IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: 

detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení



detekce po izolaci a následné separaci proteinů - SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA  dvě formy: G-aktin = globulární, jedna molekula nezpolymerované formy F-aktin = filamenta, polymerované do vláken

 F-aktin: phalloidin konjugovaný s TRITC  G-aktin: DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488  DNA: DAPI  použité buňky – buněčná linie NES2Y (lidské -buňky Langerhansových ostrůvků)

METODA 1: Fluorescenční barvení Signál produkující molekula → zviditelnění detekované molekuly

Detekovaná molekula

ve vzorku „neviditelné“

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce F-aktinu PHALLOIDIN  jed z houby Amanita phalloides

 specificky váže F-aktin  kovalentní připojení fluoroforu nemá vliv na vazbu phalloidinu k F-aktinu  TRITC po excitaci zeleným světlem vyzařuje červené světlo

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce F-aktinu

TRITC → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu

F-aktin

ve vzorku „neviditelné“

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce G-aktinu DNáza I  malý protein, který specificky interaguje s G-aktinem v jádře  fyziologická funkce této interakce není známa (je možné, že vazba ke G-aktinu slouží k regulaci aktivity DNázy)  vazba fluoroforu neovlivňuje vazbu na G-aktin  AlexaFluor 488 po excitaci modrým světlem vyzařuje zelené světlo

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce G-aktinu

AlexaFluor 488

→ zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu

G-aktin

ve vzorku „neviditelné“

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce DNA DAPI  interkaluje se do malého žlábku dsDNA

 tato vazba zvyšuje excitační vlastnosti DAPI  po excitaci UV světlem vyzařuje modré světlo

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce DNA UV

DAPI DNA

DAPI

DNA

ve vzorku „neviditelné“

→ zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu

Fixace – první krok přípravy vzorku  brání rozkladu a autolýze tkáně  cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín)  vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni  rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet  tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

Pracovní postup: • fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) • odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS • inkubace buněk s phalloidinem-TRITC a DNázou I-Alexa Fluor 488 • odstranění nevázaného phalloidinu-TRITC a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS • barvení DNA pomocí DAPI

• pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

Trojité barvení F-aktinu, G-aktinu a DNA

METODA 2: Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

Izolace proteinů z různých typů tkání  použité typy tkání:  sval  srdce  játra

Izolace proteinů z tkáně:  prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk  dezintegrace (lýza) buněk působením:  chemickým (používáme v našem experimentu)  mechanickým  fyzikálním

Pracovní postup: Izolace proteinů  přenos tkáně do zkumavky  dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát)  oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací

Stanovení koncentrace proteinů  pomocí metody podle Bradfordové

 použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky

Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE  povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS  nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel  separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy

Identifikace proteinů  barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue

 lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních

Princip metody Bradfordové  kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny  Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

Coomassie Brilliant Blue  po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou  detekce při 595 nm

Kalibrační křivka

0.500 y = 0.2286x + 0.0008 R2 = 0.9996

Absorbance (A595 nm)

0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

BSA (ug/ul)

1.4

1.6

1.8

2

2.2