KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 4. 3. – 8. 3. 2013

OPVK – Praktický kurz, 2013

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

4. 3. – 8. 3. 2013

ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR

OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

-3-


KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením

Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2013 Česká Republika První vydání

ISBN: 978-80-87541-06-7

-4-


Obsah Obsah ......................................................................................................................... 5 Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů ..................................................................................................... 7 Transfekce savčích buněk ...................................................................................... 7 Detekce GFP ........................................................................................................ 10 Mikroskopie ........................................................................................................... 10 ELISA stanovení GFP ........................................................................................... 12 Detekce luciferázy ................................................................................................. 13 Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce.............................................................. 15 Izolace mRNA ....................................................................................................... 15 Reverzní transkripce ............................................................................................. 16 qRT-PCR .............................................................................................................. 17 Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza ...................................................................................................... 19 Transformace, selekce a kultivace bakterií ........................................................... 19 Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza ....................................................... 21 Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie ......... 23 I. B-A přechod ....................................................................................................... 23 II. B-Z přechod ...................................................................................................... 24 Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese ..................................................... 26

-5-


-6-


Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů Garant: Václav Brázda

Transfekce savčích buněk Princip a cíl: Transfekcí je označován přenos cizorodého genetického materiálu do eukaryotických buněk. Existuje celá řada metodik transfekce, mezi nejstarší a nejčastěji používané patří chemická metodika transfekce fosforečnanem vápenatým. Použitá metodika transfekce fosforečnanem vápenatým je modifikací původní metodiky, která se vyznačuje jednoduchostí a spolehlivostí. Metoda transfekce fosforečnanem vápenatým je velmi efektivní způsob zavedení DNA do buňky v mnoha systémech, nicméně v jiných může být zcela neefektivní. Nejlépe funguje v buněčných liniích, které rostou přisedlé, například u buněk Hela, U2OS, SAOS2, Ada a NPC-KT lze získat transfekční účinnost od 20% do 100% v závislosti na buněčné línii a podmínkách transfekce. Metoda funguje dobře pro vytváření jak tranzientní transformace, tak i pro generování stabilních buněčných linií. Metoda je poměrně citlivá na množství použitého plazmidu. Celkové množství transfekované DNA musí být cca 30g (pro 100mm misky). Pro efektivní transfekci je vhodné použít jako nosič plazmid bez eukaryotického promotoru (například pBluescript). Pro typické transaktivační pokusy používáme mezi 50- 500 ng transfekovaného plazmidu a cca 29 µg nosičového plazmidu. Nicméně pro funkční tranfekci je někdy nutné poměr upravit až na 5-10 µg příslušného expresního vektoru a 20-25 µg nosičové DNA. Je třeba mít na paměti několik důležitých aspektů. DNA přechází přes jadernou membránu pouze během mitózy. Nedojde tedy k expresi genu dokud buňka neprojde mitózou. Po transfekci dochází k synchronizaci buněk, ty by se měli analyzovat nejméně 24 hodin po transfekci. Cílem je připravit buněčné línie HCT116 a 293F s reporterovými plazmidy: A) s luciferázovým expresním systémem pCNA3wtp3 a pMDM2-ADP2; B) s GFP proteinem pBRCA-GFP360-759.

-7-


Pracovní postup: Pro tranfekci použijeme 6ti jamkové desky. 1. Den před transfekcí naředíme kulturu konfluentních buněk (70-90%) v poměru 1:10 do 1:15 (poměr závisí na buněčných liniích, které jsou transfekovány, rychleji rostoucí buněčné linie ředíme více, velmi pomalu rostoucí buněčné linie mohou být rozředěny méně než 1:10). 2. Druhý den ráno odlejte medium (DMEM (10% FBS, + pen / strep)) a přidejte 2ml čerstvého média. 3. Vlastní transfekce 5g celkové DNA s různým množstvím efektorového plazmidu dle tabulky (dopočítejte množství plazmidu pro transfekci).

A1

A2

A3

B1

B2

B3

Deska číslo 1 (plazmid s GPF) GFP plazmid

Označení

pBluescript

2400g/ml

A1/B1

0

5 g

A2/B2

20 ng

5 g

A3/B3

1000 ng

4 g

Deska číslo 2 (plazmid s luciferázovým expresním systémem) Označení

pCNA3wtp53

pMDM2-ADP2

857g/ml

51g/ml

pBluescript

A1/B1

0

0

5 g

A2/B2

20 ng

20 ng

5 g

A3/B3

1000 ng

1000 ng

3 g

-8-


4. Pro každou transfekci dejte 86 l 1X HBS do sterilní zkumavky. 5. Přidejte odpovídající množství DNA do každé zkumavky a promíchejte. 6. Přidejte do každé zkumavky 5 l 2,5M CaCl2 a promíchejte. 7. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě. 8. Přidejte k buňkám transfekční směs po kapkách a mírně míchejte - nemixujte! 9. Vložte do CO2 inkubátoru. 10. Další den vyměňte médium. 11. Pro stadium transientní exprese jsou buňky použity po 48-72 hodinách.

Seznam chemikálií: 1X HBS 1 litr HEPES 5 g NaCl 8 g Dextróza 1 g KCl 3,7 g Na2HPO4 (7H2O) 10 ml zásobního roztoku 1. Přidejte H2O do cca 900 ml. 2. Upravte pH na 7,1 přesně. 3. Přidejte H2O do 1 litru. 4. Přefiltrujte přes sterilní filtr (0.2 m. 5. Rozdějte na alikvoty do sterilních zkumavek a uložte na -20°C.

Na2HPO4 (7H2O) zásobní roztok = 0,94 g Na2HPO4 (7H2O) v 50 ml H2O 2.5M CaCl2 100ml CaCl2 27,75 g bezvodého CaCl2 nebo CaCl2 36,75 g CaCl2 (2H2O) Rozdělte na alikvoty do sterilních zkumavek 15 ml (10 ml do každé) a uložte v mrazničce.

-9-


Detekce GFP K detekci GFP je možné použít celou řadu metodik. V rámci praktického cvičení se seznámíme s mikroskopickými technikami a ELISA stanovením.

Mikroskopie

Pro studium buněk se dlouhodobě používá mikroskopie. Jednou z nejčastějších metod zobrazení konkrétní molekuly či buněčných organel ve vysokém rozlišení je použití fluorescenčních značek, které umožní jednoznačnou identifikaci a lokalizaci proteinu v buňce. Klasická fluorescenční mikroskopie má tu nevýhodu, že se při zkoumání silnějších vzorků pletiv do roviny zaostření mikroskopu promítne i fluorescence z mimoohniskových částí. Tento rušivý šum způsobí zamlžení a sníženou ostrost snímku, kterou lze eliminovat technikou konfokální mikroskopie. Fluorescenční i konfokální mikroskopie využívají fluorescence, tj. schopnosti atomů a molekul absorbovat určité množství excitační energie a vzápětí ji vydat zpět v podobě emisního záření o vyšší vlnové délce s nižší energií. Princip laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu zjednodušeně spočívá v osvětlování pozorovaného objektu bodovým zdrojem světla, který je clonou zaostřen na jeden bod pozorovaného vzorku. Sekundární světlo odražené z tohoto bodu přechází na konfokální clonu. Ta zaostřuje na detektor jen světlo pocházející ze zaostřených bodů, zatímco světlo emitované z osvětlených, ale nezaostřených bodů jde mimo ní. Výstupní digitální obraz celé zaostřené roviny je získáván jejím rastrováním bod po bodu. Konfokální mikroskopie představuje nedestruktivní pozorovací techniku a je proto ideální metodou pro pozorování nejrůznějších struktur v živých buňkách. Při studiu živých buněk se využívají často právě transgenní organismy s fúzními proteiny. Jako první byl izolován zelený fluorescenční protein (GFP) z mořské medúzy Aequoria victoria, u které byl objeven jako součást bioluminiscence. Tento protein s molekulovou mnotností 28 kDa má maximum excitační vlnové délky cca 489 nm a maximum emisní vlnové délky 509 nm.

- 10 -


V současné době je dostupná celá řada dalších mutací GFP s odlišnými spektrálními vlastnostmi. Díky široké škále fluorescenčních barviv můžeme s využitím laserů různých vlnových délek a správných bariérových filtrů pozorovat více buněčných struktur v živých buňkách. Výstupem konfokálního mikroskopu je digitální obraz, který můžeme dále kvalitativně i kvantitativně analyzovat, sestavovat trojrozměrný obraz studovaného objektu nebo pomocí časosběrného snímkování studovat dynamiku buněčných struktur. V rámkci praktického cvičení se seznámíme s prací na konfokálním mikroskopu Leica SP5.

- 11 -


ELISA stanovení GFP Pro stanovení účinnosti transfekce je možné využít citlivé měření na ELISA readeru. Fluorescence GFP je ale rychle zhášena, proto se pro citlivé stanovení používá zpravidla fluorescenčně značená monoklonální protilátka proti GFP. V našem případě se pokusíme změřit přímo fluorescenci buněk při 509 nm a srovnáme intenzity signálu se stanovením transformantů s luciferázovým expresním systémem.

Pracovní postup: 1. Odstraň médium z kultury buněk. 2. Omyj buňky 1x PBS. 3. Přidej k buňkám 1x Trypsin – 200 l na jednu jamku v 6-ti jamkové desce, (900 l na 100 mm misku 20 l na jamku v 96-ti jamkove desce) – a nech působit cca 5 minut. 4. Odsaj buňky s 1 ml média do zkumavky a stoč (mikrocentrifuga - 2000rpm 5min.). 5. Resuspenduj buňky ve 100 l média a dej na 96-ti jamkovou ELISA desku. 6. Připrav blank (100 l média). 7. Změř fluorescenci na ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: PBS Trypsin Centrifuga ELISA reader s možností měření fluorescence

- 12 -


Detekce luciferázy

Pro studium procesů spojených s genovou expresí se často používájí reporterové systémy. Dají se použít ke studiu expresní aktivity receptoru, intracelulární signální transdukce, skládání proteinů a studium interakcí. Luciferázový systém je používán zejména z následujích důvodů: • Aktivita transfekovaného genu je k dispozici ihned po překladu do proteinu a nevyžaduje její posttranslační zpracování. • Test je velmi citlivý a použité systémy nemají žádnou vnitřní luminiscenci. • Test je rychlý, vyžaduje pouze několik sekund na vzorek. Světlo je produkováno přeměnou chemické energie oxidací luciferinu prostřednictvím elektronového přechodu při tvorbě oxyluciferinu. Luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu pomocí ATP a Mg2+. Promega systém pro detekci luciferázy obsahuje koenzym A pro zlepšení kinetiky, což umožňuje větší enzymatickou výtěžnost a zvýšení světlelné intenzity a stability signálu po dobu nejméně jedné minuty. Při optimálních podmínkách je možné detekovat okolo 10-20 molů luciferázy.

Cílem je změřit chemiluminiscenci u pokusných vzorků připravených transformací plazmidů s luciferázovým expresním systémem.

- 13 -


Pracovní postup: 1.

Odstraň médium z kultury buněk.

2.

Omyj buňky 1x PBS (2ml).

3.

Nalej na buňky 1x lysis reagent – 200 l na jednu jamku v 6-ti jamkové desce (900 l na 100 mm misku 20 l na jamku v 96jamkove desce).

4.

Seskřábni bunky z misky, přenes buňky do mikrozkumavky a odstraň debris (zbytky buněk na dně zkumavky) jemnou centrifugací (15s short spin).

5.

Přenes 20l supernatantu na ELISA desku.

6.

Připrav blank (20l 1x lysis reagent).

7.

Přidej 100l Luciferase Assay Reagent.

8.

Změř intenzitu chemiluminiscence na ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: Promega E1500 Luciferase Assay Systém PBS Škrabka Centrifuga ELISA reader s možností měření chemiluminiscence

- 14 -


Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce Garant: Václav Brázda

Princip a cíl úlohy Polymerázová řetězová reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) je enzymatická metoda umožňující zmnožení úseku DNA její replikací. PCR slouží k vytvoření až mnoha milionů kopií fragmentu DNA, což umožňuje provést analýzu DNA i z velmi malého vzorku. PCR probíhá v termocykleru, který dokáze během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia. Výsledkem PCR je obrovské množství kopií původní sekvence DNA. Metoda je tak citlivá, že dokáže v ideálním případě odhalit i jedinou molekulu DNA ve vzorku. Reverzní transkripční PCR (RT-PCR) se používá pro zmnožení DNA z RNA. Reverzní transkriptáza přepíše sekvenci RNA do cDNA. Tato metoda je používaná pro stanovení exprese genů. Pokud je známa genomová sekvence, může se tato metoda použít také pro mapování exonů a intronů. Kvantitativní PCR (qPCR) slouží k měření množství cílové sekvence. Zpravidla se využívají fluorescenčně značené sondy nebo značení DNA fluorescenční barvou, například SYBR Green pro měření signalu DNA v reálném čase.

Pracovní postup – qPCR:

Izolace mRNA MagMAX-96 total RNA isolation kit AM1830 AB-Ambion Homogenizce vzorku 1. Připrav Lysis/Binding Solution -140 l na reakci - vždy čerstvý. Poměr LysisBinding Solution Concentrate: 100% izopropanolu 11:9). 2. Odstraň z buněk (2,5x102 – 2x106) médium a přidej 140 l Lysis/Binding Solution. 3. Míchej 1 minutu a poté dej zlyzované buňky do ELISA desky na izolaci. Purifikace nukleových kyselin 1. Připrav „Bead mix“ – smíchej 10 l RNA Binding Beads s 10 l Lysis/Binding Enhancer (množství na 1 reakci).

- 15 -


2. Přidej 20 l Mag-Bead Mix ke vzorku, míchej 5 min. 3. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté odstraň opatrně supernatant. 4. Promyj 150 l Wash Solution 1, 1 minutu za míchání. 5. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Promyj 150 l Wash Solution 2 a dej míchat. 7. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 8. Připrav ředění TURBO DNase – 49 l MagMAX TURBO DNase Buffer + 1 l TURBO DNase (množství na 1 reakci).

Štepení DNA a čištění RNA 1. Přidej 50 l TURBO DNasy a míchej 10-15 min. při pokojové teplotě (bez magnetu!). 2. Přidej 100 l RNA Rebinding Solution, míchej 3 minuty. 3. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 4. Omyj 2x 150 l Wash solution 2 a dej míchat. 5. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Vysuš Beads mícháním 2 minuty. 7. Přidej 50 l Elution buffer a míchej 3 minuty. 8. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté supernatant s mRNA přepipetuj do zkumavky pro další použití. 9. Změř vyizolovanou RNA na nanodropu.

Reverzní transkripce High Capacity RNA-to-cDNA Kit (PN 4387406) Použij až 2 g celkové RNA do 20 l reakce Nech kit rozmrznout na ledu, na reakci :

- 16 -


2x RT buffer

10 l

20x RT Enzyme mix

1 l

Nuclease free H20

do 20 l

Vzorek

až 9 l

1. Rozpipetuj reakční směs do zkumavek. 2. Uzavři zkumavky. 3. Stoč a dej na led. 4. Naprogramuj thermal cycler: a. Krok 1 – 37°C 60min. b. Krok 2 – 95°C 5min. c. Krok 3 – 4°C do nekonečna 5. Nastav objem reakce na 20 l. 6. Vlož stripy do cykleru. 7. Spusť. 8. Po ukončení reverzní transkripce přečistíme cDNA pomocí QIAquick Nucleotide Removal Kitu (Quiagene, 28306). 9. Změříme koncentraci cDNA na nanodropu.

Uložení – do 24hod. 2-8°C, dlouhodobě -15 až -25°C

qRT-PCR na AB 7300 Příprava PCR reakce – SYBR Select Master Mix

Připrav cDNA, pro optimální q-PCR použij množství cDNA do 100ng na 20l vzorek. Promýchej SYBR Select Master Mix před použitím. Pro optimální výsledky je doporučeno provést reakci ve čtyřech opakováních.

Reakce pro 96-ti jamkovou desku: SYBR Select Master Mix

10 l

Primery (150-400nM)

- 17 -


cDNA template (10 a 100ng) 20 l

Celkem

Zamíchejte a opatrně stočte, aby byl vzorek bez bublin. Přeneste na PCR desku a uzavřete PCR vršky, lehce stočte, aby ve vzorcích nebyly bublinky (vlastní PCR by se měla jet do 72 hodin, vzorky uchovávejte ve tmě). Dejte do termocykleru AB 7300. Nastavte PCR reakci dle teploty tání (Tm) vašich primerů. 1. Aktivace

-

Hold 50°C 2 min.

2. Aktivace polymerázy

Hold 95°C 2 min.

3. 40 cyklů

Denaturace

95°C 15 sec.

4.

Anneal/Extend

60°C 1 min.

Nastavte dissociační krok. Nastavte objem reakce na 20 l. Spusťte „run“.

- 18 -


Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza Garant: Petr Šebest

Transformace, selekce a kultivace bakterií

Princip úlohy: Transformace je přenos DNA (v našem případě se jedná o plazmidovou DNA) do hostitelských bakteriálních buněk. Bakteriální buňky musejí být nejprve uvedeny do stavu kompetence, ve kterém jsou schopny cizorodou DNA přijmout. Stav kompetence lze u buněk Escherichia coli navodit působením chloridu vápenatého za nízké teploty (0 °C). Po přidání DNA a zahřátí na 42 °C a následném ochlazení na 0 °C (teplotní šok) přechází transformující DNA do buněk. Transformované buňky se selektují na agarových plotnách obsahujících příslušné antibiotikum. Vyselektované buňky se přeočkují do média s antibiotikem a inkubují se přes noc při teplotě 37 °C. Úspešnost transformace je udávaná 1x109 cfu/µg superhelikální DNA. Pracovní postup: 1. den: 50 min. - 3 hod. přestavka – 10 min. 2. den: 15 min. Po celou dobu pracujte sterilně a se sterilním materiálem (špičky, hokejky, ependorfky). 1. Kompetentní buňky E. coli TOP10 udržujte na ledu a napipetujte do ependorfky 10 µl. 2. Přidejte příslušnou DNA (500 ng) – pBSK nebo pPGM1. 3. Nechejte 30 min. na ledu. 4. Rozehřejte termoblok na 42°C. 5. Transformace teplotním šokem: 45 sec. na 42°C a poté 5 min. na ledu. 6. Nechejte termoblok zchladnout na 37°C. 7. Přidejte 50 µl SOC média a nechejte kultivovat na termobloku 3 hod. při 37°C a 400 rpm.

- 19 -


8. Vysejte na misky s Amp (napipetovat na misku a rozetřít hokejkou). 9. Inkubujte přes noc v termostatu při 37°C. 10. Z nejlepší kolonie odebrat špičkou buňky a přeočkovat do tekutého média s Amp, inkubujte na třepačce do druhého dne při 37°C

- 20 -


Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza Princip úlohy: Plazmidy jsou mimochromozómové genofory tvořené kružnicovou dsDNA. V bakteriálních buňkách se vyskytují v jedné až několika tisících kopií na buňku a jsou snadno dostupným zdrojem homogenní DNA. V přirozeném stavu v buňce mají plazmidy zpravidla negativní nadšroubovicové vinutí. Pro izolaci plazmidů pBluescript a pPGM1 použijeme metodu alkalické lýze s přídavkem SDS (Invisorb Spin Plazmid Mini Two kit), která vede k uvolnění vnitřního obsahu buněk. Plazmidová DNA, chromozomální DNA a proteiny jsou denaturovány a v dalším kroku dochází k jejich precipitaci kromě plazmidové DNA, která je renaturována a zůstává v roztoku. Následně je zachycena na koloně a nakonec uvolněna elučním pufrem. Pro další analýzy plazmidů použijeme restrikční endonukleázy. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit – metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. V našem případě použijeme RE PvuII, která štepí námi izolovanou DNA ve 2 místech, takže získáme 2 fragmenty.

Obr.: Plazmidy použité při transformaci

- 21 -


Pracovní postup: 3. den: 3 hod. 1. 2 ml bakteriální kultury přenést do mikrocentrifugační zkumavky (ependorfky). 2. Centrifugujte v ependorfce 1 min. 13000 rpm a odlijte supernatant. 3. Rozsuspendujte pelet v 250 µl roztoku A vortexováním nebo pipetováním, tak aby nebyly viditelné žádné shluky buněk. 4. Přidejte 250 µl roztoku B, a zamíchejte opatrně otočením ependorfky 5 krát (ne však déle než 5 minut). Nevortexovat! 5. Přidejte 250 µl roztoku C a zamíchejte jemně ale důkladně zatřepáním 4 až 6krát. Centrifugujte 5 minut při otáčkách 13000 rpm. Nevortexovat! 6. V průběhu centrifugace si připravte čisté ependorfky a umístěte do nich vazebnou kolonu. 7. Přelijte supernatant na kolonu a inkubujte 1 min. Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. 8. Vylijte filtrát a přidejte 750 µl promývacího roztoku (wash solution). Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. Vylijte filtrát. 9. Stočte 3 min. při 13000 rpm, aby došlo ke kompletnímu odstranění zbytkového etanolu. 10. Umístěte kolonku do nové ependorfky a přidejte 50-100 µl elučního pufru. Inkubujte 1 min. (až 10 min.) při pokojové teplotě a nechejte centrifugovat 1 min. 10300 rpm. 11. Změřte koncentraci DNA na nanodropu. 12. 1 µg superhelikální DNA napipetujeme do čisté zkumavky. 13. Přidejte 1/10 objemu pufru z celkového výsledného objemu pro danou RE a 2U RE PvuII a vodu do výsledného objemu 20 µl. 14. Promýchejte a dejte na 37 °C/1 hodinu. 15. V mezičase připravte 1,3% agarózový gel s 1x TAE pufrem. 16. Naneste vzorky na agarózový gel 10 µl + 1ul nanášecího pufru. 17. Zapněte elektroforézu na 100 V na 45 minut.

- 22 -


Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie Garant: Iva Kejnovská

Princip a cíl: Spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD) je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. Postupným přidáváním činidel je možné vyvolat přechod z jedné uspořádané struktury do druhé. Kooperativnost přechodu spočívá v tom, že v úzkém rozmezí měnících se podmínek dojde ke změně natočení bazí a přitom je překonána energetická bariéra mezi lokálními enegetickými minimy. Příkladem kooperativního přechodu je přechod mezi dvoušroubovicí formy B do formy A působením dehydratačního účinku trifluoretanolu (TFE). V závislosti na primárním složení DNA, tedy na obsahu bazí, je možné vyvolat stejným činidlem přechod do jiné stuktury. Ve druhé úloze s DNA složenou z opakující se CG sekvence působením TFE dojde k přechodu do levotočivé formy Z.

I. B-A přechod Pracovní postup: (120 minut)

1.

Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 60 l připraveného heteroduplexu DNA: GCGGCGACTGGTGAGTACGC . GCGTACTCACCAGTCGCCGC a přidejte 90 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum.

2.

V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. T1.

- 23 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Tn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

l]

TFE l]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě l]

[%]

90 30 30 35 45

Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě A, výchozí formě B.

II. B-Z přechod Pracovní postup: (120 minut)

1. Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 56

l zásobního

roztoku oligonukleotidu (CG)4 a přidejte 84 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum.

2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. Z1.

- 24 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Zn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

l]

TFE l]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě l]

[%]

84 20 30 40 50

Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě Z, výchozí formě B.

Seznam potřebného vybavení a chemikálií:  dichrograf  křemenné kyvety  oligonukleotidy  trifluoretanol

- 25 -


Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese Garant: Jan Špaček

Princip a cíl: Detekce hybridizace DNA (analýza nukleotidových sekvencí) a analýza genové exprese patří mezi důležité úkoly moderní molekulární diagnostiky. Elektrochemické metody mohou hrát významnou roli ve vývoji nových detekčních technik v této oblasti. DNA je elektroaktivní biopolymer poskytující na různých pracovních elektrodách řadu analyticky využitelných signálů. V některých případech se jeví jako výhodnější přístup využití značení DNA elektroaktivnímy značkami, které poskytují vlastní elektrochemické signály. Aplikace těchto značek v analýze nukleotidových sekvencí je zvláště výhodná, neboť umožňuje velmi selektivně detekovat cílovou DNA (specifickou DNA) v nadbytku ostatní (nespecifické DNA). Jednou z metod, jak připravit takto značenou DNA je inkorporace chemicky modifikovaných nukleotid trifosfátů do DNA pomocí Polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato úloha bude zaměřena na přípravu DNA obsahující 7-deazaguanin (dG*) a 7-deazaguanin modifikovaný nitrofenylem v poloze 7 (dGNO2) pomocí PCR a jejich následnou elektrochemickou detekci. O

dG*TP HN H2N O O O HO P O P O P O OOO-

dG

NO2

TP HN

N N

H2N O O O HO P O P O P O OOO-

O OH

N N

O OH

- 26 -

NO2

O


Pro procvičení před začátkem úlohy doplňte obrázek pojmy z tabulky: 5‘

elongace

templát

5‘

polymeráza

dNTP

3‘

annealing

3‘

primer

PCR Každá skupina připraví dvě reakční směsi. 1. Reakční směs: PCR s dGNO2TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (bluescript = plazmidová DNA) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µM primery 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dGNO2TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek)

2. Reakční směs: PCR s dG*TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (cDNA připravená v předchozí úloze) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µM primery

- 27 -


0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dG*TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek)

Takto připravené směsi rozdělte do malých, 200 µl, zkumavek po 30 µl. Reakční směsi v 200 µl zkumavkách umístěte do thermocycleru a spusťte program: 30 cyklů: Denaturace: 94°C, 90 s Nasedání primerů: 60°C, 30 s Prodlužování řetězců: 72°C, 180 s

Počítací úloha Spočítejte, kolik kusů dATP je v každé 200 µl zkumavce (NA = 6,022·1023 mol-1) a jakou hmotnostní koncentraci mají oba primery dohromady v 30 µl výše popsané reakční směsi (délka 20 bazí, průměrná hmotnost 330 g·mol-1).

dATP =

koncentrace primerů =

Analýza PCR produktů na agarózovém gelu: Úspěšnost reakce zjistíme pomocí elektroforézy v 1 % agarózovém gelu (100 V / 30 min, 1x TAE pufr), následným obarvením gelu v ethidium bromidu a vyfocením po ozáření UV světlem. Přečištění produktů PCR Produkt PCR je po dokončení reakce stále ve směsi s přebytkem nukleotidů a primerů, které by zhoršily elektrochemickou analýzu. Proto je nutné provést přečištění. To provedeme PCR purification kitem od firmy Qiagen podle standardního protokolu, který je součástí kitu.

- 28 -


Elektrochemické měření 1) PCR produkty značené dG*: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie na „tužkové“ uhlíkové elektrodě v 0,2 M acetátovém pufru pH 5. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0,3 V

konečný potenciál:

1,5 V

frekvence:

200 Hz

2) PCR produkty značené dGNO2: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické voltametrie na visící rtuťové kapkové elektrodě ve 0,3 M fosfátovém pufru s mravenčanem amonným pH 7. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0V

potenciál bodu obratu:

-1,85 V a -0,75 V

konečný potenciál:

0 V a 0,1 V

rychlost posuvu potenciálu:

1 V/s

- 29 -

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením

Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2013 Česká Republika První vydání

ISBN: 978-80-87541-06-7

Labolatoř molekulárních komplexů chromatinu

CEITEC a Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

1. praktický

Kurz pokročilých mikroskopických technik 11. - 14. března 2013 Praktické seznámení s pokročilými mikroskopickými technikami, které jsou využitelné v laboratořích se zaměřením na experimentální biologii, biochemii a biofyziku. Budou představeny • Pokročilé mikroskopické techniky FRAP, FLIM, FRET, FCS • Účastníci se seznámí s konfokální mikroskopií a jejím využití pro in vivo experimenty a mikroskopii v reálném čase Místo konání Brno, Univerzitní kampus Bohunice, blok A2, seminární místnost 2.11 praktická výuka bude probíhat v laboratořích UKB Přihlášení Zájemci se přihlásí prostřednictvím e-mailu na [email protected] Ctirad Hofr, Ph.D. Seminář je organizován v rámci projektu OP VK Rozvoj moderních trendů v experimentální biologii: význam biomolekulárních interakcí pro funkci buněčných struktur CZ.1.07/2.3.00/30.0019.

www.modexbio.cz

Kurz pokročilých mikroskopických technik MU Brno 11. - 14. březen 2013 teoretický blok Úvod do pokročilých metod

Pondělí

konfokální mikroskopie, přístrojové vybavení,

organizace kurzu

oběd

praktický blok Praktické seznámení s konfokálním mikroskopem Tipy a triky pro optimální nastavení pozorování vzorků

Příprava vzorků pro měření za

Úterý

Středa

Využití časově rozlišené

použití FLIM

fluorescence FLIM

Vyhodnocení doby dohasínání

v mikroskopii biologických

fluorescence u preparátů

preparátů

Nejčastější chyby začátečníků

Principy a přístrojové

Příprava vzorků pro měření za

vybavení pro provedení

použití metody FRAP a FRET

experimentů metodami

Vyhodnocení výsledků měření

FRAP a FRET

FRAP za použití software ImageJ

Čtvrtek

Kvantitativní studium

Příprava preparátů pro měření

interakce biomolekul za

za použití fluorescenční

použití fluorescenční

korelační spektroskopie

korelační spektroskopie

Základní nastavení pro FCS

FCS

měření in vitro

OSNOVA POKROČILÉ METODY STUDIA

1. Fluorescence a fluorescenční molekuly 2. Epifluorescence a konfokální mikroskopie 3. Fluorescenční molekuly a jejich vlastnosti 4. FRAP, FLIP 5. FCS, FLIM, FRET

BIMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ 11.-12. únor 2013

1

FLUORESCENCE JABLONSKI DIAGRAM

Vlastnost molekul: e- absorbují photony and tím získávají energii Část této energie je emitována jako fluorescence Emise probíhá v delších vlnových ¨délkách než excitace

Martin Chalfie Osamu Shimomura Roger Y. Tsien 2008 Nobel prize 3

2

FLUORESCENČNÍ MOLEKULY a jejich vlastnosti

AUTOFLUORESCENCE chlorofyl, karotenoidy, proteiny (Trp, Tyr, Phe), DNA SPECIFICKÁ FLUORESCENCE fluorofory fúzované s proteiny (GFP) nebo s DNA, sloučeniny a barviva interkalující se do DNA a biologických membrán atd.

(EPI)FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE

Fluorofory – polyaromaticke a heterocyklické sloučeniny Fluorescence lifetime – čas, po který fluorofor zůstává v excitovaném stavu než předá/emituje foton (fluorescence lifetime imaging)

4

Cyklický proces, destrukce fluoroforu asociovaná s neradioaktivním rozkladem

UV-light mediated emission

Quantum Yield - poměr mezi emitovanými a absorbovanými fotony, hodnota by měla být co nejvyšší na škále 0-1 (GFP 0,7)

FITC (fluorescein isothiokyanát) - maximum emise mezi 500-600 nm Hoechst (bisbenzimid) - barví DNA. DAPI - váže se na DNA a RNA (barví se modře). Ethidium bromid - váže se na dvouřetězcovou DNA a RNA (svítí oranžově). Propidium Jodid - Barví DNA (červeně). Akridinová oranž - váže se na DNA (barví se zeleně) a RNA (barví se tmavě červeně). Congo Red - váže se na amyloid (barví se růžově)

6

1

FLUORESCENCE IN VIVO FLUORESCENČNÍ PROTEINY

FLUORESCENČNÍ PROTEINY

FLUORESCENČNÍ PROTEINY CFP - ECFP - Cerulean BFP - EBFP YFP-EYFP-Venus

GFP – green fluorescent protein •Izolovaný z Aequorea victoria

Pro experiment s více FP, emisní a excitační spektra musí být dobře separována

Genetické inženýrství

•Společně s proteinem aequorin přeměňuje Ca2+ závislou chemiluminiscenci na fluorescenci

Ser65, Tyr66, Gly67

Pro některé pokročilé mikroskopické techniky se spektra použitých molekul musí překrývat – FRET, FRET-FLIM

•Sbaluje se do barelové struktury stabilizující celou molekulu

doba potřebná pro maturaci GFP je asi 6 hod

FLUORESCENČNÍ PROTEINY http://translate.google.cz/translate?hl=cs&langpair =en|cs&u=http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentprotein s/pagfpchroma/index.html

8

9

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE Fotoaktivovatelné a proteiny s ON/OFF módem •fluoreskují až po aktivaci UV světlem

12

PA-mRFP, PA-mCherry..etc

10

11

2

ZÁKLADNÍ APLIKACE

Fluorescenční molekuly a jejich vlastnosti

POKROČILÉ TECHNIKY KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/PODBworld/en/



Organely rostlinné buňky Základní aplikace konfokalní mikroskopie je získání a analýza obrazu

13

FRET-FLIM (FRET Lifetime imaging) FCS (Fluorescence Correlation Spectroskopy) a další



Photobleaching – opakovaná excitace a emise



Resonance Energy transfer – Foster 1940, neradioaktivni

přenos energie mezi excitovaným fluoroforem (donor) a dalším fluoroforem, jehož excitační spektrum leží v oblasti emisního spektra donoru (akceptor)

14

FRAP/iFRAP

POKROČILÉ TECHNIKY Time-lapse microscopy (mikroskopie v čase) – základ pro všechny ostatní pokročilé techniky FRAP/iFRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) FLAP (Fluorescence Localisation after photobleaching) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Quenching (zhášení) – dynamic-, static-, self-, colormění intenzitu fluoroforu a někdy snižují lifetime

posouvají rozlišení mikroskopie do oblastí, kde rozdíly nejsou detekovatelné okem – mikrospektroskopie kombinují výhody analýzy vzorků v kyvetě spektroskopicky (přesnost, vysoké rozlišení i při relativně nízkých koncentracích) a mikroskopie (sledování dynamiky jevů in vivo, tj. přímo v živém materiálu) výsledkem experimentu není obrázek, ale naměřené hodnoty



FRAP

 

Technika vyvinuta v 1970s, Axelrod et al Původně pro studium difúzních koeficientů molekul Dnes využíváno v buněčné biologii pro: měření difúze a pohybu molekul v buňce sledování kompartmentalizace a propojení uvnitř buněk sledování pohybu/výměny molekul mezi jednotlivými kompartmenty

určení vazebných vlastností molekul KAM, ODKUD, JAK RYCHLE

3

FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)

FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)

FRAP/iFRAP

Princip: lazer o vysoké síle vypálí (vybělí) fluorescenční molekuly v místě zájmu, jde o pulz světla Návrat molekul~obnovení fluorescence~dynamika proteinu

19

FRAP nastavení mikroskopu 

Software

20

FRAP experiment  



Rozlišení





Rychlost skenování





Efektivita vysvícení

 

vyhledání objektu zájmu nastavení parametru mikroskopu výběr a označení regionu zájmu, nastavení času, po který je nutno experiment provádět nastavenení fluorescenčního pozadí, hladiny vysvícení vzorku v důsledku skenování korekce pohybu, ztráty roviny zaostření, schopnosti detekvat daný jev jevy velice pomalé vs velice rychlé

23

24

4

FLIP (Fluorescence loss in photobleaching)

FRAP vyhodnocení

APLIKACE-FLIP – sledování pohybu mRNA v buňce

Princip metody podobný jako u FRAP region je vysvěcován opakovaně v čase, zatímco a změny fluorescence jsou sledovány v okolních regionech.

25

Aplikace FLAP - sledování organizace chromatinu při dělení

26

ÚLOHA

Výsledky-vzorek 1

1. Popsat fluorescenci v různých částech rostlin u 3 neznámých vzorků 2. Provézt FRAP u vzorku 1 a 2 3. Pokusit se odhadnout o jaké vzorky se jedná

Gerlich et al, Cell 2003

5

Výsledky vzorek 2

POKROČILÉ TECHNIKY

POKROČILÉ TECHNIKY KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

Vzorek 3

Time-lapse microscopy (mikroskopie v čase) – základ pro všechny ostatní pokročilé techniky FRAP/iFRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) FLAP (Fluorescence Localisation after photobleaching) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

posouvají rozlišení mikroskopie do oblastí, kde rozdíly nejsou detekovatelné okem – mikrospektroskopie kombinují výhody analýzy vzorků v kyvetě spektroskopicky (přesnost, vysoké rozlišení i při relativně nízkých koncentracích) a mikroskopie (sledování dynamiky jevů in vivo, tj. přímo v živém materiálu) výsledkem experimentu není obrázek, ale naměřené hodnoty

FRET-FLIM (FRET Lifetime imaging) FCS (Fluorescence Correlation Spectroskopy) a další

32

FRET – Fluorescence (Foster’s) Resonance Energy Transfer  



Kolokalizace vs interakce Rozlišení v desítkách nm (mikroskop 200nm)

Vzdálenost mezi donorem a akceptorem je minimální (2-10nm)



Excitační a emisní spektra akceptora a donora se překrývají Ideální FRET fluorescenční páry:

Účinnost FRET E frakce energie, která se přenese na akceptor při jedné excitační události (kvantový výtěžek,počet událostí vztažených na 1 foton absorbovaný systémem) E= kvantum energie přenesené donoru na akceptor po excitaci celkové množství energie absorbované donorem

původně nejčastěji používané CFP/YFP mTFP1/EYFP (long fluorescence lifetime, decay fitted to single exponent, no photoconversion) mRFP/EGFP, mSrawberry/EGFP, ECFP/EGFP

Neradioaktivní přenos energie

(Polarisation anizotropy)  Sensitized emission  Acceptor bleaching  Fluorescence lifetime imaging

FRET - parametry

FRET - prerekvizity 





Kritická vzdálenost (radius) R0

vzdálenost mezi donorem a akceptorem když je účinnost FRET 50%

Molekuly mají stejně orientované dipólové momenty Pro některé pokročilé mikroskopické techniky se spektra použitých molekul musí překrývat – FRET, FRET-FLIM

6

FRET

FRET-aplikace

METODY MĚŘENÍ FRET POMOCÍ MĚŘENÍ INTENZIT FLUORESCENCE Sensitised emission

Měření intenzity fluorescence donoru a akceptoru mikroskopicky (konfokální, epifluorescenčním) Závislé na koncentraci akceptoru a donoru Nutno korigovat - prosvěcování fluorescence donoru do detekčního kanálu akceptoru - excitaci akceptor při excitaci donoru

Acceptor photobleaching Intenzita akceptoru a donoru je měřena před a po aplikaci silného pulzu lazeru, který vysvítí akceptor Výsledkem je zvýšení intenzity fluorescence donoru Nutno povádět na fixovaném materálu aby se omezila difuze vzorku

3500 before pb

3000

after pb

2500 intensity

Spectral imaging Měření spekter jednolivých fluoroforů použitých pro FRET Umožňuje kvantitavní analýzu FRET namísto pouhé vizualizace

2000 1500 1000 500 0 400

450

500

550

600

650

wavelength

METODY MĚŘENÍ FRET POMOCÍ FLIM

FRET-FLIM

FRET-FLIM

LIFETIME= průměrný čas po který molekula zůstává v excitovaném stavu.

FRET by lifetime

Stanovujeme fluorescence lifetime donoru Přítomnost akceptoru může signifikantně tento parametr měnit Měření signálu donora Výsledek není ovlivněn koncentrací molekul ve vzorku, vysvěcováním či intenzitou signálu

Přídatná relaxační dráha která způsobí, že se excitovaná molekula dříve zbaví svojí přebytečné energie

7

FLIM požadavky TCSPC (time correlated single photon counting modul) Pulzní lazer- umožnuje dávkování fotonů na detektor v čase V několika časových intervalech dochází ke sběru fotonů na detektoru, získáme histogram vyjadřující úbytek fluorescence v čase, z něhož je přímo počítám fluorescence lifetime Analýzuje me rozložení fotonů pro každý pixel ve vzorku a místa, kde prpobíhá FRET Modely: 1 komponenta 2 komponenty a více

FLIM shows a decrease in fluorescence lifetime of the donor (CFP) upon interaction with an acceptor ( YFP)

Název prezentace v zápatí

45

8

ÚLOHA Pozorování preparátu 1. Vložte vzorek do mikroskopu a pomocí procházejícího světla a okuláru s malým zvětšením, najděte rovinu zaostření 2. Pokud máte zaostřeno, pod filtrem pro GFP zkontrolujte hladinu exprese ve vzorku. 3. Přepněte na zvětšení 40-60x , doostřete 4. Přepněte software na konfokální mode 5. Pomocí SMART setup nastavte konfokální snímání pro detekci GFP a mCherry 6. Snažte se získat co nejlepší obraz v obou kanálech 7. Posuďte, zda jde o pozadí, signál , posuďte jeho intenzitu 8. Prohlédněte si, jak vypadá se GFP signál v kořeni, hypokotylu, listu 9. Posuďte, zda se GFP lokalizuje do nějakých konkrétních kompartment buňky a zda se toto liší v různých částech rostlinného materiálu FRAP: 10. Začněte skenovat vzorek a pořádně si prohlédněte rozložení fluorescence ve vzorku 11. Popřemýšlejte, na co se díváte. Vidíte buňky ANO NE membrány ANO NE jádra ANO NE jadérka ANO NE chloroplasty ANO NE mitochondrie ANO NE Otázka: Pokud si myslíte, že se díváte na membránu, jádro, jak byste to ověřili. 12. Vyberte si jednu malou část uvnitř buňky např. uvnitř jádra či cytolazmy 13. Vyberte si pro FRAP co nejmenší region a sledujte, jak vypadá návrat fluorescence 14. V několika po sobě jdoucích experimentech postupně zvětšujte region zájmu pro vysvícení a pozorujte návrat fluorescence 15. Nakonec vyberte celou buňku a vysviťte a sledujte návrat fluorescence. 16. Měňte nastavení mikroskopu – gain, laser power, resolutiona, sledujte, jak to ovlivňuje výsledek vašeho experimentu

Manual for a course in advanced microscopic techniques, March 2013:

-

-

Introduction to Zeiss’es LSM780 confocal microscope with a spectral detector (GaAsP spectral detector) Visualization of Alexa Fluor 488-phalloidin-stained actin cytoskeleton in HEK293T cells (human embryonic kidney cells) with the use of different:  lasers: argon-ion laser, tunable laser (In Tune)  pinhole size  voltage on photomultiplier tubes (PMTs)  offset  digital gain  averaging

lecture about fluorescence correlation/cross correlation spectroscopy, FCS/FCCS preparation of dilutions of fluorescent dyes: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 633, in concentrations: 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM measuring dynamics of fluorescent particles in solutions, in glass chamber slides, with the use of argon-ion/He-Ne lasers and GaAsP detector – calibration experiment.

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

Praktický kurz pokročilých metod experimentální biologie

konaný na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v Ostravě v termínu 17. 1. – 23. 1. 2013

Program praktického kurzu Čtvrtek 17. 1. 2013

Pátek 18. 1. 2013

Pondělí 21. 1. 2013

Bakteriální identifikace Detekce apoptózy Identifikace s využitím souprav pomocí ELISA kitu. mikroorganismů izolovaných ze vzorků MIKRO-LA-TEST; Hodnocení růstu potravin s využitím systému Biolog GEN mikrobiálních kultur automatizovaným III MicroLog M systémem BIOSCREEN C

Úterý 22. 1. 2013

Středa 23. 1. 2013

Jednobuněčná gelová Biochemická analýza elektroforéza proteinů krevního séra (kometový test) pomocí gelové elektroforézy.

Identifikace mikroorganismů izolovaných ze vzorků potravin s využitím systému Biolog GEN III MicroLog M Identifikační systém Biolog GEN III MicroLog M slouží k identifikaci mikrobiologických kultur na základě přesných patentovaných biochemických testů, provedených v 96 jamkových destičkách (obr. 1).V kombinaci s širokou databází mikroorganismů se jedná o jeden z nejpřesnějších systémů mikrobiální identifikacea umožňuje identifikaci aerobních bakterií. Pomocí tohoto systému je možné v jednom testu stanovit jak grampozitivní, tak gramnegativní bakterie. Každá mikrodestička GEN III obsahuje 94 biochemických testů: 71 testů utilizace zdroje uhlíku (obr. 2, sloupce 19) a 23 senzitivních chemických testů (obr. 2, sloupce 10-12). Jamky, kolorimetricky indikující využití zdroje uhlíku, obsahují tetrazoliové redoxní barvivo. Před provedením inkubace jsou všechny jamky mikrodestičky bezbarvé. V případě pozitivní reakce dochází během inkubace k redukci tetrazoliového barviva a viditelné změně zbarvení jamky (tvorba fialového zbarvení). Jamka A-1 (obr. 2) představuje negativní kontrolu (bez zdroje uhlíku). Mikrodestička obsahuje také pozitivní kontrolu (obr. 2, jamka A10), tato jamka je srovnávána s výsledky chemických zkoušek v sloupcích 10-12. Po inkubaci jsou zjištěné výsledky (pozitivní, negativní reakce) vyhodnocovány pomocí softwaru, jež je součástí identifikačního systému Biolog. Mezi nesporné výhody této metody patří získaní výsledků identifikace už od 3 hod., což dovoluje vyhodnotit získané výsledky během jednoho bloku cvičení. Jednou z možností aplikace tohoto identifikačního systému je jeho využití pro určení vykultivovaných rodů a druhů mikroorganismů z vybraných vzorků potravin. Způsob odběru vzorků z potravin k mikrobiologickému zkoušení a postupy mikrobiologického zkoušení se stanoví podle příslušných technických norem (v případě použití jiných metod – musí být jejich validací doloženo, že jsou co do citlivosti, správnosti a reprodukovatelnosti výsledků ekvivalentní metodě podle české technické normy). Obr. 1. Ident ifika ční mikr odest ička GEN III

Obr. 2. Rozvržení biochemických testů na mikrodestičce GEN III

Materiál: A. Odebrané vzorky potravin na mikrobiologický rozbor

B. Média a chemikálie  Maximum Recovery Diluent- ředicí roztok  Violet Red Bile Glucose Agar w/o Lactose  Violet Red Bile Agar 1,2%  Nutrient Agar 1,5%  Tryptone Yeast Extract Agar w/ BCP  Oxidase Discs (50 discs / vl)  Mikrodestičky GEN III  Turbidity Standard  Biolog Universal Growth (BUG) Agar  Inoculating Fluid (IF) C. Laboratorní vybavení: Petriho misky, očkovací kličky, skleněné tyčinky, zkumavky, stojany na zkumavky, pipety, špičky, mikropipety, 8-multikanálová mikropipeta, ochranné rukavice, homogenizátor, váhy, termostat, autokláv, horkovzdušný sterilizátor, vodní lázeň, pH metr, spektrofotometr, kahan.

Referenční kultury(doporučené výrobcem):

   

Escherichia coli(ATCC 11775) Paenibacillus polymyxa (ATCC 842) Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637)

Postup práce: Úkol A. Izolace a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae (fermentují glukózu a mají negativní oxidázovou reakci - VČŽG médium- agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a glukózou). 1. Připravíme řadu desetinásobných ředění ze zkušebního vzorku, je-li výrobek tekutý, nebo z výchozí suspenze v případě ostatních výrobků. 2. Použijeme dvě sterilní Petriho misky. Do každé z nich sterilní pipetou přeneseme po 1 ml vzorku. Tento postup opakujeme s dalšími ředěními. 3. Inokulum v každé Petriho misce přelijeme 10 ml živné půdy (44-47 ºC). Doba, která uplyne mezi ukončením přípravy výchozí suspenze (nebo ředění 10-1 je-li produkt tekutý) a přelitím inokula nesmí přesáhnout 15 min. 4. Inokulum s půdou pečlivě promícháme kolébáním Petriho miskou ve vodorovné poloze a směs necháme utuhnout ponecháním Petriho misek na chladné vodorovné ploše. 5. Po úplném ztuhnutí půdy převrstvíme půdu dalšími 15 ml živné půdy, aby se zabránilo plošnému přerůstání a bylo dosaženo semianaerobních podmínek. Půdu necháme utuhnout. 6. Inokulované plotny obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme v termostatu při 37 ºC po dobu 24 h ± 2 h. Hodnocení výsledků a úkoly ke zpracování:  Po provedené inkubaci vyberte plotny obsahující méně než 150 charakteristických kolonií a tyto kolonie spočítejte (Charakteristické kolonie jsou růžové až červené nebo fialové, se zónou nebo bez zóny precipitace). Pak náhodně vyberte pět takovýchto kolonií pro subkultivaci pro biochemické konfirmační zkoušky.  Subkultivace vybraných kolonií – na živný agar rozočkujte všechny kolonie vybrané pro konfirmaci. Tyto plotny inkubujte při 37 ºC po dobu 24 h ± 2 h. Z každé inkubované plotny vyberte dobře izolované kolonie pro biochemické konfirmační testy – oxidázová reakce a zkouška fermentace.  Oxidázová reakce: s použitím kličky nebo jehly nebo skleněné tyčinky odeberte část dobře izolované kolonie a rozetřete na filtrační papír zvlhčený oxidázovým činidlem nebo na komerčně dostupný disk. Nikl-chromová klička se nesmí použít. Zkouška se považuje za negativní, když barva filtračního papíru neztmavne během 10 s. V případě hotových disků se výsledek hodnotí podle návodu výrobce.  Zkouška fermentace – kolonie, které poskytly negativní oxidázový test, naočkujte vpichem do zkumavek s glukózovým agarem. Tyto zkumavky inkubujte při 37 ºC po dobu 24 h ± 2 h. Reakce se hodnotí jako pozitivní, když se obsah zkumavky zbarví žlutě.  Kolonie, které jsou oxidáza negativní a glukóza pozitivní jsou potvrzeny jako Enterobacteriaceae. Na základě zjištěných výsledků stanovte počet mikroorganismů v mililitru nebo v gramu vzorku z počtu kolonií získaných na vybraných plotnách.



U vybraných izolátů proveďte identifikaci mikrobiální kultury pomocí systému Biolog GEN III MicroLog M – úkol C.

Úkol B. Izolace a stanovení počtu koliformních bakterií (VRBL médium - agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a laktózou). 1. Připravíme řadu desetinásobných ředění ze zkušebního vzorku, je-li výrobek tekutý, nebo z výchozí suspenze v případě ostatních výrobků. 2. Použijeme dvě sterilní Petriho misky. Do každé z nich sterilní pipetou přeneseme po 1 ml vzorku. Tento postup opakujeme s dalšími ředěními. 3. Inokulum v každé Petriho misce přelijeme 15 ml živné půdy (45 ± 0,5ºC). Doba, která uplyne mezi zaočkováním do Petriho misek a přelitím inokula nesmí přesáhnout 15 min. 4. Inokulum s půdou pečlivě promícháme kolébáním Petriho miskou ve vodorovné poloze a směs necháme utuhnout ponecháním Petriho misek na chladné vodorovné ploše. 5. Po úplném ztuhnutí půdy přelijeme povrch zaočkované půdy ještě 4 ml téže půdy a necháme utuhnout popsaným způsobem. 6. Inokulované plotny obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme v termostatu při 30 ºC, 35 ºC nebo 37 ºC po dobu 24 h ± 2 h. Hodnocení výsledků a úkoly ke zpracování:  Po provedené inkubaci spočítejte charakteristické kolonie koliformních bakterií v každé misce, ve které nevyrostlo více než 150 kolonií. Charakteristické kolonie jsou fialově červené, o průměru 0,5mm nebo větším, někdy obklopené červenavou zónou precipitované žluče.  Na základě zjištěných výsledků stanovte počet mikroorganismů v mililitru nebo v gramu vzorku z počtu kolonií získaných na vybraných plotnách.  U vybraných izolátů proveďte identifikaci mikrobiální kultury pomocí systému Biolog GEN III MicroLog M – úkol C. Poznámka: Způsob vyjádření nejvyšší mezní hodnoty počtu mikroorganismů (NMH): Způsob vyjádření přípustné hodnoty (PH) A. Množství mikroorganismů v 1 g nebo v 1 ml vzorku – vyšetřuje se plotnovými metodami technikou počítání kolonií, jako mikroorganismy se počítají jednotky tvořící kolonie (cfu). B. Požadavek nepřítomnosti mikroorganismů v navážce nebo objemu vzorku určených k vyšetření, jak jsou uvedeny za šikmou čarou po čísle nula (vyšetřuje se naočkováním celé této navážky nebo celého objemu vzorku do příslušné tekuté půdy s následným pomnožením, vyočkováním na plotnové půdy a potvrzením podezřelých kolonií – např. negat/25). Ředění: Výchozí suspenze (primární ředění): suspenze, roztok nebo emulze získaná poté, kdy odvážené či objemově odměřené množství výrobku určeného ke zkoušení (nebo odvážené či objemově odměřené množství analytického vzorku z výrobku připraveného)

bylo smícháno s devítinásobným množstvím ředicího roztoku a poté, kdy velké částice, pokud byly přítomny, byly ponechány sedimentovat. Další desetinásobná ředění: suspenze nebo roztoky získané smícháním určeného objemu výchozí suspenze s devítinásobným objemem ředicího roztoku a opakováním této pracovní operace s každým takto připraveným ředěním postupně tak, až se získá série desetinásobných ředění vhodná k inokulaci kultivačních půd. Úkol C. Identifikace získaných mikrobiálních izolátů pomocí systému Biolog GEN III MicroLog M 1. Mikrodestičky GEN III a inokulační roztok ponecháme před zahájením experimentu vytemperovat při pokojové teplotě. 2. Z čisté 24h kultury (připravené přeočkováním kultury na živném médiu BUG) připravíme pomocí inokulačního roztoku (IF) suspenzi tak, aby hustota buněk odpovídala 90-98% T. Před přípravou inokula nezapomeneme provést kalibraci přístroje. 3. Multikanálovou pipetou napipetujeme do všech jamek mikrodestičky 100 µl inokula. V tomto kroku je nutné pracovat velmi pečlivě. 4. Destičku inkubujeme v termostatu při 33 ºC po dobu 3-36 h. Hodnocení výsledků a úkoly ke zpracování:  Po inkubaci vyhodnoťte jamky sloupců 1-9. Výsledky jednotlivých zkoušek porovnejte s negativní kontrolou (jamka A-1). Pokud zjištěný výsledek odpovídá této kontrole, označte reakci jako negativní (-). Pokud zaznamenáte znatelné fialové zbarvení, je výsledek reakce pozitivní (+). Jamky s velmi slabým zbarvením nebo malými fialovými skvrnami či shluky mohou být označeny jako hraniční (/).  Jamky sloupců 10-12 srovnejte s pozitivní kontrolou (A-10). Pokud jsou jamky fialově zbarveny (podobně jako jamka A-10), je reakce označena jako pozitivní (+). V případě výrazně slabšího zbarvení je reakce negativní (-). Hraniční reakce může být opět označena jako (/).  Falešně pozitivní reakce je definována jako fialové zbarvení u negativní kontroly (jamka A-1). Takováto reakce se může vyskytnout u některých mikroorganismů (Aeromonas, Vibrio, Bacillus). V tomto případě je nutné v experimentu použít protokol B (viz příslušný manuál).  Na základě vyhodnocení jednotlivých testů proveďte příslušným softwarem identifikaci testované kultury.  Zamyslete se, jaké mohou být možné příčiny neúspěchu při mikrobiální identifikaci a jaké jsou výhody těchto testovacích systémů. Složení a příprava roztoků a kultivačních médií: Maximum Recovery Diluent (gramů látky/litr) – ředicí roztok Pro přípravu ochranného a izotonického ředicího roztoku k maximální regeneraci mikroorganismů. Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 31 00-2; 5541/1; 8261; 8199; 21528-2; a ČSN EN ISO 6887-1. masový pepton 1,00 chlorid sodný 8,5 pH (25 °C) 7,0 ± 0,2 Navažte 9,5 g přípravku do 1000 ml destilované vody a je-li nezbytné zahřívejte do úplného rozpuštění. Sterilizujte v autoklávu při 121°C po dobu 15 minut.

Violet Red Bile Glucose Agar w/o Lactose (gramů látky/litr) Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 21528-1, -2. masový pepton 7,00 kvasničný extrakt 3,00 žlučové soli (směs) 1,50 glukosa 10,00 chlorid sodný 5,00 neutrální červeň 0,03 krystalová violeť 0,002 12,00 agar pH (25 °C) 7,4 ± 0,2 Navažte 38,53 g přípravku do 1000 ml destilované vody a zahřívejte, při četnějším promíchávání, až do úplného rozpuštění. NEAUTOKLÁVOVAT! Ihned ochlaďte ve vodní lázni na 45 °C. Před naléváním na Petriho misky důkladně promíchejte. Živný agar pro subkultivaci vybraných kolonií (gramů látky/litr) (Nutrient Agar 1,5%) Obecně použitelné kultivační médium, které může být obohaceno krví nebo jinými živočišnými deriváty. Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 13720 a 21528-1; -2; a ČSN EN ISO 16654. masový pepton 5,00 hovězí extrakt 3,00 chlorid sodný 5,00 Agar 15,00 pH (25 °C) 7,0 ± 0,2 Navažte 28,0 g přípravku do 1000ml destilované vody a zahřívejte do úplného rozpuštění. Sterilizujte v autoklávu při 121°C po dobu 15 minut. Glukózový agar (gramů látky/litr) (Tryptone Yeast Extract Agar w/ BCP) Pro izolaci a stanovení počtu bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Složení přípravku odpovídá požadavkům ČSN ISO 21528-1, -2. enzymatický hydrolyzát kaseinu 10,00 kvasničný extrakt 1,50 dextrosa 10,00 chlorid sodný 5,00 bromkresolová červeň 0,015 Agar 15,00 pH (25 °C) 7,0 ± 0,2 Navažte 41,52 g přípravku do 1000 ml destilované vody a zahřívejte do úplného rozpuštění. Sterilizujte v autoklávu při 121°C po dobu 15 minut. Oxidase Discs (50 discs / vl) Pro detekci oxidázy (cytochromoxidázy) produkované mikroorganismy. Testuje se kolonie čisté, 18 - 24 hodinové, bakteriální kultury. Oxidázový disk se umístí do sterilní Petriho misky, zvlhčí se destilovanou vodou. Testovanou kolonii přeneseme sterilní kličkou a rozetřeme na povrch zvlhčeného disku. Alternativní postup je, že pomocí sterilní pinzety uchopíme vlhký disk a dotkneme se testované kolonie. Pozitivní reakce se projeví během 5-10 sekund jako tmavě modrofialové zabarvení. Opožděná

pozitivní reakce se může projevit až do 60 sekund. Změna barvy po uplynutí této doby nebo žádná barvená změna značí negativní výsledek. Violet Red Bile Agar 1,2% (gramů látky/litr) masový pepton 7,00 kvasničný extrakt 3,00 žlučové soli (směs) 1,50 laktosa 10,00 chlorid sodný 5,00 neutrální červeň 0,03 krystalová violeť 0,002 agar 12,00 pH (25 °C) 7,4 ± 0,2 Navažte 38,53 g přípravku do 1000 ml destilované vody a zahřívejte, při četnějším promíchávání, až do úplného rozpuštění. NEAUTOKLÁVOVAT! Ihned ochlaďte ve vodní lázni na 45 °C. Po vychlazení zalijte inokulum na Petriho miskách.

Bakteriální identifikace s využitím souprav MIKRO-LA-TEST Úvod: Identifikace mikroorganismů zahrnuje postupy pro určování vykultivovaných rodů a druhů mikroorganismů. Prvním stupněm při určování mikroorganismů je makroskopická identifikace, při níž je zjišťována velikost kolonií, jejich tvar, povrch, zbarvení, okrajová zóna, produkce barviv, apod. Makroskopická identifikace se uplatňuje zejména u bakterií a plísní. U plísní jsou možnosti použití biochemických a fyziologických testů značně omezené, proto se nejčastěji využívá mikroskopické identifikace (příprava nativních, barevných preparátů). Při bakteriální identifikaci se v širokém měřítku využívá biochemické identifikace jednotlivých druhů a rodů bakterií, pro určité skupiny bakterií jsou sestavovány tzv. diagnostické tabulky a diagnostické klíče. K diagnostickým přípravkům pro standardizovanou, rutinní identifikaci klinicky významných mikroorganismů v klinických, potravinářských a vodohospodářských laboratořích patří např. identifikační produkty MIKRO-LA-TEST. Sortiment těchto přípravků zahrnuje vlastní identifikační soupravy, detekční proužky sloužící pro detekci bakteriálního enzymu nebo metabolitu, diagnostické disky umožňující diferenciaci bakterií přímo na kultivační živné půdě, doplňkové přístroje, činidla a pomůcky. Princip identifikačních souprav (MIKRO-LA-TEST): Identifikační soupravy obsahují dehydratované substráty pro biochemické reakce. Jednotlivé substráty jsou umístěny v jamkách stripů dělených mikrotitračních destiček. Přidáním definované suspenze vyšetřovaného bakteriálního kmene dojde k rehydrataci substrátu a v průběhu inkubace jsou substráty činností mikroorganismů metabolizovány za vzniku produktů, které jsou detekovány barevnými změnami. Soupravy jsou umístěny na dělených mikrotitračních destičkách s 1,2 nebo 3-řádkovými stripy pro 8,16 a 24 biochemických reakcí (toto uspořádání umožňuje využít vždy jen potřebnou část destičky). Identifikaci lze doplnit testy, dodávanými ve formě detekčních proužků, jednotlivé biochemické reakce na destičkách jsou lehce odlišitelné pomocí víčka s potiskem.

Identifikace bakterií s využitím soupravy ENTEROtest 24 Princip: Souprava je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Souprava umožňuje provést identifikaci čtyřiceti kmenů, pomocí 24 biochemických testů. Testy jsou umístěny v jamkách mikrotitrační destičky, vždy tři řady po osmi jamkách obsahující testy pro identifikaci jednoho kmene. Identifikaci je možné doplnit testy, dodávanými ve formě diagnostických proužků: OXItest, COLItest pro detekci E. coli průkazem aktivity ß-glukuronidázy, PYRAtest. Materiál a pomůcky: Souprava ENTEROtest 24, činidlo pro test INDOL, činidlo pro test FENYLALANIN, činidlo pro test ACETOIN, OXItest, COLI test, parafinový olej sterilizovaný, sterilní zkumavky, sterilní fyziologický roztok, Petriho misky s kultivačním médiem, přístroj Densi-La-Meter II, vortex, mikropipety, sterilní špičky, termostat, kahan, očkovací klička, barevná srovnávací stupnice pro soupravu ENTEROtest 24, diagnostický seznam pro soupravu ENTEROtest 24, identifikační program TNW. Postup: 1. Izolace kultur (provádí se na médiích, doporučovaných pro enterobakterie). 2. Pro potvrzení příslušnosti ke střevním bakteriím proveďte test na detekci cytochromoxidázy (detekční proužek OXItest)1.

3. Z čisté 24h kultury připravte ve fyziologickém roztoku suspenzi. Suspenzi dobře homogenizujte. Zákal suspenze musí odpovídat 1. stupni McFarlandovy zákalové stupnice (s využitím přístroje Densi-La-Meter II)2. Slabší nebo hustší suspenze může vést k falešným reakcím. 4. Otevřete aluminiový sáček odstřihnutím těsně vedle sváru a vyjměte destičku. 5. Pomocí skalpelu odřízněte příslušný počet řad (stripů) destičky, odpovídající počtu testovaných kmenů (3 řady, tj. 3x8 testů, pro identifikaci 1 kmene). 6. Vyříznuté řady vyjměte z panelu, sejměte ochrannou Al fólii, řady umístěte do připraveného prázdného rámečku. Zaznamenejte čísla vyšetřovaných kultur na příslušné stripy. 7. Důkladně homogenizujte bakteriální suspenzi ve fyziologickém roztoku. Inokulujte 0,1 ml suspenze do všech jamek příslušných tří řad destičky. K jamkám H, G, F, E, D a C prvého řádku (testy IND, H2S, LYS, ORN, URE, ARG) přidejte po inokulaci po 2 kapkách parafínového oleje3. V případě, že víčko v průběhu práce používáte na přikrytí destičky, před použitím jeho vnitřní stranu otřete ethanolem. 8. Vložte rámeček destičky s naočkovanými řadami do inkubačního PE sáčku. Otevřený konec sáčku zahněte pod destičku, aby nedošlo k vysychání inokula. Vložte destičku do termostatu (37 °C) a inkubujte po dobu 24 hodin. 9. Po 24 hod. inkubaci zakapejte jamky na destičce činidly (1. řada, jamka H – test Indol – 2 kapky činidla pro IND4, a dále 3. řada, jamka H – test Acetoin – po 1 kapce činidla pro VPT I, VPT II)5. Destičku nechte inkubovat 30 minut při teplotě 37 °C pro vývoj barevných reakcí. 10. Po uplynutí této doby zakapejte činidlem jamku H, 2. řada – test Fenylalanin – 1 kapka činidla pro PHE6. Test ihned odečtěte (pozitivní reakce mizí do 2 minut po přikápnutí činidla). 11. Odečtěte ostatní testy a výsledky reakcí zaznamenejte do formuláře pro záznam výsledků. 12. Pro hodnocení barevných reakcí použijte Barevnou srovnávací stupnici pro soupravu ENTEROtest 24. 13. Identifikaci proveďte pomocí Diagnostického seznamu pro soupravu ENTEROtest 24, případně na počítači pomocí identifikačního programu TNW. 14. Po použití vložte destičku do nádoby pro infekční materiál a autoklávujte. Poznámky: 1, OXItest je individuální test pro detekci cytochromoxidázy; balení OXItestu obsahuje 50 proužků umožňujících provést 50 stanovení na detekci oxidázy. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnou reakcí N,N-dimethyl-1,4-fenylendiaminu s α-naftolem za vzniku indofenolové modři. Citlivost reakce lze zvýšit použitím Činidla pro test OXIDÁZA. 2, Densi-La-Meter II je optický přístroj, který umožňuje standardizaci bakteriálního inokula (např. při bakteriální identifikaci nebo stanovení citlivosti mikroorganismů k antimikrobiálním látkám). Přístroj pracuje na principu měření optické absorbance, naměřené hodnoty vykazuje přímo v jednotkách dle McFarlanda. 3, Parafinovaný olej sterilizovaný je pomocným přípravkem pro diagnostické soupravy, obsahující testy, které vyžadují inkubaci se zamezením přístupu kyslíku. 4, Činidlo pro test INDOL je pomocným barvotvorným činidlem pro test na produkci indolu, obsažený v souboru testů diagnostických souprav. 5, Souprava Činidlo pro test ACETOIN je pomocným barvotvorným činidlem pro test na tvorbu acetoinu (Voges-Proskauerův test), obsažený v souboru testů diagnostických souprav. 6, Souprava Činidlo pro test FENYLALANIN je pomocným přípravkem pro diagnostické soupravy, obsahující test na důkaz fenylalanindeaminázy a slouží pro barevné vyjádření tohoto testu.

Vyhodnocení a úkoly ke zpracování: 1. Zjištěné výsledky barevných reakcí zaznamenejte do tabulek (interpretace reakcí). ENTEROtest 24 Sloupec

Řádek 1 H G F E D C B A Řádek 2 H G F E D C B A Řádek 3 H G F E D C B A

Test

Zkratka testu

Indol Sirovodík Lysin Ornithin Ureáza Arginin Simmons citrát Malonát

IND H2S LYS ORN URE ARG SCI MAL

Fenylalanin β-Galaktosidáza Inositol Adonitol Cellobióza Sacharóza Trehalóza Mannitol

PHE ONP INO ADO CEL SUC TRE MAN

Acetoin Eskulin Sorbitol Rhamnóza Melibióza Raffinóza Dulcitol Glukóza

VPT ESL SOR RHA MLB RAF DUL GLU

pozitivní

Reakce

negativní

2. Uveďte podstatu provedených biochemických testů. 3. Jakým způsobem se provádí identifikace pomocí diagnostického seznamu a počítačového programu? Postup zaznamenejte. 4. Jaké mohou být nejčastější možné příčiny neúspěchu při identifikaci? 5. Zamyslete se nad výhodami těchto standardizovaných testovacích systémů. Použitá literatura: 1. Pracovní návody příslušných diagnostických souprav a činidel řady MIKROLA-TEST (produkty společnosti Erba Lachema s.r.o.). 2. Klaban, V. (2005): Ilustrovaný mikrobiologický slovník. Vydavatelství Galén. Praha. 3. Jandová, B., Kotoučková, L. (1996): Praktikum z mikrobiologie. Vydavatelství MU, Brno Schéma pracovního postupu:

Hodnocení růstu mikrobiálních kultur automatizovaným systémem BIOSCREEN C Charakteristika zařízení: Bioscreen je automatizované zařízení k hodnocení růstových vlastností kmene. Oproti standardním metodám pro stanovení růstové křivky jako jsou metoda plotnová (stanovení titru cfu/ml) výsevem bakterií na plotny nebo klasické nefelometrické metodě, umožňuje získání přesnějších výsledků, je rychlejší a levnější. Výsledky jsou získávány průběžně během celého inkubačního intervalu a jsou vyhodnocovány pomocí softwaru. Počáteční investice do zařízení se v rutinním mikrobiologické laboratoři, vzhledem k výše uvedeným přednostem, stává brzy rentabilní. Interval inkubační teploty je nastavitelný v rozmezí od 1 - 60°C, přičemž v jednotlivých krocích lze provádět velmi jemné změny v inkubační teplotě - po 0,1 °C. Systém umožňuje inkubaci při teplotách -6 /+30 °C vztaženo k aktuální pokojové teplotě. Pro inkubaci při nižších teplotách se doporučuje pracovat v chlazeném boxu. Maximální kapacita zařízení je nesrovnatelná s klasickými mikrobiologickými metodami, neboť umožňuje najednou hodnocení 200 vzorků. Velkou výhodou je, že systém může pracovat i dlouhodobě a to až 1600 hodin. Jistou nevýhodou je, že hodnocení růstu je možné provádět jen v tekutých médiích, neboť růst je hodnocen turbidometricky měřením zákalu odpovídajícímu aktuální hustotě buněk v suspenzi. Volbou vhodných vlnových délek lze měřit také barevné změny související s metabolismem mikroorganismů v průběhu kultivace. Standardní měření lze provádět při vlnových délkách 405, 420, 450, 492, 540, 580 a 600 nm, případně výrobce poskytne filtry i s dalšími vlnovými délkami. Některé příklady aplikačního využití BIOSCREENU C: Bioscreen představuje miniaturizovaný automatizovaný testovací systém nahrazující základní klasické mikrobiologické metody vyžadující určitou rutinní zručnost provedení i konvenční mikrobiologická spektrofotometrická měření včetně destičkových readrů. V mikrobiologické praxi představuje usnadnění a zejména urychlení experimentů. Zařízení lze použít pro: 

Sledování růstových parametrů – simultánní stanovení růstových křivek současně pro 200 kultur. Lze hodnotit kinetiku růstu bakterií, kvasinek, hub i řas. Systém umožňuje záznam parametrů a srovnání růstových křivek různých kmenů a zhodnocení jejich fyziologických vlastností.



Hodnocení celkového počtu mikroorganismů ve vzorcích potravin, vody, moči, apod.



Hodnocení fyziologických požadavků na složení médií, např. obsah vitamínů, aminokyselin, pH, teploty, apod.



Hodnocení antimikrobiálních/ antimykotických účinků různých látek, např. antibiotik a desinfekčních prostředků, apod. Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) antimikrobiálních látek, nebo zjištění letálních dávek (LD).



Sledování krátkodobých i dlouhodobých toxických efektů látek prostřednictvím inhibice růstu.



Hodnocení biostimulačních účinků látek zvyšujících kinetiku růstu.



Hodnocení růstu biotechnologicky významných kmenů v různých podmínkách ovlivňujících produkční a růstové schopnosti kmenů. Např. při výrobě enzymů, bílkovin, mastných kyselin nebo jiných látek.



Studium biodegradačních schopností kmenů a podmínek optimalizujících průběh biodegradací kontaminant.



Ke studiu mikrobiologických procesů uplatňujících se při výrobě jogurtu, piva, vína nebo dalších potravin a případně krmiv.



K hodnocení kometabolismu ve smíšených kulturách.



Studium kinetiky růstu bakteriofága.

Popis zařízení: Systém Bioscreen C se skládá z inkubační a měřící jednotky, a z počítače, ve kterém je instalován odpovídající software sloužící k zaznamenávání růstových křivek a jejich vyhodnocení. Vzorky a bakterie se aplikují do jamek na dvou destičkách, které se vloží do inkubační komory. Inkubace, míchání a kinetická měření probíhají automaticky podle nastavených parametrů daného pokusu.

Lampa a filtr

Otvor pro doplnění chladícího média

Inkubační komora pro 2 Honeycomb destičky Měřící zařízení OD

Zahřívací a chladící modul

Klavesnice

Display

Úkol: 1 Využití BIOSCREENU C pro sledování růstu buněk v různých fyziologických podmínkách Materiál: LB pH=7 (bakterie), Sabouraud médium (kvasinky), 0,2M Na2HPO4, 0,1M kyselina citronová, pipety, vícekanálová pipeta. Kultury: E. coli, Staphylococcus sp., Pseudomonas sp., kvasinky Postup práce: 1. Nastavení parametrů přístroje (provádíme podle návodu za přítomnosti vyučujícího): Otevřeme program v systému MS DOS. Nastavíme nový program podle návodu. Vyplníme kolonku pro bližší popis testu. Po zobrazení destičky zvolíme šipkami a mezerníkem „Simple editor“ a „Grafical well map“. Zadáme konečný objem v jamce, zadáme jednotky, ve kterých bude provedeno měření, zvolíme počet opakování pro daný vzorek a popis vzorku. Zvolíme počet vzorků. Zadáme parametry měření (pomocí všech 4 šipek a potvrzujeme Enter). Stisknutím tlačítek Ctrl + Enter odsouhlasíme parametry, kurzor umístíme na Measurement a zahájíme měření stisknutím tlačítka Enter. 2. Příprava inokula: noční kulturu získáme naočkováním 20ml LB (pH=7) 1 kličkou kultury. Inkubujeme přes noc na třepačce při 28°C. Noční kultura by měla mít asi 108 CFU/ml (0,5 Mc Farlandovy stupnice = 1,5x 108) 3. Připravíme si LB pro bakterie a Sabouraud pro kvasinky o různém pH dle tabulky: ZKUMAVKA MPB 0,2M 0,1M k.citronová Předpo Naměřená č. nebo Na2HPO4 ml ml kládané hodnota Sabouraud pH pH ml 1 2 1,93 3,07 4,0 2 2 2,57 2,43 5,0 3 2 3,16 1,84 6,0 4 2 4,12 0,88 7,0 5 2 4,86 0,14 8,0 4. Aplikaci do sterilních destiček provedeme v přísně sterilním prostředí ve flowboxu. Papír s označením jamek si umístíme pod destičku.

5. Aplikaci 330 μl LB/ Sabouraud média o různém pH provedeme podle tabulky: pH

Kmen č.1 jamky

Kmen č.2 jamky

Kmen č.3 jamky

Kmen č.4 jamky

4 5 6 7 8

1-5 6-10 11-15 16-20 21-25

26-30 31-35 36-40 41-45 46-50

51-55 56-60 61-65 66-70 71-75

76-80 81-85 86-90 91-95 96-100

6. Do příslušných jamek aplikujeme 10 μl čerstvého inokula příslušného kmene. 7. Kultivaci provádíme při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin. 8. Měření zákalu při vlnové délce λ =600 nm probíhá každé 2 hodiny podle nastavení parametrů na Bioscreenu C. Vyhodnocení a závěr 

Po zpracování výsledků softwarem Bioscreen C vytiskněte hodnoty OD600 do tabulky.



Vypočítejte průměrné hodnoty zákalu z 5 opakování a sestrojte růstovou křivku.



Z průměrných hodnot střední generační doby pro kultivační média o různé hodnotě pH (výpočet bude proveden automaticky softwarem po převedení do MS Excel) sestrojte graf závislosti průměrné generační doby na zvolené hodnotě pH kultivačního média.



V závěru se zaměřte na srovnání výsledků u všech sledovaných kmenů. Vysvětlete, proč jsou mezi kmeny rozdíly a proč se jednotlivé druhy liší svým pH optimem.

Kontrolní otázky 1. V čem spočívají výhody a omezení jednotlivých metod užívaných pro stanovení počtu buněk v suspenzi. 2. Které další faktory byste pomocí Bioscreenu mohli sledovat a pokuste se navrhnout design potenciálního experimentu. Úkol: 2 Stanovení minimální inhibiční koncentrace MIC antibakteriálních látek pomocí BIOSCREENU C MIC = minimální množství látky v mikrogramech na mililitr, které je potřebné k zastavení růstu testovaného mikroba. Materiál: LB (bakterie), Sabouraud médium (kvasinky), pipety, vícekanálová pipeta. Kultury: E. coli, Staphylococcus sp., kvasinky Postup práce: Příprava inokula: noční kulturu získáme naočkováním 20ml MPB (pH=7) 1 kličkou kultury. Inkubujeme přes noc na třepačce při 28°C. Noční kultura by měla mít asi 108 CFU/ml (0,5 Mc farlandovy stupnice = 1,5x 108) Roztoky iontů kovů: 1. Připravíme 3mM roztoky: CdCl2; CuCl2; ZnCl2;v LB nebo v Sabouraud médiu (3mM CdCl2 připravíme smícháním 10,99 mg v 20ml LB média; 3mM CuCl2 připravíme smícháním 8,07mg v 20ml LB média; 3mM ZnCl2 připravíme smícháním 8,18mg v 20ml LB média). Pracujeme za přísně sterilních podmínek. Koncentrace kovu mM 2,7 1,5 0,9 0,6 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05

Roztok 3mM kovu μl 270 150 90 60 40 30 20 10 5

LB

Inokulum

μl 120 180 210 230 240 250 260 265

μl 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Kmen č.1 jamky

Kmen č.2 jamky

Kmen č.3 jamky

1-3 4-6 7-9 10-13 14-16 17-19 20-23 24-26 27-29

30-33 34-36 37-39 40-43 44-46 47-49 50-53 54-56 57-59

60-63 64-66 67-69 70-73 74-76 77-79 80-83 84-86 87-89

2. Aplikaci do sterilních destiček provedeme v přísně sterilním prostředí ve flowboxu. Požadovanou koncentraci dosáhneme až přímo v jamce. Papír s označením jamek si umístíme pod destičku. 3. Každý pokus budeme mít ve třech opakováních. 4. Jako negativní kontrola slouží nezaočkované médium jamky 90-93. 5. Jako pozitivní kontrola slouží zaočkované médium bez přítomnosti kovů jamky 94 -97. 6. Měření zákalu při vlnové délce =600 nm probíhá každé 2 hodiny podle nastavení parametrů na Bioscreen C. Vyhodnocení a závěr 

Po zpracování výsledků softwarem Bioscreen C vytiskněte hodnoty OD600 do tabulky.



Stanovte pro jednotlivé ionty kovů MIC.



Srovnejte výsledky u všech tří kmenů.

Kontrolní otázky 1.

Objasněte, co je podstatou mikrobiální rezistence k těžkým kovům zaměřte se zejména na: efluxní a redukční mechanismy; na intracelulární vazbu na proteiny (methallotioneiny) a na sorpci na povrchové struktury.

Jednobuněčná gelová elektroforéza (kometový test) Předmět testu Kometový test je rychlý, pracovně nenáročný postup detekující zlomy a alkalilabilní místa DNA zahrnující syntézu metody alkalického rozplétání, alkalické eluce DNA a elektroforetických technik. Kometový test umožňuje detekovat jednořetězcové zlomy DNA, alkalilabilní polohy, křížové spojení DNA – protein, oxidační a alkalylabilní poškození DNA v eukaryotických buňkách in vitro prostřednictvím fluorescenčního mikroskopu. Princip testu Molekula DNA, která má přirozeně záporný náboj, migruje v elektrickém poli směrem k anodě. Rychlost migrace v elektrickém poli závisí na počtu zlomů a velikosti molekuly DNA. Výstupem zpracování je buněčné jádro, z něhož v závislosti na poškození byla elektroforeticky vytažena DNA do tvaru připomínající kometu. Ocas komety je tvořen rozvolněnými, převážně jednořetězcovými smyčkami DNA. Jejich počet v ocase komety je úměrný počtu zlomů v DNA a může být detekován v mikroskopu na základě měření intenzity fluorescence DNA jako % DNA v ocase komety (%T) nebo délky ocasu komety (TL). Materiál, pomůcky, chemikálie, přístroje Chemikálie: EDTA, Triton X-100, TRIS, Ethidium Bromide, NaOH, NaCl, DMSO, KH2PO4, Na2HPO4, Agarose II for low-gem aaplications, Agarose Type I, low EEO, ethanol Pomůcky: Podložní sklíčka, krycí sklíčka, odměrné baňky, váženky, pipety a špičky, rukavice, papírové utěrky, alobal, barvící nádoby, tác na barvení preparátů, box na preparáty Přístroje: Horizontální elektroforéza, zdroj nízkého napětí pro elektroforézu, termostat, mikrovlnná trouba, analytické váhy, pH metr, inkubátor, fluorescenční mikroskop, kamera, software pro obrazovou analýzu, počítač Pracovní postup Příprava zásobních roztoků Pufrovaný fyziologický roztok PBS – 8g NaCl, 1,44g KCl, 0,24g KH2PO4 , 1,44g Na2HPO4 – přidat 800 ml destilované vody, upravit hodnotu pH na 7,4 a doplnit do 1l. Lyzující roztok – 146,40g NaCl, 37,20g EDTA, 1,2g Tris, 8g NaOH, přidat 800 ml destilované vody, upravit hodnotu pH na 10 a doplnit do 1l. Pufr na alkalickou elektroforézu – připraví se těsně před testem z roztoků 10M NaOH a 200mM EDTA. Neutralizační pufr – 48,5g Tris, doplnit do 1 litru destilovanou vodou. Upravit na pH 7,5, skladovat při pokojové teplotě. Barvící roztok – 0,1g ethidium bromid rozpustit v 100ml destilované vody, skladovat při pokojové teplotě. LMP (low meeting point) agaróza – 0,15g Agarose II for low – gel applications rozpustit ve 20 ml PBS, rozplnit po 160 µl do eppendorfek.

NMP (normal meeting point) agaróza – 0,15g Agarose Type I, low EEO rozpustit ve 20 ml PBS, rozplnit po 250 µl do eppendorfek. Příprava sklíček (den před testem) Sklíčka se očistí v 96% ethanolu, vyleští a předehřejí v termostatu na 50oC. Připraví se agaróza – 0,6g Agarose type I rozvařit za stálého míchání v 60ml destilované vody, pak pomalu přilít 40ml 96% ethanolu. Předehřátá podložní skla se ponoří do rozehřáté agarózy a umístí se zpět na 30 minut do termostatu a nechají se vychladnout. Potažená sklíčka je možno skladovat v lednici. Příprava lyzujícího roztoku (den testu) Triton X-100 (2ml) se smíchá s 22,6, ml 10% DMSO (3ml DMSO, 27 ml destilované vody). Pak se přidá 200 ml zásobního lyzujícího roztoku. Roztok se uchovává do doby potřeby v ledničce. Odběr krve Odebereme jehlou kapku krve z prstu do heparinem vypláchnuté Pasteurovy pipety. Naředíme fyziologickým roztokem do růžova. Na test použijeme 20 µl naředěné krve. Postup testu Práce prováděné v laboratoři při běžné pokojové teplotě: Rozehřejeme NMP agarózu ve zkumavkovém inkubátoru na 100oC. Předem potažená podložní sklíčka umístíme na topnou desku nastavenou na 45oC. Na zahřáté sklíčka kápneme 110µl NMP agarózy a překryjeme krycím sklem. Po nakapání všech skel necháme ztuhnout na ledu (5 minut). Práce prováděné v chladové místnosti za použití žlutého světla: Rozehřejeme LMP agarózu ve zkumavkovém inkubátoru na 100oC, po rozehřátí snížíme teplotu na 38oC. Z připravených sklíček postupně odstraníme krycí sklíčka. 20µl vzorku odebrané krve přidáme do eppendorfky s rozehřátou LMP agarózou. Po promíchání aplikujeme 75 µl agarózy se vzorkem na každé sklo a překryjeme krycím sklem. Necháme zatuhnout na ledu (5 minut). Poté opatrně odstraníme krycí sklo a ponoříme preparáty do vychlazeného lyzujícího roztoku a umístíme do ledničky na 1 hodinu. Po uplynutí stanovené doby preparáty vyjmeme z lyzujícího roztoku a umístíme je na 40 minut do alkalického pufru. Mezitím si připravíme elektroforetickou vanu – naplníme ji elektroforetickým pufrem, nastavíme napětí na 36 V a proud na 300mA. Preparáty umístíme do vany popisem směrem k anodě (záporná elektroda – směr migrace DNA) a necháme je zde po dobu 20 minut. Dále je provedena neutralizace zakápnutím 500 µl Trisu na sklíčko, necháme působit 5 minut, postup opakujeme 3x. Barvení preparátů je prováděno roztokem ethidium bromidu (150 µl ethidium bromidu/3,7ml destilované vody). Roztok je aplikován v množství 100 µl na sklíčka, která překryjeme krycím sklem a necháme barvit po dobu 6 minut. Poté stáhneme krycí sklíčka, promyjeme destilovanou vodou v barvící vaničce a fixujeme 7 minut 50 µl methanolu. Hotové preparáty necháme uschnout v tmavé místnosti nejlépe dva dny. Vyhodnocení testu Preparáty se hodnotí v tmavé místnosti na fluorescenčním mikroskopu při zvětšení 25x nebo 40x. Sklíčko s preparátem zakápneme destilovanou vodou a překryjeme krycím sklíčkem. Při vizuálním hodnocení se analyzuje 100 komet na jeden gel. Komety se zařazují do 5 kategorií podle tvaru komety. Stanovuje se průměrná hodnota poškození (P) P =  (0 x a) + (1 x b) + (2 x c) + (3 x d) + (4 x e) kde: 0 až 4 označení kategorie poškození a = počet buněk kategorie 0 b = počet buněk kategorie 1 c = počet buněk kategorie 2

d = počet buněk kategorie 3 e = počet buněk kategorie 4 Při hodnocení preparátů obrazovou analýzou je potřeba CCD kamera a počítač. Existuje více systémů pro obrazovou analýzu (např. Comet analysis systém, vyvinutý Konetic Imaging, Ltd.). Jako parametr poškození se nejčastěji používá % DNA v ocase komety (% tail DNA). Literatura Gábelová, A., Dušinská M.: Alkalická jednobunková gélová elektroforéza – kométový test. Standardní operační postupy pro biologické monitorování genotoxických účinkl faktorů prostředí. Acta hygienica, epidemiologova et microbiologica číslo 3/2003. SZÚ Praha. ISSN 0862-5956. Ústav experimentální medicíny AVČR Praha - Standardní operační postup – Comet assay 2007.

BIOCHEMICKÁ ANALÝZA PROTEINŮ KREVNÍHO SÉRA Nejrozsáhlejší a nejvýznamnější část laboratorních vyšetření v klinické praxi tvoří analýzy krve, krevního séra nebo plazmy. Krev je poměrně snadno dostupným materiálem a v jejím složení se odráží celá řada biochemických pochodů probíhajících v různých tkáních. Krev pro odběr se může získávat z žil, tepen nebo kapilár. Nejčastěji se odebírá žilní krev (většinou z kubitální žíly), méně často kapilární (např. z prstu, ušního lalůčku nebo z prohřáté patičky u novorozence). Arteriální krev se odebírá pouze výjimečně, hlavně pro analýzy krevních plynů. Krev odebraná bez použití protisrážlivých prostředků se po kratší době sráží, v důsledku přeměny rozpustného fibrinogenu na vláknitou síť fibrinu. Odstředěním sražené krve se získá sérum. Doba srážení musí být dostatečná (při pokojové teplotě po 15–30 min). Předčasné oddělení séra od krevních elementů však může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a koagulaci séra. Pro některá klinicko-biochemická vyšetření je třeba získat nesrážlivou krev. Krev je odebírána do nádobek s přídavkem antikoagulačních činidel. Odstředěním nesrážlivé krve se získá plazma. Krev je možno odstředit ihned po odběru, čímž lze ušetřit čas u akutních stavů. Plazma nebo sérum mají být odděleny co možná nejdříve, nejpozději však do 2 hodin od odběru. K oddělení krevních elementů od plazmy, resp. krevní sraženiny od séra, se používají centrifugy. K dokonalému odstředění plné či sražené krve se používá přetížení odpovídající přibližně 1000 násobku tíhového zrychlení (1000G). Centrifugace krve se vždy provádí v uzavřených zkumavkách (zamezení vzniku aerosolu, příp. kontaminace vzorku) po dobu asi 10–15 minut při pokojové teplotě nebo při teplotě 4 ºC. Delší doba centrifugace nebo zvýšení centrifugačního přetížení vede často k částečné či úplné hemolýze. Elektroforéza proteinů krevního séra Elektroforéza proteinů krevního séra je laboratorní metoda běžně používaná v klinických laboratořích. Slouží jako screeningová metoda, tj. jako metoda „vyhledávání odchylek od normy“ ve složení spektra proteinů tělních tekutin (séra, moče, likvoru). Separace proteinů se provádí na vhodném nosiči nejčastěji na agarózovém či polyakrylamidovém gelu. Proteiny tvoří velkou skupinu látek přítomných v plazmě (séru), jejich celková koncentrace se pohybuje v rozmezí 60 - 80 g/L. Tyto proteiny plní řadu funkcí, nacházíme zde transportní proteiny, protilátky, inhibitory enzymů, srážecí faktory, aj. Pro vyšetření spektra krevních proteinů je nejvhodnějším sérum: na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen (faktor I koagulační kaskády), jehož fyziologická koncentrace je kolem 3 g/L. V případě vyšetření plazmy se fibrinogen nachází v místech, kde se za patologických situací mohou vyskytovat tzv. paraproteiny, proto je sérum na vyšetření vhodnější. Během různých onemocnění se mění relativní zastoupení jednotlivých proteinů v séru a tím i elektroforeogram, který tak může sloužit k orientačnímu zhodnocení zastoupení výše

uvedených frakcí proteinů. Elektroforéza proteinů krevního séra se proto rutinně používá v diagnostice patofyziologických stavů.

Principem elektroforézy je separace látek v elektrickém poli podle jejich relativní elektroforetické mobility (pohyblivosti). Používané nosiče můžeme rozdělit do dvou skupin: 1) nosiče umožňující separaci pouze na základě náboje dělených částic (např. acetylcelulóza, agarózový gel); 2) nosiče vykazující tzv. sítový efekt (např. polyakrylamidový gel): tyto nosiče jsou tvořeny póry o velikosti, která se blíží rozměrům separovaných molekul. Dělení proteinů se tak uskutečňuje nejen na základě velikosti náboje, ale i na základě velikosti molekuly. Výsledkem je více frakcí, než lze získat při separaci na nosičích z první skupiny (25 i více frakcí proteinů krevního séra při analýze na polyakrylamidovém gelu proti šesti frakcím získaným na agaróze). Separace se sítovým efektem tak poskytuje komplexnější obraz, který je však pro klinickou interpretaci obtížnější a v běžných klinických laboratořích se k dělení proteinů krevního séra příliš nepoužívá. Rychlost pohybu jednotlivých proteinů na agarózovém gelu závisí převážně na jejich náboji, který je dán hodnotou pH pufru používaného při analýze. Separace proteinů se běžně provádí při pH kolem 8,6. Tato hodnota pH je vyšší než je hodnota izoelektrického bodu většiny

sérových

proteinů

Pufr

používaný

při

elektroforetické separaci udržuje konstantní pH během analýzy a tím i konstantní záporný náboj jednotlivých

proteinů.

Rychlost

pohybu závisí na celkovém náboji molekuly.

Normální králičí sérum rozdělené na polyakrylamidu za nativních podmínek (vlevo) a technikou SDS-PAGE. SDS-PAGE vykazuje daleko lepší rozlišovací schopnost. Albumin (MW cca 66000) jako nejhojnější sérový protein tvořený

jediným

polypeptidovým

řetězcem

snadno

identifikujeme

na

obou

elektroforeogramech. Naopak pro imunoglobulin IgG, což je tetramer složený ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců spojených disulfidovými můstky, se výsledek obou elektrofores dost liší: zatímco za nativních podmínek migruje jako nejpomalejší γ-globulinová frakce, na SDS-PAGE se objevují zvlášť jeho těžké řetězce (MW cca 55000) a lehké řetězce (MW cca 25000). Na obrázku uprostřed SDS-PAGE sérových proteinů , v dráze č. 1. normální sérum vepře, v dráze č. 2. normální kuřecí sérum, v dráze č.3 standard proteinů lidského krevního séra. Na obrázku vpravo: dráhy

1.a 6 standard proteinů lidského

krevního séra, 2. lidské krevní sérum, 3. sérum vepře, 4. králičí sérum, 5. kuřecí sérum.

Využití elektroforézy v klinické praxi Elektroforéza proteinů krevního séra je relativně jednoduchá technika užitečná k identifikaci celé řady patofyziologických stavů, např. monoklonálních gamapatií, jaterní cirhózy, renálního selhání, hypogamaglobulinemie, aj. „Typ akutního zánětu (odpovědi akutní fáze)“ se vyznačuje poklesem albuminu. Vyskytuje se při zátěži nebo zánětech způsobených infekcí, zraněním nebo chirurgickým zákrokem. „Typ chronického zánětu“ je spojen s infekcí a vyznačuje se vzrůstem gama globulinové frakce frakce albuminu bývá snížena. „Hypogamaglobulinemie“ se vyznačuje extrémně nízkou intenzitou gama frakce; vyskytuje se při imunosupresivním onemocnění. „Jaterní cirrhóza“ se vyznačuje širokým zvýšením gama globulinů s poklesem albuminu (tzv. polyklonální gamapatie). „Nefrotický syndrom“: v elektroforéze se prezentuje selektivním snížením albuminové frakce a gamaglobulinů.

Cílové proteiny jednotlivých elektroforetických frakcí Albumin Albumin je syntetizován v játrech. Jeho koncentrace v séru je 35 - 50 g/L a biologický poločas činí 20 dní. Albumin je velmi významný transportní protein -

váže a přenáší mnohé látky (mastné kyseliny, hormony, bilirubin, léky, kovy). Dále se podílí na udržení vodní rovnováhy mezi intravaskulárním a extravaskulárním prostorem (udržování onkotického tlaku krevní plazmy) a pufruje tělní tekutiny - zvýšení: dehydratace - snížení: poškození jater, chronická infekce, onemocnění ledvin, podvýživa Gamaglobuliny Jsou imunoglobuliny (protilátky) syntetizované plazmatickými buňkami. Kvantitativně je nejvýznamnější IgG. Monoklonální imunoglobuliny se mohou nacházet v různých vzdálenostech od startu. Jedná se o patologické proteiny (paraproteiny), které jsou syntetizovány B-buněčným lymfocytárním klonem při nádorových onemocněních (např. mnohočetný myelom, leukémie). - zvýšení: polyklonální (nebo monoklonální) gamaglobulinemie, jaterní onemocnění, chronické infekce - snížení: fyziologicky u malých dětí, hypoimunitní syndrom

Normální hodnoty cílových elektroforetických frakcí: Frakce Albumin

% 56 66

gama

10 -

globuliny

18

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS 

polyakrylamidový gel vzniká polymerací volných radikálů vytvořených z: a) akrylamidu CH2=CH-CO-NH2 b) síťovacího monomeru N,N-metylénbisakrylamidu (zkratka Bis) CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

Oba monomery jsou neurotoxiny, které se vstřebávají pokožkou. Jejich efekt

je

kumulativní.

Proto

vždy

používáme

gumové

rukavice

!

Polyakrylamid je považován za netoxický, avšak může obsahovat malé množství nezpolymerovaného akrylamidu !



velikost pórů v gelu je nepřímo úměrná koncentraci akrylamidu (v 5-20 % gelech s 5% Bis se velikost pórů pohybuje v rozmezí 4,0-6,0 m)



jako redoxní katalyzátor polymerace se používá TEMED (N,N,N´,N´tetramethylendiamin)



iniciátorem polymerace je persíranamonný ( (NH4)2S2O8), který poskytuje volné kyslíkové radikály



pro

dělení

globulárních

bílkovin různé molekulové hmotnosti se používají různé koncentrace gelu % akrylamidu

molekulová hmotnost bílkovin

15-20

pod 20 000

12

10 000-90 000

7,5

30 000-150 000

4

90 000-1 000 000

Teorie 

do vzorku gelů i pufrů se přidá detergent SDS (sodiumdodecylsulfát, dodecylsíran sodný)

     

 

Dodecylsulfát sodný (SDS) je detergent, který se váže k proteinům a mění jejich tvar do válcovité podoby. Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 gSDS / g proteinu (to odpovídá jedné molekule SDS na 2 AA zbytky). Vysoký negativní náboj navázaného SDS překrývá vlastní náboj proteinu, takže proteiny pokryté SDS mají shodné poměry počtu nábojů na jednotku hmoty a podobný tvar. Následkem toho, se při elektroforézev gelech obsahujících SDS proteiny dělí působením gelové filtrace na základě své molekulovéhmotnosti. S přesností 5-10% je možno stanovit pomocí SDS-PAGE molekulovou hmotnost běžně velkých proteinů. Relativní pohyblivost se lineárně mění s logaritmem jejich molekulové hmotnosti.

když se kromě SDS přidá ještě redukující činidlo (2-merkaptoethanol nebo dithiotreitol) rozruší se tím disulfidové vazby molekul a lze takto stanovit podjednotkovou strukturu bílkoviny pro svoji jednoduchost je to dnes nejužívanější metoda pro stanovení molekulové hmotnosti bílkovin

Proteiny se nejčastěji barví ponořením gelu do kyselého roztoku obsahujícího alkohol a barvivo Coomassie brilliant blue. Proteiny jsou v tomto roztoku

jednak denaturovány a tím i fixovány, jednak se vytváří komplexy barvivoprotein. Přebytek barviva se odstraní buď omýváním gelu kyselým roztokem, nebo elektroforetickým odbarvením. Lze takto detekovat mikrogramová množství rozdělených proteinů.

Proužky gelu obsahující menší množství

proteinů je možné obarvit stříbrem (50x citlivější, ale složitější). PŘÍPRAVA ELEKTRODOVÉHO PUFRU Tris –Glycin SDS pufr, pH 8,3 10X koncentrovaný zásobní roztok: 0,25 M Tris base, 1,92 M Glycin, 1 % SDS (v případě nativní ELFO nepřidáváme) g/l pro 10X konc. roztok      

Navážíme 15,15 g Tris base) Navážíme 72,0 g Glycinu Navážíme 5 g SDS Doplníme na objem 500ml ddH2O pH není nutno upravovat Uchováváme v lednici při 4°C

V 1X koncentrovaném pufru jsou koncentrace následující: 25 mMTris base, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS Do ELFO APELEX minigel se vejde cca 400 ml pufru PŘÍPRAVA SEPARAČNÍHO (RESOLVING) GELU PRO ELEKTROFORÉZU Příprava

30

%

Akrylamidového

zásobního

roztoku

(Akrylamid+Bisakrylamid, AA+Bis, Akrylamid mix) Navážíme 29 g Akrylamidu Navážíme 1 g Bisakrylamidu Obě složky rozpustíme v 60 ml ddH2O za stálého míchání a mírného ohřevu (cca 37°C nepřekročit 55°C)  Doplníme na výsledný objem 100 ml ddH2O  Uchováváme v dobře uzavřené tmavé lahvi v lednici při 4°C  Stabilní cca 1 měsíc, pokud cítíme unikající amoniak nutno vyměnit Poznámka: výsledná koncentrace obou složek je:Akrylamid  29 %,   

Bisakrylamid 1 % Příprava 1,5 M Trisu pH 8,8  

Navážíme 18,165 g Trisu Navážku rozpustíme v cca 70-80 ml ddH2O

  

pH upravíme pomocí 1M HCl na hodnotu 8.8 Doplníme na výsledný objem 100 ml Vysterilizujeme v autoklávu

Příprava 10 % zásobního roztoku APS (ammoniumpersulfát, persíran amonný)    

Navážíme 1g APS Odvážené množství APS rozpustíme v 9 ml ddH2O Takto získáme 10% zásobní roztok APS Uchováváme při pokojové teplotě = RT

Poznámka: výsledná koncentrace APS v gelu je 0,1 % Příprava 10 % zásobního roztoku SDS (dodecylsulfát sodný)    

Navážíme 1g SDS Odvážené množství SDS rozpustíme v 9 ml ddH2O Takto získáme 10% zásobní roztok APS Uchováváme při pokojové teplotě (RT)

Objemy jednotlivých složek pro přípravu 10 % polyakrylamidového gelu

PŘÍPRAVA ZAOSTŘOVACÍHO (STACKING) GELU PRO ELEKTROFORÉZU

PROVEDENÍ VLASTNÍ ELEKTROFORÉZY 1. Uvolníme plastové šrouby držáku skel. Vložíme držák do stojanu a vložíme do něj skla (vyšší dozadu). 2. Mezi skla umístíme spacery a mírně utáhneme šrouby. Přesvědčíme se, zda jsou spodní hrany skel a spacerů v rovině.

3. Položíme držák se skly na gumovou podložku a zatlačíme jej pod výstupek z plexiskla. Nyní jsou skla připravena k nalití gelu. 4. Připravíme základní roztok pro nalití dělícího gelu a promícháme (viz. barevná tabulka). (Po přidání TEMEDu a persíranu amonného je třeba ihned nalít roztok mezi skla, protožegel začíná polymerovat.)

5. Roztok pro dělící gel naneseme do elfo komůrky, asi 3-4 cm od okraje kratšího skla.

6. Po nanesení roztoku pro dělící gel rychle zarovnáme hladinu přídavkem butanolu (jako horní vrstvu nad gelem). Gel necháme při laboratorníteplotě tuhnout minimálně 45 (30) min. (V tomto stadiulze gel po zalití vodou a zatavení do igelitového sáčku uchovat 1 den v lednici.) 7. Během tuhnutí dělícího gelu připravíme základní roztok pro zaostřovací gel. 8. Z povrchu dělícího gelu odstraníme butanol propláchnutím destilovanou vodou se střičky. Zbytky destilované vody odstraníme filtračním papírem.

9. K namíchanému základnímu roztoku zaostřovacího gelu přidáme TEMED a APS . 10. Zaostřovací gel naneseme do elfo komůrky na povrch dělícího gelu až po okraj horního skla. Pak do roztoku zaostřovacího gelu vsadíme hřeben (pozor na vznik bublin). 11. Gel necháme tuhnout minimálně 45 (60) minut. 12. Pokud je to nutné, z jamek odstraníme nezpolymerovaný podíl proužky filtračního papíru 13. Do 1/3 elfo nádoby nalijeme ELFO pufr. Filtračním papírem odstraníme bubliny na jednu stranu. 14. Prostor mezi elfo komůrkami napnlíme až po okraj ELFO pufrem. V ELFO nádobě doplníme pufr po rysku. 15. Aplikujeme 2-20 μl vzorku (dle koncentrace, velikosti jamek a tloušťky hřebenů a spacerů). 16. Na elfo nádobu nasadíme víko a nastavíme hodnotu napětí na 120 V (cca 30 mA, 15 mA na jeden gel) 17. Ukončení elfo posuzujeme podle doběhnutí barviva na konec dělícího gelu. (Zaostřovací proces probíhá asi 0,5-1 hodinu, dělící 1-1,5 hodiny). 18. Povolíme šrouby držáku skel a opatrně vyjmeme gel (sklo páčíme z boku). Označíme orientaci gelu tím, že odřízneme levý horní roh (spacerem, popř hranou lopatky).

19. Ponoříme gel do roztoku Coomassie blue R-250 a ponecháme barvit cca 10-30 minut. 20. Přelijeme gel odbarvovacím roztokem (Destainfor R-250) a ponecháme třepat za laboratorní teploty (možno přes noc) až do úplného odbarvení pozadí.

NANÁŠECÍ PUFRY Množství proteinů nanášených na gel závisí na jejich čistotě a způsobu následné barevné detekce. U vysoce purifikovaných proteinů stačí v případě minigelů 0,5-5 μg proteinů na dráhu. Buněčné lyzáty a podobné směsi se aplikují v množství cca 50 μg. Detekční limit v případě barvení Coomassie® modři představuje detekční limit 100 ng proteinu/na proužek. 2x koncentrovaný Tris-Glycin SDS vzorkový (nanášecí, sample) (126 mMTris-HCl, pH, 20 % glycerol 6,8, 4 % SDS, 0,005 % Bromfenolová modř)  Odměříme 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8  Přidáme 2 ml glycerolu  Dále přidáme 4 ml 10% SDS

 Přidáme 0,5 ml 1% Bromfenolové modři  Doplníme ddH2O do 10 ml  Uchováváme v mrazáku při -20°C V 1X koncentrovaném nanášecím pufru jsou koncentrace následující-63 mMTris-HCl, 10% glycerol, 2%SDS, 0,0025 % Bromfenolová modř, 2,5 % ME Se vzorky pracujeme při teplotě 4 °C. Jestliže připravuje vzorky, které nebudeme na gel ihned aplikovat, je vhodné z nich připravit alikvoty, abychom se vyhnuli opakovanému rozmrazování a zamrazování. Vzorky nenecháváme při pokojové teplotě bez předchozí inaktivace proteáz zahřátím na 95 °C. Vlastní příprava vzorku:  Vzorek s nanášecím pufrem dobře promícháme  Zahřejeme na 95-100 °C ve vařící vodě (na termobloku) po dobu 4-5 minut  Můžeme zamrazit při -20°C nebo přímo nanášíme na gel DETEKCE PROTEINŮ BARVIVEM Coomasie blue R-250 Coomasie blue se váže nespecificky ke většině proteinů. Coomasie blue stain solution 1X pracovní roztok (40 % etanol, 0,125 % Coomasie blue R 250, 10% CH3COOH)  Odměříme 200 ml etanolu  Do etanolu vsypeme 0,625 g Coomasie blue R 250  Přidáme 250 ml ddH2O  Doplníme 50 ml ledové CH3COOH Poznámka: Nutno zachovávat výše uvedené pořadí při přípravě roztoku Coomasie blue destain solution 1X pracovní roztok (5 % etanol, 7,5 % CH3COOH)  Odměříme 25 ml etanolu  Přidáme 75 ml ledové CH3COOH  Doplníme ddH2O do 500 ml 1. Barvíme cca 20 minut nebo déle dle potřeby (barvící roztok může být i několikrát opakovaně použit) 2. Gel poté opláchneme vodou 3. Gel umístíme do odbarvovacího roztoku (lázně) 4. Lázeň možná bude nutné v některých případech opakovaně vyměnit, aby došlo k úplnému odbarvení gelu (pozadí)

IMUNOCHEMICKÁ DETEKCE APOPTOSY A. Roztoky a reagencie 1) Mikrojamkové „stripy“: před použitím vytemperujte na pokojovou teplotu 2) 1xWash buffer(promývací pufr): Před testováním připravte čerstvý z 20x zásobního roztoku v destilované vodě. 3) 1xCell Lysis Buffer (lyzační pufr): Připravte z 10x koncentrovaného pufru, takto může být skladován v lednici po dobu 1-2týdnů. Těsně před použitím přidejte phenylmethylfulfony fluorid (PMSF) na výslednou koncentraci 1mM. 4) 1x PBS (3.2 mM Na2HPO4, 0.5 mM KH2PO4, 1.3 mM KCl, 135 mM NaCl, pH 7.4) 5) TMB substrát – roztok je součástí kitu 6) STOP roztok – je součástí kitu B. Příprava buněk – příprava lyzátů Pro adherentní buňky: 1) Skliďte buňky poté, co kultura dosáhne 80-90% konfluence. Přidejte čerstvé médium s testovanou látkou, inkubujte po zvolený čas. 2) Odstraňte médium a promyjte vychlazeným 1xPBS 3) Odstraňte PBS a přidejte lyzační roztok – na každých 10cm2 přidejte 0,5ml Cell lysis buffer s 1mM PMSF a inkubujte na ledu 5minut 4) Seškrabte buňky z misky a přeneste do centrifugační zkumavky, uchovejte je na ledu. 5) Lyzát sonikujte na ledu. 6) Centrifugujte 10minut při 14000x g při 4ºC, přeneste supernatant (obsahujcí lyzát buněk) do nové zkumavky. Lyzát můžeme uchovávat při -80ºC, nejlépe v alikvotech připravených pro použtí. Pro suspenzní buňky: 1) Odstraňte médium centrifugací za nízkých otáček (cca 120rpm) poté co kultura obsahuje cca 106 životaschopných buněk/ml. Přidejte čerstvé médium spolu s testovanou látkou, inkubujte po zvolený čas. 2) Centrifugujte buňky za nízkých otáček (cca 120 rpm) a promyjte 5-10ml vychlazeného 1xPBS. 3) Na každých 50ml média přidejte 2ml 1xCell lysis buffer s 1mM PMSF. 4) Lyzát sonikujte na ledu. 5) Centrifugujte 10minut při 14000x g při 4ºC, přeneste supernatant (obsahujcí lyzát buněk) do nové zkumavky. Lyzát můžeme uchovávat při -80ºC, nejlépe v alikvotech připravených pro použtí. C. Provedení testu 1) Po vytemperování stripů na pokojovou teplotu odlomte stripy a zbytek urychleně umístěte do lednice. 2) Do každé jamky přeneste 100ul lyzátu. Jamky překryjte izolační páskou, kterou jemně přitlačíte na povrch stripu. Inkubujte 2h při 37ºC. (Je možné inkubovat

přes noc při 4ºC). 3) Opatrně odstraňte pásku a promyjte jamky: a) Odpipetujte obsah jamek do odpadu b) 4x promyjte 1xwash buffer, 200ul na každou jamku  Při každém promytí přitlačte strip na kousek látky, filtračního papíru či ubrousku, jamky však nikdy nesmí úplně vyschnout 4) Přidejte 100ul detekční protilátky (roztok se zeleným vrškem) do každé jamky. Uzavřete páskou a inkubujte 1h při 37ºC. 5) Opakujte promývací krok z bodu 3. 6) Přidejte 100ul HRP konjugované sekundární protilátky (roztok s červeným vrškem) do každé jamky. Inkubujte 30min při 37ºC. 7) Opakujte promývací krok z bodu 3. 8) Přidejte 100ul TMB roztoku do každé jamky a inkubujte 10min při 37ºC. 9) Přidejte 100ul STOP roztoku do každé jamky, jemně protřepte. 

pozn. Původní barva pozitivní reakce je modrá, která by se po přidání STOP roztoku měla změnit na žlutou.

10) Do 30min od přidání stop roztoku změřte absorbanci při 450nm.

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

Recommend Documents