Lampiran 1. Ilustrasi ligasi antara GP25 dan pT-Easy
64
Lampiran 2. Skema pembuatan konstruksi vaksin DNA
Vaksin DNA untuk penyakit akibat infeksi KHV
65
Lampiran 3. Metode kultur cair perbanyakan bakteri dan isolasi plasmid
66
Lampiran 4. Peta plasmid pBluescript
67
Lampiran 5. Prosedur pembuatan preparat jaringan
Prosedur pembuatan preparat jaringan (Angka et al. 1990): 1. Jaringan otot, insang, limpa dan ginjal dipotong dengan ukuran sebesar 10 mm3 2. Jaringan difiksasi dalam fiksatif Bouin’s selama 24 jam, setelah itu dipindahkan ke alkohol 70% (selama 24 jam sampai beberapa hari) 3. Jaringan didehidrasi dalam alkohol 80, 90, 95, 95 % masing-masing selama 2 jam dan selanjutnya dimasukkan dalam alkohol absolut (overnight) 4. Proses clearing dilakukan di dalam campuran alcohol-xylol (1:1) selama ½ jam, xylol I, xylol II dan xylol III masing-masing ½ jam 5. Jaringan selanjutnya diisi dengan paraffin dengan cara memindahkan jaringan ke dalam campuran xylol-parafin selama ¾ jam di dalam oven bersuhu 65-70 oC, dilanjutkan dengan perendaman di paraffin I, paraffin II dan paraffin III masing-masing selama ¾ jam 6. Jaringan di-blocking dengan parafin 7. Pemotongan jaringan dilakukan dengan ketebalan 5 µm Prosedur pewarnaan jaringan: 1. Jaringan diwarnai dengan pewarnaan haematoxylin-eosin. Pewarnaan dilakukan dengan prosedur perendaman berturut-turut dalam xylol I, xylol II, alkohol absolut I, alkohol absolut II, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70%, perendaman dilakukan masing-masing selama 3 menit, kemudian dicuci 2 kali 2. Jaringan diwarnai dengan haematoxylin selama 7 menit, dicuci dengan akuades 3 detik, diwarnai dengan eosin 3 detik dan dicuci kembali 3. Jaringan didehidrasi dalam alkohol 50%, 70%, 85%, 90%, absolute I, absolute II, xylol I dan xylol II masing-masing selama 2 menit 4. Preparat di-mounting dengan entellan.
68
Lampiran 6. Analisis data RPS (Relative Percent Survival) dengan ANOVA dan uji lanjut dengan BNT (beda nyata terkecil) Data RPS adalah sebagai berikut:
B: 7.5 µg/ 100µl
C : 12.5 µg/100 µl
1 -
66.67
66.67
2 12.50
37.50
62.50
3 33.33
55.56
55.56
Ulangan
A: 2.5 µg/ 100µl
Setelah diolah dengan menggunakan ANOVA diperoleh hasil: ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups
3653.978052 1063.528807
2 1826.989 10.307134** 0.011458 5.143253 6 177.2548
Total
4717.506859
8
SS
df
MS
F
P-value
Dari hasil perhitungan di atas menunjukkan bahwa minimal ada sepasang perlakuan yang berbeda pengaruhnya (F hit > F tabel). Untuk mengetahui perlakuan mana saja yang berbeda pengaruhnya maka dilakukan uji lanjut BNT (beda nyata terkecil). Hasilnya diperoleh sebagai berikut: bnt = Perlakuan A: 2.5 µg/ 100µl B: 7.5 µg/ 100µl C : 12.5 µg/100 µl
26.63296133 Rata-rata 17.40 52.20
A B
60.87
B
Dari hasil uji tersebut dapat disimpulkan bahwa perlakuan A berbeda pengaruhnya dengan perlakuan B dan C. Sedangkan, perlakuan B memberikan pengaruh yang sama dengan perlakuan C.
69
F crit
Lampiran 7. Suhu air setelah uji tantang dengan virus KHV Uji Tantang I Hari ke-
Sore
Suhu uji tantang tahap I
Pagi
1
24
25
2
24
25
3
24
25
4
24
25
5
23.5
25
6
24
25
7
24
25
8
24
25
9
24
25
10
24
25
11
23.5
25
12
23.5
25
13
23.9
25
14
24
24.5
15
23.5
24.5
16
23.5
25
17
23.8
24.8
18
24
25
19
23.8
24.8
20
23.5
24.5
21
23.5
24.8
22
23.5
24.5
23
23.5
24.5
24
24
25
25
24
25
26
24
25
37
24
25
28
23.5
24.5
29
23.5
24.5
Suhu Terendah: 23,5 oC (pagi) Suhu tertinggi: 25 oC (sore)
70
Lampiran 7 (Lanjutan). Suhu air setelah uji tantang dengan virus KHV
Uji Tantang II Hari ke-
Pagi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
25 23 24 24 24 24 24 24.5 24 24 23 23 23 23
Sore 26
Suhu uji tantang tahap II
25 26 25 24 26 24 24 23 24 24 24 24 24
Suhu Terendah: 23 oC (pagi) Suhu Tertinggi: 26 oC(sore)
71
Lampiran 8. Jaringan otot dan insang yang tidak divaksinasi dan yang divaksinasi (Pewarnaan Hematoxylin dan Eosin).
Keterangan Gambar: A1= jaringan otot yang tidak divaksinasi A2= jaringan otot yang divaksinasi A1= myosit B1= insang yang tidak divaksinasi B2= insang yang divaksinasi b1= filamen b2= lamella Insert= filamen dan lamella insang yang diperbesar (20x)
72
Lampiran 9. Jaringan limpa dan ginjal yang tidak divaksinasi dan yang divaksinasi (Pewarnaan Hematoxylin dan Eosin).
Keterangan Gambar: C1= jaringan limpa yang tidak divaksinasi C2= jaringan yang divaksinasi c1= pulpa putih c2= pulpa merah D1= ginjal yang tidak divaksinasi D1= ginjal yang divaksinasi d1= jaringan hematopoietik d2= tubulus proksimal Insert= pulpa putih pada limpa dan tubulus ginjal yang diperbesar (20x)
73
