Kapalinová chromatografie LC - mobilní fáze kapalina, která proudí kolonou naplněnou stacionární fází 1 - adsorpční chromatografie (LSC) tuhá látka jako sorbent (použití méně často proti LLC) 2 -rozdělovací chromatografie (LLC) kapalina na pevném nosiči (používána především) -na normální fázích (původní starší uspořádání) - stacionární fáze je polární a mobilní nepolární kapalina; - na obrácených (reverzních fázích) – stacionární je nepolární kapalina, mobilní je polární kapalina Důležité především LLC a LSC prováděné jako tzv. vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) na kapalinových chromatografech s vysokým tlakem kapaliny. Analyzovaný vzorek je dávkován jako kapalina (nemusí být těkavý) Při dělení se uplatňují interakcí (silové působení mezi molekulami) dělená složka-stacionární fáze a také interakce složka-mobilní fáze
Vzájemná silová působení mezi částicemi kapalin jsou větší než mezi částicemi plynu. Volba mobilní fáze pak hraje větší roli než u plynové chromatografie. Použití při analýze organických látek; LC je proti GC použitelná pro analýzu méně těkavých a tepelně nestálých organických látek, a tedy i většího počtu látek než GC (GC potřebuje vzorek v plynném stavu, kapalné látky musíme zplynit vyšší teplotou) 3 - iontově výměnná (IEC) – stacionární fáze ionex (iontoměnič) iontově výměnná chromatografie je vhodná pro analýzu anorganických sloučenin, respektive disociovaných iontů – velmi vhodné pro stanovení aniontů (sírany, dusičnany, dusitany, chloridy, fluoridy) 4 - gelová chromatografie (GPC, tj. Gel Permeation Chromatography), neboli také vylučovací (SEC, tj. Size Exclusion Chromatography) stacionární fází je gel , na něm se složky dělí dle velikosti molekul . malé lokelui pronikají hluboko do pórů a jsou pomalejší než velké molekuly. Metoda se používá pro separaci látek s velkými molekulami - biopolymery např.) proteiny.
Kapalinová chromatografie adsorpční rozdělovací (GLC) v uspořádaní jako HPLC
(LSC)
- zásobníky mobilní fáze - zřízení pro tvorbu gradientu -směšování - vysokotlaké čerpadlo - dávkovací zařízení - kolona - detektor - registrační zařízení (zapisovač, integrátor, PC) Směšovací zařízení – většinou se pracuje se směsí několika kapalin mění svoje složení v průběhu separace (gradientová eluce)
- nízkotlaké směšování - vysokotlaké směšování Programátory tvorby gradientu.
Vysokotlaké čerpadlo – musí zajistit konstantní (nebo programovatelný) bezpulsní průtok (ca. 0,1 - 10 ml/min) při tlacích do ca. 60 mPa. - pneumatická čerpadla - pneumatická čerpadla s membránou - typ „injekční stříkačka“ - pístová čerpadla - membránová čerpadla Tlumiče pulsů: kapacitní a odporové
Dávkovací zařízení dávkuje se typicky ca. 1 až 100 µl, někdy více (při on-column prekoncentraci), v mikrokolonové chromatografii pod 1 µl. - septové dávkovače - „stop flow“ dávkovače - smyčkové dávkovače
Kolona chromatografu je rovnoměrně vyplněna jemnými zrníčky - velký odpor proudící kapalné fázi, takže je nutno protlačovat mobilní fázi s vysokými tlaky (viskozita kapalin je větší než plynů) materiál: kov (nerez), sklo, plasty (radiální komprese) rozměry: vnitřní průměr asi od 3 do 6 mm, délka asi od 5 do 30 cm (předkolony kratší, např. 3 cm). V mikrokolonové chromatografii se používají průměry pod 1 mm.
Fáze při kapalinové rozdělovací chromatografii (LLC) Stacionární fáze - kapalina zakotvená na pevném nosiči. Nebezpečí vymývání zakotvené fáze. Proto se zakotvují molekuly kapaliny na nosiči vytvořením chemické vazby. Např. na hydroxylové skupiny silikagelu se vážou molekuly zakotv. fáze (R) tzv. silanizací - zachycení vazbami Si – O - Si (např. reakcí s příslušným trialkylchlorsilanem)
Při použití reverzních fází (tj. obrácené fáze) – zachyceny nepolární molekuly - uhlovodíky s více či méně uhlíky 18 C (oktadecyl - zkratka ODS) - nejčastěji
8 C (oktyl) či -C2H5, -CH3, fenyl Mobilní fáze je polárn, pracuje se směsí dvou či tří kapalin, (např. voda, acetonitril). Její polarita může být během eluce snižována (tak, že se jejíž složení se během chromatografie řízeně dle programu mění). eluční síla mobilní fáze roste v řadě voda, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, aceton
(nejnižší schopnost eluovat nepolární složky má voda, teoreticky nejvyšší by měly nasycené uhlovodíky) Na stacionární fázi jsou více zadržovány složky nepolární a rychleji opouštějí kolonu polární složky.
Obr. LLC chromatografie s nepolární stacionární fází a s polární pohyblivou fází (tzv. chromatografie na reverzních fázích - RPC). Většími silami jsou na stacionární fázi poutány složky nepolární
Fáze při kapalinové adsorpční chromatografii (LSC) Jako stacionární fáze (náplň kolony) se používají zrnité adosrbenty s velkým povrchem
- silně polární
Silikagel (SiO2 x H2O) polární adsorbent kyselé povahy (pH = 3 až 5)a Alumina (Al2O3) polární adsorbent zásaditý (pH = 8 až 11) Mobilní fáze – eluční činidlo
nepolární nebo slabě polární kapaliny např. používá vhodná směs kapalin, jejíž složení je v průběhu dělení měněno tak, že eluční schopnosti činidla rostou (např. hexan jako rozpouštědlo s nulovou eluční silou a ve směsi s diethyletheru nebo dichlormethanu)
- detektor Obecné požadavky: - citlivost - linearita odezvy - nízký šum (vysoký poměr mezi signálem a šumem), meze detekce na úrovni 10-8 - 10-10 g/ml - stabilita signálu (malý drift) - malá citlivost na změnu průtoku a tlaku
- možnost gradientové eluce - malý mimokolonový příspěvek k mrtvému objemu (objem v µl)
Veličiny využívané k detekci v LC: absorpce záření fotometrické detektory (UV, VIS, IR), DAD index lomu refraktometrický detektor fluorescence fluorimetrický det. elektrolytický proud polarografický det. elektrická vodivost vodivostní det. permitivita kapacitní, permitivitní det. elektrodový potenciál potenciometrický det. (Pt, Cu, ISE) ionizační proud transportní plamenoionizační det. radioaktivita radiometrický det. rozptyl světla ELS (evaporative light scattering) det.
Kombinované (hyphenated) techniky: HPLC-MS - stanovení a detekce organických látek ve složitých směsích a při velmi nízkých koncentracích HPLC-AAS, HPLC-ICP AES
Příklady aplikací HPLC Separované látky
Chromatografický systém
aromatické uhlovodíky, chlorované a oxidační produkty ve vodě polycyklické uhlovodíky polycyklické aromatické uhlovodíky
C18
acetonitril + voda
C18 C18
chlorfenoly chlorované fenoly
C18 C18
kys. malonová, mléčná, octová, ...
katex
aromatické kyseliny (benzoová, salicylová, acetylsalicylová, hydroxybenzoová) aromatické kyseliny (benzoová, hydroxybenzoová, aminobenzoová, nitrobenzoová, halogenbenzoové) lipidy v potravinách
C8
methanol ve vodě, gradient methanol (acetonitril) ve vodě, různé typy gradientů acetonitril ve vodě, gradient gradient methanolu ve fosfátovém pufru, pH 4 roztoky kyselin (mechanismus iontové výluky) fosfátový pufr+tetraalkylamonná sůl ve směsi voda/acetonitril síran sodný ve směsi voda/methanol
katecholaminy v tělních tekutinách aromatické aminosloučeniny (difenylamin) volné aminokyseliny
C18 silikagel
organofosfátové pesticidy fenoxykarboxylové kyseliny
C18
silikagel
hexan a octan ethylnatý v toluenu, gradient 0,2M kys. octová pentan+methanol
Lichrofosfátový pufr (pH 4,3) ve sorb NH2 směsi acetonitril/voda, gradient C18 methanol (acetonitril) ve vodě, gradient C18 fosfátový pufr ve směsi methanol/voda, gradient
Příklad aplikačního listu výrobce chromatografu Analýza pesticidů na bázi karbamáty metodou LLC - MS Stac. fáze C18 a předepsané rozměry kolony Mobilní fáze - eluenty 0,1 % mravenčí kyselina v DI vodě 0,1 % mravenčí kyselina v acetonitrilu Míchány s předepsaným programem gradientu Předepsána rychlost průtoku a teplota Carbamate pesticides on Kinetex C18, 5u with LC/MS/MS detection
Application detalApplication Detail (App ID: 22064)
Analytical detail Column: Kinetex™ 5µm C18 100 Å, LC Column 150 x 2.1 mm, Ea Part No:00F-4601-AN Dimensions:150 x 2.1 mm ID Order Recommended Products for this Application Elution Type:Gradient Elution A:0.1% formic acid in DI H2O Elution B:0.1% formic acid in Acetonitrile Gradient Profile: Step No. Time (min) 1 0 2 20 3 22 4 22.1 5 27 Flow Rate:200 µL/min Col. Temp: 42 °C Detection: Mass Spectrometer (MS) @ amu (0°C) Detector Info: AB Sciex API 4000™
Názvy pesticidů 1 Oxamyl 2 Methomyl 3 3-OH-Carbufuran 4 Aldicarb 5 Propoxur 6 Carbofuran 7 Carbaryl 8 Methiocarbs
Pct A 90 30 30 90 90
Pct B 10 70 70 10 10