LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ
Stanovení jednotlivých monosacharidů a oligosacharidů (metoda: HPLC s refraktometrickou detekcí)
Garant úlohy: doc. Dr. Ing. Karel Cejpek
OBSAH Základní požadované znalosti pro vstupní test .......................................................................... 3 Další doporučené otázky ............................................................................................................ 3 Náplň úlohy ................................................................................................................................ 4 Kritéria hodnocení práce ............................................................................................................ 4 Časový snímek cvičení ............................................................................................................... 5 A. Stanovení jednotlivých monosacharidů a oligosacharidů metodou HPLC s refraktometrickou detekcí .......................................................................................................... 6 1. Použitelnost metody ............................................................................................................... 6 2. Princip metody ....................................................................................................................... 6 3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo ....................................................... 6 4. Standardy a kalibrační roztoky ............................................................................................... 6 5. Chemikálie a roztoky ............................................................................................................. 7 6. Pracovní postup ...................................................................................................................... 7 Příloha ........................................................................................................................................ 9 B. Refraktometrický odhad obsahu cukrů přenosným refraktometrem - stanovení rozpustné sušiny. ....................................................................................................................................... 10 1. Použitelnost metody ............................................................................................................. 10 2. Princip metody ..................................................................................................................... 10 3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo ..................................................... 10 4. Standardy a kalibrační roztoky ............................................................................................. 10 5. Chemikálie a roztoky ........................................................................................................... 10 6. Pracovní postup .................................................................................................................... 11 Příloha ...................................................................................................................................... 12 Seznam nádobí ......................................................................................................................... 13
Základní požadované znalosti pro vstupní test 1. Chemie sacharidů (v rozsahu přednášek z Chemie potravin) - struktura sacharidů (zejména monosacharidů a disacharidů), - zastoupení a obsah jednotlivých sacharidů v potravinářských komoditách - významné vlastnosti a reakce sacharidů. 2. Problematika falšování potravin, metody jeho zjišťování. 3. Metody stanovení - fyzikální metody stanovení sacharidů - princip a použitelnost refraktometrického stanovení sacharidů a rozpustné sušiny - principy kapalinové chromatografie (stacionární fáze – typy kolon, mobilní fáze, detektory) - příprava roztoků, příslušné výpočty.
Další doporučené otázky o Co jsou to sacharidy a jak se klasifikují? Uveďte příklady jednotlivých typů sacharidů. o Jaké konkrétní sacharidy se vyskytují v následujících komoditách a jaký je jejich přibližný obsah: cukrovinky (různé druhy) med ovoce (různé druhy) ovocné šťávy zeleninové šťávy nealkoholické nápoje. o Kolik D-glukosy (D-fruktosy, sacharosy) je třeba navážit na přípravu 25 ml jednosložkového standardního roztoku o koncentraci 1 g / 100ml? o Jaké objemy standardních roztoků jednotlivých cukrů D-glukosy, D-fruktosy a sacharosy o koncentraci 1g/100ml potřebujeme na přípravu 10 ml směsného roztoku cukrů o koncentraci jednotlivých cukrů 0,1g/100ml (a) a 0,3g/100ml (b)? o K čemu se používají Carrezovy roztoky a jaké je jejich složení? o Jakou metodu kalibrace použijete pro stanovení cukrů metodou HPLC s refraktometrickou detekcí? o Jaké jsou standardní podmínky měření s refraktometrem? Čím je ovlivněna hodnota refrakčního indexu? o Jak postupovat při měření refraktometrické sušiny, pokud refraktometr není vybaven lineární automatickou teplotní kompenzací? o K čemu se vztahuje stupnice °Brix a co vyjadřuje? Jaké další stupnice pro určení obsahu koncentrace rozpuštěných látek refraktometrickou metodou znáte?
Náplň úlohy Stanovení jednotlivých mono- a disacharidů v cukrovinkách a nápojích metodou HPLC s refraktometrickou detekcí. ČSN 56 8543 (Jablečná šťáva, 2001). Refraktometrické stanovení (odhad) obsahu rozpustné sušiny (cukrů) přenosným refraktometrem. ČSN 56 0414 (Odhad obsahu rozpustné sušiny – refraktometrická metoda, 1998)
upřesnění k provedení úlohy: • •
•
každá dvojice v pracovní skupině analyzuje svůj vzorek na přípravě kalibrační křivky se podílejí všichni členové skupiny; neplatí pro studenty, kteří na rozdíl od ostatních členů skupiny připravují k analýze potravinu se složitější matricí Nástřiky standardů cukrů (kalibrační křivka) je nutno realizovat co nejdříve, aby bylo možné úlohu provést ve vymezeném čase.
Kritéria hodnocení práce - prokázané teoretické znalosti - praktické provedení práce- protokol - ucelenost experimentálních údajů, výpočet výsledků a jejich diskuse - dodržení pravidel pro práci v laboratoři (bezpečnost, pořádek, čistota) - protokol - ucelenost experimentálních údajů, výpočet výsledků a jejich diskuse.
Časový snímek cvičení
30 min
Prezence + kontrola požadovaných znalostí; příprava HPLC systému k měření
30 min
Výklad postupu + rozdělení práce; výklad k přístrojům
60 min
Příprava analytických standardů
Příprava vzorků Příprava vzorků (filtrace, složitější matrice)
30 min Měření kalibračních křivek (HPLC) 30 min
30 min
30 min
Kalibrace přenosného refraktometru
Analýza vzorků (HPLC)
Analýza vzorků (přenosný refraktometr)
Vyhodnocení výsledků + požadavky na zpracování protokolů + úklid
A. Stanovení jednotlivých monosacharidů a oligosacharidů metodou HPLC s refraktometrickou detekcí
1. Použitelnost metody Metoda slouží ke stanovení jednotlivých monosacharidů a disacharidů v potravinách, zejména cukrovinkách a nápojích.
2. Princip metody Sacharidy se ze vzorku extrahují směsí acetonitril:voda. Získaný extrakt se přefiltruje, případně přečistí dalším způsobem, a jednotlivé sacharidy se stanoví metodou kapalinové chromatografie s refraktometrickou detekcí. Identifikace a kvantifikace se provádí metodou vnějšího standardu.
3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo -
vysokotlaké isokratické čerpadlo HPP 5001 (Laboratorní přístroje, Praha) nástřikový systém se smyčkou (Rheodyne, USA) analytická kolona plněná normální fází s funkční skupinou - NH2, 4,6 x 250 mm refraktometrický detektor (RID) (Knauer, Deutschland) ultrazvuková lázeň běžné laboratorní sklo a vybavení analytické váhy běžné chemické sklo a laboratorní materiál
4. Standardy a kalibrační roztoky • glukosa (p.a.) • fruktosa (p.a.) • sacharosa (p.a.) Příprava standardních roztoků: Připravte zásobní roztoky glukosy, fruktosy a sacharosy o koncentraci cca 1.0 g /100 ml (0,25 g/25ml + 10 ml acetonitril: voda 1:1 v/v, doplnit roztokem acetonitril:voda 3:1 v/v). Pro zhotovení kalibrační křivky připravte standardní roztoky glukosy, fruktosy a sacharosy o koncentraci 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0.5 a 1,0 g/100 ml (kalibrační křivku připravte ze tří bodů, koncentrace volte po konzultaci s asistentem). Pro zhotovení kalibrační křivky použijte směsné standardy. K ředění standardů použijte směs acetonitril:voda 3:1 (případně roztok o koncentraci doporučené asistentem).
5. Chemikálie a roztoky Používají se chemikálie čistoty p.a. a vyšší -
acetonitril pro HPLC demineralizovaná voda roztok Carrez I: 30% síran zinečnatý - ZnSO4 roztok Carrez II: 15% hexakyanoželeznatan draselný - K4Fe(CN)6 skládaný filtr o střední velikosti pórů membránový filtr o porozitě 0,2-0,45 µm
6. Pracovní postup 6.1. Příprava laboratorního vzorku 6.1.1. Pevné vzorky Pevné vzorky (např. med, dia pečivo, sušené mléko) se rozdrtí v třecí misce a dokonale promíchají. Do 250 ml Erlenmayerovy baňky se odváží 5 - 10 g s přesností na 0,01 g homogenního vzorku. Po přídavku 100 ml horké vody se baňka promíchá, vloží se do ultrazvukové lázně a sonikuje se 15 min. K vyčeření se použijí ještě za horka 3 ml roztoku Carreze I a po promíchání 3 ml roztoku Carreze II. Po dalším promíchání se roztok přefiltruje a kvantitativně převede do 200 ml odměrné baňky a po ochlazení na laboratorní teplotu se doplní vodou po značku. Vzorek je dále možno ředit směsí acetonitril:voda (dle pokynu asistenta). Všechny roztoky vzorků se před nástřikem do kapalinového chromatografu filtrují přes skládaný filtr popř. membránový filtr. 6.1.2. Kapalné vzorky Všechny ovocné nápoje, limonády a alkoholické nápoje se po dokonalém promíchání ředí směsí vody a acetonitrilu (poměr dle pokynu asistenta). Před nástřikem do kapalinového chromatografu se vzorky filtrují přes membránový filtr. 6.1.3 Ostatní vzorky Tang – cca 0,06 g do 10 ml (acetonitril:voda 3:1) Sirup – cca 0,1 g do 10 ml (acetonitril:voda 3:1) Bonbony – 1 bonbon (rozdrtit, zvážit) + 40 ml horké vody + 3 ml Carrez I a 3 ml Carrez II do 100 ml (doplnit acetonitrilem) Před nástřikem do kapalinového chromatografu se vzorky filtrují přes membránový filtr. 6.2. Příprava a parametry systému s kapalinovou chromatografií Kolona: analytická kolona plněná normální fází s navázanou funkční skupinou NH2, (např. 4,6 x 150 mm, Lichrospher, Spherisorb) s předkolonou Mobilní fáze: acetonitril / redestilovaná voda (80/20, v/v; případně 75/25, v/v) (připravená mobilní fáze se odplyní v ultrazvukové lázni 10 min) Průtok mobilní fáze: 1 ml/min (případně 1,2 ml/min) Detekce: refraktometrický detektor KNAUER 20 µl Teplota: laboratorní teplota Objem nástřiku: Chromatogramy jsou vyhodnocovány pomocí software CSW32
6.3. Identifikace a stanovení Identifikace se provádí porovnáním retenčního času analytu ve vzorku s retenčním časem kalibračního standardu. Další identifikační možností je přídavek standardu ke vzorku. Kvantitativní vyhodnocení se provádí metodou vnějšího standardu, a to buď 1) odečtením koncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislosti plochy, příp. výšky píku na koncentraci standardu v g/l v rozsahu jednoho řádu, koncentrace analytu ve vzorku musí ležet uvnitř-mezi nejnižším a nejvyšším bodem kalibrační přímky) a přepočtem na původní vzorek podle následujícího vztahu: ca = x . Va / n nebo 2) porovnáním plochy, případně výšky píku sledovaného analytu a standardu podobné koncentrace a přepočtem na původní vzorek podle následujícího vztahu: ca = cst . Aa / Ast . Va /n ca cst Aa Ast x Va n
- výsledná koncentrace analytu [g/kg, popř. g/l] - koncentrace standardu [g/l] - plocha píku stanovovaného analytu - plocha píku standardu - hodnota koncentrace analytu odečtená z kalibrační křivky [g/l] - objem roztoku vzorku po doplnění do odměrné baňky [l] - navážka vzorku [kg, popř. l]
Linearita metody odezva je lineární v rozsahu 0,05 – 1,00 g/100ml Mez detekce, mez stanovitelnosti a opakovatelnost metody Mez detekce je nejnižší množství stanovované látky ve vzorku, které může být detekováno. Pro výše uvedené vzorky je mez detekce vypočtena jako trojnásobek šumu z analýzy reálného vzorku. Mez stanovitelnosti je nejnižší množství stanovované látky ve vzorku, které může být kvantitativně stanoveno s přijatelným stupněm přesnosti. Je vypočtena jako desetinásobek šumu z analýzy reálného vzorku. Opakovatelnost byla vypočtena z opakovaných analýz reálného vzorku.
sacharosa glukosa fruktosa
Mez detekce (g/100ml) 0,01 0,01 0,01
Mez stanovitelnosti (g/100ml) 0,05 0,06 0,06
RSD (%) 4,3 2,5 1,8
Příloha ČSN 56 8543, 2001: Jablečná šťáva. Texty technických norem nemohou být volně šířeny, a proto není tato příloha součástí návodů v elektronické podobě. Studenti mohou do této normy nahlédnout při výuce nebo využít přístup k plným textům českých technických norem z ústřední knihovny VŠCHT.
B. Refraktometrický odhad obsahu cukrů přenosným refraktometrem - stanovení rozpustné sušiny.
1. Použitelnost metody Metoda slouží k určení cukernatosti sirupů, ovocných šťáv, kvasů, zeleninových šťáv a mléčných nápojů, a odhadu celkové koncentrace monosacharidů a disacharidů v libovolném roztoku.
2. Princip metody Kapalný vzorek se napipetuje na měřicí celu nebo se měřicí cela ponoří do vzorku. Přístroj měří cukernatost ve zvolených jednotkách měření (koncentrace v rámci kalibrační křivky; % stupnice Brix; obsah cukru v hroznové šťávě apod.) po předchozí adjustaci a nastavení teplotních kompenzačních koeficientů.
3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo -
Přenosný refraktometr Refracto 30PX (Mettler Toledo, Švýcarsko) s příslušenstvím běžné laboratorní sklo a vybavení analytické váhy běžné chemické sklo a laboratorní materiál
4. Standardy a kalibrační roztoky • glukosa (p.a.) • fruktosa (p.a.) • sacharosa (p.a.) Příprava standardních roztoků: Připravte zásobní vodné roztoky glukosy, fruktosy a sacharosy o koncentraci 20 g/100 ml podle pokynů asistenta. Pro zhotovení kalibrační křivky připravte standardní roztoky glukosy, fruktosy a sacharosy o koncentraci 1; 2; 3; 4; 5, 10 a 20 g/100 ml (kalibrační křivku připravte ze tří bodů, koncentrace volte po konzultaci s asistentem). K ředění standardů použijte vodu.
5. Chemikálie a roztoky - demineralizovaná voda - skládaný filtr o střední velikosti pórů - membránový filtr o porozitě 0,2-0,45 µm
6. Pracovní postup 6.1. Příprava laboratorního vzorku 6.1.1. Kapalné vzorky Vzorky se před aplikací na celu případně (dle pokynu asistenta) filtrují přes skládaný filtr popř. membránový filtr. Vzorek se před měřením řádně promíchá. Stanovení obsahu nerozpustné sušiny se provádí bez naředění. 6.1.3 Ostatní vzorky Tang – cca 1 g do 10 ml vody Sirup – cca 1 g do 10 ml vody 6.2. Nastavení a kalibrace přístroje Dle pokynu asistenta přístroj Refracto zapněte a proveďte adjustaci na destilovanou vodu tak, že pipetou opatrně nakapete několik kapek vody na měřicí celu. Pokud je odchylka >0,0005, provede se kalibrace na vodu. Pro úplné odstranění zbytků vzorku vždy dokonale ale jemně vysušte měřicí celu buničinou. Podle pokynů asistenta nastavte jednotky měření podle zvolené aplikace: a) „Sugar“ (stanovení cukru) – zobrazení výsledků (obsah rozpustné sušiny) jako stupně Brix (v g sacharosy/ 100 g vzorku). U citrusových šťáv a koncentrátů se provádí korekce na obsah kyselin podle pokynů asistenta (viz Příloha kapitola 8 a příloha A). b) „Conc.“ (koncentrace) – měření koncentrace přes zadání požadovaného konverzního koncentračního vzorce y = a + bx při referenční teplotě, kde y = koncentrace v % nebo bez jednotek a, b = koeficienty závislé na vzorku x = naměřený index lomu Z paměti se zvolí vhodný teplotní kompenzační koeficient podle pokynů asistenta. c) „Wine“ (obsah cukru v hroznové šťávě) Výsledky se zobrazí v jedné ze zvolených jednotek (°Oechsle, °KMW, °Baumé) Výpočet teplotního kompenzačního koeficientu - Změřte index lomu (nD) vzorku: při teplotě (T1) nad normální teplotou měření (nDT1) při teplotě (T2) pod normální teplotou měření (nDT2) - Vypočtěte α podle vzorce α = (nDT1 - nDT2)/ (T2 - T2) - Vložte hodnotu α*1000 do přístroje.
6.3. Měření Dle pokynů asistenta změřte připravené standardní roztoky a vzorky. Dbejte na to, aby před každým měřením byl hranol a měřicí cela čisté. Zajistěte, aby měřené vzorky byly homogenní a co nejblíže okolní teplotě. Napipetujte vzorek na měřicí celu. Měřicí cela musí být naplněna
po značku. Po vyrovnání teplot (asi 20 s) se provede měření podle instrukcí pro použití přístroje. Během měření je nezbytné udržovat konstantní teplotu. Pokud měříte s teplotním kompenzačním koeficientem α, zvolte požadovaný koeficient a pak teprve měřte. Výsledky neukládejte do paměti přístroje, ale zapište jej do svého laboratorního deníku. Obsah rozpustné sušiny (°Brix) se odečítá přímo v % sacharosy s přesností na 0,1 %. U každého vzorku se provádějí 2 paralelní měření. Získaný výsledek je obsah cukrů v % stanovený refraktometrickou metodou. 6.4. Opakovatelnost metody Absolutní hodnota rozdílu výsledku dvou jednotlivých zkoušek, provedených na stejném zkušebním materiálu jedním pracovníkem, za použití stejného zařízení, v nejkratším možném časovém intervalu nepřesáhne hodnotu opakovatelnosti r ve více než 5 % případů. Hodnoty opakovatelnosti jsou: šťávy koncentráty
r = 0,15 °Brix r = 0,2 °Brix
Příloha ČSN 56 0414, 1998: Odhad obsahu rozpustné sušiny – refraktometrická metoda. Texty technických norem nemohou být volně šířeny, a proto není tato příloha součástí návodů v elektronické podobě. Studenti mohou do této normy nahlédnout při výuce nebo využít přístup k plným textům českých technických norem z ústřední knihovny VŠCHT.
Seznam nádobí Třecí miska + tlouček Hodinové sklíčko Ø 10 cm Váženka Pipetovací balónky Laboratorní lžička Kopistka Skleněná tyčinka Plastová stříkačka 3 ml 10 ml Pipety dělené 10 ml 5 ml nedělené 10 ml 2 ml 1 ml Nálevky Ø 8 cm Nálevky Ø 4 cm Kádinka 400 ml 250 ml 100 ml 50 ml Erlenmayerova baňka 250 ml 1l Odměrný válec 250 ml 100 ml 10 ml Odměrná baňka 200 ml 100 ml 50 ml 25 ml 10 ml Zátky skleněné 29 19 14 12 10 7 Zásobní láhev 1l
1x 1x 3x 2x 2x 1x 1x 1x 1x 1x 4x 1x 2x 4x 3x 3x 1x 1x 4x 2x 6x 1x 1x 1x 4x 3x 1x 3x 5x 3x 3x 2x 5x 12x 8x 5x 1x
