Izolace, separace a detekce proteinů a nukleových kyselin a jejich význam VOJTĚCH ADAM

Izolace, separace a detekce proteinů a nukleových kyselin a jejich význam VOJTĚCH ADAM

Životní prostředí

Obranné mechanismy Rostlinná buňka

Živočišná buňka

VAKUOLA PC - M 2GS - M

2GS - M GSH M

MTF-1

PC - M

GSH

MTI

(γ-glu-cys)n-gly

GSH Fytochelatin

Fytochelatiny

syntáza *Aktivace*

MTF-1

(b) MTI

MT

MTF-1 (c) mRNA

MRE (a)

M

M

Ionty kovů (M)

O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 192, 794-800. V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

M

(d)

Obsah

I. Genová exprese

II. Rostlinné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy

Obsah

I. Genová exprese



I.

Genová exprese

Pokročilé materiály v izolaci nukleových kyselin A. Přidání vzorku

F. Získání cílové molekuly

B. Izolace nukleové kyseliny

G. Adsorpce na povrch molekuly

C. Separace pomocí magnetu

H. Promytí

D. Promývání

E. Ohřev 85 C

I. Měření Pracovní elektroda Referentní elektroda

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

Pomocná elektroda

Potenciostat/ Galvanostat

I.

Genová exprese

Izolace nukleových kyselin Automatická

Poloautomatická 11 6

5

B

7

A

15

D

16

5

3x

8

1 2

Promývání

9

3x

3

3 12

Promývání

4

4

10

C

2

A

6

Elektrochemická detekce

13 85°C 14

potenciostat

POTENCIOSTAT GALVANOSTAT

7 Signal

Elektrochemická detekce


I.

Genová exprese

Optimalizace elektrochemické detekce nukleových kyselin A

C

B

100

Square wave voltametrie

1000 (nA)

Výška píku (%)

Výška píku (%)

95

75

55

90 80 70 60

35 -1.3

-1.5

-1.4

-1.7

-1.6

170

Potenciál (V)

D

220 270 Frekvence (Hz)

50

320

0

E

y = 0.5302x + 0.1444 R2 = 0.9901 6

90

Výška píku

Výška píku (%)

Výška píku (%)

90

300

8

100

100

200

F 110

110

100

Doba akumulace (s)

80 70

80

4

2

60

70

0

50

40

35

30

25

20

Teplota (°C)

15

10

3.6 3.8 4.2 4.4 4.6 4.8

5

5.2

pH


0

5

10

Koncentrace poly(A) (µg/ml)

15

I.

Genová exprese

Je separace založená na paramagnetických částicích v kombinaci s elektrochemickou detekcí využitelná pro analýzu reálných vzorků?

I.

Genová exprese

Izolace mRNA z reálného vzorku Kontrolní rostliny

50 mM Cd(II)

0

5

10

25

100

50

Aplikovaná koncentrace kadmia (µM) 105 kořen

Obsah mRNA (%)

stonek

100 mM Cd(II)

70

35

0 0

5

10

25

50

100

Aplikovaná koncentrace kadmia (µM)

0

24 48 72 96 120 Doba kultivace (hod.)

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411. D. Huska et al. (2009) Chem. Listy, 103, s167-s171.

Obsah

I. Genová exprese

II.Rostlinné obranné mechanismy


II.

Rostlinné obranné mechanismy

Fytochelatiny Sírany

• • Methionin

cystein Protein Redukovaný glutathion

•

•

Významný rostlinný peptid, který má základní strukturu (-Glu-Cys)n-Gly. Dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (-Glu-Cys) se může opakovat 2 až 11krát. Molekula glutathionu (γ-Glu-Cys-Gly) je substrátem pro syntézu fytochelatinů. Hlavní funkce této skupiny peptidů je detoxikace těžkých kovů, která probíhá vazbou na thiolové skupiny peptidu schopnost interakce.

Fytochelatin2

II.


Fytochelatin syntáza γ-glu-cys-gly

VAKUOLA

+

γ-glu-cys-gly

PC - Cd 2GS - Cd

2GS - Cd GSH Cd2+

PC - Cd GSH GSH

FYTOCHELATIN SYNTÁZA

*AKTIVACE*

(γ-glu-cys)n-gly

γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly (γ-glu-cys) n=2–gly

FYTOCHELATINY

+ gly

γ-glu-cys-gly

Cd2+

Cd2+

γ-glu-cys- γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly (γ-glu-cys)n=3-gly γ-glu-cys-gly

FYTOCHELATIN SYNTÁZA n=4

n=5 O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 6, 1367-1381.

II.


Jak komplexně hodnotit reakci rostliny na přítomnost těžkého kovu?

II.


Tabáková BY-2 buněčná line Kultivace BY-2 buněk s přídavkem různých koncentrací Cd(II) iontů během třídenní kultivace v tekutém médiu Murashige and Skoog. 0 µM

5 µM

10 µM

25 µM

50 µM

100 µM

•

Životnost buněk – stanovena pomocí esterázové aktivity

•

Celkový obsah Cd(II) v BY-2 buňkách – stanoven pomocí diferenční pulzní voltametrie

•

Obsah fytochelatinu2 jako produktu fytochelatin syntázy – stanoven pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

II.


Aktivace fytochelatin syntázy Přídavek redukovaného glutathionu k alikvotům (mM) 0

Homogenizace

0.05 0.1 Supernatant N2 (l)

Fosfátový pufr s trikarboxy(ethyl) fosfinem

Centrifugace

Postup přípravy vzorku

0.2 1.0 2.5

Přídavek Cd + inkubace 30 min. 35 C

5.0

Buňky BY-2 po kultivaci s Cd(II) ionty

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí

O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

II.


Km fytochelatin syntázy 2.5

Km [GSH (mM)]

2

1.5

1

0.5

0 0

5

10

25

50

100

Koncentrace Cd(II) (µM)

O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

Obsah

I. Genová exprese



III.

Živočišné obranné mechanismy

Metalothionein – protein • • • • •

Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 – 10 kDa). Metalothionein se skládá ze dvou vazebných domén – α a β. N-terminální část peptidu – β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty. C-terminální část peptidu – -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů. Nejčastější repetice: cystein(C)–serin(S)–cystein(C). 20

Počet aminokyselin

β - doména 9

8 5

5 3

C

S

K

G

A

T

2

2

2

2

N

E

M

P

1

1

1

D

Q

I

Aminokyseliny (C – cystein, S – serin, K – lysin, G – glycin, A – alanin, T – threonin, N – asparagin, E – kyselina glutamová, M – methionin, P – prolin, D – kyselina asparagová, Q – glutamin, I – isoleucin)

J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.

α - doména

III.


Detoxikace těžkých kovů ledvina

(f) těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu ?) (a) fosforylace?

MTF-1 MTI MTF-1

(e) MT

MT

?

MTI

MRE jádro

(a) Vstup iontů kovu do buňky. (b) Ionty interagují s inhibitorem syntézy metalothioneinu (MTI).

(b) MTF-1 (c)

vyloučení

mRNA (d)

(c) Spuštění transkripčního faktoru (MTF-1) spojeného s metaloresponsivním elementem (MRE). (d) Syntéza mRNA pro translaci MT. (e) MT se váží ion těžkých kovů, komplex MT-iont těžkého kovu je transportován do ledviny nebo k regulačním proteinům závislým na těžkém kovu (f).

cytoplasma V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

III.


Jak studovat úlohu tohoto proteinu v buňce?

III.


Tepelná denaturace a přenosová technika

kapka vzorku po tepelné denaturaci

15 min. parafilm mikroskopické sklo

visící rtuťová kapková elektroda

Adsorpce při 10 °C

2°C Co(II)

RS2Co

250 nA

Uhlíková elektroda

Cat1 Cat2

Co1

Ag/AgCl/ 3M KCl omývání

Brdičkova reakce -0.3

–0.8

–1.3

–1.8

Potenciál (V) J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119. V. Adam, et al. (2008) Sensors, 8, 2293-2305.

III.


Cisplatina a buněčné linie Mateřská linie

100 nA

UKF-NB4 – rezistentní k cisplatině

b

Rezistentni linie

c

0 µg cddp/ml media

a

1 µg cddp/ml media

B

sken

Množství MT (%)

C

Buněčná linie

n.d.

MT 300 ng

MT v buněčném extraku

D

E Množství MT (%)

MT 300 ng

Množství MT (%)

A

Koncentrace cisplatiny (µM)

I. Fabrik, et al. (2008) Electroanalysis, 20, 1521-1532.

MT 300 ng

n.d.

Koncentrace karboplatiny (µM)

III.


Pokročilé materiály v izolaci metalothioneinu A. Navázání protilátek

G. Získání cílové molekuly

B. Přidání vzorku

C. Izolace cílové molekuly

H. Adsorpce na povrch molekuly

D. Separace pomocí magnetu

I. Promytí

E. Promývání

F. Ohřev

J. Měření Pracovní elektroda Referentní elektroda

M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

Pomocná elektroda

Potenciostat/ Galvanostat

III.


Teplota ( C)

Normalizovaný signál (%)

Vzorek


Myší IgG Králičí IgG



Optimalizace postupu izolace

Čas (min.)

22Rv1

pH


III.


MT mRNA

Koncentrace Cd(II) (µM) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA

Koncentrace Cd(II) (µM)

Metalothionein/viabilita (%)

Metalothionein/viabilita (%)

Analýza prostatické buněčné linie 22Rv1

MT mRNA

Koncentrace Cu(II) (µM) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA

Koncentrace Cu(II) (µM)


Shrnutí

 Multi-instrumentální přístup  Nové materiály založené na nanotechnologiích  In situ a on line detekce  Praktické aplikace

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě  Využití moderní a robustní analytické, biochemické a biologické instrumentace v základní výuce Anorganické a Analytické chemie a Biochemie.  Unikátní

přístroje

biochemických

ve

specializovaných

předmětech

chemických

(Bioanalytická

a

chemie,

Biotechnologie životního prostředí, Biosenzory, Biochemické pokročilé praktikum).  Bakalářské a diplomové práce.

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě

Moderní instrumentace Odborné vedení

Nadaní studenti Biotechnologie rostlin Biotechnologie živočichů Zootechnika

Chemie a technologie potravin Jakost a zdravotní nezávadnost potravin

Pedagogický rozvoj

Pedagogický rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě Výchova mladých vědeckých pracovníků  Rozvoj izolačních a separačních postupů založených na pokročilých materiálech.  Lab-on-chip technologie, aplikace in situ.  Praktická

aplikace,

studium

v organismech všech úrovní.

biochemických

procesů

Vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě Základní výzkum (grantové projekty národní i evropské) GA ČR 522/07/0692 „Studium tvorby thiolových sloučenin u rostlin – uplatnění při remediačních technologiích“ EU 7H10021„MAS, Nanoelectronics for mobile AAL-Systems“

Zemědělská chemie Aplikovaný výzkum NAZV QI91A032 „Výběr rezistentních genotypů meruněk k PPV s tržní kvalitou plodů“

Zahraniční spolupráce John Innes Institute (Prof. Kopřiva) The estación experimental del Zaidín (Dr. Ferrol)

Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě In vivo zobrazovací technologie Kvantová tečka – quantum dot, ohraničená oblast polovodiče o průměru kolem 30 nm a výšce 8 nm, schopná v důsledku nižší energie ve srovnání s energií vodivostního pásu okolního polovodiče vázat elektrony. Důležitou vlastností je také optická schopnost teček se zabarvovat.

http://www.carestream.com

Intenzita signálu > 100 000 Excitace (440 nm), Emise (790 nm) kontrola

10 µM

100 µM

PODĚKOVÁNÍ

PODĚKOVÁNÍ Laboratoř metalomiky a nanotechnologií Červen 2007

Prosinec 2005

Duben 2006

Duben 2008

Listopad 2007 Září 2010

Květen 2011

Březen 2009

Děkuji za pozornost

Izolace, separace a detekce proteinů a nukleových kyselin a jejich význam VOJTĚCH ADAM

Recommend Documents