JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH
ZEMĚDĚLSKÁ FAKULTA
AUTOREFERÁT DISERTAČNÍ PRÁCE
Barevné sloučeniny vznikající během zpracování česnekovitých rostlin
ING. PETRA KUČEROVÁ
ČESKÉ BUDĚJOVICE 2013
Autoreferát disertační práce
Doktorand: Studijní program: Studijní obor: Název práce : Školitel :
Ing. Petra Kučerová Chemie Zemědělská chemie Barevné změny vznikající česnekovitých rostlin doc. Ing. Roman Kubec, Ph.D.
během
zpracování
Oponenti: prof. Ing. Jaromír Lachman, CSc. Česká zemědělská univerzita v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 - Suchdol
prof. Ing. Jan Tříska, CSc. Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, Na Sádkách 7, České Budějovice
doc. Dr. Ing. Karel Cejpek Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 - Dejvice
Obhajoba disertační práce se koná dne 23.9.2013 v 13:00 hod. v zasedací místnosti vědecké rady ZF JU v Českých Budějovicích. S disertační prací se lze seznámit na studijním oddělení Zemědělské fakulty JU v Českých Budějovicích.
prof. Ing. Pavel Kalač, CSc předseda oborové rady zemědělská chemie ZF JU v Českých Budějovicích
Dizertační práce vznikla za podpory těchto grantů: GAJU 067/2010/Z GAJU 067/2011/Z GAJU 060/2012/Z MSM 6007665806 MSM 6046137305 IAA 400720706 Seznam publikačních výstupů souvisejících s tématem dizertační práce: Schraml, J., Kubec, R., Kučerová P. Determination of substitution sites in monosubstituted five-membered aromatic heterocycles. Mag. Res. Chem 2011, v. 49, p. 147–150. (IF – 1,437; osobní podíl 20 %)
Kučerová, P., Kubec, R., Šimek, P., Václavík, L., Schraml, J. Allium discoloration: The precursor and formation of the red pigment in giant onion (Allium giganteum Regel) and some other subgenus Melanocrommyum species. J. Agric. Food Chem. 2011, v. 59, p. 1821–1828. (IF – 2,823; osobní podíl 40 %)
4
SOUHRN Tato práce je zaměřena na studium barevných sloučenin, které vznikají během zpracování česneku, cibule, póru a ostatních, v potravinářském průmyslu doposud méně využívaných česnekovitých rostlin, jako je cibule obří (Allium giganteum Regel) nebo česnek sicilský (Allium siculum Ucria Lindl). Zatímco při zpracování česneku dochází k tvorbě červených, zelených či modrých látek, v ostatních studovaných druzích se tvoří růžové až červené zbarvení. Tvorba barevných sloučenin ovšem významně snižuje senzorickou kvalitu produktů z těchto zelenin a způsobuje jejich zpracovatelům nezanedbatelné ekonomické ztráty. Vzhledem k mimořádné komplexnosti procesů vedoucích k tvorbě barevných látek v reálných vzorcích byla struktura těchto sloučenin a pravděpodobný mechanismus jejich vzniku studován pomocí modelových systémů, včetně využití celé řady izotopově substituovaných látek. Byl vypracován postup vedoucí k tvorbě těchto sloučenin, jejich izolaci, přečištění, rozdělení pomocí HPLC a následné identifikaci pomocí NMR a MS. Bylo zjištěno, že tyto sloučeniny jsou velmi pestrou směsí oligomerů N-substituovaných derivátů 3,4-dialkylpyrrolů, ve kterých jsou pyrrolová jádra propojena tří- nebo jednouhlíkatým můstkem. V česneku bylo detekováno sedm hlavních barevných látek (λmax 418–597 nm), v cibuli a póru bylo charakterizováno celkem 14 barevných sloučenin (λmax 410–634 nm), přičemž většina těchto látek má stejný základní strukturní skelet, jenž se liší pouze strukturou postranních řetězců. V homogenátech česneku sicilského bylo charakterizováno celkem šest hlavních barevných látek (λmax 430–580 nm), z nichž všechny vykazovaly značnou strukturní analogii s barevnými látkami nalezenými v cibuli a póru. Na základě získaných dat byl navržen i pravděpodobný mechanismus vzniku těchto barevných sloučenin. Primárním prekurzorem barevných látek vznikajících v česneku, cibuli a póru je sirná aminokyselina isoalliin, zatímco v česneku sicilském to je její vyšší homolog homoisoalliin. Bylo zjištěno, že nezanedbatelnou úlohu při tvorbě barevných sloučenin však hraje také methiin. Po narušení pletiva 5
dochází k enzymově katalyzovanému rozkladu těchto sirných aminokyselin na příslušné sulfenové kyseliny, jejichž kondenzací dochází k tvorbě nestabilních thiosulfinátů. Následnými neenzymatickými reakcemi jejich rozkladných produktů s aminokyselinami pak vznikají barevné látky. Zcela odlišným mechanismem ovšem vzniká červený pigment v cibuli obří. Bylo prokázáno, že prekurzorem těchto barevných látek je S-(2-pyrrolyl)cysteinsulfoxid, který je po narušení pletiva rozštěpen alliinasou na 2-pyrrolsulfenovou kyselinu, která se posléze v několika krocích spontánně přeměňuje na červený 2,2'-epidithio-3,3'-dipyrrol. Vzhledem k chemické povaze procesů vedoucích k tvorbě studovaných barevných látek lze konstatovat, že jejich vzniku lze předcházet jen velmi obtížně, neboť prekurzory těchto sloučenin jsou aminokyseliny (isoalliin, alliin a methiin), které jsou zároveň klíčovými prekurzory látek, které se podílí na tvorbě typického a žádaného aroma česnekovitých rostlin.
6
SUMMARY The thesis is focused on study of color compounds arising during processing of alliaceaeous plants such as garlic, leek, and onion. Discoloration of two less known Allium species, giant onion (Allium giganteum Regel) and Sicilian honey garlic (Allium siculum Ucria Lindl), was also examined. While red, green or blue compounds are formed during processing of garlic, pink to red compounds are formed in the other studied species. The formation of these compounds significantly lowers sensory quality of these vegetables which causes considerable economical losses. Due to extreme complexity of the processes leading to formation of color compounds in real homogenates, the structure of the compounds and their formation pathways were studied by using of model systems including a wide range of isotopically-labeled compounds. A procedure was developed for isolation and purification of the color compounds, their separation by HPLC followed by identification using NMR and MS. It was found that these color compounds are a complex mixture of oligomers of N-substituted derivatives of 3,4-dialkylpyrroles in which are the pyrrole moieties connected with three- or one-carbon chains. Seven main color compounds (λmax 418−597 nm) were detected in garlic homogenates, while fourteen color compounds (λmax 410–634 nm) arising in onion and leek homogenates were characterized. The vast majority of the compounds shared the identical base structure, which differed only in the structure of side chains. Six main color compounds (λmax 430−580 nm) were characterized in a homogenate of Sicilian honey garlic, from which all of them showed considerable analogy of their structure with those found in onion and leek. Based on the acquired information, a probable mechanism of formation of the pigments was proposed. While isoalliin was confirmed to be the primary precursor of color compounds arising in garlic, leek and onion, in Sicilian honey garlic homoisoalliin is the primary precursor. Methiin was showed to be another very important compound involved in the discoloration. After cell disruption, a catalytic 7
cleavage of the sulfur amino acids (isoalliin, homoisoalliin, methiin, alliin) takes place to form the corresponding sulfenic acids, which in turn yield unstable thiosulfinates. The color compounds are then created by subsequent non-enzymatic reactions of degradation products of thiosulfinates with amino acids. The red pigment of giant onion is formed in a completely different manner. S-(2-Pyrrolyl)cysteine S-oxide was shown to be the primary precursor of the color compounds. After cell disruption, it is cleaved by alliinase to form 2-pyrrolesulfenic acid, which turns spontaneously into the red 2,2'-epidithio-3,3'-dipyrrole in several steps. Due to the chemical nature of processes leading to examined color compounds, it can be concluded that complete prevention of their formation is very difficult, because the precursors of the color compounds are amino acids, which also play an important role in generation of the typical and desired alliaceous aroma.
8
ÚVOD S česnekovitými rostlinami se můžeme setkat téměř po celém světě s výjimkou několika nehostinných oblastí. Nejen díky mnoha prospěšným účinkům na lidský organismus (antidiabetické, antimikrobiální, protiplísňové účinky, podpora imunitního systému apod.) se stále zvyšuje poptávka po této zelenině. Zejména česnek, pór a cibule jsou také nedílnou součástí potravinářského průmyslu. Díky svému typickému aroma a chuti se staly nepostradatelnou složkou různých kořenících směsí, přidávají se do salátů, dresinků, polévek, uzenin, slaných koláčů a jsou také velmi vhodným kořením k pečenému masu. O stále rostoucí oblibě této zeleniny svědčí i zvyšující se zemědělská produkce, která narůstá téměř exponenciálně. Největším producentem česneku je Čína (v roce 2011 téměř 20 milionů tun) a největší produkci sušené cibule zaznamenává Indie (v roce 2011 téměř 16 milionů tun). Pro některé země tvoří produkce a export česnekovitých rostlin velmi významnou část jejich hrubého domácího produktu. Z důvodu snadnějšího transportu a skladování se většina produkce suší na prášek, granule či kolečka. Dále se také tato zelenina nakládá, vyrábějí se různé pasty, pyré, tinktury apod. Nejen během dehydratace, ale i během následného zpracování však často dochází k tvorbě barevných sloučenin. V česneku se tvoří modré až zelené látky, zatímco v cibuli a póru červené. Přítomnost těchto látek pak výrazně snižuje organoleptickou hodnotu zeleniny, která je následně konzumenty odmítána. V technologické praxi zatím neexistuje žádný jednoduchý a ekonomicky nenáročný způsob, jak účinně zabránit vzniku tohoto nežádoucího zbarvení. K eliminaci tvorby těchto barevných látek je nutno provádět dehydrataci za vysokých teplot nebo surovinu okyselit popř. přidat cystein. Těmito technologickými zásahy však bohužel dochází ke ztrátám typické chuti a aroma, pro které je tato zelenina využívána. V případě přídavku cysteinu navíc vzniká nežádoucí sirný „přípach“. Nejenže jsou tak tyto technologické kroky často neefektivní, ale jsou také velmi náročné a nákladné, což producentům zvyšuje výrobní náklady.
9
CÍLE PRÁCE Hlavním cílem této práce bylo získat detailní informace o chemické struktuře barevných látek, které vznikají v některých česnekovitých rostlinách při jejich zpracování. Na základě pravděpodobných struktur pigmentů pak navrhnout mechanismus jejich vzniku. Získané informace by mohly pomoci v předcházení vzniku těchto barevných sloučenin během technologického zpracování (sušení, nakládání, homogenizace, atd.). Práce byla zaměřena na následující body: •
Izolaci a identifikaci prekurzoru pigmentu v cibuli obří (A. giganteum), určení struktury vzniklého červeného pigmentu a mechanismu jeho tvorby.
•
Identifikaci pigmentů, které se vytvářejí během zpracování česneku, cibule, póru a česneku sicilského (A. siculum).
•
Detailní studium mechanismu tvorby barevných látek v česneku, cibuli, póru a A. siculum.
•
Na základě získaných informací navrhnout opatření, které zamezí vzniku barevných látek během technologického zpracování česnekovitých rostlin.
10
VÝSLEDKY Tvorba barevných látek v cibuli obří K detailnímu studiu barevných změn probíhajících v cibuli obří byla nezbytná izolace prekurzoru těchto sloučenin. Ve frakci obsahující aminokyseliny, která byla extrahována z cibulí A. giganteum, bylo pomocí HPLC detekováno několik sloučenin vykazujících absorpční maximum v rozmezí 240–280 nm, které byly následně izolovány pomocí iontovýměnné chromatografie a preparativní HPLC a plně charakterizovány za použití různých spektroskopických metod. Hlavní sloučenina poskytovala pozitivní reakci jak s ninhydrinem, tak s Ehrlichovým činidlem (to naznačovalo její aminokyselinovou povahu a zároveň přítomnost pyrrolového jádra). Pomocí spektroskopických metod (NMR, IČ, CD, HRMS) byla odvozena struktura a absolutní konfigurace izolované aminokyseliny. Jedná se o (RS,RC)-S-(2-pyrrolyl)-cysteinsulfoxid (2-PyrrCSO, Obrázek 1).
N H
+
S
O
-
COOH NH2
Obrázek 1:Chemická struktura S-(2-pyrrolyl)cysteinsulfoxidu (2-PyrrCSO)
V další fázi byla pozornost zaměřena na izolaci a identifikaci hlavní červené sloučeniny, která se tvoří v macerátu cibulí A. giganteum. Tato sloučenina vykazovala UV-Vis absorpční maximum při λ = 519 nm a měla shodná UV-Vis a ESI-MS spektra jako látka, která vznikla v modelové směsi sestávající z alliinasy a 2-PyrrCSO. Kvůli vysoké nestabilitě této sloučeniny byla tedy její struktura určena pomocí 1H LC-NMR a LC-HRMS. Na základě zjištěných skutečností, je velmi pravděpodobné, že vznikající červená látka je 2,2'-epidithio-3,3'-dipyrrol (alternativní název dipyrrolo[2,3-d:2',3'-e]-1,2-dithiin) (Obrázek 2).
11
S
S
NH
NH
Obrázek 2: 2,2'-Epidithio-3,3'-dipyrrol
2,2'-Epidithio-3,3'-dipyrrol zřejmě vzniká katalytickým působením alliinasy na 2-PyrrCSO. Lze předpokládat, že při tomto enzymově katalyzovaném rozkladu 2-PyrrCSO primárně vzniká 2-pyrrolsulfenová kyselina, která následnou kondenzací poskytuje S-(2-pyrrolyl)-2-pyrrolthiosulfinát. Tento thiosulfinát poté spontánně (via [3,3]-sigmatropní přesmyk) poskytuje červený 2,2'-epidithio3,3'-dipyrrol (Obrázek 3).
N H
S O
COOH NH2
S-(2-pyrrolyl)cysteinsulfoxid
O
2x
alliinasa N H
SOH
2-pyrrolsulfenová kyselina
S
-H2 O
S
NH
N H
S-(2-pyrrolyl)-2-pyrrolthiosulfinát -H2 O S NH
S NH
2,2'-epidithio-3,3'-dipyrrol
Obrázek 3: Pravděpodobný mechanismus vzniku červené sloučeniny v cibuli obří
12
Tvorba barevných sloučenin v cibuli a póru Vzhledem ke značné komplexnosti reakčních směsí byla pozornost zaměřena na určení struktury pouze 14 nejvýznamnějších barevných látek, jejichž UV-Vis absorpční maxima se pohybovala v rozmezí 410–634 nm. Bylo zjištěno, že jejich obecný sumární vzorec je buď CxHyN2O4, nebo CxHyN2O5 (x = 20–26, y = 27–37). Společný základ všech barevných sloučenin pravděpodobně tvoří dvě molekuly 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny. Vytvořené barevné sloučeniny jsou kombinací těchto dvou molekul a jedno- nebo tříuhlíkatých řetězců navázaných na jednotlivá pyrrolylová jádra v polohách 2 a/nebo 5. Tvorba barevných látek v cibuli a póru je iniciována katalytickým štěpením S-alk(en)ylcysteinsulfoxidů na příslušné sulfenové kyseliny. Tvorbu slzotvorné látky zapřičiňuje LF-synthasa, která katalyzuje rozklad 1-propensulfenové kyseliny. Současnou kondenzací sulfenových kyselin vznikají thiosulfináty. Ty, které obsahují 1-propenylovou skupinu podléhají E/Z izomerizaci, přičemž meziprodukt izomerizace je ve vodném prostředí dále rozkládán. Reakcí tzv. „color developeru“ s alaninem vzniká 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanová kyselina. Ta reakcí s formaldehydem vytváří 2,2'-[methandiylbis(3,4-dimethyl1H-pyrrol-2,1-diyl)]dipropanovou kyselinu, jež tvoří společný základ většiny červených látek charakterizovaných v homogenátech cibule a póru. Následnými reakcemi této substituované dipropanové kyseliny s karbonylovými sloučeninami, které jsou rozkladnými produkty thiosulfinátů a slzotvorné látky, vznikají červené sloučeniny. Fialové sloučeniny, jejichž pyrrolová jádra jsou spojena tříuhlíkatým můstkem vznikají reakcí 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny s thiosulfináty obsahující 1-propenylovou skupinu a následnými reakcemi s ostatními karbonylovými sloučeninami.
13
Barevné sloučeniny obsahující jednouhlíkatý můstek
N
N COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
LO-386
LO-358
N
N
N
N COOH
LO-426 OH
OH N
COOH
LO-442
N
N COOH
COOH
COOH
LO-424
LO-384
O N
N
O N
N COOH
COOH
COOH
COOH
LO-402
N COOH
COOH
COOH
LO-398
N
N
N
N
N COOH
N
COOH
LO-416
COOH
LO-456
Barevné sloučeniny obsahující tříuhlíkatý můstek
N
N
+
COOH
4:
COOH
Pravděpodobné
struktury
N
N
N
COOH
COOH COOH
LO-450
GLO-411
GLO-371
Obrázek
+
N COOH
barevných
látek
vznikajících
v
cibuli
a póru
14
Tvorba barevných sloučenin v česneku V macerátu z česneku bylo detekováno sedm hlavních barevných látek. Tři z nich byly žluté (λmax v rozmezí 384–418 nm), ostatní čtyři byly fialové až modré (λmax v rozmezí 568–597 nm). Dvě barevné sloučeniny (GLO-371 a GLO-411, Obrázek 4) vytvořené v česnekovém extraktu byly detekované také v cibuli a póru. Bylo pozorováno, že tyto látky jsou velmi nestabilní, neboť i při použití velmi mírných podmínek během odpařování rozpouštědla na RVO (30 °C) docházelo ke změně barvy modrého eluátu na zelenou. Takto zřejmě dochází ke vzniku některých žlutých sloučenin. Sumární vzorec dvou žlutých sloučenin je buď C12H16NO4 nebo C15H18NO5. Měly by se tedy skládat z jedné molekuly 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny a jednoho či dvou postranních řetězců. Ostatní barevné sloučeniny obsahují, stejně jako v případě cibule a póru, minimálně dvacet atomů uhlíku, vždy dva atomy dusíku a čtyři až šest atomů kyslíku. Jejich obecný sumární vzorec je tedy CxHyN2Oz, kde x = 21–24, y = 17–31 a z = 4–6. Tyto sloučeniny by tedy měly obsahovat dvě pyrrolová jádra se dvěma aminokyselinami spojená jedno- nebo tříuhlíkatým můstkem, případně by ještě mohla nést boční řetězec. Kromě GLO-371 a GLO-411 (Obrázek 4) se na základě získaných informací bohužel podařilo určit pravděpodobnou strukturu pouze jedné barevné sloučeniny (Obrázek 5).
N COOH
+
N
COOH
Obrázek 5: (2E)-1-(1-karboxyethyl)-2-{(2E)-3-[1-(1-karboxyethyl)-3,4,5-tri-methyl-1H-pyrrol2-yl]-prop-2-en-1-yliden}-3,4-dimethyl-2H-pyrrolium
15
Počátek tvorby barevných sloučenin je stejný jako v případě cibule a póru. Barviva popsaná v česnekovém homogenátu měla společný strukturní základ tvořený dvěma molekulami 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny spojenými 1-propenylenovým můstkem. Ačkoli přesný mechanismus tvorby této struktury není zatím bohužel objasněn, je jisté, že jde o reakci výše zmíněné substituované propanové kyseliny s thiosulfináty obsahující 1-propenylovou skupinu nebo allylovou. Jednotlivé barevné látky pak dále vznikají reakcí (2E)-1-(1-karboxyethyl)-2-{(2E)-3-[1-(1-karbo-xyethyl)-3,4-dimethyl-1H-pyrrol2-yl]-prop-2-en-1-yliden}-3,4-dimethyl-2H-pyrrolia s karbonylovými sloučeninami vytvořenými rozkladem thiosulfinátů. Zelený odstín homogenátu způsobuje přítomnost žlutých sloučenin, které jsou pravděpodobně rozkladnými produkty fialových a modrých látek.
Tvorba barevných sloučenin v česneku sicilském I přes použití modelových směsí byl výtěžek barevných sloučenin (λmax = 533–580 nm) velmi nízký a nebylo možné získat dostatek materiálu na konveční NMR experimenty. Pravděpodobné struktury barevných látek byly tedy navrženy výlučně na základě HRMS/MS dat za využití celé řady izotopově substituovaných prekurzorů. Všechny barevné sloučeniny vznikající v česneku sicilském sestávají minimálně z 27 atomů uhlíku, vždy dvou atomů dusíku a čtyř nebo pěti atomů kyslíku. Jejich obecný vzorec je tedy CxHyN2O4 nebo CxHyN2O5 (x = 27–31, y = 39–47). Na základě doposud získaných informací se lze domnívat, že i tyto barevné sloučeniny mají pyrrolový charakter. (Obrázek 6). Podle předchozích předpokladů jsou rysy tvorby červených sloučenin v česneku sicilském podobné těm při tvorbě červených látek v cibuli a póru. Tvorba barevných sloučenin je iniciována katalytickým stěpením S-substi16
tuovaných cysteinsulfoxidů. Dochází tak k tvorbě thiosulfinátů, které se dále rozkládají. Thiosulfináty obsahující 1-butenylovou skupinu podléhají E/Z izomerizaci přičemž meziprodukt izomerizace je ve vodném prostředí dále rozkládán. Následnou reakcí tzv. „color developeru“ s alaninem vzniká bezbarvá 2-(3,4-diethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanová kyselina. Její reakcí s formaldehydem vzniká 2,2'-[methandiylbis(3,4-diethyl-1H-pyrrol-2,1-diyl)]dipropanová kyselina, jež tvoří základ většiny barevných látek popsaných v homogenátu A. siculum. Následnými reakcemi této látky s karbonylovými sloučeninami vznikají červené sloučeniny.
HO
N
HO
N
N COOH
COOH
N COOH
COOH
S-472
S-526
O
N
N
N COOH
COOH
N
S-486
S-454
N
S-508
N
N
N
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
S-494
Obrázek 6: Pravděpodobná struktura sloučenin vznikajících v česneku sicilském
17
ZÁVĚR Tvorba červené sloučeniny v cibuli obří Některé rysy tvorby červené sloučeniny v cibuli obří jsou podobné těm při tvorbě růžového pigmentu v homogenátu cibule kuchyňské. Tvorba obou druhů pigmentů je iniciována katalytickým štěpením S-substitu-ovaného cysteinsulfoxidu [S-(2-pyrrolyl)cystein-sulfoxidu v cibuli obří a S-(E)-(1-propenyl)cysteinsulfoxidu (isoalliinu) v cibuli kuchyňské]. V obou případech dochází k tvorbě thiosulfinátů, které velmi snadno podléhají [3,3]-sigmatropnímu přesmyku. Nicméně výsledné struktury barevných sloučenin a dráhy jejich vzniku v obou druzích cibule se značně liší. Zatímco pigment se v A. giganteum tvoří přesmykem přímo z thiosulfinátů, růžovění cibule je mnohem složitější a časově mnohem pomalejší proces. Je zde zapotřebí přítomnost thiosulfinátu obsahující 1-propenylovou skupinu, aminokyseliny a (thio)karbonylové sloučeniny. Tvorba barevných sloučenin v cibuli a póru Tvorba barevných sloučenin v cibuli a póru je iniciována katalytickým štěpením S-alk(en)ylcysteinsulfoxidů na příslušné sulfenové kyseliny. Tvorbu slzotvorné látky zapřičiňuje LF-synthasa, která katalyzuje rozklad 1-propensulfenové kyseliny. Současnou kondenzací sulfenových kyselin vznikají symetrické a asymetrické thiosulfináty. U thiosulfinátů, jež obsahují 1-propenylovou skupinu, dochází k E/Z izomerizaci, přičemž meziprodukt izomerizace je ve vodném prostředí dále rozkládán. Reakcí tzv. „color developeru“ s alaninem vzniká 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanová kyselina. Ta reakcí s formaldehydem vytváří 2,2'-[methan-diylbis(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-2,1-diyl)]dipropanovou kyselinu, jež tvoří společný základ většiny červených látek charakterizovaných v homogenátech cibule a póru. Následnými reakcemi této látky s karbonylovými sloučeninami, které jsou rozkladnými produkty thiosulfinátů a slzotvorné látky, vznikají červené sloučeniny. Fialové sloučeniny, jejichž pyrrolová jádra jsou spojena tříuhlíkatým můstkem, vznikají reakcí 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny s thiosulfináty obsahujícími 18
1-propenylovou skupinu a následnými reakcemi s ostatními karbonylovými sloučeninami. Nejdůležitější roli při tvorbě barevných sloučenin tedy hrají S-alk(en)ylcysteinsulfoxidy, zejména množství přítomného S-(1-propenyl)-cysteinsulfoxidu (isoalliinu). Jeho rozkladem vznikají thiosulfináty obsahující 1-propenylovou skupinu, které jsou však zároveň nositeli typické a konzumenty žádané štiplavé chuti a vůně. Tyto látky zároveň vykazují různé pozitivní biologické účinky, proto je vyšší hladina isoalliinu v cibuli a póru vyžadována jak potravinářským, tak farmaceutickým průmyslem. Jisté řešení se nabízí ve vyšlechtění kultivaru, který by měl velmi aktivní enzym LF-synthasu. Z isoallinu by přednostně vznikal propanthialsulfoxid (slzotvorná látka) na úkor výše zmíněných thiosulfinátů. Ačkoli by se tvorba červeného zbarvení výrazně omezila, tento produkt by zřejmě nebyl konzumenty vyhledáván pro jeho vyšší slzotvorné účinky. Tvorba barevných sloučenin v česneku Počátek tvorby barevných sloučenin v česneku je stejný jako v případě cibule a póru. Barevné látky vznikající v česnekovém homogenátu mají společný strukturní základ tvořený dvěma molekulami 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanové kyseliny spojenými 1-propenylenovým můstkem. Jednotlivé barevné látky pak dále vznikají reakcí (2E)-1-(1-karboxyethyl)-2-{(2E)-3-[1-(1-kar-boxyethyl)3,4-dimethyl-1H-pyrrol-2-yl]-prop-2-en-1-yliden}-3,4-di-methyl-2H-pyrrolia s karbonylovými sloučeninami vytvořenými rozkladem thiosulfinátů. Zelený odstín homogenátu způsobuje přítomnost žlutých sloučenin, které jsou pravděpodobně rozkladnými produkty fialových a modrých látek. V procesu zelenání česneku opět hraje klíčovou roli isoalliin. Ačkoli je obsah této aminokyseliny v česneku nízký (obvykle kolem 10 % z celkového množství S-alk(en)yl-cysteinsulfoxidů), jeho přítomnost způsobuje vznik barevných sloučenin. V tomto případě by se tvorba barevných látek dala omezit vhodným skladováním (při teplotách kolem 20 °C), množství isoalliinu je totiž závislé na teplotě skladování. Dalším řešením by mohlo být vyšlechtění kultivarů, které by 19
přirozeně obsahovaly jen minimální množství isoalliinu. Chuť a aroma pro česnek typické totiž zapříčiňuje především rozklad S-allylcysteinsulfoxidu (alliinu) na allicin. Také za příznivé biologické účinky česneku jsou zodpovědné zejména látky vznikající rozkladem alliinu. Tvorba barevných sloučenin v česneku sicilském Podle předchozích předpokladů jsou rysy tvorby červených sloučenin v česneku sicilském podobné těm při tvorbě červených látek v cibuli a póru. Tvorba barevných sloučenin je iniciována katalytickým štěpením S-substituovaných cysteinsulfoxidů (methiinu, butiinu a homoisoalliinu). Dochází tak k tvorbě thiosulfinátů, které se dále rozkládají. Thiosulfináty obsahující 1-butenylovou skupinu také podléhají E/Z izomerizaci, přičemž meziprodukt izomerizace je ve vodném prostředí dále rozkládán. Následnou reakcí tzv. „color developeru“ s alaninem vzniká 2-(3,4-diethyl-1H-pyrrol-1-yl)propanová kyselina. Její reakcí s formaldehydem vzniká 2,2'-[methandiylbis(3,4-diethyl-1H-pyrrol2,1-diyl)]dipropanová kyselina, jež tvoří základ většiny barevných látek popsaných v homogenátu A. siculum. Následnými reakcemi této látky s karbonylovými sloučeninami vznikají červené pigmenty. Je tedy zřejmé, že proces červenání česneku sicilského probíhá stejným způsobem jako červenání cibule a póru. Vzhledem ke skutečnosti, že tento druh česneku je pěstován spíše jako okrasná rostlina, není potřeba řešit problém se vznikem barevných sloučenin během jeho zpracování.
20
