15/03/2010
KVANTIFIKACE ZMĚN Ě GENOVÉ EXPRESE
•
Northern bloty pracné a zdlouhavé
•
Genové čipy nákladné; http://www.molbio.upol.cz/
•
Semikvantitativní RT-PCR nepřesné
•
qPCR metodiky real-time PCR vysoké dynamické rozpětí
1
15/03/2010
problém: precizní kvantifikace mRNA spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné
řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen™ - 1000x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými f fragmenty. t nebo relativní stanovení pomocí qPCR
NORTHERN BLOT control
expt
cílový l gen GOI GO referenční gen aktin, GAPDHetc
korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5
2
15/03/2010
aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k k externímu standardu, d d detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie
2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů
3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNA mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami
3
15/03/2010
princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání
chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot
4
15/03/2010
chemismus 2) hybridizační sondy (TAGman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer
srovnání TagMan
SybrGreen
specifita
primery proba PCR podmínky
primery PCR podmínky
flexibilita
singleplex multiplex (max.4) (max 4)
singleplex
aplikace
kvantifikace SNP detekce
kvantifikace
cena
vysoká
nízká
5
15/03/2010
kontaminace • největší problém PCR • aerosol, pipety, staré amplikony • částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA
štěpí ss a dsDNA s inkorporovaným deoxyuracilem (dUTP) termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C nereaguje s templátem (dTTP) dUTP v qPCR mixu místo dTTP pracuje během nastavení PCR reakce
pg2
chyby v pipetování • •
templát (cDNA) premix (p p (primery, y, proba, p , polymerasa, p y , dNTP,, pufr, p , srovnávací fluorescenční barvivo)
částečné řešení
- ROX (Karboxy-X-Rhodamin)
fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1)
pufr, Mg2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery
2)
vzorek (cDNA, genomická DNA)
6
Snímek 12 pg2
hořčík vyšší davky pro Tagman kvuli 5-3- exonucleasove aktivite galuszka; 22/02/2010
15/03/2010
AMOUNT OF DNA
lineární vynesení 1600000000 1400000000 AMOUNT OF DNA A
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000
1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 0
5
10
15
20
25
30
35
PCR CYCLE NUMBER
logaritmické vynesení AMOU N T OF D N A
CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0
5
10
15
20
25
30
35
PCR CYCLE NUMBER
lineární ~20 do ~1500
7
15/03/2010
CT hodnoty threshold
treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)
před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku threshold
templát: 10x ředění přímo cDNA, nebo p plasmid s buď p naklonovaným genem, který stanovujeme
CT koncentrace templátu
8
15/03/2010
PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY • směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce • %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu • R2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995)
Eff=10(-1/slope) –1
%EFF 100% 90% 80% 70%
= 2.00x = 1.90x = 1.80x = 1.70x
10,000,000,000 100% EFF
1,000,000,000
90% EFF
100,000,000 AM MOUNT OF DNA
CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 4 3 3 3 8 7 6 5 4 16 13 10 8 5 32 25 19 14 6 64 47 34 24 7 128 89 61 41 8 256 170 110 70 9 512 323 198 119 10 1,024 613 357 202 11 2,048 1,165 643 343 12 4,096 2,213 1,157 583 13 8,192 4,205 2,082 990 14 16,384 7,990 3,748 1,684 15 32,768 15,181 6,747 2,862 16 65,536 28,844 12,144 4,866 17 131,072 54,804 21,859 8,272 18 262,144 104,127 39,346 14,063 19 524,288 197,842 70,824 23,907 20 1,048,576 375,900 127,482 40,642 21 2,097,152 714,209 229,468 69,092 22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456 23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676 24 16 777 216 16,777,216 4 898 763 4,898,763 1 338 259 1,338,259 339 449 339,449 25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466
80% EFF
10,000,000
70% EFF
1,000,000 100,000 10,000 1,000 , 100 10 1 0
10
20
30
PCR CYCLE NUMBER
relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% ± 3%
9
15/03/2010
tolerance efektivity
Chemismus SybrGreen Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání
teplota
10
15/03/2010
REFERENČNÍ GEN • musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích • nejčastěji provozní geny (house-keeping) • aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1
TaqMan Human Endogenous Control Plate
ΔCT
11
15/03/2010
ΔCT = 2
čtyřnásobný rozdíl v expresi
změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cDNA
18S ribosomální RNA • přepisována jinou RNA polymerasou než mRNA • byly popsány výkyvy mezi množstvím rRNA a mRNA • nelze použít pokud se vychází z mRNA
vyhodnocení kalibrátor
sample 1
sample 2
izolace celkové RNA (mRNA) přepis do cDNA navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení č í standardních t d d í h křivek kři k pro oba b geny a stanovení t í efektivity f kti it
GAPDH GOI
GAPDH GOI
GAPDH GOI
12
15/03/2010
vyhodnocení
kalibrátor sample A sample A sample B kalibrátor sample B
GAPDH GOI
1
vyhodnocení
metoda „delta delta cé té“
změny exprese pro sample 1
1 určíme CT pro všechny křivky 1. 2. určíme CT 3. 4.
GOI
určíme CT
- CT
GOI
GAPDH
- CT
pro kalibrátor
ΔCT kalibrátor
pro sample 1
ΔCT sample 1
GAPDH
ΔCTsample 1 - ΔCTkalibrátor
ΔΔCT
výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován)
2-ΔΔCT
13
15/03/2010
2
vyhodnocení
Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek
počítá se i s efektivitou
3
vyhodnocení
pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích
14
15/03/2010
příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cDNA a provedeno qPCR s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cDNA cDNA
CT 22,48 CT 22,3
kalibrator silencing
cDNA cDNA
pkg2
2-ΔΔCT 2
–(5,33-2,43)
0,134 7,5x
GAPDH Eff 77% CT 20,05 CT 16,97 silencing kalibrator
cDNA cDNA DNA
kalibrator
cDNA cDNA
kalibrator
1,1x104 kopií 1 23 104 kopií 1,23x10 k ií
silencing
GAPDH
(1+0,86)0,18/(1+0,77)3,08
1,55x104 kopií 8,92x104 kopií
silencing
0,192 Gen snížil expresi 5,2x
0,194 5,2x
pg1
navrhování primerů velikost amplikonu
50-150 bp
délk primerů délka i ů
20 bp b
primery se nesmí překrývat s próbou
Tm 58-60◦C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou
GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)
15
Snímek 30 pg1
> > > > > > > >
An ideal primer has a stable 5'end and an unstable 3' end. If the primer has a stable 3' end, it will bond to a site which is complementary to it other than the target with its 5' end hanging off the edge...[nice terminology BTW]...Stability of the 5' termini allows for efficient bonding of the primer to the target site. This stable 5' region is called the GC Clamp. It ensures adequate binding of the primer to the template... Notice that the 3' end should not be very stable and the 5' end should have a strong GC clamp.
galuszka; 22/02/2010
15/03/2010
navrhování proby délka proby
13-25 bp
primery p e y se nesmí es překrývat p e ý at s p próbou óbou
Tm 68-70◦C o 10◦C vyšší než Tm primerů
GC obsah 50-70% žádné G na 5´konci zháší fluorescenci FAM barvy
16
15/03/2010
navrhování primerů a proby
kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon
17
15/03/2010
MGB PROBY •
minor groove binding
•
stabilizuje bili j vazbu b proby b na ssDNA DNA
•
výrazně zvyšuje Tm
•
můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm
18
15/03/2010
MGB PROBY využití pro alelické diskriminace
kolik replikací a kdy replikovat? sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
qPCR
3X
6X
19
15/03/2010
kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
27X
qPCR
instrumentace 7500 Real Time PCR System
7900HT Real Time PCR System
StepONE Real Time PCR System
20
15/03/2010
zesilovač halogenová lampa
ccd kamera
emisní filtry
excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku
instrumentace
21
15/03/2010
http://www.youtube.com/watch?v=k16WgEU1kVM
HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) • detekce SNP bez specifických sond • díky kvalitní instrumentaci Corbett (±0.02◦C) (±0 02◦C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)
22
15/03/2010
HRM ANALYSA
pro amplikony do 200bp
23
