

•

Konjugát se neředí.

•

TMB-Complete, jednosložkový chromogenní substrátový roztok se neředí.

3.2.4 Ředění vzorků •

Ředění vzorků sér a plazmy → Důkladně promíchané vzorky séra a plazmy se ředí 1+100 Ředicím roztokem vzorků: 10µl vzorku + 1ml Ředícího roztoku vzorků. Naředěný roztok se dobře promíchá a u IgM protilátek se ještě inkubuje 10 minut při laboratorní teplotě.

- 43 -

3.2.5 Pracovní postup u vyšetřování přítomnosti IgM a IgG protilátek

1.

Kontroly a ředěné vzorky se dávkují podle pracovního schématu přiloženého v návodu. •

Pipetuje se 100 µl Ředícího roztoku vzorků do jamky A1.

•

Pipetuje se 100 µl Negativní kontroly do 1 jamky.

•

Pipetuje se 100 µl CUT-OFF do 2 jamek.

•

Pipetuje se 100 µl Pozitivní kontroly do 1 jamky.

•

Pipetuje se 100 µl testovaných vzorků do zbývajících jamek.

2. Destička se přikryje víčkem a inkubace probíhá 30 minut při 37°C. 3.

Obsah jamek se odsaje a 5krát promyje pracovním promývacím roztokem s intervaly mezi jednotlivými kroky po 1 minutě. Jamky se plní po horní okraj. Na závěr se důkladně vyklepou zbytky roztoku do savého materiálu.

4. Do všech jamek se dávkuje 100 µl Konjugátu. 5. Destička se přikryje víčkem a inkubace probíhá 30 minut při 37°C. 6. Obsah jamek se odsaje a 5krát promyje pracovním promývacím roztokem s intervaly mezi jednotlivými kroky po 1 minutě. Jamky se plní po horní okraj. Na závěr se důkladně vyklepou zbytky roztoku do savého materiálu. 7. Do všech jamek se dávkuje 100 µl jednosložkového substrátu TMB-Complete. 8. Destička se přikryje víčkem a inkubace probíhá 30 minut při 37°C. 9. Reakce se zastaví přidáním 100 µl Zastavovacího roztoku ve stejném pořadí a intervalech, jako byl dávkován substrát. 10. Na fotometru při vlnové délce 450 nm se změří intenzita zbarvení roztoku v jamkách proti blanku (jamka A1), a to do 30 minut po zastavení reakce

- 44 -

Obr. 9:: Obrázek pracovního schématu MTD. EIA TBE Virus IgG – Imunoenzymatická O souprava ke stanovení protilátek proti viru klíšťové encefalitidy v lidském séru, plazmě nebo mozkomíšním moku, TestLine Clinical Diagnostics. BL: 100µl Ředicího roztoku vzorků (blank) NK: 100µl Negativní kontroly CO: 100µl 00µl CUT-OFF CUT OFF PK: 100µl Pozitivní kontroly TV1-x: x: 100µl ředěného testovaného vzorku

3.2.6 Interpretace výsledků

Sérum a citrátová plazma – interpretace v indexech pozitivity (IP) Výpočet: Pro vzorky séra a citrátové plazmy se absorbance testovaného vzorku dělí průměrnou absorbancí CUT-OFF CUT OFF naměřenou v téže sérii vyšetření:

Index pozitivity (IP)

Hodnocení

Menší než 0,9

Negativní

0,9 0,9-1,1

Hraniční

Větší než 1,1

Pozitivní

- 45 -

3.3 Zhodnocení výsledků-celkový počet vyšetření

o Celkový počet vyšetření 2537 o 2008 vzorků bylo IgG negativní, IgM negativní o 361 vzorků bylo IgG pozitivní, IgM negativní (stav po očkování nebo po dříve prodělané infekci) o 1 vzorek byl IgG negativní, IgM pozitivní (akutní infekce) o 167 vzorků bylo IgG pozitivní, IgM pozitivní (akutní infekce nebo stav po dříve prodělané infekci)

Graf 1: Celkový počet vyšetření

Celkový počet vyšetření 2537 2500

Počet vyšetření

2000

2008

1500

1000

500

361 167 1

0 IgG negativní, IgM negativní

IgG pozitivní, IgM negativní ( Stav po očkování nebo po dříve prodělané infekci)

IgG negativní, IgM pozitivní ( Akutní infekce)

IgG pozitivní, IgM pozitivní (Akutní infekce nebo stav po prodělané infekci)

Z celkového počtu 168 vzorků s pozitivním průkazem protilátek třídy IgM byla vybrána podskupina 99 vzorků (za účelem možností srovnání byla vyloučena opakovaná vyšetření

- 46 -

u stejných pacientů – hodnocena pouze první vyšetření v daném kalendářním roce). roce V této podskupině bylo na základě anamnestických, klinických a dalších laboratorních údajů vyhodnoceno zda se jednalo o akutní infekci nebo přetrvávající pozitivity protilátek po dříve vyhodnoceno, prodělané infekci. infekci.

Graf 2: Podíl odíl pozitivních a negativních negativních výsledků proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgG a IgM

Celkový počet vyšetření 2537

IgG negativní, IgM negativní 79%

IgG pozitivní, IgM pozitivní (Akutní infekce nebo stav po prodělané infekci) 7%

IgG negativní, IgM pozitivní ( Akutní infekce) 0%

IgG pozitivní, IgM negativní ( Stav po očkování nebo po dříve prodělané infekci) 14%

- 47 -

3.3.1 Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek

Pacienti byli rozděleni do skupin na základě výsledků v laboratorním informačním systému. Pacienti po dříve prodělané infekci měli v LIS (MLab) uvedena dřívější vyšetření s pozitivitou IgM protilátek. Jednalo se tedy o stav po dříve prodělané infekci. U pacientů s akutní infekcí se jednalo o první vyšetření, zpravidla doprovázené i vyšetřením likvoru s odpovídajícím serologickým nálezem, tzn. pozitivitou IgM.

•

U 48 pacientů zjištěny přetrvávající protilátky po dříve prodělané infekci (IgG pozitivní, IgM pozitivní)

•

U 50 pacientů zjištěna akutní infekce ( IgG pozitivní, IgM pozitivní)

•

U 1 pacienta zjištěna akutní infekce ( IgG negativní, IgM pozitivní)

- 48 -

Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek podle pohlaví •

Ženy 48

•

Muži 51

Graf 3: Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek podle pohlaví

Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek podle pohlaví 52

počet zastoupení

51 50 49 48 47 46 Ženy

Muži

- 49 -

Graf 4: Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek podle typu infekce

Rozdělení pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek podle typu infekce 50 48 50

Počet pacientů

40

30

20

10

1 0 Pacienti s přetrvávajícími protilátkami po dříve prodělané infekci

Pacienti s akutní infekcí

Pacient s akutní infekcí, IgG negativ., IgM pozitiv.

- 50 -

3.3.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku

Graf č. 5 popisuje četnost vyšetření pacientů s pozitivním průkazem IgM protilátek na klíšťovou encefalitidu v závislosti na jejich věku. Na grafu je červenou barvou znázorněný věk 37 a 39 let. V těchto uvedených věkových skupinách bylo provedeno nejvíce (5) vyšetření. Další nejčastěji vyšetřovanou věkovou skupinou (4 vyšetření) byl věk 12,38,47,57, který je znázorněn tmavě modrou barvou.

Graf 5:: Počet pacientů v jednotlivých věkových období

Počet pacientů v jednotlivých věkových období 6

5

3

2

1

0 Věk pacienta 7 Věk pacienta 9 Věk pacienta 12 Věk pacienta 17 Věk pacienta 19 Věk pacienta 21 Věk pacienta 25 Věk pacienta 27 Věk pacienta 29 Věk pacienta 31 Věk pacienta 35 Věk pacienta 37 Věk pacienta 39 Věk pacienta 41 Věk pacienta 45 Věk pacienta 47 Věk pacienta 49 Věk pacienta 51 Věk pacienta 53 Věk pacienta 55 Věk pacienta 57 Věk pacienta 59 Věk pacienta 61 Věk pacienta 65 Věk pacienta 69 Věk pacienta 71 Věk pacienta 76 Věk pacienta 82

Počet pacientů

4

- 51 -

Tento graf je podobný, zachycuje jednotlivá věková rozmezí, a počet pacientů, kteří v daném období byli vyšetřeni. Nejvíce vyšetření bylo provedeno mezi 20. – 29. rokem a mezi 40. – 49. rokem, což je na grafu znázorněno tmavě modrou barvou.

Graf 6: Počet pacientů v daném věkovém rozmezí

Počet pacientů v daném věkovém rozmezí 25 21 20 20

Počet pacientů

17 15 11

11 9

10

5 5 2 0 pod 9

deset - 19 20 - 29

30 - 39

40 - 49

Věkové rozmezí

50 - 59

60 - 69

70 - 79

- 52 -

3.4 Zhodnocení výsledků – akutní fáze onemocnění onemocněn V předchozí části bylo v grafu znázorněno, že do akutní fáze spadá skupina 50 pacientů, které v této části rozdělíme podle pohlaví a podle počtu vyšetřených pacientů v závislosti na věku.

3.4. Rozdělení podle 3.4.1 podle pohlaví •

Ženy 26

•

Muži 24

Graf 7:: Rozdělení pacientů v akutní fázi podle pohlaví

Zastoupení pohlaví u pacientů v akutní fázi 27

Počet zastoupení

26

25

24

23

22

21 Ženy

Muži

- 53 -

3.4.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku

Vyšetřovaných pacientů s akutní infekcí bylo dohromady 50. Z toho nejmladší pacient byl ve věku 9 let a nejstarší pacient byl vyšetřen ve věku 81 let. Nejčastěji bylo vyšetření provedeno ve věku 47 let – 3 pacienti, na grafu znázorněno zelenou barvou. Ve věku 37,38,49 let, bylo vyšetření provedeno u 2 pacientů, na grafu znázorněno barvou fialovou.

Graf 8: Počet vyšetřených pacientů v závislosti na věku

Počet vyšetřených pacientů v závislosti na věku 5

Počet pacientů

4

3

2

1

0

- 54 -

3.5 Přítomnost přetrvávajících protilátek IgG a IgM V této skupině se nachází 48 pacientů, rozdělíme je podle pohlaví, závislosti počtu vyšetřených pacientů na věku a podle délky přetrvávající pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci.

3.5.1 Rozdělení podle pohlaví •

Ženy 21

•

Muži 27

Graf 9: Rozdělení pacientů s přetrvávající pozitivitou IgM protilátek po prodělané infekci podle pohlaví

Rozdělení pacientů s přetrvávající pozitivitou IgM protilátek po prodělané infekci podle pohlaví 27

Počet zastoupení

26 25 24 23 22 21 20 Ženy

Muži

- 55 -

3.5.2 Rozdělení počtu vyšetřovaných pacientů vzhledem k věku

Vyšetřovaných pacientů bylo dohromady 48. Z toho nejmladší vyšetřovaný pacient byl ve věku 7 let. Nejstaršímu pacientovi bylo 82 let. Nejčastěji bylo vyšetření provedeno ve věku 35 let, na grafu znázorněno červenou barvou. Vyšetření v této věkové skupině podstoupili 3 pacienti. Ve věku 12,23,37,44,50,57,58,59,61,66,67 let byli vyšetřeni 2 pacienti, na grafu znázorněno barvou šedou.

Graf 10: Počet vyšetřených pacientů v závislosti na věku

Počet vyšetřených pacientů v závislosti na věku 4

2

1

0 Věk pacienta 7 8 12 13 17 18 19 23 25 26 27 29 32 35 36 37 38 40 44 45 48 50 51 54 55 56 57 58 59 61 63 66 69 71 72 82

Počet pacientů

3

- 56 -

3.5.3 Rozdělení podle délky přetrvávání pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci Na tomto grafu je znázorněna délka trvání pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci. Nejčastější délka pozitivity je 15 měsíců a 14 měsíců, barevně znázorněno světle zelenou barvou. Nejkratší délka pozitivity jsou 4 měsíce a nejdelší 68 měsíců, barevně znázorněno tmavě zelenou barvou.

Graf 11: Délka trvání pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci v závislosti na počtu pacientů

Délka trvání pozitivity protilátek ve třídě IgM po prodělané infekci v závislosti na počtu pacientů 10 9 8

Počet pacientů

7 6 5 4 3 2 1 0

Doba trvání v měsících

- 57 -

3.6 Kazuistiky 3.6.1 Pacient č. 1

Jedná se o muže ve věku 53 let. Pacient byl přijat na Kliniku infekčních chorob ve FN Brno, vzorky byly vyšetřeny na Oddělení klinické mikrobiologie pro podezření na klíšťovou encefalitidu. Vzorky byly odebrány 11. 10. 2012, jednalo se o sérum a likvor. Vyšetřované vzorky byly zpracovány pomocí metody ELISA. Výsledky pro klíšťovou encefalitidu: •

Sérum →pozitivní

•

Likvor → pozitivní

•

Index pozitivity u séra → pozitivní (KE IgG = 6,5, KE IgM = 7,2).

•

Index pozitivity u likvoru → pozitivní (KE IgG=5,1, KE IgM = 6,2).

•

Cytologický nález v likvoru ukázal přítomnost mononukleárů 12/ µl a polymorfonukleárů 54/ µl→značí serózní zánět.

•

Anamnéza pacienta: Klíšťata opakovaně

•

Nynější onemocnění: zvýšená teplota, bolesti hlavy, po několikadenním zlepšení horečka, spavost, světloplachost, nausea, zvracení

•

Diagnόza: Klíšťová meningoencefalitida s dvoufázovým průběhem

- 58 -

3.6.2 Pacient č. 2

Jedná se o muže ve věku 48 let. Pacient byl přijat na Kliniku infekčních chorob ve FN Brno, vzorky byly vyšetřovány na Oddělení klinické mikrobiologie kvůli podezření na klíšťovou encefalitidu a borreliόzu. Vzorky byly odebrány 17. 11. 2012. Jednalo se o krev a likvor. Vyšetření na KE a borreliόzu bylo provedeno pomocí metody ELISA.

Výsledky pro klíšťovou encefalitidu: •

krev → pozitivní

•

likvor → pozitivní

•

index pozitivity u krve → pozitivní (KE IgG = 4,1, KE IgM = 4,6)

•

index pozitivity u likvoru → pozitivní (KE IgG = 3,4, KE IgM = 3,8)

Výsledky pro borreliόzu: •

krev → pozitivní

•

likvor → pozitivní

•

pozitivita intratekální syntézy IgG

•

Anamnéza: klíšťata opakovaně

•

Nynější onemocnění: zvýšená teplota, bolest hlavy

•

Diagnόza: klíšťová meningoencefalitida v kombinaci s neuroborreliόzou

- 59 -

3.6.3 Pacient č. 3

Třetí pacient je žena ve věku 18 let. Pacientka byla přijata na Klinice dětských infekčních chorob v Dětské nemocnici v Brně. Vzorky byly vyšetřovány ve Fakultní nemocnici v Brně na Oddělení klinické mikrobiologie kvůli podezření na klíšťovou encefalitidu. Pacientka byla vyšetřována opakovaně. Pozitivita protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgM v séru přetrvává 27 měsíců po prodělaném onemocnění. (První odběr proveden 12. 7. 2010 a poslední 2. 10. 2012, kdy byly IgM protilátky stále pozitivní). Pro vyšetření použita metoda ELISA. Výsledky pro klíšťovou encefalitidu: •

sérum z 12.7.2010→ pozitivní. Silně zvýšený index pozitivity u IgM protilátek 25,47. U IgG též pozitivní 12,04.

•

sérum z 25.1.2011→ pozitivní. Index pozitivity u IgM protilátek klesl na 8,02. IgG 12,51.

•

sérum z 7.6.201 → pozitivní. Index pozitivity u IgM protilátek opět klesl na 4,0. IgG 12,2.

•

sérum z 2.10.2012→ pozitivní. Index pozitivity u IgM protilátek klesl na 2,2. IgG 8,1.

•

Anamnéza: opakovaně klíště

•

Nynější onemocnění ke dni 12. 7. 2010 : bolest hlavy, zvýšená teplota, zvracení, klíště v anamnéze.

•

Likvor ke dni 12. 7. 2010 : mononukleáry 309/µl , polymorfonukleáry 96/ µl

•

Diagnόza: Stav po prodělané akutní klíšťové encefalitidě v 7/2010. Dlouhodobé přetrvávání pozitivity IgM protilátek po prodělaném onemocnění (>2 roky).

- 60 -

4 ZÁVĚR Ve své bakalářské práci jsem se zabývala tématem klíšťová encefalitida. Po nastudování odborné literatury jsem zjistila, že toto téma je v dnešní době velice diskutované a aktuální. Jedná se o závažné onemocnění vyskytující se ve střední Evropě včetně České republiky. Pokud se nezachytí v časných stádiích, může napáchat velké škody a v krajních případech může pacient tomuto onemocnění podlehnout a zemřít. Specifická léčba klíšťové encefalitidy není k dispozici, proto se onemocnění léčí symptomaticky. V experimentální části své bakalářské práce jsem se věnovala záchytu protilátek proti viru klíšťové encefalitidy ve třídě IgM a IgG ve vyšetřovaném souboru pacientů. Celkový počet vyšetření byl 2537. U 361 vzorků byly detekovány pozitivní protilátky ve třídě IgG a negativní protilátky ve třídě IgM, u jednoho vzorku byly detekovány negativní protilátky ve třídě IgG a pozitivní protilátky ve třídě IgM a u 167 vzorků byly detekovány pozitivní protilátky v obou sledovaných třídách. Z tohoto souboru jsem vybrala podskupinu 99 pacientů s pozitivitou IgM protilátek. Tuto podskupinu jsem na základě přetrvávající pozitivity IgM protilátek rozdělila na pacienty s akutní fází a pacienty s dlouhodobou přetrvávající pozitivitou IgM protilátek. U akutní fáze bylo vyšetřeno 26 žen a 24 mužů. Největší počet vyšetření byl proveden u pacientů ve věku 47 let. Nejmladší pacient, který měl akutní infekci KE byl ve věku 9 let. Nejstarší pacient byl ve věku 81 let. Z výsledků je zřejmé, že se jedná o velké věkové rozmezí, a že onemocnění může postihnout člověka v jakémkoliv věku. Přetrvávající protilátky ve třídě IgM byly diagnostikovány u 48 pacientů, z toho 21 žen a 27 mužů. Nejčastější délka přetrvávající pozitivity byla 14–15 měsíců. Avšak v našem souboru se vyskytli i pacienti, u kterých byla pozitivita přítomna přes 2 roky. Nejdelší doba přetrvávání protilátek IgM byla 68 měsíců, což je 5 let a 8 měsíců. Právě dlouhodobé přetrvávání pozitivity IgM protilátek po dříve prodělaném onemocnění by mohlo být nesprávně interpretováno jako akutní KE, a to na základě pozitivity IgM, které jsou obecně spojovány s akutní fází onemocnění, přestože by se mohlo u KE jednat o pouhou přetrvávající pozitivitu protilátek třídy IgM po dříve prodělaném onemocnění. Literární zdroje a studijní texty zpravidla udávají, že u infekčních onemocnění IgM protilátky vymizí během několika týdnů až maximálně měsíců, u KE je tomu jinak, což bylo zjištěno analýzou opakovaných vyšetření u pacientů po prodělané KE.

- 61 -

5 LITERATURA 1, AMBLER Z., BEDNAŘÍK J., RŮŽIČKA E., Klinická neurologie. Vyd. 2. Praha: Triton, 2008, 976 s. ISBN 978–807-3871–574

2, BANZHOFF A., BRÖKER M., ZENT O., Protection against tick-borne encephalitis (TBE) for people living in and travelling to TBE-endemic areas. Travel Med, 2008, [cit. 2013–04-18]. Infect. Dis. 4210: 1040–1055.

3, BÁRTOVÁ E., KLIMEŠ J., Zoologie. Vydání 2., přepracované. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2010, ISBN 978–80-7305–107-5. 4, BRÖKER M., KOLLARITSCH H., After a tick bite in a tick-borne encephalitis virus endemic area: current positions about post-exposure treatment. Vaccine, 2008, [cit. 2013–035]. 26: 863–868. 5, CELER, V., Praktika z veterinární virologie 2002 (2. přepracované vydání) VÚVeL, Brno, 75 stran. ISBN 80–902963-2–7. 6, DASTYCH M., BREINEK P., Klinická biochemie: bakalářský obor Zdravotní laborant. 2. Přepracované vydání. Brno: Masarykova univerzita, 2011, 232 s. ISBN 978–80-87192–184. 7, DUMPIS U., CROOK D., OKSI J., Tick-borne encephalitis. Clin. Infect, 1999, [cit. 2013–03-11]. Dis. 28: 882–890.

8, GRITSUN T. S., HEINZ F. X., LABUDA M., LASHKEVICH V. A., LOKTEV V., GÜNTHER G. HAGLUND M., Tick-borne encephalitis – pathogenesis, clinical course and long-term follow-up. Vaccine, 2003, [cit. 2013–03-12]. 21, Suppl. 1: 11–18.

9, GÜNTHER G., HAGLUND M., LINDQUIST L., FORSGREN M., SKÖLDENBERG B., Tick-borne encephalitis in Sweden in relation to aseptic meningo-encephalitis of other etology: a prospective study of clinical course and outcome. J. Neurol, 1997, [cit. 2013–0210]. 244: 230–238.

- 62 -

10, HEINZ F. X., Molecular aspects of TBE virus research. Vaccine, 2003, [cit. 2013–0316]. 21, Suppl. 1: 3–10. 11, HOŘEJŠÍ V., BARTŮŇKOVÁ J., Základy imunologie. 4. vydání. Praha: Triton, 2009, 316 s. ISBN 978–807-3872–809.

12, HUBÁLEK Z., RUDOLF I., Mikrobiální zoonózy a sapronózy, 2007, 2. vydání (učební text), Masarykova univerzita, Brno. 176 s.

13, CHARREL R. N., ATTOUI H., BUTENKO A. M., CLEGG J. C., DEUBEL V., FROLOVA T. V., GOULD E. A., GRITSUN T. S., HEINZ F. X., LABUDA M., LASHKEVICH V. A., LOKTEV V., LUNDKVIST A., LVOV D. V., MANDL C. W., NIEDRIG M., PAPA A., PETROV V. S., PLYUSNIN A., RANDOLPH S., SUSS J., ZLOBIN V. I., a LAMBALLERIE X. DE., Tick-borne virus diseases of human interest in Europe. Clinical Microbiology and Infection [online]. 2004, roč. 10, č. 12, s. 1040–1055 [cit. 2013–04-16]. ISSN 1198 – 743x. DOI: 10.1111/j. 1469 – 0691. 2004. 01022. x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1469-0691.2004.01022.x. 14, JÍROVEC O., BEDRNÍK P., JÍRA J., KMETY E., KOTRLÁ B., KRAMÁŘ J., KUČERA K., KULDA J., PŘÍVORA M., ROSICKÝ B., Parasitologie pro lékaře, 1977, 3. vydání. Avicenum, Praha. 798 s. 15, JOHNSTON L. J., HALLIDAY G. M., KING N. J. C., Langerhans cells migrate to local lymph nodes following iutaneous infection witch an arbovirus. 2000, J. Invest. Dermatol. 114: 560–568.

16,

KAISER

R.,

Clinical

description,

2007,

Dostupné

z:

http://www.tbe-

info.com/upload/medialibrary/Monograph_TBE.pdf

17, KALA M., MAREŠ J., Lumbální punkce a mozkomíšní mok. 1. vyd. Praha: Galén, 2008, viii, 137 s. ISBN 978–807-2625–680. 18, KUNZ C., HOFMANN H., HEINZ F. X., DIPPE H., Efficacy of Vaccination Against Tick-Borne Encephalitis. Wien. Klin. Wochenschr, 1980, [cit. 2013–04-12]. 92: 809–813.

- 63 -

19, KUNZE U., Is there a need for a travel vaccination against tick-borne encephalitis? Travel Med, 2008, [cit. 2013–04-10]. Infect. Dis. 6: 380–383.

20, LINDQUIST L., VAPALAHTI O., Tick-borne encephalitis. Lancet, 2008, [cit. 2013– 03-11]. 371: 1861–1871. 21, PATFYZ., Imunita. 2008. Dostupné z: http://www.med.muni.cz/patfyz/tmbg/Protilatky_MM.pdf

22, RAJČÁNI J., ČIAMPOR F., Lekárska virológia. Veda, 2006, Bratislava. 573 s.

23, RENDI-WAGNER P., Risk and prevention of tick-borne encephalitis in travelers. J. Travel, 2004, [cit. 2013–03-11]. Med. 11: 307–312. 24, RENDI-WAGNER P., PAULKE-KORINEK M., KUNDI M., WIEDERMANN U., LAABER B., KOLLARITSCH H., Antibody persistence following booster vaccination against tick-borne encephalitis: 3-year post-booster follow-up. Vaccine, 2007, [cit. 2013–035]. 25: 5097–5101.

25, SCÖNDORF I., TERNA G., OROSZLÀN G., NICOLAY U., BANZHOFF U., ZENT O., Tick-borne encephalitis (TBE) vaccination in children: advantage of rapid immunization schedule (i. e., days 0, 7, 21). Hum. Vaccine, 2007, [cit. 2013–04-9]. 3: 42–47. 26, SCHÖNDORF I., BERAN J., CIZKOVA D., LESNA V., BANZHOFF A., ZENT O., Tick-borne vaccination: applying the most suitable vaccination schedule. Vaccine, 2007, 25: 1470–1475. 27, VOTAVA M., a kolektiv. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003, 495 s. ISBN 80–902-8966–5. 28, VOTAVA M., Vyšetřovací metody v klinické mikrobiologii a klinické imunologii: výukový CD ROM pro zdravotnické školy. 1. vydání. Hradec Králové: Střední zdravotnická škola a Vyšší zdravotnická škola, 2004c2003, 1 CD-ROM. ISBN 80–903414-0–3.

- 64 -

29, VOTAVA M., Lékařská mikrobiologie. 1. vydání. Brno: Masarykova univerzita, 2000, 309 s. ISBN 80–210-2272–8.

Internetové zdroje

Obrázek č. 1:

http://www.helago-cz.cz/product/kliste-obecne-ixodes-ricinus/

Obrázek č. 2:

http://www.ezoo.cz/zvire.php?zvire_id=77

Obrázek č. 3:

http://www.symbinatur.com/Protilatky-clanek-60.html

Obrázek č. 4:

http://ams.fzu.cz/tem2cz.php

Obrázek č. 5:

http://www.virology.ws/2010/07/16/detection-of-antigens-or antibodies-by-elisa/

Obrázek č. 6:

DASTYCH M., BREINEK P., Klinická biochemie: bakalářský obor Zdravotní laborant. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2008, 232 s. ISBN 978–802-1045–729.

Obrázek č. 7:

AMBLER,Zdeněk, Základy neurologie. Praha: Galén, 2011.351s. ISBN 978–80-7262707.3.

Obrázek č. 8:

http://www.zbynekmlcoch.cz/informace/medicina/ neurologienemoci-vysetreni/atraumaticka-lumbalni-punkcefoto-vyhody-provedeni-typ-a-cena-jehly

Obrázek č. 9:

http://www.testlinecd.cz/o-firme

Tabulka č. 1:

uia.fnplzen.cz/sites/default/files/users/uia/Prednaska111109.ppt

6 PŘÍLOHY Soubor výsledků, se kterým jsem v bakalářské práci pracovala

- 65 -

Pohlaví Muž Muž Muž Muž Muž Žena Muž Žena Žena Žena Žena Muž Žena Muž Žena Muž Žena Žena Žena Žena Muž Muž Muž

Věk Přítomnost protilátek 32 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 45 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 23 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 20 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 17 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 70 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 36 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 76 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 38 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 49 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 46 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 50 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 38 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 56 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 48 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 59 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 19 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 11 KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní 31 KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní 11 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 37 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 47 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 23 KEM: pozitivní, KEG: pozitivní

Žena Muž Muž Žena Muž Žena Muž Muž Muž Muž Žena Muž Žena Muž

27 66 55 57 29 37 49 18 41 36 63 55 27 81

Žena Muž Žena Muž Muž

58 35 40 7 29

Akutní infekce versus stav po dříve prodělané infekci Infekce přetrvává 20 měsíců (trvá od 1. 12. 2010 do1.8.2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 7 měsíců (trvá od 20.12.2010 do 1. 7. 2011) Akutní infekce Infekce přetrvává 28 měsíců (trvá od 13. 7. 2010 do 6. 11. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 10. 9. 2011 do 8. 11. 2012) Infekce přetrvává 8 měsíců (trvá od 9. 5. 2012 do 2. 1. 2013) Akutní infekce Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 30. 5. 2011 do 22. 8. 2012) Infekce přetrvává 11 měsíců (trvá od 25. 7. 2011 do 4. 6. 2012) Infekce přetrvává 27 měsíců (trvá od 12. 7. 2010 do 2. 10. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 11. 7. 2011 do 2. 10. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 8 měsíců (trvá od 15. 8. 2011 do 18. 4. 2012) Infekce přetrvává 17 měsíců (trvá od 28. 7. 2011 do 18. 12. KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 2012) KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 5. 9. 2011 do 19. 11. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 32 měsíců (trvá od 8. 7. 2009 do 13. 3. 2012) KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 2. 9. 2011 do 18. 10. 2012) KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává13 měsíců (trvá od 5. 9. 2011 do 2. 10. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 3. 7. 2011 do 19. 9. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Akutní infekce Infekce přetrvává 11 měsíců (trvá od 12. 10. 2011 do 25. 9. KEM: pozitivní, KEG: pozitivní 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 23. 6. 2011 do 25. 9. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 27. 6. 2011 do 29. 8. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 5 měsíců (trvá od 8. 11. 2011 do 29. 3. 2012) KEM: pozitivní, KEG: pozitivní Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 7. 9. 2011 do 13. 11. 2012)

- 66 Žena Žena Žena Žena Žena Muž Žena Žena Muž Žena Muž Žena Žena Žena Muž Muž Žena Žena Žena Žena Muž Muž Muž

35 35 59 21 50 82 51 53 12 30 72 60 35 39 38 53 26 47 44 12 18 37 47

Žena Muž Muž Muž Žena Žena Žena

46 37 9 57 32 8 76

KEM: pozitivní, KEG: negativní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: hraniční hodnota KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní

Muž Žena Muž Žena Muž Žena

13 28 45 61 12 51

KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní

Muž Žena Muž Muž Žena Muž Muž Žena

44 66 57 47 35 41 57 61

KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní

Meningitida způsobená jinými přesně určenými příčinami Akutní infekce Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 6. 10. 2011 do 6. 12. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 10. 5. 2011 do 30. 6. 2012) Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 9. 2. 2011 do 17. 3. 2012) Infekce přetrvává 12 měsíců (trvá od 7. 8 . 2011 do 15. 8. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 12 měsíců (trvá od 30. 9. 2011 do 25. 9. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 7 měsíců (trvá od 19. 11. 2011 do 5. 6. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 8 měsíců (trvá od 2. 3. 2012 do 9. 10. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 29. 6. 2011 do 18. 9. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 2. 3. 2011 do 9. 3. 2012) Infekce přetrvává 11 měsíců (trvá od 6. 5. 2011 do 21. 2. 2012) Infekce přetrvává 10 měsíců (trvá od 15. 9. 2011 do 19. 7. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 16 měsíců (trvá od 30. 11. 2010 do 20. 3. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 29. 8. 2011 do 10. 9. 2012) Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 15. 7. 2011 do 4. 10. 2012) Infekce přetrvává 4 měsíců (trvá od 13. 7. 2011 do 10. 11. 2011) Akutní infekce Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 22. 9. 2011 do 30. 12. 2012) Infekce přetrvává 67 měsíců (trvá od 14. 9. 2006 do 5. 4. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 15. 9. 2011 do 4. 10. 2012) Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 19. 7. 2011 do 16. 10.

- 67 2012) Muž Muž Muž Žena Muž Muž Žena Muž Žena Muž Žena Žena Muž

71 56 38 65 37 54 58 69 66 49 25 54 12

KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: slabě pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní KEM: pozitivní, KEG: pozitivní

Infekce přetrvává 11 měsíců (trvá od 15. 8. 2011 do 27. 7. 2012) Infekce přetrvává 15 měsíců (trvá od 20. 7. 2011 do 4. 10. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 10. 8. 2011 do 1. 10. 2012) Akutní infekce Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 19. 9. 2011 do 4. 10. 2012) Infekce přetrvává 13 měsíců (trvá od 10. 7. 2011 do 7. 8. 2012) Akutní infekce Akutní infekce Infekce přetrvává 14 měsíců (trvá od 6. 7. 2011 do 4. 9. 2012) Infekce přetrvává 11 měsíců (trvá od 19. 8. 2011 do 13. 7. 2012) Infekce přetrvává 5 měsíců (trvá od 6. 9. 2011 do 31. 1. 2012)